Лабораторная диагностика пневмококковой инфекции

Материал	Метод исследования	Результат
Мокрота, отделяемое носоглотки, экссудат, гной	1. Микроскопический 2. Бактериологический посев на 5% кровяной агар А. Микроскопия мазков из колонии Б. Выделение чистой культуры 3. Биологический - заражение белых мышей А. Мазки-отпечатки, окраска по Граму Б. Взятие экссудата и постановка реакции агглютинации с типоспепифическими сыворотками	Гр + кокки Рост мелких, нежных, окруженные зеленоватой зоной и небольшим гемолизом Гр + кокки Гр + кокки + PA

Видовая идентификация пневмококков

Дифференциально-диагностические признаки пневмококков

И зеленящих стрептококков

Вид	Ферментация инулина	Признак растворяющее действие 10-40% раствора желчи	Ингибирующее действие оптохина 1:500 000
Пневмококки Стрептококки	+ –	+ –	+ –

Оптохиновый тест

Чистую культуру засевают на агар, содержащий 1:50000-1:100000 оптохина. На следующие сутки учитывают результат. Пневмококки не растут в присутствии оптохина. Можно использовать бумажные диски 6 мкг оптохина, которые накладываются после посева на поверхность среды (посев лучше производить секторами). У пневмококков вокруг диска образуется зона задержки роста не менее 5 мм.

Тест с желчью

Основан на способности 10% желчи и 2% раствора оксидолатов лизировать пневмококк.

Вопросы для обсуждения

1. Морфология, тинкториальные и культуральные свойства пневмококков.

2. Заболевания человека, вызываемые пневмококками.

3. Антигенная структура пневмококков.

4. Лабораторная диагностика пневмококковых заболеваний.

5. Специфическая профилактика пневмококковых инфекций.

Самостоятельная работа студентов

1. Познакомиться со схемой исследования при пневмококковых инфекциях.

2. Микробиологический диагноз пневмококковых инфекций:

а. изучить демонстрационный препарат из чистой культуры пневмококка, зарисовать;

б. изучить рост пневмококка на кровяном агаре и МПБ;

в. сделать посев мокроты на чашку с кровяным МПА;

г. приготовить мазок из мокроты, окрасить его по Граму, зарисовать;

д. определить чувствительность к антибиотикам по демонстрационным посевам.

Схема микробиологических исследований

При пневмококковых инфекциях

Материал	Метод исследования	Результат
Мокрота, гной, эксудат из плевраль-ной полости, слизь из гортани, носоглот-ки	1. Микроскопический 2. Бактериологический посев на 5% кровяной агар А. Микроскопия мазков из колоний Б. Выделение чистой культуры 1. Микроскопический Культуралъное определение 2. Биохимическая активность тест с желчью ферментация глюкозы, сахарозы инулина 3. Биологический А. Заражение белых мышей с последующим вскрытием и приготовлением мазков-отпечатков. Б. Реакция агглютинации 4. Серологический Определение типа пневмококка в РА с противопневмококковыми сыворотками	Гр+ кокки Мелкие, округлые, кусочные колонии с гемолизом Гр+ кокки Гр+ кокки Гемолитические колонии + Ферментация до кислоты, без образования газа Гр+ кокки +РА +РА

Заключение: в материале обнаружен S. pneumoniae.

Менингококковые инфекции

Цель занятия: выработать навыки лабораторного анализа менингококковых инфекций.

Задачи:

1. Изучить биологические свойства возбудителя менингококковых инфекций.

2. Знать патогенетические факторы микроорганизмов.

3. Освоить методы лабораторной диагностики.

· интерпретировать полученные результаты лабораторной диагностики менингококковых заболеваний;

· оценить результаты антибиотикограммы и факторов персистенции;

· подобрать препараты для профилактики и лечения заболеваний.

Семейство Neisseriaceae объединяет группу аэробных парных кокков и парных палочек, семейство включает 4 рода: Neisseria, Moraxella, Branhamella, Acinetobacter.

В род нейссерия включено 6 видов, которые выделяются от человека: патогенные виды N. meningitidis, N. gonorrhaeae и непатогенные N. mucosa, N. sicea, N. subflava, N. flavescens. Непатогенные нейссерии являются кoмвeнcaлaми. У ослабленных больных признана их роль в развитии менингитов, эндокардитов, сепсиса, пневмоний, отитов и синуситов, бронхиальной астмы.

