Тест для диагностики туберкулезной инфекции методом elispot

Универсальный альтернативный вариант иммунологического исследования in vitro диагностики туберкулезного процесса путем количественного определения мононуклеарных клеток периферической крови, продуцирующих ИФН-γ в ответ на присутствие белков CFP-10 и ESAT-6 M. tuberculosis.

Иммунологический тест на туберкулез

Синонимы английские

Testing for tuberculosis infection

Прямая оценка функции T-клеток энзим-связывающий иммуноспотингом (ELISPOT).

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Как правильно подготовиться к исследованию?

Не принимать пищу в течение 2-3 часов до исследования, можно пить чистую негазированную воду.

Общая информация об исследовании

Возбудителем туберкулёза является микобактерия туберкулеза (МБТ, палочка Коха, Mycobacterium tuberculosis) – высокоустойчивый микроорганизм. В настоящее время описано около 150 видов микобактерий, но клинически значимыми признаны М. tuberculosis (более 90 % всех случаев туберкулезной инфекции), М. bovis (5 %) и М. africanum (около 3 % – главным образом среди населения стран тропической Африки).

Источником инфекции являются больные люди и животные. Наиболее распространен воздушно-капельный путь заражения, при котором возбудитель проникает в организм через верхние дыхательные пути, иногда через слизистые оболочки пищеварительного тракта или через поврежденную кожу.

Попадая в окружающую среду, возбудитель способен длительно сохраняться: в высохшей мокроте он выживают до 10 месяцев, на предметах, окружающих больного (белье, книги), – более 3 месяцев, в воде – более года, в почве – до 6 месяцев.

В настоящее время описаны следующие варианты развития ситуации после проникновения МБТ в организм человека: [1]

полная элиминация (удаление) возбудителя из организма;
развитие первичного туберкулеза (при быстром росте и размножении МБТ);
инфицирование, или "латентная туберкулезная инфекция" (ЛТИ), [2] – состояние стойкого иммунного ответа на антигены МБТ при отсутствии клинических проявлений активной формы туберкулеза.

Присутствующий в организме возбудитель способен не только длительно бессимптомно персистировать в организме, но при определенных обстоятельствах (интенсивное размножение МБТ на фоне малоэффективного иммунитета и т.д.) реактивироваться и вызвать развитие заболевания. В настоящее время установлено, что с момента инфицирования МБТ в течение первого года заболевание развивается у 5 % инфицированных людей, в течение всей оставшейся жизни туберкулез развивается еще у 5 %, то есть пожизненный риск заболевания туберкулезом среди инфицированных составляет 10 %.

Вместе с тем наличие различных факторов может способствовать повышению риска развития локального туберкулеза: так, при ВИЧ-инфицировании ежегодный риск заболевания туберкулезом на фоне ЛТИ составляет 10 %, а пожизненный риск – 50 %.

Диагностика туберкулеза является комплексной и включает, согласно регламентирующим документам, [3] аллергические внутрикожные пробы (реакция Манту и "Диаскинтест"), инструментальное обследование (ФЛГ, рентген) и лабораторные – направленные как на выявление и идентификацию возбудителя с определением спектра его чувствительности к препаратам этиотропной терапии, так и на изучение выраженности иммунологической реакции на патоген.

Одним из современных и высокоинформативных методов определения специфической иммунной реакции на МБТ, особенно при отсутствии или минимальных клинико-инструментальных признаках инфекции и сомнительных результатах общепринятых методов лабораторной диагностики туберкулеза, является тест T-SPOT.

Исследование иммунного Т-клеточно-опосредованного ответа: количественное определение в крови эффекторных Т-клеток (CD4 и CD8), вырабатывающих ИФН-ɣ (гамма-интерферон), который продуцируется в ответ на стимуляцию специально подобранными антигенами ESAT-6 и CFP10. Эти белки входят в состав клинически значимых МБТ (М. tuberculosis, М. bovis, М. africanum) и отсутствуют у бактерий, используемых при производстве вакцины БЦЖ и у непатогенных для человека микобактерий.

Преимущества теста Т- SPOT:

высокая специфичность и чувствительность метода (87-97 %);
безопасность, отсутствие побочных реакций;
отсутствие ложноположительных результатов;
результат исследования не зависит от наличия вакцинации БЦЖ;
не имеет противопоказаний и ограничений по времени проведения;
позволяет диагностировать внелегочные формы туберкулеза;
позволяет диагностировать инфекцию у пациентов с ВИЧ и низкими показателями уровня CD4. [4]

Для чего используется исследование?

Диагностика туберкулезной инфекции.

Когда назначается исследование?

Пациентам, у которых в связи с основным заболеванием (эпилепсия, хронические заболевания в стадии обострения и др.) затруднено проведение внутрикожных тестов.
При наличии в анамнезе пациента токсико-аллергических реакций на туберкулин.
Детям, привитым БЦЖ, у которых выявлена ложноположительная реакция Манту, – до проведения инструментального обследования легких. [5]
По эпидемиологическим показаниям – пациентам, прибывшим из стран с высоким уровнем заболеваемости туберкулезом (Африка, Азия) и/или находившимся в контакте с лицами с диагностированным заболеванием.
Пациентам с аутоиммунными и др. заболеваниями (силикоз), ведущими к снижению системного иммунитета.
Пациентам, получающим системное лечение глюкокортикоидами или иммуносупрессивную терапию.
Онкологическим пациентам, получающим лучевую и химиотерапию.
Пациентам на диализе или готовящимся к трансплантации органов или переливанию крови.
ВИЧ-инфицированным, особенно со снижением количества СD4-клеток.
При подозрении на внелегочные формы туберкулеза.

[youtube.player]

Возбудителем такого опасного заболевания как туберкулез являются кислотоустойчивые микобактерии, которые характеризуются особой агрессивностью. Туберкулезная микобактерия может поддерживать жизнеспособность длительное время даже в неблагоприятных условиях (на поверхности предметов, в высушенной бронхиальной слизи, а также в почве).Вероятность развития заболевания как у взрослых, так и у детей достаточно высока. Это объясняется сниженной иммунной защитой организма и наличием сопутствующих заболеваний.

Основной способ передачи заболевания – воздушно-капельный. Инфицирование происходит даже при вдыхании незначительного количества возбудителей туберкулеза. Риск заражения существует также при контакте с инфицированными предметами и продуктами.

Симптомы туберкулеза

Необходимость проведения комплексного обследования организма возникает при наличии следующих симптомов:

Продолжительный кашель с выделением слизи с примесями крови (дольше 3 недель)
Болезненные ощущения за грудиной
Наличие субфебрильной температуры
Чрезмерная потливость (особенно ночью)
Вялость.

По данным многочисленных исследований приблизительно треть населения инфицирована туберкулезной микобактерией, но само заболевание протекает в латентной форме. Стоит отметить, что такие пациенты не заразны. Вероятность перехода заболевания в активную форму очень низок и составляет около 10%. Несмотря на это, лица со сниженной иммунной защитой (ВИЧ-инфицированные, больные сахарным диабетом, курящие, дети) подвергаются высокому риску возникновения данного недуга.

Методы диагностики

Зачастую при латентном туберкулезе рентген-снимок не определяет какие-либо изменения в легких. Основными методами диагностики такой формы ранее являлись именно кожные тесты (Диаскинтест или же пр. Манту). Но стоит отметить, что такие методы выявления туберкулезной инфекции имеют перечень противопоказаний:

Острое или хроническое течение инфекционных недугов
Соматические болезни во время обострения
Эпилепсия
Аллергия.

T-SPOT.TB – эффективный способ диагностики туберкулезной инфекции

T-SPOT.TB – иммунологический способ выявления туберкулеза, как у детей, так и у взрослых, рекомендованный Российским обществом фтизиатров.

Данный метод имеет сложную аббревиатуру и расшифровывается так:

Применение методики под названием Т-СПОТ в России утверждено с 2012 г.

Методика выявления носительства туберкулеза Т-СПОТ достаточно информативна. Применение теста пот помогает исключить ложнопозитивную реакцию на микобактерии туберкулеза даже в тех случаях, когда другие методы показывают ошибочный позитивный результат. Чувствительность теста T-SPOT.ТВ в различных странах оценивается на уровне 98%.

За счет чего T-SPOT является высокоинформативным тестом

T-SPOT.TB – это in vitro исследование, которое основано на определении производства лимфоцитами γ -интерферона под воздействием определенных антигенов (CFP-10, а также ESAT-6). Такой тест пот позволяет определить количество Т-клеток, которые отвечают на воздействие ESAT-6 и CFP10. Данные антигены не могут определяться в штаммах БЦЖ, а также у представителей нетуберкулезных микобактерий. Во время диагностики у инфицированных пациентов в крови выявляются Т-лимфоциты, которые распознают те или другие виды антигенов.

Благодаря этому T-SPOT.ТВ стал наиболее информативным способом диагностики как латентной, так и активной формы туберкулеза. Высокий показатель точности теста пот позволяет исключить проведение дополнительных анализов, а также вредных лечебных процедур.

Основные преимущества теста T-SPOT над кожными пробами

Такая диагностика имеет ряд преимуществ по сравнению с проводимыми ранее кожными пробами, а именно:

Специфичность
Повышенная восприимчивость
Полное отсутствие противопоказаний к дальнейшему проведению
Безвредность
Отсутствие временных ограничений в проведении
Не показывает ложноположительный результат при БЦЖ
Быстрое получение результатов исследования.

Когда лучше применять метод Т-СПОТ

Применение теста пот для диагностики туберкулеза рекомендуется данной группе пациентов:

Детям при имеющихся противопоказаниях к осуществлению кожных проб на туберкулез (аллергия, кожные болезни, острое или хроническое течение недугов, эпилепсия)
Детям при токсико-аллергической реакции на вещество туберкулин
Дошкольникам или школьникам, которые привиты БЦЖ при ложноположительной реакции на Манту
Лицам, которые находились в странах с повышенным показателем инфицирования туберкулезной микобактерией (к примеру, Африка и Азия)
Беременным при контакте с инфицированными туберкулезом пациентами или же при наличии характерных признаков болезни
Лицам, контактирующим с пациентами, у которых диагностирован туберкулез
ВИЧ-инфицированным
Лицам, у которых подозревается внелегочная форма заболевания
Дошкольникам или школьникам, родители которых отказались от проведения кожных тестов
Лицам, получавшим терапию антителами против ФНО.

Расшифровка анализа Т-СПОТ.ТБ

Результаты проводимого иммунологического исследования могут показать три варианта ответа:

Негативный – пациент не инфицирован туберкулезной микобактерией
Позитивный – пациент инфицирован туберкулезом
Сомнительный – требуется повторное проведение теста или же дополнительная диагностика (к примеру, антитела к туберкулезу, ПЦР).

О результатах теста Т-СПОТ лучше всего узнать на приеме у фтизиатра, он подробно расскажет пациенту о проводимом исследовании и дальнейших действиях.

[youtube.player]

Т-СПОТ.ТБ (T-SPOT® ТВ)

Набор реагентов для in vitro диагностики туберкулезной инфекции

Т-СПОТ.ТБ (Т-SPOT®.ТВ) является тестом для in vitro диагностики туберкулеза путем выявления эффекторных Т клеток, реагирующих на стимуляцию антигеном Mycobacterium tuberculosis, предназначенным в качестве дополнительного средства диагностики туберкулезной инфекции.

Иммунный ответ на инфицирование М. tuberculosis является преимущественно клеточно-опосредованным. В процессе этого ответа, Т клетки сенсибилизируются к антигенам М. tuberculosis. Активированные эффекторные Т клетки, CD4 и CD8, выделенные из крови, могут быть подсчитаны благодаря способности стимулироваться этими антигенами in vitro 1,2. Применение специально подобранных антигенов ESAT-6 и CFP10, входящих в состав микобактерий комплекса М. tuberculosis (М tuberculosis, М bovis, М africanum), повышает эффективность и специфичность теста, так как эти антигены отсутствуют в БЦЖ и во многих других не вирулентных для человека микобактериях, находящихся в окружающей среде3,4

Т-СПОТ.ТБ (Т-SPOT®. ТВ) является упрощенным вариантом иммуноферментного метода ELISPOT, в котором цитокины связываются буквально рядом с секретирующими их клетками, до растворения в супернатанте и до захвата рецепторами соседних клеток или разрушения. Поэтому анализ ELISPOT значительно более чувствителен, чем традиционно применяемый метод ИФА 5. Т-СПОТ.ТБ (T-SPOT®.TB) предназначен для выявления эффекторных Т клеток, которые отвечают на стимуляцию специфическим антигеном М. tuberculosis3,4,6'9, и позволяет подсчитать отдельные активированные ТБ-специфичные Т клетки. Данный анализ может быть применен для всех пациентов, находящихся в группе риска по латентной туберкулезной инфекции, а также для лиц с подозрением на туберкулез10,11 вне зависимости от их возраста, пола, иммунного статуса, терапии.

Путем исследования 93 образцов от доноров с установленным по истории болезни и личной информации низким риском инфицирования М tuberculosis оценивали специфичность. Рассчитанная специфичность T-SPOT.ТB (93 отрицательных из 93) составила 100% (95%

доверительные интервалы 95.8% - 100%).

Путем исследования 87 образцов культурально подтвержденных случаев заражения М. tuberculosis, включая группы с иммунной недостаточностью оценивали чувствительность. Рассчитанная чувствительность T-SPOT.ТВ (86 положительных из 87) составляет 98.8% (95% доверительные интервалы 90.8% - 99.9%).

Специфичность оценивалась путем исследования 15 образцов у здоровых туберкулинотрицательных детей. Специфичность теста составила 100 %.

Чувствительность оценивалась при исследовании 15 образцов у пациентов, страдающих туберкулезом легких. Чувствительность теста составила 93,3 %.

Мононуклеары периферической крови (МНПК) выделяют из образцов цельной крови и промывают, с целью удаления любых источников фонового сигнала, мешающего учету. Затем МНПК подсчитывают с тем, чтобы в анализируемый образец добавить стандартное количество клеток. Подсчет служит гарантией того, что даже для анализа образцов крови лиц с низкими содержанием Т клеток вследствие ослабления иммунной системы (иммунная недостаточность и иммуносупрессия) в лунки планшета будет добавлено соответсвующее количество клеток. Стадии промывания и подсчета клеток обеспечивают наилучшие условия для выявления больных и инфицированных туберкулезной инфекцией.

Краткая схема тестирования представлена на рис. 1:

МНПК инкубируют с антигеном для стимуляции имеющихся сенсибилизированных Т клеток. Секретированные этими клетками цитокины связываются и удерживаются специфическими антителами, находящимися на поверхности мембраны, выстилающей лунку, остальные клетки удаляются при промывании. Затем специфические антитела, конъюгированные со щелочной фосфатазой и нацеленные на различные эпитопы молекулы цитокина, добавляются для связывания с цитокином, удерживаемым на поверхности мембраны планшета. Несвязанный конъюгат удаляется при промывании. В каждую лунку добавляется раствор субстрата; он расщепляется связанным ферментом и образует пятно нерастворимого преципитата в месте реакции. Каждое пятно является отпечатком одной интерферон гамма-секретирующей Т клетки, а оценка количества полученных пятен является количественной характеристикой содержания сенсибилизированных микобактериями туберкулеза эффекторных Т клеток в периферической крови.

Микротитровальный планшет (в рамке 12 стрипов по 8 лунок в каждом), на котором сорбированы мышиные поликлональные антитела к цитокину - интеферону гамма человека (IFN-y);
Антиген А: антиген ESAT-6, бычий сывороточный альбумин (БСА), антимикробные средства;
Антиген В: антиген CFP10, БСА, антимикробные средства;
Положительный контрольный образец (положительный контроль): фитогемагглютинин (ФГА) для контроля функциональных свойств клеток 15 мкг/мл, БСА, антимикробные средства;
Конъюгированный реагент (коньюгат): мышиные моноклональные антитела к цитокину IFN-y, конъюгированные со щелочной фосфатазой;
Раствор субстрата: раствор BCIP/NBTplus (BCIP: 5-Бромо-4-хлоро-3- индол-фосфат, NBT: нитро-тетразолиум синий).

Набор предназначен:

Только для диагностики in vitro.
Только для профессионального применения.
Закрытый набор реагентов следует хранить при температуре от 2 до 8 °С. После истечения срока годности, обозначенного на этикетке, набор не пригоден для дальнейшего использования.
Вскрытый набор реагентов допускается хранить при температуре от 2 до 8 °С в течение 8 недель после вскрытия, но не более срока годности набора.
Запрещается смешивать компоненты из разных наборов.
Перед использованием необходимо внимательно прочитать приложенную инструкцию.
Следует соблюдать правила препятствующие загрязнению реагентов, лунок планшета, клеточных суспензий и клеточной среды.
Следует избегать изменений рекомендованной техники пипетирования и отмывки, времени инкубации и/или температуры, т.к. они могут повлиять на полученные результаты.
Кровь у обследуемого лица должна забираться не более, чем за 8 ч до начала исследования.
Хранение и транспортирование образцов крови в лабораторию производится при температуре от 18 до 25 °С. Образцы цельной крови нельзя ни охлаждать, ни замораживать.
Т-СПОТ.ТБ (Т-SPOT®.ТВ) следует применять и интерпретировать только совместно с общей клинической картиной.
Негативный результат теста не исключает возможности инфицирования М. tuberculosis.
Антигены ESAT-6 и CFP10 отсутствуют в штаммах БЦЖ и у большинства микобактерий, циркулирующих в окружающей среде, за исключением М kansasii, М szulgai и М. marinum3,4 и М. gordonae.

