Что такое вирусные векторы
Аннотация научной статьи по биотехнологиям в медицине, автор научной работы — Епифанова Е.А., Борисова Е.В., Салина В.А., Бабаев А.А.
Вирусные векторы современный инструмент для доставки генетического материала в клетку. Рассмотрены различные типы вирусных векторов , таких как ретровирусные, аденоассоциированные и лентивирусные векторные системы, векторные системы на основе аденовирусов, вируса герпеса простого и поксвирусов. Более подробно представлены аденоассоциированные векторные системы. Их основные преимущества (способность интегрировать целевой ген в нужное место генома хозяина, что предотвращает нежелательные мутации; встраивание как в делящиеся, так и в покоящиеся клетки; широкий профиль трансдукции; низкий иммунный ответ; сильная и устойчивая экспрессия трансгена) сделали эти векторы популярным и универсальным инструментом для доставки генов in vitro и in vivo. Показаны возможности применения вирусных векторов в нейробиологии .
Похожие темы научных работ по биотехнологиям в медицине , автор научной работы — Епифанова Е.А., Борисова Е.В., Салина В.А., Бабаев А.А.
Viral Vectors for Delivering Gene Material into Cells and Their Application in Neurobiology (Review)
Viral vectors are modern tools for delivering genetic material into cells. Various types of viral vectors based on retroviruses, adeno-associated and lentiviral viruses, adenoviruses, herpes simplex and poxviruses are considered in this work. Adeno-associated vector systems are presented in more detail. Their main advantages (ability to integrate a target gene into the proper site of the host genome, preventing undesirable mutations; entering both dividing and nondividing cells; a wide transduction profile; low immune response; strong and stable transgene expression) have made these vectors a widely used and universal tool for transferring genes in vitro and in vivo. Possible applications of viral vectors in neurobiology are also shown.
1я доставки ериалав клетку 1ание в нейробиологии (обзор)
Е.А. Епифанова, магистрант, лаборант лаборатории генно-инженерных технологий Института биологии и биомедицины;
Е.В. Борисова, аспирант, младший научный сотрудник лаборатории генно-инженерных технологий Института биологии и биомедицины;
В.А. Салина, аспирант, младший научный сотрудник лаборатории генно-инженерных технологий Института биологии и биомедицины;
А.А. Бабаев, к.б.н., доцент кафедры молекулярной биологии и иммунологии; старший научный сотрудник лаборатории генно-инженерных технологий Института биологии и биомедицины
Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского, Н. Новгород, 603950, проспект Гагарина, 23
Вирусные векторы — современный инструмент для доставки генетического материала в клетку. Рассмотрены различные типы вирусных векторов, таких как ретровирусные, аденоассоциированные и лентивирусные векторные системы, векторные системы на основе аденовирусов, вируса герпеса простого и поксвирусов. Более подробно представлены аденоассоциированные векторные системы. Их основные преимущества (способность интегрировать целевой ген в нужное место генома хозяина, что предотвращает нежелательные мутации; встраивание как в делящиеся, так и в покоящиеся клетки; широкий профиль трансдукции; низкий иммунный ответ; сильная и устойчивая экспрессия трансгена) сделали эти векторы популярным и универсальным инструментом для доставки генов in vitro и in vivo. Показаны возможности применения вирусных векторов в нейробиологии.
Ключевые слова: вирусные векторы; аденоассоциированные вирусные векторы; хелперные плазмиды; трансфекция; нейро-биология.
Viral Vectors for Delivering Gene Material into Cells and Their Application in Neurobiology (Review)
E.A. Еpifanova, Master's degree Student, Laboratory Assistant, Laboratory of Genetic Engineering Technologies of the Institute of Biology and Biomedicine;
Е.V. Borisova, PhD Student, Junior Researcher, Laboratory of Genetic Engineering Technologies of the Institute of Biology and Biomedicine;
V.A. Salina, PhD Student, Junior Researcher, Laboratory of Genetic Engineering Technologies of the Institute of Biology and Biomedicine;
Для контактов: Епифанова Екатерина Алексеевна, e-mail: epifa888@mail.ru
А.А. Babaev, PhD, Associate Professor, Department of Molecular Biology and Immunology; Senior Researcher, Laboratory of Genetic Engineering Technologies of the Institute of Biology and Biomedicine
Lobachevsky State University of Nizhni Novgorod, 23 Prospect Gagarina, Nizhny Novgorod, 603950, Russian Federation
Viral vectors are modern tools for delivering genetic material into cells. Various types of viral vectors based on retroviruses, adeno-associated and lentiviral viruses, adenoviruses, herpes simplex and poxviruses are considered in this work. Adeno-associated vector systems are presented in more detail. Their main advantages (ability to integrate a target gene into the proper site of the host genome, preventing undesirable mutations; entering both dividing and nondividing cells; a wide transduction profile; low immune response; strong and stable transgene expression) have made these vectors a widely used and universal tool for transferring genes in vitro and in vivo. Possible applications of viral vectors in neurobiology are also shown.
Key words: viral vectors; adeno-associated viral vectors; helper plasmids; transfection; neurobiology.
В настоящее время вирусные векторы — распространенный инструмент для доставки генетического материала в клетку. Именно благодаря особенностям жизненного цикла вирусов первые векторы (носители трансгенов) стали разрабатывать на их основе [1]. Вирусы переносят чужеродные гены, которые способны экспрессироваться в зараженных клетках [2]. Сейчас вирусы эволюционировали в специализированные молекулярные механизмы, способные эффективно транспортировать их геномы внутрь клеток, которые они заражают [3].
Разнообразие вирусных векторов велико, и каждый имеет свои преимущества и недостатки. Сейчас значительные усилия направляются на разработку вирусных векторов с улучшенными характеристиками безопасности и большей эффективностью доставки нуклеиновой кислоты в клетки, а также на обеспечение длительной и тканеспецифичной экспрессии введенного генетического материала. Потенциально вирусные векторы могут применяться как один из способов доставки генов в генной терапии новообразований и наследственных заболеваний.
Рекомбинантные аденоассоциированные вирусы (рААВ) являются одними из наиболее перспективных векторов доставки для генной терапии благодаря своим непатогенным свойствам, отсутствию иммуноген-ности со стороны хозяина и тропности к большинству клеток и тканей [4]. Аденоассоциированные вирусные векторы по своим характеристикам приближаются к идеальному вектору [5].
Вирусные векторы нашли свое применение и в ней-робиологии в качестве систем эффективной доставки генов в нейроны и другие нейрональные клетки in vitro и in vivo. Вирусные векторы позволяют вести наблюдение за нейробиологическими функциями, изменять экспрессию целевых генов, метить клетки для определения их судьбы и менять физиологическое состояние специфических клеточных популяций. Использование вирусных векторов для доставки генов в нервную систему имеет большие перспективы как для фундаментальных исследований, так и для терапевтического применения.
Типы вирусных векторов, используемых в нейробиологии
навать клетки-мишени. Поэтому для доставки генов в эукариотические клетки с начала 1980-х гг. разрабатываются векторные генетические конструкции [11].
Ретровирусные векторные системы
Ретровирусы относятся к группе вирусов, РНК-геном которых в инфицированных клетках конвертируется в ДНК. Геном ретровирусов образован плюс-цепью РНК и включает три структурных гена (gag, pol и env), фланкированных длинными терминальными повторами (LTR, long terminal repeat) [12]. В LTR содержатся регуляторные элементы, которые играют роль во встраивании ретровируса и необходимы для интеграции ДНК-копии генома вируса с геномом хозяина, а также определяют начало и конец вирусного генома. LTR также контролируют экспрессию вирусных генов [13]. Оболочка ретровирусов состоит из цитоплазма-тической мембраны зараженной клетки и вирусных белков [14]. Особенностью жизненного цикла ретро-вирусов является обратная транскрипция в зараженной клетке на матрице вирусной РНК с образованием двухцепочечной ДНК (провирус), которая затем встраивается в клеточный геном. Вирус встраивается в клеточный геном случайным образом, поэтому возрастает риск инсерционного мутагенеза. Так как эти вирусы заражают только делящиеся клетки (для проникновения в ядро необходимо разрушение ядерной оболочки клетки, происходящее в ходе митоза), ретровирусные векторы используют в основном для трансфекции клеток ex vivo или для лечения злокачественных опухолей [15]. Сами ретровирусные векторы получают на основе провируса, из которого удаляются гены gag, pol и env для предотвращения репродукции вируса и освобождения места для желаемого генетического материала. В вектор на основе ретровируса может быть включено до 8 тыс. пар оснований ДНК-вставки. Для репродукции вируса удаленные вирусные гены (gag, pol, env), которые кодируют вирусные белки и обеспечивают репродукцию вируса, встраивают в геном упаковывающей клеточной линии на разные хромосомы так, чтобы снизить вероятность обратной рекомбинации вирусных генов в исходный вирусный геном и образования вирусов, которые могут репродуцироваться [16].
Лентивирусные векторные системы
Лентивирусы относятся к семейству ретровирусов и в отличие от других ретровирусов инфицируют не только делящиеся, но и неделящиеся клетки. Наиболее исследованным лентивирусом является вирус иммунодефицита человека (ВИЧ). В связи со способностью лентивирусов включать большое количество генетического материала (до 8 тыс. пар оснований) и инфицировать делящиеся и неделящиеся клетки, эти вирусы являются перспективным вектором для доставки генов в условиях in vivo [17]. Геном ВИЧ
включает три гена структурных белков (gag, pol и env) и б генов регуляторных белков (tat, rev, vpr, vpu, nef и vif) [18, 19]. Некоторые гены могут быть исключены из генома вируса и при этом не вызвать снижения вирусной способности к размножению и инфицированию клеток. Лентивирусный жизненный цикл похож на жизненные циклы других ретровирусов, за исключением способности заражать и неделящиеся клетки. Эта способность обеспечивается взаимодействием вирусного преинтеграционного комплекса с ядерной оболочкой и транспортом через нее [2O]. Сборка лентивирусного вектора происходит в упаковывающих клетках — это перевиваемые клетки, осуществляющие синтез виру-соспецифических белков [21]. Упаковывающие клетки включают в себя пакующую, векторную и оболочечную кассеты, которые вместе позволяют собрать функциональную вирусную частицу [22, 23]. При этом их одновременная экспрессия не вызывает образования ретровирусных частиц, способных инициировать инфекционный процесс у человека [24].
Лентивирусы имеют сравнительно небольшой объем вставки целевого гена (до 8 тыс. пар оснований), могут обеспечить длительную экспрессию трансгена и индуцируют минимальный иммунный ответ организма-хозяина [25]. Некоторые авторы считают эти векторы малоподходящими для доставки in vivo, так как они увеличивают риск инсерционного мутагенеза. Однако при использовании лентивирусов для трансдукции дифференцированных клеток риск инсерционного мутагенеза меньше, чем при использовании других ре-тровирусов [2б].
Векторные системы на основе аденовирусов
Аденовирусы — семейство ДНК-вирусов, несущих в своем составе одну двуцепочечную молекулу ДНК и лишенных липидной оболочки. Аденовирусы разделены на основе связывания со специфическими сыворотками на 51 серотип [27], а по способности агглютинировать эритроциты у людей, кроликов и мышей и по онкогенности для грызунов — еще на б субгрупп (от A до F) [28]. Аденовирусы разных субгрупп поражают различные органы и ткани человека [29].
Создание рекомбинантных аденовирусных векторов во многом схоже с созданием лентивирусных векторов. Аденовирусы, дефектные по репликации, получали за счет замены гена Е1, необходимого для репликации, на ген интереса, промотор и энхансер [3O]. При этом такие рекомбинантные векторы эффективно размножаются в пакующих клетках, экспресси-рующих продукт гена Е1. Неспособные к репликации вне пакующих клеток аденовирусные векторы используют для введения трансгенов в условиях in vivo [31]. Рекомбинантные аденовирусные векторы обеспечивают очень высокую экспрессию клонированных генов, но на короткое время (5-1O сут) — из-за иммунного ответа организма-реципиента [32]. Для решения этой проблемы было создано второе поколение аденови-
русных векторов, у которых дополнительно к гену Е1 удалили гены, отвечающие за репликацию вируса, и оставили только элементы, определяющие начало и конец генома и вирусную пакующую последовательность [33]. Такие векторы способны к более длительной экспрессии генов [14].
Аденовирусы способны инфицировать большинство типов клеток (делящиеся и неделящиеся). Объем для вставки целевого гена составляет 20 тыс. пар оснований, что является достаточно большой емкостью ре-комбинантных аденовирусных векторов. Аденовирусы реплицируются в ядре инфицированной клетки как эписомные элементы и обладают высокой эффективностью трансдукции. Так, например, после прямой внутричерепной инъекции рекомбинантного аденовируса была обнаружена его способность заражать нейроны, астроциты, олигодендроглию, эпендимоциты, хориои-дальный эпителий и микроглию [34, 35].
Векторные системы на основе вируса простого герпеса
Вирусные векторы на основе вируса простого герпеса (herpes simplex virus, HSV) имеют конструкцию проще, чем векторы на основе аденовирусов. Сам вирус включает около 80 генов, один из которых (IE3) чаще всего замещается при создании вектора [36]. Исключены могут быть и другие гены, что позволяет увеличить объем вектора или заклонировать несколько генов интереса. Недостатками векторов на основе вирусов простого герпеса являются кратковременная экспрессия клонированных генов, токсичность для клеток-мишеней, низкая эффективность трансдукции и способность заражать только неделящиеся клетки [37].
Для создания вирусных векторов сейчас активно используются ампликоны — многократно повторяющиеся последовательности вируса простого герпеса, которые включают мономерные последовательности, организованные как конкатемеры [38]. Каждый мономер включает хотя бы один участок начала репликации вирусной ДНК (oriS или oriL) и последовательность для упаковки ДНК в вирусную частицу (pac) [39]. Молекулярное клонирование этих последовательностей в бактериальную плазмиду позволяет получить вектор, который упаковывает ДНК в вирион HSV. Такие векторные системы способны включать до 150 тыс. пар оснований чужеродной ДНК, что предоставляет возможность одним вектором доставлять в клетку-мишень несколько транскрипционных единиц, не вызывая при этом иммунного ответа и цитопатического эффекта [40]. Особенность жизненного цикла вирусов простого герпеса — наличие двух стадий инфицирования: активной (проникновение и репродукция в клетках эпителия, приводящие к лизису клеток) и латентной (внедрение и репродукция в нервных клетках) [41]. Лизис клеток происходит за счет того, что при репликации вируса сформировавшиеся вирионы покидают клетку путем почкования ядерной мембраны.
Вирусы простого герпеса — нейротрофичны и высокоэффективны при изучении ретроградного и анте-роградного транспорта в ЦНС, могут быть введены в неопасном латентном состоянии. HSV-векторы имеют большую генетическую емкость и могут обеспечить долгосрочную экспрессию трансгена, однако, как отмечалось выше, основным недостатком их являются токсичность для клеток и низкая эффективность тран-сдукции [24].
Векторные системы на основе поксвирусов
Поксвирусы — крупные вирусы, которые содержат двунитевую ДНК. Поксвирусный вектор позволяет включить до 25 тыс. пар нуклеотидов ДНК интереса без исключения генов самого вируса. Векторные системы на основе поксвирусов не имеют такого широкого применения, поскольку эукариотические промоторы неэффективно распознаются транскрипционными механизмами поксвирусов и для эффективной экспрессии рекомбинантных генов в клетке-реципиенте нужно использовать поксвирусные промоторы [42]. Поксвирусные транскрипты не подвергаются сплайсингу, из-за чего ДНК интереса обязательно должна быть представлена в форме комплементарной ДНК. Особенностью жизненного цикла поксвирусов является наличие собственной ДНК-зависимой РНК-полимеразы, которая обеспечивает считывание более половины вирусного генома в течение начальной и ранней стадий репродуктивного цикла. Вследствие большого размера и неинфекционной природы поксвирусной ДНК чужеродные гены клонируются в поксвирусах путем рекомбинации в условиях in vivo. Поксвирусы обладают природным тропизмом к опухолевой ткани [43].
Главными недостатками поксвирусов являются высокая иммуногенность, кратковременная продолжительность экспрессии и сложности репликации в эукариотических клетках. При этом положительными сторонами поксвирусов служат высокая эффективность трансдукции, емкость и способность заражать большинство типов клеток [44].
Аденоассоциированные вирусные системы и их преимущества
Рекомбинантные аденоассоциированные вирусы (ААВ) являются одними из наиболее перспективных векторов доставки для генной терапии и нейробиоло-гии благодаря своим непатогенным свойствам, низкой иммуногенности со стороны хозяина, тропности к большинству клеток и тканей, высокой эффективности трансдукции и продолжительной экспрессии [45]. Основной их недостаток — небольшая емкость вектора (до 5 тыс. пар оснований).
Всего у ААВ известно 8 различных серотипов. ААВ2, ААВ3 и ААВ5 первоначально были выделены у обезьян [46]. Полагают, что ААВ6 был сформиро-
ван путем рекомбинирования ААВ2 и ААВ1, а именно 5'-конец ААВ2 слился с З'-концом ААВ1 (включая две открытые рамки считывания) [47, 48]. ААВ7 и ААВ8 были выделены от макаки-резуса при ПЦР-амплификации с использованием праймеров, полученных из консервативных областей серотипов ААВ1-ААВ6 [49]. Среди всех восьми серотипов ААВ2 является наиболее изученным и широко используется в качестве вектора доставки генов [5].
ААВ принадлежит к семейству РагуоуШав. Это группа безоболочечных вирусов, содержащих одноце-почечную ДНК. Вирусная частица имеет икосаэдриче-скую (20 граней) симметрию с диаметром 18-26 нм и молекулярную массу 5,5-6,2 МДа [50].
Наиболее характерными особенностями ядерной структуры являются группы тройных выступов и
- 7170
- 5,9
- 4
- 2
Смертельные клешни
Человечество столкнулось с этой загадочной болезнью еще до нашей эры. Ее пытались понять и лечить ученые мужи в самых различных уголках мира: в Древнем Египте — Еберс, в Индии — Сушрута, Греции — Гиппократ. Все они и многие другие медики вели борьбу с опасным и серьезным противником — раком. И хоть эта битва продолжается до сих пор, сложно определить, есть ли шансы на полную и окончательную победу. Ведь чем больше мы изучаем болезнь, тем чаще возникают вопросы — можно ли полностью излечить рак? Как избежать болезни? Можно ли сделать лечение быстрым, доступным и недорогим?
Мутации: погибнуть или жить вечно?
Рисунок 1. Генетическая модель рака: рак толстой кишки. Первый шаг — потеря или инактивация двух аллелей гена АРS на пятой хромосоме. В случае семейного рака (familiar adenomatous polyposis, FAP) одна мутация гена АРС наследуется. Потеря обоих аллелей ведет к образованию доброкачественных аденом. Последующие мутации генов на 12, 17, 18 хромосомах доброкачественной аденомы могут привести к трансформации в злокачественную опухоль. Источник: [1].
Очевидно, что развитие определенных видов рака включают в себя изменение большинства или даже всех этих генов и может проходить различными путями. Из этого следует, что каждую опухоль следует рассматривать как биологически уникальный объект. На сегодняшний день существуют специальные генетические информационные базы по раку, содержащих данные о 1,2 млн. мутаций из 8207 образцов тканей, относящихся к 20 видам опухолей: атлас Ракового Генома (Cancer Genome Atlas) и каталог соматических мутаций при раке (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer (COSMIC)) [2].
Рисунок 2. Распространение метастаз. Рисунок с сайта pharmaceuticalintelligence.com.
Однако клетки вооружены специальными механизмами, защищающими от развития опухолей:
- импринтинг — механизм эпигенетических модификаций, который контролирует нормальный рост и правильное развитие организма. Любые нарушения в метилировании определенных генов могут поспособствовать возникновению рака. Например, в исследованиях было обнаружено, что потеря импринтинга после инактивации материнского аллеля гена IgF2 увеличивает риск развития рака прямой кишки в раз [3];
- репарация ДНК (например, однонуклеотидная эксцизионная репарация защищает ДНК от мутаций, вызванных канцерогенными агентами) [4];
- контрольные точки клеточного цикла — используют специфичные белки-мессенжеры, такие как ATM, ATR и комплекс RAD17-RFC для поиска повреждений в молекулах ДНК. Сигнальные белки активируют р53 и инактивируют циклин-зависимые киназы, что, в свою очередь, ингибирует клеточный цикл от G1 до S (G1/S точка рестрикции), репликацию ДНК в S-фазе и G2-фазу (G2/M-точка рестрикции) [5];
- программируемая клеточная смерть — апоптоз и связанные регуляторные гены имеют огромное влияние на возникновение злокачественного фенотипа. Некоторые онкогенные мутации нарушают апоптоз, что приводит к инициации канцерогенеза и метастазирования [6];
- иммунная система — активация естественных киллеров (NK — natural killer cells), макрофагов, нейтрофилов, эозинофилов и специфических Т-цитотоксических клеток; синтез цитокинов и специфических антител [7].
Традиционные методы и их недостатки
- хирургическая (полное удаление опухоли). Используется, когда опухоль имеет небольшие размеры и хорошо локализована. Также удаляют часть тканей, которые контактируют со злокачественным новообразованием. Метод не применяется при наличии метастазов;
- лучевая — облучение опухоли радиоактивными частицами для остановки и предотвращения деления раковых клеток. Здоровые клетки тоже чувствительны к этому излучению и часто погибают;
- химиотерапия — используются лекарства, тормозящие рост быстро делящихся клеток. Лекарства оказывают негативное воздействие и на нормальные клетки.
Вышеописанные подходы не всегда могут избавить больного от рака. Часто при хирургическом лечении остаются единичные раковые клетки, и опухоль может дать рецидив, а при химиотерапии и лучевой терапии возникают побочные эффекты (снижение иммунитета, анемия, выпадение волос и др.), которые приводят к серьезным последствиям, а часто и к смерти пациента. Тем не менее, с каждым годом улучшаются традиционные и появляются новые методы лечения, которые могут победить рак, такие как биологическая терапия, гормональная терапия, использование стволовых клеток, трансплантация костного мозга, а также различные поддерживающие терапии. Наиболее перспективной считается генная терапия, так как она направлена на первопричину рака — компенсацию неправильной работы определенных генов.
Генная терапия как перспектива
По данным PubMed, интерес к генной терапии (ГТ) раковых заболеваний стремительно растет, и на сегодняшний день ГТ объединяет ряд методик, которые оперируют с раковыми клетками и в организме (in vivo) и вне его (ех vivo) (рис. 3).
Рисунок 3. Две основные стратегии генной терапии. Еx vivo — генетический материал с помощью векторов переносится в клетки, выращиваемые в культуре (трансдукция), а затем трансгенные клетки вводят реципиенту; in vivo — введение вектора с нужным геном в определенную ткань или орган. Картинка из [8].
В качестве вирусных векторов используют ретровирусы, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, лентивирусы, вирусы герпеса и другие. Эти вирусы отличаются по эффективности трансдукции, по взаимодействию с клетками (распознавание и заражение) и ДНК. Главным критерием является безопасность и отсутствие риска неконтролируемого распространения вирусной ДНК: если гены вставляются в неправильном месте генома человека, они могут создать вредные мутации и инициировать развитие опухоли. Также важно учитывать уровень экспрессии перенесенных генов, чтобы предотвратить воспалительные или иммунные реакции организма при гиперсинтезе целевых белков (Таблица 1).
| Вектор | Краткое описание |
|---|---|
| Вирус кори (measles virus) | содержит отрицательную последовательность РНК, которая не вызывает защитного ответа в раковых клетках |
| Вирус простого герпеса (HSV-1) | может переносить длинные последовательности трансгенов |
| Лентивирус | производный от ВИЧ, может интегрировать гены в неделящиеся клетки |
| Ретровирус (RCR) | не способный к самостоятельной репликации, обеспечивает эффективное встраивание чужеродной ДНК в геном и постоянство генетических изменений |
| Обезьяний пенистый вирус (SFV) | новый РНК-вектор, который передает трансген в опухоль и стимулирует его экспрессию |
| Рекомбинантный аденовирус (rAdv) | обеспечивает эффективную трансфекцию, но возможна сильная иммунная реакция |
| Рекомбинантный аденоассоциированный вирус (rAAV) | способен к трансфекции многих типов клеток |
Синтетические катионные липосомы в настоящее время признаны перспективным способом доставки функциональных генов. Положительный заряд на поверхности частиц обеспечивает слияние с отрицательно заряженными клеточными мембранами. Катионные липосомы нейтрализуют отрицательный заряд цепи ДНК, делают более компактной ее пространственную структуру и способствуют эффективной конденсации. Плазмидно-липосомный комплекс имеет ряд важных достоинств: могут вмещать генетические конструкции практически неограниченных размеров, отсутствует риск репликации или рекомбинации, практически не вызывает иммунного ответа в организме хозяина. Недостаток этой системы состоит в низкой продолжительности терапевтического эффекта, а при повторном введении могут появляться побочные эффекты [12].
Электропорация является популярным методом невирусной доставки ДНК, довольно простым и не вызывающим иммунного ответа. С помощью индуцированных электрических импульсов на поверхности клеток образуются поры, и плазмидные ДНК легко проникают во внутриклеточное пространство [13]. Генная терапия іn vivo с использованием электропорации доказала свою эффективность в ряде экспериментов на мышиных опухолях. При этом можно переносить любые гены, например, гены цитокинов (IL-12) и цитотоксические гены (TRAIL), что способствует развитию широкого спектра терапевтических стратегий. Кроме того, этот подход может быть эффективным для лечения и метастатических, и первичных опухолей [14].
Выбор техники
В зависимости от типа опухоли и ее прогрессии, для пациента подбирается наиболее эффективная методика лечения. На сегодняшний день разработаны новые перспективные техники генной терапии против рака, среди которых онколитическая вирусная ГТ, пролекарственная ГТ (prodrug therapy), иммунотерапия, ГТ с использованием стволовых клеток.
Для этой методики используются вирусы, которые с помощью специальных генетических манипуляций становятся онколитическими — перестают размножаться в здоровых клетках и воздействуют только на опухолевые. Хорошим примером такой терапии является ONYX-015 — модифицированный аденовирус, который не экспрессирует белок Е1В. При отсутствии этого белка вирус не может реплицироваться в клетках с нормальным геном p53 [15]. Два вектора, сконструированных на базе вируса простого герпеса (HSV-1) — G207 и NV1020 — также несут в себе мутации нескольких генов, чтобы реплицироваться только в раковых клетках [16]. Большим преимуществом техники является то, что при проведении внутривенных инъекций онколитические вирусы разносятся с кровью по всему организму и могут бороться с метастазами. Основные проблемы, которые возникают при работе с вирусами — это возможный риск возникновения иммунного ответа в организме реципиента, а также неконтролируемое встраивание генетических конструкций в геном здоровых клеток, и, как следствие, возникновение раковой опухоли.
Минус терапии состоит в том, что в опухолях присутствуют все защитные механизмы, свойственные здоровым клеткам, и они постепенно адаптируются к повреждающим факторам и пролекарству. Процессу адаптации способствует экспрессия цитокинов (аутокринная регуляция), факторов регуляции клеточного цикла (отбор самых стойких раковых клонов), MDR-гена (отвечает за восприимчивость к некоторым медикаментам).
Благодаря генной терапии, в последнее время начала активно развиваться иммунотерапия — новый подход для лечения рака с помощью противоопухолевых вакцин. Основная стратегия метода — активная иммунизация организма против раковых антигенов (ТАА) с помощью технологии переноса генов [?18].
Главным отличием рекомбинантных вакцин от других препаратов является то, что они помогают иммунной системе пациента распознавать раковые клетки и уничтожать их. На первом этапе раковые клетки получают из организма реципиента (аутологичные клетки) или из специальных клеточных линий (аллогенные клетки), а затем выращивают их в пробирке. Для того чтобы эти клетки могли узнаваться иммунной системой, вводят один или несколько генов, которые производят иммуностимулирующие молекулы (цитокины) или белки с повышенным количеством антигенов. После этих модификаций клетки продолжают культивировать, затем проводят лизис и получают готовую вакцину.
Когда было доказано, что большинство видов рака имеют специфические антигены и способны индуцировать свои защитные механизмы [22], была выдвинута гипотеза, что блокировка иммунной системы раковых клеток облегчит отторжение опухоли. Поэтому для производства большинства противоопухолевых вакцин в качестве источника антигенов используют опухолевые клетки пациента или специальные аллогенные клетки. Основные проблемы иммунотерапии опухолей — вероятность возникновения аутоиммунных реакций в организме больного, отсутствие противоопухолевого ответа, иммуностимуляция роста опухоли и другие.
Заключение
Если подвести итоги, можно с уверенностью говорить, что наступает эпоха персонализированной медицины, когда для лечения каждого онкобольного будет подбираться определенная эффективная терапия. Уже разрабатываются индивидуальные программы лечения, которые обеспечивают своевременный и правильный уход и приводят к значительному улучшению состояния пациентов. Эволюционные подходы для персонализированной онкологии, такие как геномный анализ, производство таргетных препаратов, генная терапия рака и молекулярная диагностика с использованием биомаркеров уже приносят свои плоды [17].
Рак: узнать, предупредить и устранить болезнь.
Читайте также:
