Что такое пцр диагностика инфекций у животных

1. Хламидиоз животных (семейство Chlamydiaceae)

Биологический материал для анализа: для исследования используют: соскобы слизистых оболочек (конъюнктивы, урогенитального тракта, а у птиц - клоаки), помет птиц, паренхиматозные органы павших или вынужденно убитых животных и птиц, кусочки плодовых оболочек, паренхиматозные органы и перевязанный с двух сторон сычуг аборт-плодов, сперму замороженную (или пробы эякулята), мочу от производителей, подозрительных по заболеванию.

2. Чума плотоядных (Canine Distemper virus)

Чума плотоядных – высококонтагиозная болезнь, проявляющаяся лихорадкой, воспалением слизистых оболочек глаз, дыхательных путей, кожной экзантемой и тяжелым поражением нервной системы. Заболевание регистрируется в любое время года, но весной и осенью протекает преимущественно в виде эпизоотий. Летальность колеблется от 50 до 80%. Чуму плотоядных вызывает РНК-содержащий вирус из семейства Paramyxoviridae, имеющий близкое родство с вирусом кори человека и вирусом чумы крупного и мелкого рогатого скота. Возбудитель относительно устойчив к действию внешних факторов. В выделениях больных животных, во внешней среде при температуре 4°С вирус сохраняется 7-11 дней, а при 100°С погибает мгновенно.

Чума плотоядных до сих пор признается трудноизлечимым заболеванием. Это связано с тем, что болезнь сопровождается поражением центральной нервной системы, при котором до настоящего времени не разработана эффективная терапия, и вызывается вирусом, на который сложно воздействовать из-за особенностей его цикла репродукции. К тому же следует дифференцировать другие заболевания, характеризующиеся сходными клиническими признаками, – парвовирусный энтерит и др. В связи с этим роль ранней диагностики чумы собак, до проникновения вируса через гематоэнцефалический барьер, является наиболее важной для владельцев животных и ветеринарных специалистов, оказывающих помощь больным.

Метод ПЦР позволяет достаточно быстро и точно выявлять РНК вирус чумы плотоядных (Canine Distemper virus). При соблюдении всех мер профилактики контаминации проб требуется всего 3-8 часов от взятия клинических проб до получения надежного диагноза.

Показания к назначению: диагностика чумы плотоядных.

Биологический материал для анализа: мазки или смывы (в малом объеме – не более 300 мкл жидкости) конъюнктивы глаз, мазки со слизистой носа, мазки со слизистой прямой кишки, цельная кровь, плазма крови, сыворотка крови, фекалии животных.

3. Ринотрахеит кошек (Feline herpes virus)

Инфекционный ринотрахеит кошек — остропротекающая вирусная инфекционная болезнь, сопровождающаяся поражением глаз и органов дыхания.

Возбудитель - ДНК содержащий вирус семейства Herpesviridae. Заболеваемость составляет 50%, смертность 5-20%. Вирус ИРТ кошек является видоспецифическим заболеванием, которое не опасно для других видов домашних животных и человека. Зараженные и переболевшие кошки являются источником возбудителя инфекции. Даже после полного выздоровления, кошки становятся переносчиками ринотрахеита еще на 8-9 месяцев. Заражение осуществляется через выделения из носа, глаз и половых органов. Передача вируса так же происходит через воздух, предметы ухода, насекомых, корма. Аэрогенный способ заражение самый распространенный в естественной среде.

Показания к назначению: ринотрахеит кошек

Биологический материал для анализа: смывы с конъюнктивы глаз и поврежденной слизистой носоглотки, а также с изъязвлений слизистой ротовой полости.

4. Вирус кальцивироза кошек (Feline calicivirus)

Возбудитель калицивироза — инфекционного заболевания кошек, проявляющегося повышением температуры, конъюнктивитом, изъязвлением слизистых ротовой и носовой полости, хромотой. Симптомы — возникновение язв в ротовой полости, слюнотечение, общее недомогание, гипертермия, иногда конъюнктивит, чихание, отказ от еды, одышка. Большинство кошек после выздоровления выделяют вирус в течение 75 дней, а некоторые — в течение всей жизни.

Показания к назначению: 1) Диагностика калицивироза кошек; 2) Установление калицивирусной этиологии: артриты; заболевания дыхательной системы; заболевания глаз; язв ротовой полости 3) Оценка эффективности лечения.