Предупреждения и меры предосторожности

При работе с материалом, полученным от людей, необходимо соблюдать меры предосторожности. Все образцы крови должны считаться потенциально инфицированными.

Работа с образцами крови и компонентами исследования, их использование, хранение и уничтожение должны производиться в соответствии с процедурами, описанными в соответствующих Санитарно-эпидемиологических правилах, как СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)" и др.

Следует соблюдать осторожность при работе с химическими реактивами. Все реактивы должны считаться потенциально опасными.

Необходимые материалы и оборудование, которые не входят в набор:

Бессывороточную питательную среду рекомендуется предварительно разлить в условиях асептики в отдельные флаконы вместимостью 50 мл. На все флаконы наклеивают этикетки на которых указывают: дату розлива, срок годности, название среды, номер серии. Хранят при температуре от 2 до 8 °С.

Перед использованием флакон с питательной средой выдерживают в термостате при 37 °С в течение 10 мин.

Микротитровальный планшет (в рамке 12 стрипов по 8 лунок в каждом), на котором сорбированы мышиные поликлональные антитела к цитокину - интеферону гамма человека (IFN-y) - поставляется готовым к употреблению. Извлекают необходимое количество 8-луночных стрипов и оставляют согреться до комнатной температуры. Оставшиеся стрипы упаковывают в наружную упаковку из фольги вместе с имеющимся в ней осушителем и помещают в холодильник.
Антиген М tuberculosis ESAT-6 (антиген А) готов к употреблению.
Антиген М. tuberculosis CFP10 (антиген В) готов к употреблению.
Положительный контрольный образец готов к употреблению.
Непосредственно перед началом анализа готовят рабочий раствор конъюгированного реагента 1:200. Для этого рассчитывают требуемый объем рабочего раствора конъюгированного реагента.
Раствор субстрата поставляется готовым к употреблению. Не менее чем за 30 мин до начала контроля раствор субстрата доводят до температуры от 15 до 25 °С.

Исследование должно проводиться в соответствии с принципами Надлежащей лабораторной практики (GLP) и в строгом соответствии с данной инструкцией по применению.

Необходимо контролировать правильность процедуры сбора МНПК, подсчета МНПК и выбор подходящей среды для поддержания функциональных свойств Т клеток на этапе первичной инкубации. Обычно, для имункомпетентного пациента, достаточное для проведения исследования количество МНПК может быть получено из образца венозной крови при соблюдении следующих правил:

Взрослые и дети в возрасте 10 лет и старше: одна пробирка 8 мл или две пробирки по 4 мл
Дети в возрасте 2-9 лет: одна пробирка 4 мл
Дети в возрасте до 2 лет: одна пробирка 2 мл

При использовании пробирок Vacutainer® СРТ™, пробирки с объемом 8 мл центрифугируют при 1600g в течение 28 мин, пробирки с объем 4 мл - при 1800g в течение ЗО мин при температуре от 18 до 25 °С.

При использовании других видов пробирок для забора крови перед центрифугированием необходимо предварительное разведение крови. Для этого в пробирку вместимостью 15 мл помещают 5 мл питательной среды RPMI 1640 и 5 мл крови. Перемешивают однократным переворачиванием.

Затем в центрифужную пробирку вместимостью 15 мл помещают 5 мл среды для выделения МНПК (Фиколл) и осторожно наслаивают разведенную кровь. Центрифугируют при 1000g (2200 об/мин) при температуре от 18 до 25 °С в течение 22 мин.

С помощью пипетки отбирают белый мутный слой МНПК и переносят в конические центрифужные пробирки вместимостью 15 мл. Доводят объем с помощью питательной среды RPMI 1640 до 10 мл.

Центрифугируют при 600g (1700 об/мин) в течение 7 мин. Затем удаляют супернатант и ресуспендируют осадок в 1 мл питательной среды RPMI 1640.

Доводят объем до 10 мл питательной средой RPMI 1640 и центрифугируют при 350g (1300 об/мин) в течение 7 мин.

Сливают супернатант и ресуспендируют осадок в 0,7 мл бессывороточной питательной среды AIM-V или среды 199.

Для анализа одного образца необходимо в каждую лунку внести по 2.5x105 МНПК. Использование недостаточного или избыточного количества клеток может привести к неправильной интерпретации результатов.

Перед отбором клеточной суспензии для анализа, разведения или подсчета клеточную суспензию следует аккуратно перемешать. В противном случае клетки могут осесть на дно пробирки, что приводит к неправильному подсчету клеток. При использовании счетной камеры, действуют в соответствии с инструкцией по применению для камеры. При использовании автоматизированного гематологического анализатора для диагностического тестирования цельной крови in vitro (COBAS MICROS ОТ) для расчета используют следующую формулу:

X — количество лейкоцитов, полученное на анализаторе

Y - количество клеточной суспензии, которую необходимо отобрать из пробирки, мкл.

Готовят 500 мкл конечной клеточной суспензии с концентрацией 2.5x10 клеток /100 мкл, для каждого исследуемого образца, используя формулу

Z - количество питательной среды, мкл Например:

При анализе получено значение содержания лейкоцитов Х= 7,0 х 103/мм3,

Z = 500 мкл -180 мкл =320 мкл.

Соответственно, необходимо отобрать 180 мкл клеточной суспензии и добавить 320 мкл питательной среды AIM-V.

Необходимо приготовить 500 мкл клеточной суспензии с концентрацией 2.5x105 клеток /100 мкл

Извлекают из упаковки необходимое количество 8-луночных стрипов, закрепляют в рамке и оставляют при комнатной температуре не менее, чем на 30 мин. Оставшиеся стрипы следует убрать в холодильник. Рамки, подложки и крышки следует сохранять и использовать повторно.

Образцы на планшете рекомендуется располагать вертикально, как показано на рисунке ниже.

В лунки нулевого контроля, соответствующие буквам А и Е на планшете, добавляют по 50 мкл бессывороточной питательной среды AIM-V или среды 199.

В лунки антигена А, соответствующие буквам В и F на планшете, добавляют по 50 мкл раствора антигена А.

В лунки антигена В, соответствующие буквам С и J на планшете, добавляют по 50 мкл раствора антигена В.

В лунки положительного контрольного образца, соответствующие буквам D и Н на планшете, добавляют по 50 мкл раствора положительного контрольного образца.

Не следует касаться мембраны наконечником пипетки, т.к. это ведет к образованию вмятин, что может привести к получению ложных результатов в лунках.

Чтобы мембраны в основании каждой лунки были покрыты раствором, требуется слегка постучать по планшету. Однако интенсивного перемешивания следует избегать, с тем, чтобы избежать или минимизировать попадание антигена в соседние лунки.

Используя новый наконечник, в каждую из четырех лунок, предназначенных для одного образца крови, добавляют по 100 мкл конечной клеточной суспензии, приготовленной как указано выше. Перед очередным забором клеточной суспензии ее перемешивают путем осторожного однократного пипетирования.

Планшет инкубируют в инкубаторе с влажной камерой при 37 °С в атмосфере 5 % С02 в течение 16-20 ч. Следует избегать встряхивания планшета. Несоблюдение рекомендованного времени инкубации может привести к получению неправильных результатов.

Извлекают планшет из инкубатора и удаляют клеточную среду путем переворачивания планшета.

Промывают каждую лунку с помощью пипетки 4 раза, добавляя по 200 мкл ФСБ. Удаляют раствор ФСБ путем переворачивания планшета на фильтровальную бумагу.

Для получения рабочего раствора конъюгированного реагента разводят концентрированный раствор в 200 раз с помощью ФСБ, который не должен содержать полисорбат 80 или другие детергенты, поскольку они повышают фоновый уровень.

Следует приготовить количество рабочего раствора, немного превышающее необходимое (на случай непроизводственных потерь). Например, на 8-луночный стрип (на каждую лунку требуется 50 мкл), рекомендуется приготовить 500 мкл рабочего раствора, добавив 2,05 мкл концентрированного конъюгированного реагента к 497,5 мкл ФСБ.

Добавляют 50 мкл рабочего раствора конъюгированного реагента в каждую лунку и инкубируют при температуре от 2 до 8 °С в течение 1 ч.

Удаляют конъюгат и четырежды промывают планшет раствором ФСБ как описано выше.

Не менее чем за 30 мин до начала исследования раствор субстрата доводят до температуры от 15 до 25 °С. В каждую лунку добавляют по 50 мкл раствора субстрата, и инкубируют планшет в течение 7 мин при комнатной температуре.

Чтобы остановить реакцию тщательно промывают планшет дистиллированной водой.

Помещают планшет на 4 ч в термостат с температурой 37 °С или оставляют в течение ночи при комнатной температуре.

Подсчитывают и записывают количество отчетливо видных темносиних пятен на мембране каждой лунки.

Перед применением нижеприведенных критериев, обратитесь к разделу контроля качества постановки теста.

Критерии:

В лунке с положительным контрольным образом должно быть 20 или более пятен.

В лунках нулевого контроля пятна, как правило, должны отсутствовать.

При оценке результатов следует учитывать, что в нулевом контроле допускается наличие пятен, при этом:

а) Если в нулевом контроле содержится от 1 до 5 пятен, то для определения количества пятен в лунках с антигенами, необходимо вычесть из числа пятен в лунке с антигеном А и с антигеном В число пятен в нулевом контроле.

б) Если в нулевом контроле содержится от 6 до 10 пятен, то для определения количества пятен в лунках с антигенами необходимо вычесть из числа пятен в лунке с антигеном А и с антигеном В, двукратное число пятен в нулевом контроле.

ТБ-отрицательный результат:

В результате анализа (см. п. Критерии) количество пятен в лунке антигена Айв лунке антигена В должно быть не более 5 с учетом числа пятен в нулевом контроле (см. п. Критерии, а) и б).

ТБ-положительный результат:

В результате анализа количество пятен в лунке с антигеном Айв лунке с антигеном В должно быть от 8 до 100 с учетом числа пятен в нулевом контроле (см. п. Критерии, а) и б). Если пятен много, то их число можно не подсчитывать, указав в протоколе, что их более 20. Так как растворы антигена А и антигена В имеют разный состав, то образцы крови больных туберкулезом могут реагировать как на один из антигенов, так и на оба антигена.

Серая зона

При проведении исследования может иметь место серая зона включающая 5-7 пятен в лунках с антигеном А или В (с учетом числа пятен в нулевом контроле (см. п. Критерии, а) и б). В таком случае необходимо повторить исследование.

Типичным ожидаемым результатом является следующий: отсутствие или несколько пятен в нулевом контроле и более 20 пятен в положительном контроле.

Обычно в положительном контроле функционального состояния клеток наблюдается количество пятен > 20 или перенасыщение (слишком много пятен, чтобы их сосчитать). У небольшого процента пациентов могут быть Т клетки, которые демонстрируют лишь

[youtube.player]

T-Spot – тест на туберкулез, который является одним из методов диагностики заболевания, альтернативой пробам Манту. Заключается в иммунологическом исследовании крови, сложный и дорогостоящий. Данный тест покажет, насколько человек подвержен заболеванию туберкулезом.

Показания и противопоказания

Показано проведение T-Spot tb теста:

Детям (дошкольники и школьники) с противопоказаниями к кожным пробам, аллергией на туберкулин. Также если недавно проводилась вакцинация БЦЖ или была выявлена ложноположительная проба Манту.
Больным с хроническими патологиями, ослабляющими иммунитет (пневмокониоз, сахарный диабет).
Пациентам, которым проводится лечение методами, угнетающими иммунитет (глюкокортикоиды, лучевая терапия и др.).
Наркозависимым.
Людям после контакта с зараженными, или вернувшимся из стран, где отмечается неблагополучная эпидобстановка по туберкулезу.
Лицам в тюремном заключении или после недавнего освобождения, не имеющим места жительства.
Пациентам с ВИЧ-инфекцией.

При лечении лекарственными препаратами можно проводить тест. Допустимые сочетания: с антибиотиками, стероидными препаратами, лучевой терапией.

Противопоказаний к исследованию нет, такой способ не представляет опасности, побочные эффекты или осложнения после его проведения отсутствуют.