Раздел	Вопросы для изучения
Биология возбудителя	1. Таксономия Возбудитель менингококковых инфекций относится к семейству Neisseriaceae, роду Neisseria, включающему 6 видов. 2. Основные биологические свойства: Морфологические – бобовидные клетки диаметром 0,6-0,8 мкм, располагающиеся парами или тетрадами, нередко внутри лейкоцитов – незавершенный фагоцитоз. Спор не образуют, способны образовывать капсулу. Тинкториальные – грамотрицательные клетки. Культуральные: строгие аэробы. Температурный oптимyм –37 0 C, оптимальная реакция среда pH = 7,2-7,4. На обычных питательных средах не растут, для роста необходимо добавление сыворотки. Колонии на плотных питательных средах нежные, прозрачные, размером 2-3 мм. На сывороточном бульоне образуют помутнение и небольшой осадок на дне. Биохимические свойства. Ферментируют глюкозу, мальтозу с образованием кислоты без газа. Не разжижают желатин, оксидазоположительны. Патогенность 1. Факторы адгезии и колонизации: пили, белки наружной мембраны, капсула, которая является главным фактором патогенности менингококков. 2. Токсины и ферменты агрессии, гиалуронидаза, нейраминидаза, протеазы, плазмокоагулаза, фибринолизин, гемолизин, антилизоцимная активность. Антигенные свойства: У менингококков имеются 4 антигенные системы: 1. Капсульные полисахаридные антигены; 2. Белковые антигены наружной мембраны; 3. Белковый антиген, общий для всего рода; 4. Липополисахаридный антиген, включающий 8 серотипов. В соответствии с этим антигенная формула менингококков имеет следующий вид: серогруппа: серотип по белку: субтип по белку: серотип по ЛПС.
Эпидемиология	Источником инфекции может быть только человек: больной, реконвалесцент или бактерионоситель. Распространение инфекции происходит воздушно-капельным путем.
Патогенез	Входными воротами инфекции является носоглотка, откуда менингококкоки проникают в лимфатические сосуды и кровь, развивается бактериемия. Затем микроорганизмы внедряются в мозговые оболочки. Менингококки могут вызывать следующие формы болезни: нозофарингит, менингококцемия (менингококковый сепсис), эпидемический цереброспинальный менингит (гнойное воспаление мозговых оболочек головного и спинного мозга)
Постинфекци-онный иммунитет	После перенесенной болезни формируется прочный длительный антимикробный иммунитет против всех серогрупп менингококков. Видоспецифический.

Этиотропная терапия менингококковой инфекции проводится сульфа-ниламидами или пенициллином G, а у людей с аллергией к пенициллину - хлорамфениколом.

Если быстрые методы диагностики не позволяют предварительно идентифицировать возбудителя или по каким-либо причинам происходит задержка с выполнением люмбальной пункции, то антибактериальная терапия назначается эмпирически, не позднее 2-3 часов с момента установления диагноза. Выбор антибиотиков в данной ситуации диктуется необходимостью перекрыть весь спектр возможных возбудителей.

Специфическая профилактикапроводится по эпидемиологическим показаниям или военнослужащим – химической менингококковой вакциной, содержащей полисахаридные антигены серогрупп А и С (активный антимикробный иммунитет), или человеческим нормальным иммуноглобулином (пассивный антимикробный иммунитет).

ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Методы изучения нормальной микрофлоры

Для изучения нормальной микрофлоры применяют два метода; бактериоскопический и бактериологический.

Бактериоскопический метод. Имеет большое самостоятельное значение для тех биотопов организма человека, в которых обитает большое количество различных видов микроорганизмов (полость рта. кишечник, вагина). Он позволяет получить общее представление о составе микрофлоры (преобладание грам/+ или грам/- бактерий той или иной формы - кокки, диплококки, стрептококки, палочки, бациллы, стрептобациллы, фузиформные бактерии, наличие грибов и т.д.), а также выявить те микроорганизмы, которые не удается культивировать на питательных средах. Бактериологический метод. Применяют для биотопов с широким спектром микроорганизмов (полость рта, кишечник, вагина), выполняют с учетом данных бактериоскопии.

Основные принципы бактериологического исследования:

а) использование качественной (видовой состав) и количественной

(количественное соотношение разных видов) оценки микрофлоры; 6) первичный посев материала без предварительного обогащения, так как

обогащение нарушает количественные соотношения видов; в) использование большого набора различных питательных сред, подбор

условий культивирования (аэробные, анаэробные, атмосфера СО₂ и т.д.). Методы взятия материала для исследования:

1. Получение естественных экскретов <слюна, моча и т.д.).

2. Метод реплик; а) отпечатки на поверхности агаровой среды, б) отпечатки марлево-агаровыми пластинами.

3. Метод смывов увлажненным тампоном.

4. Аспирационный метод (из межзубных пространств, гингивальных карманов, из верхних и средних отделов дыхательных путей, аспирация на фильтры).

5. Введение зондов в кишечник.

6. Метод аппликаций - снятие микроорганизмов с помощью бумажных или тканевых пластинок определенной площади.

Пневмококк (Streptococcus pneumoniae) - грамположительный ланцетовидный диплококк, имеет полисахаридную капсулу. Культивируется на средах с белком при рН 7,6 (5% кровяной агар), образует мелкие (средние) уплощенные колонии с а-гемолизом. Лучше растет при насыщении воздуха СО . По типу К-антигена имеет 84 варианта. Чувствителен к химическим и физическим факторам, в частности, к солям желчи (лизис), оптохину, NaCI. К факторам патогенности пневмококка относят капсулу, гиалуронидазу, нейраминидазу, экзопротеазу IgA, О-пневмолизин, лейкоцидин. Патогенен для белых мышей. Пневмококк вызывает острые и хронические заболевания дыхательного тракта (гайморит, бронхит, пневмония), менингит, сепсис, гнойно-воспалительные заболевания, ползучую язву роговицы. Материал для диагностического исследования берут в зависимости от формы пневмококковой инфекции: например, при пневмонии- мокроту, при сепсисе -кровь, при гнойном заболевании-гной, при отите - отделяемое из слухового прохода и т.д. Материал важно забрать до начала этиотропного лечения.

Для обнаружения антител исследуют сыворотку крови.

С целью лабораторной диагностики применяют следующие методы.

I. Экспресс-методы (обнаружение возбудителя в патологическом материале):

1. Микроскопическое исследование- мазок из патологического материала с окраской по Граму. Обнаружение грамположительных капсульных диплококков.

2. Определение антигена капсулы в реакции "Набухание капсулы" (по Нейфельду - феномен увеличения размеров капсулы в присутствии поливалентной противокапсульной сыворотки). Последняя наносится на мазок исследуемого материала; учет с помощью фазовоконтрастного микроскопа.

3. Обнаружение антигена в сыворотке или ликворе (РСК, латекс-агглютинация, встречный иммуноэлектрофорез). Экспресс-методы чаще являются ориентировочными, так как:

а) не всегда обнаружение пневмококка свидетельствует о его этиологической роли (часто носительство);

б) возбудитель не обнаруживается с началом этиотропного лечения.

II. Культуральный (бактериологический) метод:

1 этап. Материал (не позднее 1-2 часов с момента забора) засевают на 5% -и кровяной агар, культивируют в эксикаторе со свечой (СО2) 20-24 часа при температуре 37°С;

2 этап. Отбирают подозрительные колонии, дающие а-гемолиз, микроскопируют (окраска по Граму, на капсулу), отсевают в сывороточный бульон;

3 этап. Определяют чистоту культуры (окраска по Граму). Идентификацию проводят по морфологическим, серологическим (р. агглютинации на стекле с поливалентной противокапсульной сывороткой), культуральным, биологическим свойствам. Последние проводят путем посева в среду с оптохином (нет роста), в 10%-й желчный бульон (лизис), внутрибрюшинного заражения мышей (гибель). При необходимости (например, при пневмонии) доказывают этиологическую значимость пневмококка (в частности, определяют КОЕ/мл). Определяют также чувствительность к антибиотикам. Культуральный метод является ведущим методом диагностики, так как он ранний, точный, чувствительный и позволяет выбрать адекватное этиотропное лечение.

III. Серологический метод: определение противокапсульных антител и их динамики в сыворотке крови с помощью РНИФ (с ауто штамма ми), РСК и РИГА (с эталонными штаммами пневмококка). Чаще используют при хронических формах инфекции. Применение метода ограничивается более поздними сроками получения результата и отсутствием готовых диагностикумов.

IV. Биологический метод: внутрибрюшинное заражение белых мышей исследуемым материалом (чаще мокротой). Погибших мышей вскрывают, делают мазки-отпечатки, посевы крови и органов на кровяной агар с последующей идентификацией возбудителя. Метод вспомогательный, ограничивается трудоемкостью, наличием в материале других видов микроорганизмов, патогенных для мышей, низкой чувствительностью мышей к некоторым сероварам пневмококка.

Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет

Аннотация научной статьи по клинической медицине, автор научной работы — Б.А. Рамазанова, К.К. Мустафина, Е.А. Колоскова

В данной статье представлены результаты идентификации Streptococcus pneumoniae из различных биологических материалов, полученных от детей в возрасте до 5 лет, с последующим сравнением двух методов лабораторной диагностики пневмококковой инфекции для оценки эффективности применяемых методов.

METHODS OF LABORATORY DIAGNOSIS OF PNEUMOCOCCAL INFECTIONS AND THEIR EVALUATION

In this article, we presented the results of the identification of Streptococcus pneumoniae from a different biological materials obtained from children under the age of 5 years. Results comparison of two methods of laboratory diagnosis of pneumococcal infection to evaluate the effectiveness of the methods used.

• Nq1 -201 6 • КазНМУ • kaznmu.kz

МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ПНЕВМОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ И ИХ ОЦЕНКА

Б.А. РАМАЗАНОВА, К.К. МУСТАФИНА, Е.А. КОЛОСКОВА

Кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии Казахский Национальный медицинский университет имени С.Д. Асфендиярова

Ключевые слова: пневмококковая инфекция, Streptococcus pneumoniae, ПЦР-диагностика, микробиологический метод.

Введение. Пневмококковая инфекция является серьезной проблемой в современной медицине в связи с широким ее распространением, развитием тяжелых осложнений и высокими цифрами летальности. Так, по данным ВОЗ, ежегодно от 700 000 до 1 млн. детей погибает от пневмококковой инфекции [1]. Возбудитель

пневмококковой инфекции - Streptococcus pneumoniae, микроорганизм вызывающий пневмонии, отиты, выходит на первое место среди возбудителей менингитов неменингококковой этиологии после введения вакцинации от Hib-инфекции в США и Великобритании и занимает третье место в этиологии бактериемий во всем мире4. Идентификация возбудителя возможна с применением классических и молекулярных методов исследования, имеющих свои достоинства и недостатки, что наиболее актуально с разработкой и введением вакцинации от пневмококковой инфекции. Включение вакцинации против пневмококковой инфекции показывает необходимость проведения микробиологического мониторинга штаммов S.pneumoniae для оценки заболеваемости и изменение серотипового пейзажа на фоне проводимой иммунизации. Введение вакцинации против пневмококковой инфекции на территории Республики Казахстан и рост антибиотикорезистентных штаммов Streptococcus pneumoniae определяет важность правильной и современной диагностики пневмококковой инфекции6. Цель исследования. Дать характеристику и оценить культуральный и молекулярный (ПЦР) методы диагностики пневмококковой инфекции с последующим выявлением преимуществ и недостатков.

Материалы и методы. Исследование проводилось в период с апреля 2014 г по декабрь 2015года на базах Городской клинической больницы №5, Детской городской клинической больницы №2, Детской городской клинической инфекционной больницы, городской поликлиники №12 и детской поликлиники №3 города Алматы.

Было обследовано 78 детей с острыми средними отитами, 110 детей с инфекциями нижних дыхательных путей и 250 здоровых детей на предмет пневмококкового бактерионосительства.

Этические вопросы. Отбор детей для исследования осуществлялся после устной беседы с родителями или их

законными представителями с разъяснением целей и задач исследования, рисков для детей. После подписания информированного согласия у ребенка производили забор материала для исследования. Забор материала.

Забор материала на пневмококковое бактерионосительство. У здоровых детей в возрасте до 2 лет с помощью прозрачной линейки отмеряли расстояние от козелка уха до крыльев носа. На стерильном аппликаторе отмечали % расстояния маркером и вводили в носовой ход до отметки на аппликаторе или до ощущения сопротивления. Аппликатор поворачивали влево и вправо для абсорбции секрета. Аппликатор помещали в пробирку с транспортной средой и отправляли в лабораторию с указанием фамилии, имени и даты рождения.

Забор мокроты. Пациенту накануне исследования проводили щелочные ингаляции для улучшения отхождения мокроты из дыхательных путей. Путем надавливания на корень языка стимулировали кашлевый рефлекс. Мокроту собирали шпателем в стерильный контейнер и транспортировали в лабораторию. Забор жидкости из среднего уха. При остром среднем отите проводили исследование жидкости из среднего уха путем проведения процедуры тимпаноцентеза. Перед проведением тимпаноцентеза кожные покровы наружного слухового прохода обрабатывали 70% этиловым спиртом и протирали насухо стерильным ватным тампоном и вводили стерильную воронку, через которую проводили надрез барабанной перепонки. Полученную жидкость собирали стерильным аппликатором и помещали в транспортную среду. Полученный материал хранился до транспортировки в лабораторию при температуре +4°С +8°С не более 6 часов. Транспортировка материала в лабораторию осуществлялась в сумке-холодильнике при температуре +4°С +8°С. Микробиологические методы исследования. Микроскопия. Перед посевом первичного материала готовили мазки и окрашивали их по Гинс-Бурри и метиленовой синью для предварительной диагностики наличия пневмококков в материале и оценки качества образцов. Окраска по Гинс-Бурри позволяет обнаружить капсульные микроорганизмы, к которым относится Streptococcus рпеишошае (рисунок 1).

кагпти.кг • КазНМУ • N01-2016

Сбор мокроты у детей младше 5 лет сложен и часто совсем невозможен. При сборе мокроты существует вероятность контаминации материала флорой ротовой полости и для этого необходимо произвести подсчет лейкоцитов и эпителиальных клеток в мазке [8]. Критериями

пригодности мокроты для бактериологического исследования считались наличие более 25

сегментоядерных лейкоцитов и не более 10 эпителиальных клеток в поле зрения при просмотре, как минимум, 20 полей зрения мазка, окрашенного метиленовой синью (Рисунок 2).

В случае если образец не отвечал этим требованиям, то мокроту собирали повторно (Рисунок 3).

Культуральные свойства. Изучение культуральных свойств основывалось на микробиологических свойствах группы Streptococcus и характеру роста на питательных средах. Посев Streptococcus pneumoniae проводился на питательных средах с добавлением дефибринированной

бараньей крови в атмосфере с повышенным содержанием углекислого газа. После 24-часового инкубирования изучали характер выросших колоний, внимание уделялось колониям, окруженным а-гемолизом

Рисунок 4 - Рост колоний Streptococcus pneumoniae на кровяном агаре, окруженные зоной а-гемолиза. Кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии Каз11МУ им.С-Д, Асфендиярова.

С вдавленным центром или блюдцеобразным (Рисунок 5).

У штаммов S.pneumoniae с повышенной продукцией полисахарида, колонии слизистые, по типу капли масла на агаре (Рисунок 6)[9].

Фенотипическая идентификация пневмококков.

Идентификация колоний на питательных средах основывается на чувствительности микроорганизма к оптохину. Подозрительные колонии отсевались штрихами на чашку и накладывали диск с оптохином и инкубировали в атмосфере с повышенным содержанием СО2 в течение 18 часов. На следующий день мы оценивали зону задержки роста вокруг диска с оптохином. Если зона задержки роста составляла более 14 мм, отмечали как оптохинчувствительную - пневмококк положительную[10]. Если зона задержки роста была менее 14 мм, то проводили тест на чувствительность культуры к солям желчи. На чистую культуру, выросшую на секторе, накладывали диск с желчью и смачивали его 1-2 каплями дистиллированной воды и инкубировали в термостате в обычных условиях в

течение 2 часов. После с помощью лупы изучали зону вокруг диска. Положительным тестом считали лизис культуры вокруг диска в 1-2 мм. Если лизиса не отмечалось, то культуру расценивали как стрептококк группы viridans[11]. Хранение культур. Чистую культуру в количестве 1-2 колонии помещали в криопробирки. Исходный материал переливали в микропробирки. Чистые культуры в криопробирках и исходный материал сохраняли при температуре -70С0 для проведения молекулярно-генетических исследований. Молекулярно-генетические исследования. Экстракция ДНК. Для выделения ДНК из образцов крови использовались наборы ДНК-сорб с прилагаемым протоколом завода-изготовителя. Для реакций использовали 20 мкл выделенной ДНК.

• Nq1 -201 6 • КазНМУ • kaznmu.kz

Проведение полимеразно-цепной реакции. В качестве мишеней при проведении ПЦР использовали psаA ген с протоколом термоциклирования: прогрев системы при 94 С0 - 2 минуты, 45 циклов при 94 С0 - 10 секунд, 52 С0 - 15 секунд, 72 С0 - 10 секунд, достройка цепей при 72 С0 - 2 минуты, с последующим хранением продукта при температуре 4 С0.

Проведение электрофореза. Электрофорез был проведен в 2% агарозном геле, в лунки которого вносили амплифицированную ДНК с красителем. Агарозный гель помещали в ваночку с трис-боратным буфером. В первую лунку добавляли маркер для определения длин ампликона, в последную лунку - отрицательный контроль. Электрофорез проводили в течение 25 минут при

напряжении 100 Вт. Следующим этапом гель отмывали в растворе бромистого этидия и в УФ-излучении определяли длины ампликонов.

Результаты. Было обследовано 112 детей с инфекциями нижних дыхательных путей, после исключения 1 ребенка (старше 5 лет), в исследовании осталось 111 детей. С острыми средними отитами было обследовано 78 детей. Выявление бактерионосительства проводилось у 250 детей. S.pneumoniae был выделен из мокроты в 36,9% (41/111) случаев, из жидкости среднего уха - 24,4% (19/78) и из носоглотки в 15,2% (38/250). Сравнение методов выделения S.pneumoniae из различных сред организма представлены в Таблице 1.

Таблица 1 - Сравнение микробиологического и ПЦР-метода для идентификации Streptococcus pneumoniae из различных

Методы исследования Мокрота Жидкость из среднего уха Мазок из носоглотки

Только методом ПЦР 9 21,95 11 57,9 13 34,2

Культуральный метод + ПЦР 32 78,05 8 42,1 25 65,8

Всего 41 100 19 100 38 100

Идентификация оптохинрезистентных штаммов S. Pneumoniae из мокроты составила 2,4% (27/111), из носоглотки - 0,04% (10/250). Обсуждение.

Важное значение в клинической практике имеет быстрая и правильная верификация возбудителя с выбором верной тактики антибактериальной терапии.

При выделении пневмококка из различных сред организма имеет значение места выделения. Так, например, выделение S.pneumoniae из стерильных локусов - крови и ликвора всегда указывает на инфекцию, мокрота требует предварительной оценки качества собранного материала, мазки из носоглотки и ротовой полости контаминированы различными микроорганизмами, что уменьшает принадлежность микроорганизма к развитию инфекции[12].

Использование фенотипических тестов - основной диагностический принцип диагностики S.pneumoniae. Циркуляция оптохинрезистентных штаммов в популяции приводит к ошибочному результату диагностики

S.pneumoniae. По данным , до 10% циркулирующих штаммов являются оптохинрезистентными[15]. Также лабораторную идентификацию S. pneumoniae осложняет описание нового вида Streptococcus pseudopneumoniae. С. pseudopneumoniae фенотипически и генетически отличается от С. pneumoniae и других стрептококков группы viridans, но некоторые ключевые характеристики С. pseudopneumoniae способствует ошибочному определению вида как пневмококк: отсутствие пневмококковой капсулы, нерастворимости в желчи, вариабельной чувствительности к оптохину при инкубации в различных атмосферных условиях и положительных реакциях с ДНК гибридизацией и тестами на выявление антигенов[16]. Клиническая значимость S. pseudopneumoniae все еще остается неопределенной, хотя возможна ассоциация с хронической обструктивной болезнью легких[17].

Заключение. Вместе с тем диагностика пневмококковой инфекции сохраняется на низком уровне в большинстве развивающихся стран. Выделение, а в особенности идентификация этого микроорганизма, сопряжены со значительными трудностями, связанными с отсутствием тест-систем и препаратов для идентификации и дифференциальной диагностики, циркуляцией штаммов нечувствительных к стандартным тестам идентификации и близкородственных видов.

kaznmu.kz • КазНМУ • №1-201 6*

3 Rodrigo Lopez Castelblanco, MinJae Lee, Rodrigo Hasbun Epidemiology of bacterial meningitis in the USA from 1997 to 2010: a population-based observational study / / The Lancet. - 2014. - №14(9). - С. 813-9.

4 Martin NG, Sadarangani M, Pollard AJ, Goldacre MJ Hospital admission rates for meningitis and septicaemia caused by Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, and Streptococcus pneumoniae in children in England over five decades: a population-based observational study // Lancet Infect Dis. - 2014 . - №14(5). - С. 397-405.

5 K.B. Laupland Incidence of bloodstream infection: a review of population-based studies // European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. - 2013 . - №19 . - С. 492-500.

8 Пульмонология: Национальное руководство / Под ред. А.Г. Чучалина. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009. - 960 с.

9 35. Bergey's manual of Systematic Bacteriology / Paul De Vos, George M. Garrity, Dorothy Jones, Noel R. Krieg, Wolfgang Ludwig, Fred A. Rainey, Karl-Heinz Schleifer, William B. Whitman, Под ред. William B. Whitman. - Second Edition изд. - New York: Springer, 2009. -1422 с.

10 МР для микробиологов. Выделение, идентификация и определение чувствительности к антибиотикам S.pneumoniae // КМАХ . -2000. - №1-2. - С. 88-98.

11 Л.А. Краева Микробиологическая диагностика менингококковой инфекции и гнойных менингитов // Инфекция и иммунитет. -2011,. - № Т. 1, № 1. - С. 51-58.

12 С.В. Сидоренко. Основы лабораторной диагностики пневмококковых инфекций: преаналитический этап, место классических и молекулярных методов//Семинар. 2013.

14 Werno AM, Murdoch DR. Medical microbiology: laboratory diagnosis of invasive pneumococcal disease.// Clin Infect Dis. 2008 Mar 15;46(6):926-32.

15 Kellogg JA, Bankert DA, Elder CJ, Gibbs JL, Smith MC. Identification of Streptococcus pneumoniae revisited. //J Clin Microbiol 2001; 39:3373-5.

16 Rolo D, S Simoes A, Domenech A, Fenoll A, Linares J, de Lencastre H, Ardanuy C, Sa-Leao R. Disease isolates of Streptococcus pseudopneumoniae and non-typeable S. pneumoniae presumptively identified as atypical S. pneumoniae in Spain.// PLoS One. 2013;8(2):e57047.

17 Mohammadi JS, Dhanashree B. Streptococcus pseudopneumoniae: an emerging respiratory tract pathogen.// Indian J Med Res. 2012 Nov;136(5):877-80.

B.A. RAMAZANOVA, K.K. MUSTAFINA, E.A. KOLOSKOVA

Department of microbiology, virology and immunology Asfendiyarov Kazakh national medical university, Almaty, Kazakhstan

METHODS OF LABORATORY DIAGNOSIS OF PNEUMOCOCCAL INFECTIONS AND THEIR EVALUATION

Resume: In this article, we presented the results of the identification of Streptococcus pneumoniae from a different biological materials obtained from children under the age of 5 years. Results comparison of two methods of laboratory diagnosis of pneumococcal infection to evaluate the effectiveness of the methods used.

Keywords: pneumococcal infection, Streptococcus pneumoniae, PCR-diagnostic, microbiological method.

Б.А. РАМАЗАНОВА, К.К. МУСТАФИНА, Е.А. КОЛОСКОВА

Микробиология, вирусология жэне иммунология кафедрасы С.Ж. Асфендияров атындагы Казац улттыцмедицинауниверситет1

ПНЕВМОКОКК ИНФЕКЦИЯНЫН, ДИАГНОСТИКАЛЬЩ ЗЕРТАХАЛЬЩ ЭД1СТЕР1 ЖЭНЕ ОЛАРДЫН, БАFАЛАУЫ

ТYЙiн: Бул ма;алада 5 жас;а дешнп балалардан алынгант Yрлi биологияльщ материалдардагы Streptococcus pneumoniae аны;тау нэтижелерш усынган. Кешн пайдаланылатын пневмококк инфекциясынын зертханалы; диагностика эдктершш тшмдтгш багалау максатымен бiр-бipiмен салыстыру журпзшдь

ТYЙiндi сездер: пневмококк инфекциясы, Streptococcus pneumoniae, егу зертханалы;-диагностикалы; эдктерь ПЦР теру, микробиологиялы; эдiстерi

Пневмококковая инфекция обусловлена патогенным микроорганизмом Streptococcus pneumoniae. Этот возбудитель является главной причиной острых внебольничных пневмоний, занимает ведущее место в этиологии бактериальных менингитов, острых средних отитов, синуситов, вызывает первичный сепсис, заболевания кожи, суставов и другие инфекции, пневмококки являются этиологической причиной пневмонии в 20–75% случаев. Риносинусит имеет пневмококковую этиологию в 20–43% случаев, средний отит – 30–50%.

Ежегодно в США диагностируется около 4 млн. случаев внебольничной пневмонии и более 3 млн. в странах Европейского союза. В России число таких больных превышает 1,5 млн. человек в год, а заболеваемость составляет 14–15 случаев на 1000 населения. По данным Министерства обороны РФ у военных срочной службы в течение 2000–2003 гг. заболеваемость пневмонией превышала показатель 40 случаев на 1000 военнослужащих.

Заболеваемость пневмококковым менингитом в США определяется на уровне 1–2 случая на 100 тыс. населения с уровнем летальности 19–46% в различных возрастных группах. В России, по данным Референс-центра по надзору за гнойными бактериальными менингитами за 2010 г., общий уровень заболеваемости составил 0,19 на 100 тыс. населения (с колебаниями по Федеральным округам от 0,11 до 0,30 на 100 тыс. населения), с летальностью 13%.

В тоже время, пневмококк относится к нормальным обитателям ротоглотки и частота здорового носительства в популяции может достигать 40–70%. При этом возможно как одновременное носительство различных серотипов пневмококка, так и смена одного серотипа другим в течение непродолжительного времени. Заболевание пневмонией, отитом, синуситом, как правило, возникает при попадании микроба в нижние или верхние дыхательные пути на фоне нарушения защитных механизмов организма человека (снижение уровня общего и местного иммунитета, нарушение мукоцилиарного клиренса и др.). При генерализации процесса развивается сепсис, менингит, абсцессы внутренних органов, поражения сердца (эндокардит), почек, суставов.

Резервуаром пневмококковой инфекции является человек. Вместе с тем, пневмококковая патология встречается у диких и домашних копытных животных (овец, коз, телят и т. д.), преимущественно в виде пневмонии или сепсиса. Выделенный возбудитель от животных не отличается по свойствам от пневмококка, вызывающего заболевание у людей.

Основной путь передачи инфекции – воздушно-капельный, иногда контактный. Отмечены случаи внутриутробного заражения. Пик заболеваемости приходится на холодные сезоны года и носит спорадический характер. Среди заболевших преобладают мужчины. Наиболее уязвимыми возрастными контингентами являются дети до 5 лет и лица пожилого возраста (старше 65 лет). Пневмококковая инфекция наиболее тяжело, с генерализацией инфекционного процесса, протекает у лиц старших возрастов, особенно при наличии сопутствующих хронических патологий (хроническая обструктивная болезнь легких, злокачественные новообразования, алкоголизм, сахарный диабет, заболевания сердечно-сосудистой системы, почек и печени и др.), а также иммунодефицитов различного генеза.

Показания к обследованию. Пациенты при подозрении на крупозную пневмонию, острый бронхит; отит, синусит; менингит, менингоэнцефалит; септическое состояние; поражения кожи, подкожной клетчатки, соединительной ткани (редкая локализация инфекции); конъюнктивит (редкая локализация инфекции).

Дифференциальная диагностика проводится с микробными агентами:

Haemophilus influenzae

Chlamydia pneumoniae

Mycoplasma pneumoniae

Legionella pneumophila

Staphylococcus aureus

Enterobacteriaceae

при отитах, синуситах – Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Moraxella catarrhalis, Streptococcus pyogenes, дрожжевыми грибами рода Candida;
при менингите – Neisseria meningitides, Haemophilus influenzae тип b, Staphylococcus aureus, семействомEnterobacteriaceae;
при поражениях кожи, подкожной клетчатки, соединительной ткани – Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa.

Материал для исследования

Мокрота, БАЛ, пунктаты (при подозрении на пневмонию); гнойное отделяемое, пунктаты (средний отит, синусит); СМЖ, кровь (менингит, менингоэнцефалит); кровь (септические состояния); отделяемое из раны (кожные поражения); секционный материал – культуральные исследования, выявление ДНК микроорганизма;
СМЖ – определение АГ;
сыворотка крови – определение АГ, АТ.

Этиологическая лабораторная диагностика включает выявление пневмококков методом микроскопии, посев исследуемого материала с дальнейшей культуральной и биохимической идентификацией возбудителя, определением антибиотикочувствительности; обнаружение специфических генетических фрагментов пневмококка и его АГ, обнаружение специфических АТ.

взятие материала должно проводиться до начала антибиотикотерапии;
контроль правильности отбора, доставки и обработки материала:
- задержка приготовления препарата на 2–5 ч от момента взятия материала может привести к ошибочным результатам;
- подтверждением взятия образца мокроты из нижних отделов дыхательных путей служит выявление менее 10 эпителиальных клеток в поле зрения при малом увеличении микроскопа;
- материал считается пригодным для бактериологического посева при обнаружении в мокроте большого количества нейтрофилов (более 25 в поле зрения), небольшого количества эпителиальных клеток (менее 10 в поле зрения) и преобладании монофлоры, по морфологии сходной с пневмококком.

Для посева с дальнейшей культуральной и биохимической идентификацией возбудителя, определением антибиотикочувствительности используют различные виды материала: мокрота, бронхоальвеолярный лаваж, отделяемое из уха и придаточных пазух, кровь, ликвор, плевральная жидкость.

При наличии роста на чашках проводится обязательная количественная оценка бактериального роста и выделение чистой культуры предполагаемого возбудителя для дальнейшей идентификации.

Принадлежность к виду Streptococcus pneumoniae подтверждается:

характерным видом колоний на средах, содержащих кровь (колонии по форме напоминают игральные шашки или блюдца, мелкие, прозрачные, окружены зоной зеленоватого гемолиза);
чувствительностью микроорганизма к оптохину;
чувствительностью к желчным кислотам;
положительной реакцией набухания капсулы с антипневмококковой omniсывороткой;
биохимической характеристикой возбудителя с использованием соответствующих наборов реагентов.

Оценка результатов культурального исследования. Для нестерильных локусов:

выявление при посеве в мокроте или лаважной жидкости более чем 10 3 КОЕ/мл пневмококков является диагностическим критерием постановки диагноза пневмония;
выявление в гнойном экссудате при остром бактериальном синусите более 10 5 КОЕ/мл пневмококков является диагностическим критерием постановки диагноза синусит;
выявление в гнойном отделяемом при остром среднем отите более 10 4 КОЕ/мл пневмококков, является диагностическим критерием постановки диагноза отит.

Для стерильных локусов:

любое выявление возбудителя в стерильных жидкостях организма служит основанием для постановки диагноза пневмококковой инфекции.

Для определения чувствительности к антибиотикам используются несколько методов.

Метод серийных разведений в бульоне или агаре. Принцип метода основан на оценке чувствительности возбудителя к серии последовательных разведений тестируемого антибиотика. При этом определяется точное значение минимальной подавляющей концентрации (МПК) препарата для микроорганизма. Однако изза значительной трудоемкости, метод используется преимущественно в научных лабораториях. Более широкое применение получил модифицированный метод серийных разведений, основанный на использовании пограничных концентраций антибиотика, который не дает точного определения МПК препарата для возбудителя, но позволяет оценить его принадлежность к чувствительным (S), промежуточно устойчивым (I) или резистентным (R) штаммам. Большинство готовых наборов реагентов используют именно этот принцип.
Диско-диффузионный метод – основан на оценке диаметра зоны подавления роста вокруг бумажного диска с антибиотиком, наложенного на растущую на плотной питательной среде культуру исследуемого микроорганизма. Образование зоны ингибирования роста происходит за счет диффузии антибактериального препарата из носителя (диска) в питательную среду, при которой величина диаметра ингибирования роста жестко связана с величиной МПК. Метод не определяет точное значение минимальной подавляющей концентрации антибиотика для микроорганизма, а только позволяет отнести его к одной из категорий чувствительности (S, I, R).
Метод эпсилометрии (Е-тест) – в качестве носителя используется полоска полимера, пропитанная различными концентрациями антибиотика, с нанесенными на нее значениями таких концентраций. Интерпретации результатов выполняют в соответствии с инструкцией к набору реагентов.

Наиболее важным при тяжелых пневмококковых инфекциях является определение чувствительности пневмококков к пенициллину и другим бета-лактамным антибиотикам (аминопенициллинам, карбапинемам, цефалоспоринам) – основным препаратам выбора. В качестве скринингового теста для определения чувствительности к этим препаратам используется диско-диффузионный метод.

В исследование обязательно включают изучение чувствительности к макролидам, линкозамидам, стрептограминам. Данные препараты часто используются для лечения внегоспитальной пневмококковой пневмонии и заболеваний верхних дыхательных путей. Пневмококки могут быть устойчивыми только к 14- и 15-членным макролидам, при сохранении чувствительности к 16-членным макролидам и линкозамидам, а могут быть устойчивыми ко всем представителям этих классов.

Определение устойчивости к хинолонам, хлорамфениколу, тетрациклину, котримоксазолу, рифампицину, ванкомицину, позволяет более полно характеризовать фенотип возбудителя. При этом необходимо учитывать, что ранние хинолоны (офлоксацин), которые применяются в отношении пневмококков, резистентных к пенициллину, в последнее время показывают рост устойчивости к этому препарату. Для преодоления устойчивости используют новые фторхинолоны с повышенной антипневмококковой активностью: спарфлоксацин, моксифлоксацин и др.

Примерно от 5 до 15% культур пневмококков в России демонстрируют полирезистентные свойств, т. е. одновременной устойчивостью к 3 и более классам препаратов.

Для обнаружение АГ пневмококка в пробах биологических жидкостей пациента применяют методы латекс-агглютинации и ИХА. Наборы реагентов, основанные на реакции латекс-агглютинации или коагглютинации, предназначены для работы с материалом, полученным из стерильных локусов (кровь, ликвор), при работе с нестерильными локусами эти наборы могут давать ложноположительный результат. Чувствительность и специфичность наборов разных производителей составляет 94–100% и 85–98%, соответственно. Набор реагентов с использованием ИХА позволяет определить наличие указанного АГ у больных пневмонией (в моче) и менингитом (в СМЖ). Этот тест рекомендован как дополнительный метод диагностики пневмоний. При исследовании проб пациентов с высоким уровнем назофарингеального носительства возможны ложноположительные результаты.

Для обнаружения специфических генетических фрагментов пневмококка применяют ПЦР, в качестве мишеней используют специфические фрагменты генов, кодирующих факторы патогенности: пневмолизин (Ply), аутолизин (LytA), пневмококковый поверхностный АГ (PsaA), пневмококковый поверхностный протеин А (PspA), марганец-зависимая супероксид-дисмутаза (sodA), поверхностный пенициллин-связывающий белок 2b (Pbp2b), Spn9802, Spn9828. Для повышения специфичности исследования применяется мультиплексная ПЦР, при которой проводится одновременная индикация нескольких генов патогенности с сохранением высокой чувствительности реакции.

Остается проблемой установление диагностически значимых количественных показателей, позволяющих дифференцировать заболевание от носительства при исследовании материала из нестерильных локусов.

Использование метода секвенирования участка 16S рибосомальной РНК для идентификации пневмококков затруднено сходством с некоторыми видами стрептококков, входящих в группу Mitis. Гомология ДНК-ДНК между стрептококками, входящими в группу Mitis, составляет 40–60%, тогда как сходство сиквенсов 16S рРНК генов между S.mitis, S.oralis и S.pneumoniae может достигать более чем 99%. Сравнение участков 16S рРНК между штаммами S.pseudopneumoniae и S.pneumoniae (суммарный размер 1 468 пар нуклеотидов) показало 99,7% совпадение сиквенса, различие отмечено только в 5 парах нуклеотидов.

Обнаружение АТ редко используются при проведении лабораторной диагностики пневмококковой инфекции. Это связано с отсутствием надежных доступных методик, имеющих достаточную чувствительность и специфичность и ролью временного фактора, поскольку для выявления роста титров АТ необходимо значительное время от начала заболевания. В настоящий момент используются определения АТ против четырех АГ пневмококка (С-антигена, капсульных полисахаридов, фосфорилхолина и пневмолизина). Чувствительность метода для С-антигена и капсульных полисахаридов составляет 89% и 97% соответственно. Наиболее распространенные методы определения – ИФА и РИФ (МФА). При применении МФА в качестве АГ рекомендуется использовать аутоштамм пневмококка, выделенный от данного больного. В случае отсутствия аутоштамма применяют смесь штаммов из наиболее часто встречающихся на данной территории серотипов. Выявление минимального диагностического титра АТ к пневмококку у детей до 3 лет 1:320 и 1:640 у взрослых свидетельствует о пневмококковой этиологии перенесенного заболевания.

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, пользовательских данных (сведения о местоположении; тип и версия ОС; тип и версия Браузера; тип устройства и разрешение его экрана; источник откуда пришел на сайт пользователь; с какого сайта или по какой рекламе; язык ОС и Браузера; какие страницы открывает и на какие кнопки нажимает пользователь; ip-адрес) в целях функционирования сайта, проведения ретаргетинга и проведения статистических исследований и обзоров. Если вы не хотите, чтобы ваши данные обрабатывались, покиньте сайт.

Читайте также:

Лабораторная диагностика пневмококковой инфекции

Аннотация научной статьи по клинической медицине, автор научной работы — Б.А. Рамазанова, К.К. Мустафина, Е.А. Колоскова

Похожие темы научных работ по клинической медицине , автор научной работы — Б.А. Рамазанова, К.К. Мустафина, Е.А. Колоскова

METHODS OF LABORATORY DIAGNOSIS OF PNEUMOCOCCAL INFECTIONS AND THEIR EVALUATION