Биологический материал для анализа: соскобы из язв ротовой полости; смывы со слизистой конъюнктивы глаз; смывы со слизистой носа и ротоглотки.

5. Коронавирус кошек и собак (Canine Coronavirus, Feline Coronavirus)

Возбудителем коронавирусной инфекции у собак является Canine coronavirus, вызывающий острый коронавирусный энтерит. Заболевание передается при непосредственном контакте с носителем вируса (через слюну и фекалии). Данной инфекции подвержены собаки любого возраста, однако чаще всего поражаются щенки и ослабленные животные, которые уже перенесли другую болезнь, например, парвовирусную инфекцию. Основные симптомы заболевания — рвота и диарея, иногда с примесью крови, обезвоживание организма, потеря в весе, апатия. Через 3-4 недели после выздоровления может развиться повторное заболевание. При проведении диагностики коронавирусный энтерит собак необходимо дифференцировать от парвовирусного энтерита, аденовирусной инфекции кишечного типа и чумы плотоядных.
Коронавирусы, поражающие кошек, представлены двумя биотипами: FECV, или коронавирус энтерита кошек, и FIPV — вирус инфекционного перитонита кошек (2, 3). Носителями FECV является 16-50% домашних кошек, у которых вирус локализуется в тонком кишечнике, не вызывая заболевания или становясь причиной легкой диареи. В то же время у 5-12% носителей может наблюдаться мутация условно-патогенной кишечной формы FECV в патогенную (FIPV), что приводит к развитию болезни.

Показания к назначению: 1) Диагностика коронавирусного энтерита собак и кошек; 2) Неясная клиническая картина; 3) Контроль эффективности терапии; 4) Профилактические скрининговые исследования (для исключения вероятности бессимптомного течения инфекции).

Биологический материал для анализа: плазма крови, асцитическая жидкость и фекалии

6. Аденовирус плотоядных (Canine adenovirus I, II)

Canine adenovirus II вызывает аденовироз собак (инфекционный ларинготрахеит) Основные симптомы – это кашель и выделения из носа. Кашель часто усиливается от питья, еды и выхода на свежий воздух. Характерным кашлем при аденовирозе является кашель до рвоты или отрыжки. При этом увеличиваются лимфатические узлы, и часто повышается температура. Возможны конъюнктивиты. Кроме того, имеют место различные диспептические явления: понос (часто с кровью), иногда рвота. Собака угнетена, аппетит снижен. В каловых массах остатки непереваренного корма. Температура субфебрильная или нормальная.

Показания к назначению: 1) Диагностика гепатита плотоядных, аденовироза собак. 2) Подозрения на аденовирусную этиологию гепатита, поражения глаз, ларинготрахеита, увеличения лимфатических узлов, диспептических явлений. 3) Скрининговые исследования.

Биологический материал для анализа: смывы с конъюнктивы (в первую неделю после появления конъюнктивита), выделения из носа (в первую неделю после их появления), фекалии (при наличии расстройства ЖКТ) и сыворотка крови (при подозрении на гепатит собак)

7. Микоплазмоз плотоядных (Mycoplasma)

Возбудители микоплазмоза относятся к классу Mollicutes и являются грамотрицательными очень мелкими (0,2 – 0,3 мкм) организмами, характеризующимися отсутствием жесткой клеточной стенки. Заражение микоплазмами происходит воздушно-капельным путем, контактным путем через предметы обихода, половым и натальным путем во время прохождения плода через родовые пути. Микоплазмоз встречается как у животных при групповом содержании (питомники), так и при одиночном содержании. Наиболее часто болеют молодые животные или животные с ослабленной иммунной системой. Микоплазмоз у животных часто сопровождается вторичной бактериальной инфекцией. Заболевание часто переходит в хроническую форму. Микоплазмоз проявляется одно- или двухсторонними конъюнктивитами с серозными, а затем и слизисто-гнойными выделениями, ринитами, пневмониями, артритами, кожными абсцессами. Могут наблюдаться циститы, вагиниты, уретриты, нарушения желудочно-кишечного тракта. Микоплазмы могут быть причиной бесплодия и абортов у самок, рождения нежизнеспособного молодняка.

Показания к назначению: 1) Диагностика микоплазмоза плотоядных.

Биологический материал для анализа: назальные, конъюнктивальные смывы, истечения, синовиальная жидкость суставов, желток, аллантоисную жидкость эмбрионов, паренхиматозные органы, трахею, воздухоносные мешки павшей птицы, цельную кровь, сыворотки (лечебные), культуры клеток (оптимальная концентрация 10 6 клеток в мл), сперма в объеме не менее 2 мл.

8. Вирус иммунодефицита кошек (Provirus)

Вирус иммунодефицита кошек - ретровирус, для которого свойственна тропность к клеткам лимфоидной ткани. При заражении кошки вызывает синдром иммунодефицита.

Распространяется в кошачьей популяции парентеральным путем, обычно через рану, редко - трансплацентарно или в процессе родов. Могут поражаться нервные клетки, мегакариоциты и мононуклеарные клетки костного мозга. Если к поражению, вызванного вирусом иммунодефицита присоединяется вирус лейкоза кошек, то это приводит к поражению почек, головного мозга, печени и других тканей. Заболеваемость повышается с возрастом, наиболее часто выявляется в 5 лет. Коты более подвержены риску заражения. Активному распространению инфекции способствует вольный образ жизни кошки и контакты с другими бродячими животными. Первыми признаками инфекции могут быть рецидивирующие болезни верхних дыхательных путей и желудочно-кишечного тракта. Затем развиваются умеренная или выраженная лимфаденопатия, лимфосаркома или другие новообразования. На фоне иммунодефицита у 25-50% животных возникают гингивит, стоматит, периодонтоз; в 30% случаев - ринит, конъюнктивит, кератит; в 10-20% случаев - персистирующая диарея, вызванная инфекцией (бактериальной, вирусной, грибковой или паразитарной) или обусловленная прямым воздействием вируса на эпителий кишечника. Активизируется хроническая бактериальная или микотическая инфекция, наблюдаются поражения глаз по типу переднего увеита, хориоретинита, глаукомы; неврологические расстройства (периферическая нейропатия). Лихорадка и слабость наиболее выражены на поздних стадиях болезни и возможно обусловлены высоким уровнем фактора некроза опухоли.

Показания к назначению: 1) Диагностика вируса иммунодефицита кошек

Биологический материал для анализа: цельная кровь.

9. Парвовирусный энтерит собак и панлейкопения кошек (Canineparvovirus, Felinepanleukopeniavirus, Minkenteritisvirus)

Высококонтагиозная вирусная болезнь собак, характеризующаяся в основном острым геморрагическим энтеритом, обезвоживанием организма, лейкопенией и миокардитом. ДНК-содержащий вирус, относится к семейству Parvoviridae роду Parvovirus. Существует две разновидности парвовируса собак (ПВС): ПВС-1 и ПВС-2. Наиболее опасен патогенный ПВС-2, который обусловливает острые парвовирусные энтериты у собак. Заражение происходит в основном фекально-оральным способом через инфицированные ПВС корма и воду, а также контактным - при обнюхивании и облизывании непосредственно больных животных или инфицированных ими объектов внешней среды. Инкубационный период при парвовирусном энтерите составляет обычно от 4 до 10 дней, а у 1-2 месячных щенков - 1-3 дня. Заболеванию подвержены собаки любого возраста, но наиболее восприимчивы к болезни щенки в возрасте от 2 до 16 недель. Это объясняется тем, что возбудитель ПВС-2 особенно быстро размножается в клетках с высоким уровнем митоза (основная форма клеточного деления), а у щенят в возрасте до 4 недель активно делятся клетки миокарда, позднее - клетки лимфоидной ткани, костного мозга и эпителия кишечных крипт. Наиболее часто болезнь наблюдают у щенков, полученных от невакцинированных сук. В зависимости от степени выраженности клинических признаков условно разделяют три основные формы болезни: сердечную, кишечную и смешанную.

Показания к назначению: диагностика и выявление ДНК парвовирусов (Canineparvovirus, Felinepanleukopeniavirus, Minkenteritisvirus), вызывающих парвовирусный энтерит собак и норок и панлейкопению кошек

Биологический материал для анализа: в мазках со слизистой прямой кишки и фекалии.

Бактериальные и вирусные заболевания — одни из наиболее часто встречающихся заболеваний домашних животных. Это, например, пироплазмоз, лептоспироз, гепатит, чумка, герпесвирус, калицивироз, хламидиоз и др.

До настоящего времени диагностика таких заболеваний вызывала затруднения, поскольку существующие виды анализов из-за их малой доступности не нашли широкого применения в ветеринарии. Зачастую работа по диагностике и лечению вирусных и бактериальных инфекций строится на основании одних лишь симптомов заболевания и личного опыта врача. При этом нужно учитывать, что часто различные вирусы и бактерии могу вызывать одинаковые симптомы заболевания. Разумеется, рассчитывать на высокую эффективность лечения при таких условиях невозможно. Но с появлением нового диагностического инструмента — анализа ПЦР — ситуация существенно изменилась! Теперь на основании данного анализа ветврач может точно определить заболевание и назначить эффективное лечение или скорректировать уже проводимое.

ПЦР (полимеразная цепная реакция) — высокоточный метод диагностики многих инфекций, который основывается на исследовании генетического материала животных (ДНК и РНК). Это один из самых точных и чувствительных методов диагностики инфекционных заболеваний.

ДОСТОИНСТВА МЕТОДА

Универсальность. ПЦР позволяет обнаруживать любые ДНК и РНК, даже когда бессильны другие методы.

Специфичность. При поиске определяется вид конкретного возбудителя. Кроме того в одном биологическом материале, возможен поиск нескольких возбудителей без ущерба для качества полученных данных.

Чувствительность. Результат будет получен даже при минимальном содержании возбудителя в материале, например, на начальной стадии заболевания или если заболевание не вылечено окончательно. А лечение болезни на раннем этапе значительно повышает эффективность и скорость выздоровления пациента, предотвращает риски осложнений.

Оперативность. Результат анализа готов уже через сутки.

Так как все инфекции собак и кошек можно разделить на несколько групп: системные, кровопаразитарные, офтальмологические, респираторные, дерматофитозные, половые, желудочно-кишечные, то и забор материала должен проводиться с соответствующих мест. Материалом для исследования может служить: кровь, слюна, мокрота, фекалии, соскобы и суспензии клещей.

Несмотря на вышеуказанные трудности ПЦР остается наиболее доступным и совершенным на сегодняшний день приемом диагностики.

КАКИЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ ОПРЕДЕЛЯЮТСЯ МЕТОДОМ ПЦР?

1. Герпесвирусная инфекция — приводит к абортам, высокой смертности новорожденных (инфицирование почти в 60% случаев).
2. Калицивирус — тяжело протекает у котят, в то же время 25-80% переболевших взрослых животных становятся носителями и являются источником заражения, передавая вирус через слюну.
3. Панлейкопения — вирусное заболевание кошек, характеризующееся резким падением уровня лейкоцитов, гастроэнтеритом, ринитами с конъюнктивитами, высокой смертностью (30-90 %) заболевших котят.
4. 4. Короновирусная инфекция — тяжелое заболевание, возбудителем которого является РНК-содержащий высокопатогенный вирус.
5. Иммунодефицит кошек и лейкемия кошек — вирус поражает иммунную и нервную системы.
6. Аденовирус и чума плотоядных у собак проявляется комплексом симптомов: лихорадка, конъюнктивиты и ринотрахеиты, расстройство желудочно-кишечного тракта, поражение нервной системы.
7. Токсоплазмоз — промежуточными хозяевами могут быть кошка, собака, человек. Клинические симптомы зависят от пораженных органов: могут наблюдаться неврологические нарушения (тремор, паралич) или нарушения походки, атрофия мышц, а также миокардит и гепатит.
8. Хламидиоз — у кошек заболевание проявляется в основном в форме гнойных и негнойных конъюнктивитов и кератитов, также могут наблюдаться ринит, пневмония, вагинит, аборты и бесплодие. У котят встречается конъюнктивит. У собак симптомы разнообразны и проявляются воспалительными заболеваниями конъюнктивы, половых органов, гастритами, артритами, абортами и бесплодием. Есть данные о роли хламидий в развитии атеросклероза у собак.
9. Микоплазмоз — протекает с признаками бронхопневмонии, кератоконъюктевитов и кератитов.
10. Пироплазмоз, анаплазмоз, боррелиоз — заболевания, переносимые клещами.

Все перечисленные заболевания очень коварны, так как легко и быстро передаются от больных животных здоровым (а также людям) и имеют высокий показатель смертности при отсутствии должного лечения.

ПЦР-метод позволяет гарантированно обнаруживать даже единичных возбудителей в биологическом материале за короткий промежуток времени, благодаря чему врач может поставить точный диагноз, назначить адекватное лечение и разработать профилактические мероприятия.

Радюк Екатерина Васильевна – врач-лаборант ИВЦ МВА

Инфекционные заболевания весьма часто встречаются в ветеринарной практике. Для владельца животного важно вовремя обратить внимание на симптомы недомогания питомца. Для большинства инфекционных заболеваний эти симптомы неспецифичны: угнетение, отказ от корма, повышенная температура тела, рвота, понос; при некоторых заболеваниях встречается хромота и опухание суставов; возможно изменение цвета мочи.

Для ветеринарного врача, к которому приводят заболевшее животное, важно составить список дифференциальных диагнозов и исключить (или подтвердить) их специальными методами диагностики. Однако стоит помнить, что выбор диагностического метода будет зависеть от вида возбудителя, его локализации и стадии заболевания. Методика, применимая для диагностики одной инфекции, совершенно неприемлема для диагностики другой.

В данной статье представлен обзор основных методов диагностики инфекционных заболеваний, которыми располагает современная ветеринарная медицина.

Возбудители многих заболеваний, как правило, достаточно требовательны к питательным средам и достаточно сложны для культивирования invitro. Не для всех возбудителей определены условия культивирования. В некоторых случаях используют синтетические или полусинтетические среды – однако при этом рост возбудителей очень медленный (до нескольких месяцев) и всегда присутствует значительный риск грибковой или бактериальной контаминации, несмотря строгое соблюдение асептики. Кроме того, проведение работ по культивированию возможно только в специализированных микробиологических лабораториях. Поэтому в ветеринарии данный метод не нашел широкого применения при диагностике инфекционных заболеваний; работы, связанные с культивированием возбудителей, проводятся, как правило, только в специальных исследовательских институтах с целью их более детального изучения и разработки диагностических тест-систем.

2. Световая микроскопия

1) Микроскопия фиксированных окрашенных препаратов

Является наиболее доступным и потому распространенным методом диагностики инфекционных (особенно трансмиссивных) заболеваний в ветеринарной медицине. Основан на выявлении возбудителя в клиническом материале по характерной морфологии. Однако, несмотря на свою простоту и доступность, у этого метода есть свои недостатки.

Во-первых, у метода световой микроскопии достаточно ограниченная чувствительность. При незначительном количестве возбудителей в материале результат микроскопии может быть отрицательным.

Во-вторых, необходимо тщательное приготовление и окраска мазков для минимизации возможных артефактов.

В-третьих, лаборанту или врачу, интерпретирующему мазок, требуется достаточный опыт и хорошее знание морфологии как клеток тканей, так и возбудителей и умение отличать последних от возможных рефракционных артефактов или преципитатов красителя. И, в-четвертых, точное определение вида возбудителя при использовании только световой микроскопии возможно далеко не всегда. Поэтому световую микроскопию стараются дополнять другими методами диагностики, основанными на обнаружении специфических антител либо генетического материала возбудителя.

2)Темнопольная микроскопия

Вид оптической микроскопии, в которой контраст изображения увеличивают за счет регистрации только света, рассеянного изучаемым образцом. Как правило, используется для обнаружения спирохет - боррелий и лептоспир. Из-за необходимости наличия специального оборудования в рутинной ветеринарной практике применяется редко. Кроме того, с помощью темнопольной микроскопии невозможно определить видовую принадлежность возбудителя и его патогенность.

3. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – это метод ферментативного получения ампликонов (большого количества копий) исследуемых фрагментов ДНК путем повторных циклов репликации и денатурации (разделения цепи ДНК на отдельные нити); при этом происходит копирование только исследуемого участка ДНК (при условии его присутствия в данном образце), поскольку только этот участок соответствует заданным условиям.

Метод ПЦР идеально подходит для обнаружения микроорганизмов, трудно визуализирующихся, медленно растущих или сложных в культивировании. ПЦР является наиболее предпочтительным методом для диагностики заболевания в острый период. Основным лимитирующим фактором при использовании ПЦР является содержание в исследуемой пробе достаточного количества материала (нуклеиновой кислоты возбудителя). Для многих возбудителей известно, что их количество в крови меняется с течением времени; таким образом, в какой-то момент времени ПЦР может показать ложноотрицательный результат у инфицированного пациента. Таким образом, для врача крайне важно знать тропность возбудителя к тканям организма и отправлять на исследование тот материал, в котором вероятность обнаружения возбудителя наиболее высока (например, мочу – при диагностике лептоспироза, плаценту или пунктат семенников при подозрении на бруцеллез, синовиальную жидкость - при исследовании на боррелиоз).

4. Серологические методы диагностики

Данные методы основаны на выявлении у животных специфических антител. Заражение инфекционным агентом, если оно происходит впервые, в течение недели вызывает у животного умеренный рост иммуноглобулинов класса М (IgM) и постепенное увеличение иммуноглобулинов класса G (IgG), которое достигает пика через 14 дней. Определение уровня антител у животных с остро начинающимся заболеванием (таким как бабезиоз) дает мало полезной диагностической информации. Для диагностики хронических заболеваний (например, моноцитарного эрлихиоза) измерение уровня антител будет более полезным.

Продукция антител у каждого животного может сильно варьироваться; этот процесс зависит от возраста, иммунного статуса и генетической принадлежности. Лучший способ оценки степени сероконверсии заключается в исследовании парных сывороток, взятых с интервалом в 2-3 недели. Растущий титр антител указывают на недавнюю и, следовательно, клинически значимую инфекцию, особенно если это подтверждается соответствующими клиническими признаками. Альтернативным методом определения недавней инфекции является измерение уровня IgM, однако в ветеринарной практике данный метод практически не используется.

1) Твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА, ELISA)

Принцип метода заключается в том, один их специфических реагентов (антиген) иммобилизуют на твердой фазе. Затем последовательно добавляют другие специфические реагенты, проводя после инкубации каждого из них промывку с целью удаления несвязавшихся компонентов. Один из специфических реагентов, так называемый конъюгат, содержит ферментную метку. Для визуализации результата в конце реакции добавляют хромогеновый субстрат. Через определенный промежуток времени реакцию останавливают и проводят считывание на спектрофотометре.

Для определения титра антител в сыворотке готовят несколько последовательных разведений; титр антител определяется как обратный последнему видимому разведению (к примеру, если последнее разведение было 1:2000, то титр антител составит 2000). Метод твердофазного ИФА является наиболее предпочтительным для определения наличия антител к возбудителям, антигены которых легкодоступны (т.е. это либо легко культивируемые микроорганизмы, либо те, для которых получены рекомбинантные антигены). Кроме того, он может использоваться и для выявления антигенов возбудителя – например при диагностике инвазии Dirofilariaimmitisили вируса лейкемии кошек.

Для использования полноценного твердофазного иммуноферментного анализа необходимо наличие специального лабораторного оборудования. Однако существует экспресс-модификация ИФА (SNAP, IDEXX Laboratories), где антиген/антитела иммобилизированы не на плашке, а на мембранном фильтре. Эти тесты широко используются в клиниках для диагностики трансмиссивных заболеваний (лейшманиоза, дирофиляриоза, анаплазмоза, эрлихиоза и боррелиоза). Однако они не дают возможность зафиксировать рост или снижение титра антител, а также определить их принадлежность к M или G классу.

2) Метод флюоресцирующих антител (МФА, IFA)

В случае, когда культивирование микроорганизма сопряжено с техническими сложностями либо небезопасно, применяют метод иммунофлюоресценции. При этом может быть обнаружен как сам организм в зараженных клетках и тканях пациента (прямой МФА) либо наличие в сыворотке специфичных антител (непрямой МФА). В непрямом МФА зараженные клетки (как правило, культурального происхождения) зафиксированы на предметных стеклах либо планшетках. Сама процедура исследования схожа с таковой в ИФА. Однако в конъюгате вместо фермента здесь используется специальный краситель, дающий при определенной длине волны флюоресцентное свечение, которое можно видеть в специальный микроскоп. Количество антител также определяется по последнему разведению, давшему положительный результат.

Прямой МФА считается менее чувствительным; используется в тех случаях, когда число зараженных клеток невелико (например, для выявления в мазках крови морул Anaplasmaphagocytophilum).

3) Иммуноблот (вестерн-блот)

Таким образом, в статье были рассмотрены основные методы, применяемые сегодня для диагностики инфекционных заболеваний животных. Особое внимание хотелось бы уделить тому, что не существует какого-либо универсального метода для диагностики того или иного заболевания. Поэтому от врача при постановке диагноза требуется комплексный подход; необходимо учитывать анамнез, длительность заболевания, клинические признаки и данные общих лабораторных исследований.

Кроме того, необходимо умение правильно интерпретировать результаты – ведь даже обнаружение антител (особенно класса G) к тому или иному возбудителю не говорит о том, что именно этот этиологический агент является причиной нынешнего состояния животного. Только грамотное применение и интерпретация специальных методов исследования (не только при диагностике трансмиссивных заболеваний) в сочетании с клинической картиной дает возможность правильно поставить диагноз и назначить адекватное лечение.

Стадии ПЦР

Следует отметить, что для получения достоверного результата ПЦР-анализа необходимым условием является соблюдение правил отбора, хранения и транспортировки клинического материала. Несмотря на то, что ПЦР является очень чувствительным методом, желательно наличие определенного количества возбудителя в пробе.

Взятие материала для ПЦР-исследования следует проводить в одноразовых неталькованных перчатках (так как тальк угнетает ПЦР). При взятии соскобов и смывов следует пользоваться одноразовыми стерильными зондами с повышенной адсорбцией (имеющими на конце щеточку), так как они отбирают оптимальное количество материала.

Соскобы и смывы со слизистых оболочек носа, ротовой полости, влагалища, конъюнктивы отбирают в одноразовые пластиковые микропробирки - эппендорфы - объемом 1,5 мл, в которые разлито по 0,5 мл стерильного физиологического раствора. Желательно не использовать зонды с ватными наконечниками. Следует также избегать отламывания кончика зонда в пробирку с физиологическим раствором, так как это затрудняет дальнейшую обработку и повышает риск перекрестной контаминации проб. Для получения необходимого количества материала достаточно вращать зонд в пробирке в течение 1-2 минут, избегая разбрызгивания жидкости. Проба должна быть мутной на вид, а при отстаивании в ней должен образовываться небольшой осадок.

Сперму отбирают в стерильные одноразовые пробирки или флаконы.

Моча. Отбирают первую порцию утренней мочи в количестве не менее 20-40 мл в стерильный сухой флакон или пробирку.

Фекалии. Отбирают пробы массой 1-3 грамма из предварительно продезинфицированного и вымытого лотка, одноразовыми лопаточками переносят в стерильный флакон.

Кусочки пораженных органов от павших животных отбирают в стерильные одноразовые контейнеры или в чистые стеклянные или пластиковые емкости.

Следует строго соблюдать температурные режимы хранения и транспортирования отобранного материала. Транспортирование осуществляют в термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом. При хранении материала более суток его необходимо заморозить при Т минус 20°С.

Наиболее часто встречающимися заболеваниями у кошек и собак являются конъюнктивит, ринотрахеит, а также энтерит. Для того чтобы выяснить этиологию заболевания, требуется провести качественную лабораторную диагностику.

Причиной коньюнктивитов или инфекций верхнего респираторного тракта у кошек может быть инфицирование следующими микроорганизмами: герпесвирус типа 1 (FHV1), калицивирус кошек, Chlamediapcittaci. Mycoplasma felis, Bordetella bronchiseptica, Feline reovirus, Staphylococ-cuc aureus, Brohaemolytic streptococcic и Salmonella tephimurium.

Наиболее частой причиной, по данным различных авторов и методов исследования, являются герпес-вирус типа FHY1 (от 10% до 34%) и калицивирус кошек (от 20% до 53%). Chlamydia pcittaci (от 10% до 35%).

Герпесвирусная инфекция, ассоциирована абортами, высокой смертностью новорожденных (инфицирование почти 60% случаев) с признаками интерстициальной пневмонии.
Калицивирус - тяжело протекает у котят, в то же время 25-80% переболевших взрослых животных становятся носителями и являются источником заражения, передавая вирус через слюну.

Панлейкопения - контагиозное вирусное заболевание кошек, характеризующееся резким падением уровня лейкоцитов, гастроэнтеритом, ринитами с конъюнктивитами, высокой смертностью (30-90 % заболевших котят).

Настоящим бичом для питомников является инфекционный перитонит кошек - тяжелое заболевание, возбудителем которого является РНК-содержащий высокопатогенный вирус. Вирус реплицируется в миндалинах и энтероцитах тонкого кишечника, рассеиваясь по организму через макрофаги и моноциты. Коронавирусы с низкой вирулентностью вызывают энтериты средней тяжести, чаще всего у котят после отъема от матери. Высоковирулентный коронавирус может привести к развитию сухого или выпотного перитонита. Перитонит часто сопровождается почечной недостаточностью, печеночными и неврологическими симптомами.

При инфицировании аденовирусами обоих типов и вирусом чумы плотоядных у собак проявляется общий комплекс симптомов: лихорадка, конъюнктивиты и ринотрахеиты, расстройство желудочно-кишечного тракта, поражение нервной системы.

При чуме плотоядных клинические признаки могут включать серозно-слизистые назальные и конъюнктивальные выделения, кашель, одышку, пневмонию, рвоту и понос, а также лихорадку и гиперкератоз.

Аденовирус плотоядных. Возбудитель - ДНК-содержащий аденовирус плотоядных первого типа (вызывает инфекционный гепатит плотоядных) и второго типа (вызывает аденовироз собак). Наблюдаются лихорадка, апатия, анорексия, жажда, рвота и понос, болезненность брюшной стенки при пальпации. Иногда развиваются конъюнктивит, кератит, светобоязнь. Могут быть точечные кровоизлияния на слизистой оболочке и коже. Редко наблюдаются неврологические нарушения.

Все перечисленные заболевания имеют высокий индекс контагиозности и ассоциированы с высокой смертностью среди щенков, от парвовирусного энтерита погибает 10-50% заболевших щенков, при инфицировании не вакцинированных щенков вирусом чумы плотоядных смертность доходит до 100%.

Токсоплазмоз. Возбудитель - простейшее Toxoplasma gondii. Размножение возбудителя происходит у кошек на стенках кишечника. С калом они выделяют во внешнюю среду ооцисты.

Тканевые цисты могут вызывать анорексию, угнетение, кератиты, желтуху, рвоту, понос и неврологические симптомы в зависимости от пораженных органов. У собак клинические симптомы зависят от пораженных органов: могут наблюдаться неврологические нарушения (тремор, атаксия, паралич) или токсоплазмозный миозит (нарушение походки, атрофия мышц, ригидность), а также миокардит и гепатит.

Хламидиоз и орнитоз. Возбудители у кошек - Chlamydophila felts, у собак - Chlamydophila abortus, Ch. pecorum, у тех и у других заболевание может вызывать Ch. psittaci. У птиц - Ch. psittaci.
У кошек заболевание проявляется в основном в форме гнойных и негнойных конъюнктивитов и кератитов, также могут наблюдаться ринит, пневмония, вагинит, аборты и бесплодие. У котят встречается неонатальныи хламидиозный конъюнктивит. У собак симптомы разнообразны и проявляются воспалительными заболеваниями конъюнктивы, половых органов, гастритами, артритами, абортами и бесплодием. Есть данные о роли хламидий в патогенезе атеросклероза у собак.

Микоплазмоз. Возбудители - микроорганизмы рода Mycoplasma. Протекает с признаками бронхопневмонии, кератоконъюктевитов и кератитов.

Вирусный иммунодефицит кошек. Иммунодефицит кошек - тяжелое заболевание, вызываемое вирусом из семейства Retrovoridae, рода Lentivirus. Вирус поражает иммунную и нервную системы. Обладает тропизмом к Т-лимфоцитам. В результате иммунодепрессии организм становится беззащитным против бактерий, грибов, вирусов и погибает от вторичной инфекции.
Клинические признаки развиваются медленно, и заболевание чаще регистрируется среди кошек 6-10 лет.

Встречаются у домашних животных и такие заболевания как: лептоспироз собак, листериоз кошек и собак, иерсиниоз щенков, бруцеллез, ротовирусный энтерит, бешенство.

Правильность постановки ПЦР-анализа и качественное выделение инфекции зависит, в первую очередь, от правильности взятия материала, во-вторых, от соблюдения температурного режима хранения и транспортирования проб. Поступившая в лабораторию проба регистрируется, проходит все стадии ПЦР, подвергается электрофоретической детекции с последующей выдачей конечного результата.

Таким образом, высокая чувствительность и специфичность ПЦР-метода позволяет гарантированно обнаруживать единичных возбудителей в биологическом материале за короткий промежуток времени, что позволяет поставить точный диагноз, назначить адекватное лечение и разработать профилактические мероприятия.

И.М. Донник, член-корреспондент РАСХН, д.б.н., профессор, Н.А. Пелевина, м.н.с, О.Г. Бодрова, м.н.с,
ГНУ Уральский государственный научно-исследовательский ветеринарный нститут РАСХН