Наличие вирусной или бактериологической инфекции является относительным противопоказанием, т. к. будет затруднено исследование. Также не рекомендуется производить забор крови для анализа у пациентов, страдающих тяжелой анемией.

Преимущества и недостатки

Отличие данного анализа от других тестов, проводимых подкожно, заключается в получении результатов. Исследование проводят в пробирке, поэтому на результат не оказывают влияния вакцина БЦЖ у пациента или наличие аллергических реакций.

Главные преимущества исследования в сравнении с проведением других проб:

Высокая точность (у здоровых людей ложноположительный результат отсутствует в 97%).
Безопасен, крайне редко возникают нежелательные эффекты или осложнения.
Можно применять для диагностики туберкулеза у ВИЧ-инфицированных пациентов или людей, страдающих аллергическими реакциями.
Противопоказания почти отсутствуют.
Позволяет выявить как легочный туберкулез, так и внелегочные формы.
Нет временных ограничений для проведения исследования.
Вакцинация БЦЖ не влияет на результаты анализа.

Т-спот тест на туберкулез пока не получил широкого распространения, он не может полностью заменить стандартные пробы по следующим причинам:

отсутствует 100% гарантия точного результата;
тест-пот недоступен по полису ОМС;
исследование дорогостоящее;
эффективность и информативность остаются невысокими;
не все медицинские учреждения проводят исследование (не во всех городах имеются лаборатории);
нет возможности обнаружить инфицирование, если оно произошло недавно, или определить степень активности заболевания;
эффективность диагностики туберкулезной инфекции с помощью данной методики (90%) ниже, чем у диаскинтеста, показавшего 98%.

Поэтому тиспот не может заменить другие пробы, хотя подходит в качестве альтернативы.

Подготовка к тесту

Специальной подготовки к проведению исследования не требуется. Сдают кровь утром. Запрещено в течение суток курить, употреблять алкогольные напитки. Может потребоваться отменить на время прием некоторых медикаментозных средств (после согласования с доктором).

Для тестирования требуется согласие пациента (если ему 18 лет и больше) или письменное разрешение законных представителей (для детей).

В лаборатории делают забор венозной крови (натощак, лучше в утренние часы). На количество крови влияет возраст (дети младше 2 лет – 2 мл, 2-9 лет – 4 мл, старше 10 лет – 8 мл).

Затем на Т-лимфоциты воздействуют антигенами туберкулеза. Начинается активная выработка Т-лимфоцитами гамма-интерферона. Результат тест-пота влияет на количество выделившегося интерферона, действие его и Т-лимфоцитов.

Возможные результаты

Результаты Т-Спот теста будут готовы через 3-4 дня. Может быть 3 варианта:

Положительный – свидетельствует о том, что пациент инфицирован. Найдены антитела, число спотов 8-100. Такие значения свидетельствуют о контакте организма с палочкой туберкулеза.
Отрицательный – показывает отсутствие инфицирования. Не обнаружены антитела, число спотов не превышает 5. Такой итог является основанием для выдачи фтизиатром справки о состоянии здоровья. Осмотр требуется, чтобы опровергнуть вероятность снижения реакции Т-лимфоцитов. Такие данные свидетельствуют о сниженной реактивности Т-лимфоцитов, возникающей в результате ослабления защитных свойств организма.
Сомнительный – результат неясный, количество спотов больше 5-7. Иногда это свидетельствует о начале заболевания. Требуется проведение повторной или дополнительной диагностики.

На основании положительных результатов заболевание не диагностируют, назначают проведение дополнительного обследования:

анализ мокроты;
рентгенологическое исследование;
ИФА;
КТ;
ПЦР и др.

Где сделать и сколько стоит

Цена теста Т-Спот высокая, может отличаться в разных регионах и зависит от уровня медучреждения. Пока о данном тесте знают не все, сделать его можно лишь в отдельных научно-медицинских учреждениях.

Стоимость исследования составляет 5700-6800 руб., на услугу в частных медцентрах влияют расходы, связанные с транспортировкой биоматериала к месту анализа (такие исследования в частных медицинских центрах не проводятся).

Выбор места тестирования следует обсудить с лечащим врачом. В отличие от гемотеста данное исследование доступно лишь в нескольких туберкулезных центрах, расположенных в следующих городах:

Иногда можно сдать кровь в своем городе, затем ее отправляют в другой город для тестирования.

[youtube.player]

Читайте также: