Особенности бактериологического метода при диагностике туберкулеза

Наилучшие результаты получают при одновременном использовании двух различных плотных сред. При этом не следует ограничиваться однократным или даже повторным исследованием, а необходимо последовательно, через известные интервалы производить посевы мокроты или промывных вод бронхов. Целесообразность такой диагностической тактики подтверждается повседневным опытом и, в частности, наблюдениями, проведенными в Институте туберкулеза в Будапеште. При троекратном исследовании методом посева мокроты у значительной группы больных туберкулезом легких микобактерии были обнаружены у 70,3% из них, после 5 анализов — у 80,7%, а после 10 — у 97,9%.

При бактериологическом способе исследования удается не только выявить и подсчитать количество выросших колоний микобактерии туберкулеза, но и изучить их различные свойства, дифференцировать от кислотоупорных сапрофитов и атипичных штаммов, определить типовую принадлежность, ферментативную активность, лекарственную чувствительность и др.

Успехи различных способов культивирования микобактерии, естественно, ограничили сферу применения биологического метода исследования, т. е. заражения животных исследуемым материалом. Но они ни в какой мере пе исключают его. Путем заражения высокочувствительных к туберкулезу лабораторных животных, главным образом морских свинок, можно обнаружить микобактерий, даже если они содержатся в исследуемом материале в небольшом количестве. Это обстоятельство приобретает, конечно, весьма важное диагностическое значение. Тем же способом удается лучше дифференцировать вирулентные и атипичные штаммы от сапрофитов, определить тип микробов, к которым одни виды животных чувствительны, а другие устойчивы, а также установить патогенность и вирулентность микобактерий туберкулеза.

Следует подчеркнуть, что при специфической химиотерапии затрудняется обнаружение микобактерий в различных выделениях, жидкостях и тканях организма больного. Это явление связано с тем, что под влиянием антибактериальных препаратов, особенно при длительной терапии, понижается жизнеспособность микобактерий и изменяются их морфологические свойства и химический состав, что отражается на тинкториальной способности, так как может вести к снижению или утрате присущей микобактериям кислотоустойчивости. Мертвые микобактерий по Цилю—Нельсену окрашиваются так же, как и живые. Для их дифференциации применяют специальные методы окраски. Так, живые микобактерий, в которых содержится нативная дезоксирибонуклеиновая кислота, окрашиваются метиловым зеленым. Погибшие микробы лучше окрашиваются пиронином в розовый цвет, а сафранином — в красный. При докраске карболовым фуксином живые микобактерий окрашиваются в зеленый цвет, а погибшие — в красный.

Распознавание таких биологически и морфологически измененных форм возбудителя туберкулеза, особенно в условиях повседневной практики, естественно, встречает затруднения. Этим отчасти можно объяснить, что у некоторых больных даже деструктивным туберкулезом легких не находят микобактерий туберкулеза в мокроте уже вскоре после начатой химиотерапии. Нет сомнения, что только у части из них произошло стойкое и полное морфологическое и биологическое оздоровление стенок туберкулезных каверн. У остальных имеет место мнимая абациллярность, что подтверждается возможностью обострения процесса при динамическом наблюдении, а также обнаружением микобактерий в полости или стенках каверны при специальном исследовании. В этом можно убедиться, если произвести пункцию, казалось бы, излеченной каверны и исследовать ее содержимое после промывания физиологическим раствором. Пользуясь таким методом, Neef (1966) из 49 больных с остаточными, большей частью небольшими (до 0,5 см в диаметре), посттуберкулезными полостями в легких у 11 больных, т. е. почти в 1/4 случаев, обнаружил микобактерий, которые не удавалось найти в мокроте или в промывных водах бронхов всеми доступными способами.

Таким образом, в условиях современной химиотерапии возникает необходимость дальнейшего усовершенствования методов обнаружения микобактерий туберкулеза. В то же время обязательным условием является одновременное динамическое комплексное применение различных лабораторных способов исследования патологического материала: бактериоскопии, посева, по возможности заражения лабораторных животных. Необходимо, кроме того, использование ряда специальных методов для выявления не только классических, но и других вариантов возбудителя.

Так, применяя новые питательные среды, а также пенициллин и дигидрострептомицин, можно выделить из мокроты, спинномозговой жидкости, мочи и тканей больных туберкулезом L-формы микобактерий в виде мелких зерен и шаровидных тел.

При дифференциации типичных и атипичных микобактерий используют комплекс многих методов исследования: определяют кислотно- и спиртоустойчивость микобактерий; изучают особенности их роста при различной температуре, на отдельных питательных средах, при наличии и отсутствии солнечного света; исследуют морфологию культур и способность образовывать пигмент; устанавливают степень чувствительности к туберкулостатическим препаратам. Существенное диагностическое значение имеют некоторые биохимические тесты: амидазный и ниациновый, определение каталазной, дегидрогеназной, пероксидазной, уреазной и липазной активности и реакция восстановления нитратов. О вирулентности тех или иных штаммов микробов судят по результатам определения корд-фактора и цитохимическим тестам. Их патогенность устанавливают при заражении морских свинок, белых мышей, кроликов, кур. Эти исследования дополняются изучением антигенных структур, а также аллергическими пробами с туберкулином и сенситинами, серологическими реакциями у больных.

Определенную роль в клинике туберкулеза органов дыхания играет вторичная — смешанная — инфекция, что связано прежде всего с тем что при нем нередко отмечаются хронический бронхит и пневмония, пневмосклероз, бронхоэктазы. Эти изменения могут сопутствовать туберкулезу или становятся его осложнением, особенно при длительном течении. В том и другом случае, отмечают Н. В. Татарский и А. Я. Цигельник (1968), создаются условия для проявления активности вторичной флоры и развития ряда клинических симптомов: повышения температуры, увеличения количества мокроты, нарастания катаральных явлений в легких, амилоидоза и т. д. При бактериологическом исследовании при этом обнаруживают различного вида стрептококки и стафилококки, грамположительные и грамотрицательные кокки, кишечную палочку и т. д. Все они имеют различную степень чувствительности к отдельным антибиотикам. При этом обязательным является выделение чистых культур и определение их патогенности.

При дифференциальной диагностике туберкулеза и глубоких микозов— аспергиллеза, гистоплазмоза, актиномикоза, кокцидиомикоза, нокаридиоза, кандидомикоза и т. д. — важно не только тщательно исследовать нативные и окрашенные препараты мокроты на присутствие дрожжеподобных грибов рода Candida, Coccidoides immitis, Histoplasma capsulatum, Aspergillus fumigatus и т. д., но и производить посевы на специальные питательные среды, главным образом на среду Сабуро с агаром или без него. Положительные результаты приобретают большее диагностическое значение, если одновременно у больных выявляются кожные реакции на кокцидиоидин, гистоплазмин, аспергиллин, бластомицин и др., а также серологические реакции с соответствующими антигенами (реакция преципитации, связывания комплемента).

- Вернуться в оглавление раздела "Пульмонология."

Лабораторная диагностика. Для диагностики туберкулеза применяют все ме­тоды: бактериоскопический, бактериологический, серологический, биологический, аллергические пробы, ПЦР. При бактериоскопическом исследовании исходного материала (мокрота, моча, гной, спинномозговая жидкость, испражнения) необхо­димо учитывать, что содержание в нем микобактерий может быть незначительным, выделение их эпизодическим и в нем могут быть измененные варианты возбудителя, в том числе L-формы. Поэтому для повышения вероятности обнаружения микобак­терий туберкулеза используют методы концентрирования их с помощью центрифу­гирования или флотации, а также фазово-контрастной (для обнаружения L-форм) и люминесцентной микроскопии (в качестве флуорохромов используют аурамин, аурамин-родамин, акридиновый оранжевый и др.).

Биологический метод — заражение морских свинок — является одним из на­иболее чувствительных. Считается, что заражающая доза возбудителя для них со­ставляет несколько клеток. Морские свинки могут быть использованы и для обна­ружения L-форм туберкулезных бактерий, но в этом случае необходимо сделать несколько последовательных заражений, так как L-формы обладают меньшей ви­рулентностью и вызывают у свинок доброкачественную форму туберкулеза, которая в случае реверсии L-форм в исходное состояние может перейти в генерализо­ванный процесс.

Из числа серологических реакций для диагностики туберкулеза предложены РСК, РПГА, реакции преципитации, методы иммуноферментного анализа (в том числе точечного), радиоиммунный метод, иммуноблотинг, реакция агрегат-гемаг- глютинации (для обнаружения ЦИК) и др. Использование различных антигенов позволяет обнаруживать наличие определенных антител. Для совершенствования серологических методов диагностики туберкулеза важное значение имеет получение моноклональных антител к различным антигенам микобактерий. Это позволит вы­явить те специфические эпитопы туберкулезных бактерий и соответственно те анти­тела к ним, обнаружение которых имеет наибольшее диагностическое значение, а также позволит создать коммерческие тест-системы для иммунодиагностики ту­беркулеза.

Среди всех методов микробиологической диагностики туберкулеза решающим все же остается бактериологический. Он необходим не только для постановки диа­гноза болезни, но и для контроля эффективности химиотерапии, своевременной оценки чувствительности микобактерий к антибиотикам и химиопрепаратам, диа­гноза рецидивов туберкулеза, степени очищения больного организма от возбудителя и выявления его измененных вариантов, особенно L-форм. Исследуемый материал перед посевом необходимо обрабатывать слабым раствором серной кислоты (6— 12 %) для устранения сопутствующей микрофлоры. Выделение чистых культур ми­кобактерий ведут с учетом скорости их роста, пигментообразования и синтеза ниа- цина. Дифференциацию между отдельными видами микобактерий осуществляют на основании их биологических свойств, как указано выше. Вопрос о вирулентности микобактерий решается с помощью биологических проб и на основании обнаруже­ния корд-фактора. Для этой цели предложены цитохимические реакции. Они осно­ваны на том, что вирулентные микобактерии (содержащие корд-фактор) прочно связывают красители — нейтральный красный или нильский голубой — и при до­бавлении щелочи сохраняют цвет краски, а раствор и невирулентные микобактерии изменяют свою окраску.

Для более быстрого выделения возбудителя туберкулеза предложен метод мик­рокультур. Суть его состоит в том, что на предметное стекло наносят исследуемый материал, обрабатывают его серной кислотой, отмывают, стекло помещают в цит- ратную лизированную кровь и инкубируют при температуре 37 "С. Уже через 3— 4 сут. рост микобактерий на стекле проявляется в виде микроколоний, которые к 7—10-му дню достигают максимального развития, а микобактерии хорошо выявля­ются при микроскопии. При этом вирулентные микобактерии образуют змеевидные колонии, а невирулентные растут в виде аморфных скоплений.

Для обнаружения L-форм используют культуральный, биологический и иммунофлуоресцентный методы. В связи с широким распространением лекарствен- ноустойчивых штаммов микобактерий возникла необходимость усилить контроль за этим процессом. С этой целью, а также для более точной идентификации и дифференциации микобактерий используют молекулярно-генетические методы, в частности, метод типирования штаммов, основанный на выявлении различий в структуре генома микобактерий — геномная дактилоскопия. Метод заключается в обнаружении в геноме микобактерии ряда повторяющихся нуклеотидных последовательностей и анализе полиморфизма длин фрагментов рестрикции. В качестве зонда (праймера) обычно используют IS6110 (англ. insertion sequence — вставочная последовательность). В хромосоме микобактерии, как правило, имеется несколько копий элемента IS6110, которые отличаются высокой стабильностью своего местоположения, что позволяет точно идентифицировать различные штаммы.

Биологический способ обнаружения L-форм заключается в серии последователь­ных пассажей на морских свинках.

Для иммунофлуоресцентного метода используют диагностические сыворотки, содержащие меченные флуорохромом антитела к антигенам L-форм.

9. Бактериологическая диагностика туберкулеза. Схема дифференцирования мико­бактерий в ходе их выделения. Специфическая профилактика туберкулёза. Вакцина БЦЖ, состав, способы применения. Химиотерапия туберкулеза.

Среди всех методов микробиологической диагностики туберкулеза решающим все же остается бактериологический. Он необходим не только для постановки диа­гноза болезни, но и для контроля эффективности химиотерапии, своевременной оценки чувствительности микобактерий к антибиотикам и химиопрепаратам, диа­гноза рецидивов туберкулеза, степени очищения больного организма от возбудителя и выявления его измененных вариантов, особенно L-форм. Исследуемый материал перед посевом необходимо обрабатывать слабым раствором серной кислоты (6— 12 %) для устранения сопутствующей микрофлоры. Выделение чистых культур ми­кобактерий ведут с учетом скорости их роста, пигментообразования и синтеза ниа- цина. Дифференциацию между отдельными видами микобактерий осуществляют на основании их биологических свойств, как указано выше. Вопрос о вирулентности микобактерий решается с помощью биологических проб и на основании обнаруже­ния корд-фактора. Для этой цели предложены цитохимические реакции. Они осно­ваны на том, что вирулентные микобактерии (содержащие корд-фактор) прочно связывают красители — нейтральный красный или нильский голубой — и при до­бавлении щелочи сохраняют цвет краски, а раствор и невирулентные микобактерии изменяют свою окраску.

По патогенным свойствам род Mycobacterium подразделяют на две группы:

1) па­тогенные и условно-патогенные (потенциально патогенные)

2) сапрофита. Для их ускоренной предварительной дифференциации учитывают прежде всего три при­знака: а) скорость и условия роста; б) способность к пигментообразованию; в) спо­собность синтезировать никотиновую кислоту (ниацин).

По скорости роста род Mycobacterium подразделяют на три группы:

1) Быстрорастущие — крупные видимые колонии появляются ранее 7-го дня инкубации (18 видов).

2) Медленнорастущие — крупные видимые колонии появляются после 7-ми и бо­лее дней инкубации (20 видов).

3) Микобактерии, которые требуют специальных условий для роста или не растут на искусственных питательных средах. К этой группе относятся два вида: М. leprae и М. lepraemurium.

По способности к пигментообразованию микобактерии также делят на 3 группы:

1) Фотохромогенные — образуют пигмент лимонно-желтого цвета при росте на свету.

2) Скотохромогенные — образуют пигмент оранжево-желтого цвета при инкуби­ровании в темноте.

3) Нефотохромогенные — пигмента не образуют (независимо от наличия света), иногда культуры имеют светло-желтоватую окраску.

К патогенным и потенциально патогенным относится 24 вида.

Профилактика. Помимо проведения широких социально-экономических меро­приятий, направленных на улучшение жизни населения, раннего и своевременного выявления больных туберкулезом и оказания им эффективной лечебной помощи, большое значение имеет плановая массовая вакцинация против туберкулеза. Она осуществляется вакциной БЦЖ, полученной А. Кальметтом и Ш. Гереном из ослаб­ленного многолетними пересевами штамма М. bovis. Вакцинации подлежат все ново­рожденные дети на 5—7-й день жизни. Вакцину, содержащую 0,05 мг сухих живых бактерий в объеме ОД мл, вводят внутрикожно. Ревакцинацию проводят в возрасте 7—12—17—22 и 27—30 лет только лицам, отрицательно реагирующим на внутри- кожную пробу Манту (5 ТЕ/0,1 мл).

Лечение. Консервативное лечение туберкулеза проводят с помощью антибиоти­ков и химиопрепаратов. Препараты I ряда (более ранние) включают производные парааминосалициловой кислоты (ПАСК), гидразида изоникотиновой кислоты (ГИНК) — изотиазид (тубазид), фтивазид и др. и препараты группы стрептомицина. Препараты II ряда — циклосерин, канамицин, флоримицин, рифампицин и другие антибиотики. У микобактерий к химиопрепаратам, в особенности I ряда, часто на­блюдается устойчивость, поэтому лечение должно сопровождаться контролем сте­пени чувствительности их к применяемым препаратам.

10. Возбудитель лепры. Морфологические и культуральные особенности. Лаборатор­ная диагностика. Аллергические пробы и их диагностическое значение. Химио­терапия лепры.

Лепра — высококонтагиозное и одновре­менно низкопатогенное хроническое заболевание, при котором субклиническая инфекция — обычное явление, в то время как клинические проявления отмечаются только у небольшого числа инфицированных лиц. Характеризуется длительным течением, специфическим поражением кожи, слизистых оболочек, периферических нервов и различных внутренних органов. Возбудитель — Mycobacterium leprae — был открыт в 1874 г. А. Хансеном. До сих пор никому не удавалось получить рост возбу­дителя проказы на искусственных питательных средах. Палочка лепры является строгим внутриклеточным паразитом тканевых макрофагов (гистиоцитов), моно- нуклеарных фагоцитов и других клеток. Ее удается культивировать только в орга­низме мышей, крыс и особенно при внутривенном заражении большими дозами (до 10 8 клеток) броненосцев (армадиллов), у которых она вызывает специфический ге­нерализованный процесс и накапливается в огромном количестве в пораженных тканях (лимфатические узлы, печень, селезенка). В связи с этим морфологические свойства возбудителя лепры описаны по его картине в лепрозных тканях.

М. leprae — прямая или слегка изогнутая палочка с закругленными концами, ди­аметром 0,3—0,5 мкм и длиной 1,0—8,0 мкм. Спор, капсул не образует, жгутиков не имеет, грамположительна. По химическому составу сходна с М. tuberculosis, облада­ет спирто- и кислотоустойчивостью, поэтому ее окрашивают по методу Циля—

Нильсена. М. leprae обладает большим полиморфизмом: в лепромах (лепрозных бу­горках) встречаются зернистые, кокковидные, булавовидные, нитевидные, ветвя­щиеся и другие необычные формы. В пораженных клетках они образуют шаровид­ные плотные скопления, в которых микобактерии располагаются параллельно друг другу, напоминая расположение сигар в пачке.

Главные особенности болезни во многом определяются следующими свойствами возбудителя:

1) Очень медленное размножение в организме является причиной продолжитель­ного инкубационного периода (в среднем 3—7 лет, иногда до 15—20 и более лет) и хронического течения болезни у людей и подопытных животных.

2) М. leprae регулярно вовлекает в процесс нервную ткань и приводит к инвалид­ности, а это имеет большое экономическое значение для эндемичных регионов.

3) Оптимальная температура для размножения возбудителя менее 37 °С. Следо­вательно, наиболее поражаемы охлаждаемые ткани человека и подопытных живот­ных (у броненосцев температура тела 30—35 °С).

4) М. leprae способны вызывать иммунологическую толерантность у людей с лепроматозной формой болезни, и такие больные являются главным источником заражения людей лепрой.

Определяющим фактором формирования типа болезни и исхода первичного за­ражения служит степень напряженности естественного иммунитета против лепры, которая выявляется с помощью лепроминовой пробы. Положительная реакция на лепромин свидетельствует о наличии достаточно высокого естественного иммуните­та к М. leprae. Нарушение клеточного иммунитета при лепроматозном типе болезни проявляется прежде всего в том, что фагоцитоз имеет незавершенный характер: ми­кобактерии лепры не только не разрушаются макрофагами, но именно в них они ак­тивно размножаются. Кроме того, лимфоциты у таких больных не подвергаются бласттрансформации и не подавляют миграции макрофагов (у больных туберкуло- идным типом эти реакции положительны). Иммунитет к лепре зависит от многих факторов, и при его снижении возможно обострение процесса и отягощение течения болезни.

Лабораторная диагностика. Из всех микробиологических методов диагностики используется главным образом бактериоскопический. Материалом для исследова­ния являются слизь или соскобы со слизистой оболочки носа, скарификаты из пора­женного участка кожи, кусочки пораженного органа или ткани, из которых готовят гистологические срезы. Мазки и срезы окрашивают по Цилю—Нильсену. Для диф­ференциации №. leprae от М. tuberculosis используют биологическую пробу на белых мышах, для которых М. leprae не патогенна.

Лечение. Больные лепрой, в зависимости от ее типа, подвергаются лечению или в специальных противолепрозных учреждениях (лепрозориях), или в амбулаториях по месту жительства. В лепрозории госпитализируют первично выявленных боль­ных, у которых имеются распространенные кожные высыпания, возбудитель обна­руживается бактериоскопически; а также больных, находящихся на постоянном учете, в случае обострения или рецидива болезни. Амбулаторно можно лечить боль­ных с ограниченными кожными проявлениями, у которых при бактериоскопии воз­будитель не обнаруживается.

Лечение должно носить комплексный характер с одновременным использовани­ем 2—3 различных антилепрозных химиопрепаратов, а также общеукрепляющих и стимулирующих иммунную систему средств. Наиболее активными химиопрепара- тами являются: производные сульфонового ряда — диафенилсульфон, солюсуль- фон, диуцифон и др.; рифампицин, лампрен, этионамид и др. Курс химиотерапии должен быть не менее 6 мес., при необходимости проводят несколько курсов, чере­дуя препараты.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Туберкулез - общее инфекционное заболевание с преимущественной локализацией процесса в легких. При туберкулезе также поражаются лимфатические узлы, серозные оболочки, пищеварительный тракт, урогенитальная система, кожа, кости и суставы (туберкулез внелегочной локализации).

Материал для исследования: мокрота, слизь с задней стенки глотки, промывные воды бронхов и желудка, моча, спинномозговая жидкость, плевральный экссудат, гной из абсцессов и др.

Больной собирает мокроту в чистую баночку или карманную плевательницу. Лучшие результаты дают исследования мокроты, выделенной больным в течение полусуток. На баночку наклеивают бумажку с фамилией и инициалами больного, заполняют специальный сопроводительный бланк (фамилия и инициалы больного, диагноз, группа диспансерного учета, цель исследования) и направляют в лабораторию.

В микробиологической диагностике туберкулеза используют бактериоскопический, бактериологический и биологический методы, а также комплекс иммунологических исследований.

Бактериоскопический метод

Туберкулезные микобактерииокрашиваются в красный цвет, все остальные элементы мокроты и другие бактерии — в синий. Туберкулезные микобактерии имеют вид тонких, слегка изогнутых палочек различной длины с утолщениями на концах или посередине, располагаются группами и поодиночке.

При окраске по Цилю—Нильсену в красный цвет окрашиваются также кислотоустойчивые сапрофиты. Они находятся в почве, воде, молоке, масле, сметане, коже здоровых людей, желудке и т.д. При окраске по Цилю—Нильсену их трудно отличить от МБТ. Кислотоустойчивые сапрофитные бактерии окрашиваются в вишневокрасный цвет, но теряют свою окраску при длительном обесцвечивании солянокислым спиртовым раствором (от 3 ч до суток) или 0,01% раствором гипохлорита калия (КС10). Кислотоустойчивые сапрофиты в отличие от МБТ толстые, грубые, короткие, незернистые, иногда со вздутиями на концах, заостренные или веретенообразные, располагаются чаще кучками. Необходимо помнить, что аэробный микроорганизм Нокардиа (Nocardia asteroides), имеющий нежные, палочковидные, разветвляющиеся волокна диаметром 1 мкм, попадает в легкие при вдыхании воздуха и также затрудняет бактериоскопическую диагностику.

Кислотоустойчивая сапрофитная флора отличается от МБТ культуральными и биохимическими свойствами.

Положительное заключение выдают при обнаружении микобактерии туберкулеза в препарате после просмотра не менее 100 полей зрения: обязательно указывают число микробов в поле зрения. Отрицательный результат микроскопии необязательно должен свидетельствовать об отсутствии микобактерии в исследуемом материале.

Метод люминесцентной микроскопии

Препараты мокроты и промывных вод бронхов можно исследовать люминисцентным методом.

Принцип. Туберкулезные микобактерии, окрашенные ауромином-родамином, люминесцируют под влиянием ультрафиолетовых лучей в виде светящихся золотистых палочек (метод менее трудоемкий и более быстрый, чем предыдущие).

Мазки-препараты приготовляют из осадка, полученного методом накопления, фиксируют проведением через пламя. Мазки окрашивают в течение 15 мин смесью растворов флюорохромных красителей: на 1000 мл дистиллированной воды 1,0 ауромина 00 и 0,1 родамина С. После окраски мазок обесцвечивают 3% раствором соляно-кислого спирта в течение 30 сек, промывают водой. Если фон мазка сильно флюоресцирует, следует применить в качестве гасителя 0,25% водный раствор метиленового синего, промыть мазок водой, подсушить и микроскопировать в люминесцентном микроскопе. Микобактерии светятся золотисто-желтым светом на темно-зеленом фоне. Положительный ответ выдается, если в препарате обнаружено не меньше 4—5 палочек. При наличии 1—2 палочек в препарате анализ следует повторить.

Окраска ауромином-родамином, кроме того, выявляет нежизнеспособные МБТ. При окраске по Цилю—Нильсену они не выявляются, поэтому для оценки прогноза все аурамин-родамин позитивные пробы должны быть окрашены также и по Цилю—Нильсену.

Окрашивание ауромином-родамином имеет следующие преимущества перед окраской по Цилю—Нильсену:

1. кислотоустойчивые бациллы имеют большее сродство к ауромин-родаминовой окраске;

2. весь мазок может быть просмотрен при небольшом увеличении;

3. на темном фоне во флюоресцентном микроскопе МБТ выделяются более четко, и это позволяет быстрее и точнее просмотреть весь мазок.

При люминесценции кислотоустойчивые сапрофиты имеют бледно-желтый или зелено-желтый оттенок свечения, отличающийся от золотисто-оранжевого свечения МБТ.Исследуемую мокроту переносят в чашку Петри, с помощью препаровальных игл или пинцета выбирают гнойные комочки и переносят их на середину предметного стекла, накрывают комочек другим предметным стеклом и растирают материал между стеклами. Спинномозговую жидкость отстаивают в холодильнике и готовят мазки из нежной пленки фибрина. Мочу центрифугируют и делают мазки из осадка. Препараты обесцвечивают не только кислотой, но и спиртом для дифференциации от M.smegmatis, которые могут находиться в моче здоровых лиц.

Гомогенизация. Собрать в банку суточное количество мокроты и добавить равный объем 1% NaOH, закрыть стерильной резиновой пробкой и встряхивать в шюттель-аппарате до полного разжижения мокроты. Обычно для этого требуется 10-15 мин. Гомогенизированную мокроту переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют при 3000 оборотов в минуту в течение 10-15 мин. Жидкость сливают в раствор хлорамина, осадок нейтрализуют 1-2 каплями 10% раствора НСl, из осадка приготовляют мазки, окрашивают по Цилю-Нильсену и микроскопируют.

Флотация. Мокроту переливают в колбу, прибавляют равный объем 1% раствора NaOH, закрывают резиновой пробкой и встряхивают в шюттель-аппарате до полного разжижения. Колбу помещают в водяную баню 55°С и нагревают в течение 30 мин. а затем добавляют 1-2 капли ксилола или бензина, встряхивают 10 мин, доливают дистиллированную воду до горлышка колбы и оставляют при комнатной температуре на 25-30 мин.

Углеводород всплывает на поверхность и увлекает адсорбированные микобактерии. Образуется тонкий слой углеводорода и возбудителей туберкулеза в горлышке колбы в виде сливкообразного кольца.

На хорошо нагретую водяную баню кладут обычное стекло 20х20 см и на нем раскладывают предметные стекла для мазков. Проволочной петлей в форме улитки берут материал флотационного кольца и наносят на предметные стекла, по мере подсыхания материала добавляют новую порцию взвеси. Наслоение материала по принципу толстой капли на одно и то же место делают 3-4 раза, каждую каплю подсушивают, прежде чем наносят следующую.

Готовые, хорошо высушенные препараты промывают эфиром (огнеопасно!), подсушивают, фиксируют, окрашивают и бактериоскопируют.

Исследование промывных вод бронхов или желудка выполняют после нейтрализации материала 1-2 мл 0.5% раствора NaOH.

Флотация повышает на 10% обнаружение микобактерии туберкулеза в патологическом материале.

Бактериоскопическим методом удается обнаружить возбудителя туберкулеза при содержании в 1 мл патологического материала более тысячи микобактерии.

Бактериологический метод

Все материалы для исследования бактериологическим методом, как правило, содержат постоянную микрофлору, что практически делает невозможным выделить микобактерии в чистой культуре без предварительной обработки материалов. Исключением из этого правила является стерильно взятая спинномозговая жидкость.

С целью уничтожения сопутствующей микрофлоры и гомогенизации мокроты, гноя и других материалов применяют 10% раствор серной кислоты или 10% раствор трехзамещенного фосфорнокислого натрия 1:1.

Жидкие материалы центрифугируют 30-40 мин, осадок обрабатывают серной кислотой в течение 20-30 мин, устанавливают рН среды в пределах 7,2-7,6 и высевают на среду Левенштейна - Йенсена и среду Финн-2. Засеянные среды инкубируют в термостате при температуре 37°С 3-4 недели. Пробирки со средами, в которые исследуемый материал вносили петлей и втирали в поверхность среды, размещают вертикально; в тех случаях, когда посевы делают пастеровской пипеткой, пробирки помещают в термостат в полугоризоптальном положении на 2-3 сут, а затем вертикально. Все пробки заливают расплавленным парафином или закрывают целлофановым колпачком и уплотняют резиновым кольцом.

Посевы просматривают раз в неделю. Все пробирки, в которых обнаружен рост посторонней микробной флоры, удаляют. Рост микобактерий туберкулеза обычно обнаруживается на 3-й неделе, но иногда через 2,5-3 мес.

Микобактерии туберкулеза формируют колонии на плотных питательных средах с характерными признаками. Они как правило, сухие, морщинистые, грубые (напоминают бородавки), обычно в R-форме. S-форма колоний с пигментацией желтого или оранжевого цвета при влажном росте свойственна другим микобактериям.

При учете результатов следует фиксировать обильность и сроки появления роста микобактерий. Эти показатели, определяемые в динамике, имеют эпидемиологическое и прогностическое значение.

Культуры микобактерий туберкулеза, выращенные на питательных средах, микроскопируют. В мазках, окрашенных по Цилю - Нильсену, образуются скопления кислотоустойчивых типичных микобактерий.

В молодых культурах, выделенных из организма больных, леченных антибактериальными препаратами, обнаруживают микроорганизмы с измененной формой (короткие палочки, неправильной формы шары).

В некоторых случаях исследуемый материал высевают на 3-4 пробирки жидкой питательной среды с плазмой крови донора или сывороткой крупного рогатого скота.

Результаты посева учитывают через 10 дней. Берут одну пробирку и стерилизуют, из осадка готовят мазки, фиксируют, окрашивают и микроскопируют. Отрицательный результат выдают только после инкубирования посевов в термостате в течение месяца. Посторонние микроорганизмы в таких питательных средах растут, размножаются в первые дни культивирования и вызывают помутнение жидкости.

Микобактерии, выращенные на жидкой питательной среде, пересевают в пробирки с плотной средой. В таких случаях положительные результаты возрастают, но продолжительность исследования увеличивается.

Микобактерии могут размножаться и образовывать микроколонии на стекле. Для этой цели готовят полоски обычного стекла 10 см длиной и 0,9-1 см шириной, моют, обезжиривают, сушат и стерилизуют.

Мокроту больного выливают в чашку Петри, выбирают гнойные комочки, наносят их на полоску стекла и растирают другой такой же полоской так, чтобы получились два мазка, занимающие 2/3 длины стекла. Стекла кладут на стерильную бумагу и подсушивают. Сухие мазки погружают на 15-20 мин в пробирки с 2% раствором серной кислоты, а затем 2-3 раза промывают дистиллированной водой и помещают в жидкую синтетическую или кровяную среду, в которую добавляют 10 ЕД/мл пенициллина. Мазок должен быть полностью покрыт питательной средой. Инкубируют в термостате при 37-38°С. Результаты учитываются на 1-й. 15-й и 30-й день. Каждый раз один такой мазок вынимают из пробирки, высушивают, фиксируют, окрашивают по Цилю - Нильсену или аурамином и микроскопируют. Положительными будут посевы, в которых на стекле выявляются микроскопические колонии в виде "жгутиков", "кос" и "пауков".

Определение лекарственной устойчивости
микобактерий туберкулеза

Лекарственную устойчивость микобактерий туберкулеза определяют с помощью бактериологических методов перед началом лечения, затем спустя 3 мес и далее при продолжающемся выделении бактерий туберкулеза через каждые б мес. Это делают путем выращивания микобактерий на питательных средах с различным содержанием препарата, к которому определяют устойчивость, и на тех же средах без добавления его (контроль).

Определение лекарственной устойчивости может быть: а) прямое - посев соответственно обработанного патологического материала (мокрота, гной и т.д.) на среды, содержащие лекарственные препараты; б) непрямое - пересев предварительно выделенных чистых культур микобактерий туберкулеза на среды, содержащие лекарственные препараты.

Прямой способ более эффективен, но им можно пользоваться, если микобактерии обнаруживаются в материале бактериоскопически и содержатся в значительном количестве (1-5 палочек в поле зрения). Наиболее распространенными методами определения лекарственной устойчивости являются:

1) культивирование на плотных яичных средах;

2) микрокультивирование на стеклах;

3) глубинные посевы на полусинтетические среды;.

Результаты исследования учитывают по истечении определенного срока выращивания, достаточного для получения обильного роста в контрольных пробирках.

В остальных пробирках в зависимости от концентрации препарата и степени устойчивости к нему данного штамма микобактерии туберкулеза рост может быть различной интенсивности или к этому времени отсутствовать.

Лекарственно чувствительные штаммы дают рост в пределах определенных концентраций, различных для каждого препарата.

Штаммы, которые дают рост при соответственно более высоком содержании препаратов, относят к лекарственно устойчивым. Устойчивость определяют по макроросту на плотных и по микроросту на жидких средах. Устойчивость данного штамма в целом выражается той максимальной концентрацией антибактериального препарата (количество микрограммов в 1 мл питательной среды), при которой еще наблюдается рост, приближающийся к росту в контроле.

В части случаев выявляется обильный типичный рост микобактерии в присутствии той или другой концентрации антибактериального препарата, а на среде, содержащей более высокие концентрации этого же препарата, рост может быть скудным в виде единичных макро- или микроколоний, что указывает на размножение только некоторых, более резистентных, особей данного штамма. В таких случаях отмечают как максимальную концентрацию препарата, при которой еще размножается основная устойчивая масса микробных особей, так и предельную - при скудном росте ("относительная устойчивость" см. таб.).