Индекс стимуляции при туберкулезе
Основными методами активного выявления туберкулезной инфекции у детей в России остаются проба Манту с 2 ТЕ ППД-Л (туберкулин) и диаскинтест (ДСТ) [3, 4].
В качестве альтернативных специфических тестов в последнее время в нашей стране используются тесты in vitro. Гибрид двух антигенов — ESAT6 и CFP10 — включен в специфические диагностические тесты, основанные на продукции ИФН-g в ответ на стимуляцию этими антигенами (IGRA – Interferon Gamma Release Assays) [7]. Тесты IGRA оказались высокоспецифичными (до 99%), но имели низкую чувствительность [1, 5, 13].
Для повышения специфичности и чувствительности иммуноферментного анализа (ИФА) продолжаются поиски более специфичных антигенов, в том числе полученных генно-инженерным путем [6]. Среди нескольких групп антигенов M. tuberculosis с протективной активностью центральное место занимают секретируемые белки [12].
Недавно у лиц, инфицированных МБТ, был обнаружен белок CFP32 [11]. По результатам ИФА у 32% больных легочной формой туберкулеза в сыворотке обнаруживались антитела против CFP32, а сам белок выявлялся в сыворотке 56% больных [11]. Результаты другого исследования показали, что CFP32 (также известен как Rv0577 и TB27.3) мог регулировать врожденный и адаптивный иммунитет [8].
Группа ученых под руководством профессора Андерсена (2011) обнаружила шесть генов, экспрессия которых не зависела от стадии инфекции, и продуктом одного из этих генов являлся белок Rv2660c. В исследованиях Stefan Ehlers и Ulrich E. Schaible (2013) Rv2660c определялся на протяжении всего периода инфекции у мышей, но при этом оставался слабым индуктором ИФН-g [9].
Таким образом, несмотря на проводимые исследования, данные по специфическим антигенам противоречивы; требуется дальнейшее их изучение.
Цель исследования
Оценка специфических антигенов для ранней диагностики туберкулезной инфекции у детей.
Материал и методы исследования
Диагноз ТБ основывался на результатах клинических, лабораторных, в том числе бактериологических (бактериоскопия на кислотоустойчивые микобактерии – окраска мазка патологического материала по Циль—Нильсену, посев на МБТ – на жидкие среды системы Bactec 960 и твердые среды Левенштейна—Йенсена), молекулярно-генетических (ПЦР на ДНК к МБТ), лучевых (рентгенография органов грудной клетки, простая томография и мультиспиральная компьютерная томография органов грудной клетки, ультразвуковое исследование органов брюшной полости) методов. Учитывались результаты туберкулинодиагностики (проба Манту с 2 ТЕ ППД-Л) и пробы с ДСТ.
Дополнительно всем детям было проведено специфическое иммунологическое исследование. Исследование включало определение ИФН-g в цельной крови после 72-часовой индукции специфическими антигенами: ППД-Л, CFP32B, Rv2660c, ESAT6, 85а, ESAT6-CFP10. Оценку уровня специфического ИФН-g проводили по определению индекса стимуляции (и.с.) и в пг/мл [2]. Специфические антигены (CFP32B, Rv2660c, ESAT6, 85а, ESAT6-CFP10) были выделены в лаборатории трансляционной биомедицины отдела генетики и молекулярной биологии бактерий ФНИЦ эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи.
Размер выборки пациентов, минимально достаточный для получения доказательных данных, был рассчитан в программе OpenEpi, версии 3. Полученные данные обрабатывались с использованием статистических программ Statistica 6,0 и Biostat.
На проведение данного исследования получено разрешение этического комитета Омской государственной медицинской академии (протокол № 51 от 10.10.2012 г.). Для участия детей в иммунологическом исследовании от родителей или их законных представителей было получено добровольное информированное согласие.
Публикация подготовлена в рамках поддержанного РГНФ научного проекта № 16-16-55001 (исследование проведено за счет средств областного бюджета Омской области и Фонда).
Результаты исследования и их обсуждение
Средний возраст детей, включенных в исследование, составил 6,9±0,7 лет, девочек было 53,7% (N=54, n=29) и мальчиков 46,3% (N=54, n=25). Половина детей была из социально-благополучных семей (N=54, n=27). Из социально-неблагополучных семей в основном были дети с установленным диагнозом ТБ (р=0,005), также чаще эти дети были из семейного (р=0,015), бациллярного (р=0,013) очага туберкулеза. Среди детей с ЛТИ чаще регистрировали отягощенный аллергологический анамнез (р=0,001), частые респираторные заболевания (р=0,027).
Среди детей, больных ТБ, уровень чувствительности к ППД-Л был достоверно выше, чем среди детей с ЛТИ и не инфицированных МБТ (р
Владельцы патента RU 2315315:
Изобретение относится к медицине, а именно к фтизиопедиатрии. Для ранней диагностики туберкулезной инфекции у детей определяют уровень пролиферации лимфоцитов в микрокультурах цельной крови по реакции бластной трансформации лимфоцитов (РБТЛ) с аллергеном туберкулином (ППД-Л) в 6 разведениях. Оценивают индекс стимуляции специфического клеточного ответа по определению индекса стимуляции. При показателях индекса стимуляции менее 3,2 диагностируют отсутствие инфицирования микобактериями туберкулеза. При индексе стимуляции более 3,2 диагностируют инфицирование микобактериями туберкулеза, а при показателе более 12,1 - активный туберкулезный процесс. Использование способа позволяет повысить качество и точность ранней диагностики туберкулезной инфекции у детей. 1 табл.
Изобретение относится к медицине, преимущественно к фтизиопедиатрии, может быть использовано для диагностики первичного инфицирования, скрытой активности туберкулеза у детей и оценки эффективности специфической терапии.
Известен иммунологический метод определения противотуберкулезных антител - иммуноферментный анализ (ИФА). В диагностике туберкулеза серологические методы, в том числе ИФА, не оправдали всех возлагавшихся надежд, поскольку не удалось обнаружить специфичных антигенов M.tuberculosis, на которые у большинства больных вырабатываются соответствующие антитела. Существующие иммуноферментные тест-системы обладают специфичностью на уровне 90-94% (6-10% ложноположительных результатов у здоровых лиц или больных нетуберкулезными заболеваниями), тогда как чувствительность (число положительных результатов у больных активным туберкулезом) составляет в среднем около 70%. Поэтому говорить о самостоятельном значении данного метода для дифференциальной диагностики туберкулеза органов дыхания пока не представляется возможным (Диагностика и химиотерапия туберкулеза органов дыхания. Пособие для врачей. - М.: Медицина и жизнь, 2003. - 48 с.), так же как и для дифференциальной диагностики инфицирования микобактериями туберкулеза и парааллергии, чувствительность ИФА у инфицированных составляет 23,2% (Некрасов С.В. Диагностическая и прогностическая значимость определения противотуберкулезных антител при инфицировании и заболевании туберкулезом легких у детей и взрослых: Автореф. дис. канд. мед. наук. - М., 1999. - 23 с.).
Известна реакция бластной трансформации лимфоцитов (РБТЛ) с туберкулином (ППД-Л) для оценки состояния специфического клеточного иммунитета, используемая в клинике (особенно в комплексе с рядом других иммунологических тестов) для дифференциальной диагностики туберкулеза, оценки активности его течения и выявления минимальной активности туберкулезных поражений. Механизм этой реакции состоит в трансформации лимфоцитов в бластные клетки под действием специфического митогена - туберкулина. Реакция состоит из 3-х этапов (Абрамова З.П., Дубровская Н.А., Еремеев В.В., Авербах М.М. Сравнительное определение пролиферативной активности лимфоцитов в макро- и микроварианте реакции бласттрансформации у больных туберкулезом. Актуальные вопросы лабораторной диагностики туберкулеза в эксперименте и клинике. - М., 1989. - С.114-116):
1. выделение лимфоцитов (или лейкоцитарной массы);
2. культивирование лимфоцитов (лейкоцитов) с ППД-Л;
3. оценка результатов.
Недостатки методики: невысокий процент выявления повышенного уровня бластообразования (положительных результатов) можно объяснить потерей лимфоцитов на этапе их выделения (на фекол-верографине). Для оптимального протекания РБТЛ необходимо присутствие макрофагов, поэтому использовать высокоочищенные лимфоциты не рекомендуется (Лебедев К.А., Понякина И.Д. Иммунограмма в клинической практике. - М.: Наука, 1990. - 224 с.).
Задачей изобретения является повышение качества и сокращение времени ранней диагностики туберкулезной инфекции у детей.
Поставленная задача решается тем, что в способе ранней диагностики туберкулезной инфекции у детей, включающем оценку состояния специфического клеточного иммунитета с помощью реакции бластной трансформации лимфоцитов с туберкулином, отличающемся тем, что РБТЛ проводят с использованием микрокультур цельной крови с аллергеном туберкулезным (ППД-Л), используют 6 разведений и параллельно с фитогемагглютинином (ФГА), оценивают уровень специфического клеточного ответа по определению индекса стимуляции и при показателях индекса стимуляции менее 3,2 диагностируют отсутствие инфицирования микобактериями туберкулеза, при индексе стимуляции более 3,2 диагностируют инфицирование микобактериями туберкулеза, а при показателе более 12,1 - активный туберкулезный процесс.
Разработанная реакция на основании РБТЛ (модифицированная РБТЛ с ППД-Л) позволила повысить информативность данного иммунологического теста. При выполнении теста исключены потери Т-лимфоцитов и других клеток крови, принимающих участие в реакции (макрофаги), использовано несколько доз антигена (6 разведений), параллельно с туберкулином реакцию осуществляют с неспецифическим митогеном - фитогемагглютинином (как показатель вторичного иммунодефицита). Возможность использования малого объема крови (200 мкл). Оценку метода проводят по степени активности включения 3 H-тимидина (используя для этого автоматический сцинтилляционный счетчик).
Установлено, что результат индекса стимуляции лимфоцитов до 3,2 - отрицательный, более 3,2 - положительный.
В исследованиях была определена специфичность и чувствительность мРБТЛ с ППД-Л. Установлена высокая специфичность - 97,9% и чувствительность метода - 97,8%. Доля истинных результатов мРБТЛ с ППД-Л составила 97,8±1,1%.
Нами была исследована информативность показателя пролиферации лимфоцитов при стимуляции туберкулином (мРБТЛ с ППД-Л) у 279 детей. Среди них у 117 (41,9%) детей 2-17 лет рентгенологически был подтвержден туберкулез органов дыхания, в том числе в фазе инфильтрации у 72 (61,5%), в фазе распада у 6 (5,1%), в фазе рассасывания и уплотнения у 11 (9,4%), кальцинации у 16 (13,7%) и внелегочных локализаций. Инфицирование диагностировано у 107 (38,4%) детей дошкольного и младшего школьного возраста, с неуточненным инфицированном 24 (8,6%). Здоровых, не реагирующих на туберкулин или с сомнительными результатами пробы Манту с 2 ТЕ ППД-Л - 31 (11,1%) ребенок дошкольного возраста, из них 9 детей были обследованы в динамике через 6-12 месяцев. Всего в рамках исследования было выполнено 293 анализа.
При обследовании детей, больных туберкулезом в фазе инфильтрации, до лечения пролиферация лимфоцитов на туберкулин у всех (100%) была выражена, при этом результаты по фазам туберкулезного процесса до лечения достоверно не различались (р=0,302).
Анализируя динамику пролиферации лимфоцитов на туберкулин во время лечения, установили, что в течение первых 2 месяцев достоверного снижения средних величин не выявлялось (р>0,05), в течение третьего месяца лечения отметили снижение на 43% от исходного, но достоверно не значимо (р>0,05). Статистически достоверное различие (р=0,005) с исходным уровнем наблюдали лишь у больных, получивших противотуберкулезную терапию (2-3 препарата) в течение 6 и более месяцев.
Таким образом, положительные результаты пробы Манту с 2 ТЕ ППД-Л при слабо выраженной пролиферации на туберкулин нами были расценены как проявление парааллергии и на их долю пришлось 12±2,7%.
Нами был установлен высокий уровень корреляционной зависимости между пробой Манту с 2 ТЕ ППД-Л и мРБТЛ с ППД-Л (r=0,71 по Спирмену и r=0,91 - коэффициент знаковой корреляции).
Полученные результаты проведенных исследований мРБТЛ с ППД-Л позволяют утверждать, что детей с положительной туберкулиновой пробой, у которых индекс стимуляции не более 3,1, следует относить к группе неинфицированных, а положительную реакцию Манту с 2 ТЕ ППД-Л расценивать как парааллергию (с 3-х лет). Детей с положительной реакцией Манту с 2 ТЕ ППД-Л и с индексом стимуляции более 3,2 считать инфицированными микобактериями туберкулеза. У детей с положительной реакцией Манту с 2 ТЕ ППД-Л и с индексом стимуляции более 12,1 результаты оценивать как активный туберкулезный процесс несмотря на отсутствие рентгенологических данных.
Примерами информативности определения уровня специфического клеточного ответа при первичной туберкулезной инфекции у детей могут служить следующие выписки из историй болезни.
Пример 1. Дмитрий К., 2 г. 5 мес, карта стационарного больного №17/03, поступил в стационар 28.01.03 г. на лечение. Клинический диагноз: Туберкулез внутригрудных лимфатических узлов бронхопульмональной группы в фазе инфильтрации, МБТ - (эпид. №18604).
С декабря 2002 года установлен контакт с матерью. При обследовании в январе 2003 года выявили гиперергическую реакцию на туберкулин (проба Манту с 2 ТЕ ППД-Л) - инфильтрат 15 мм с некрозом, что совпало с впервые положительным результатом. При поступлении жалоб не было, но наблюдали проявление интоксикации в виде бледных кожных покровов, дефицита массы тела, при пальпации определялись увеличенные до второго размера периферические лимфатические узлы в 5 группах. По другим органам и системам без особенностей. При поступлении был определен уровень специфического клеточного ответа в мРБТЛ с ППД-Л, индекс стимуляции составил 17,4.
При рентгенологическом обследовании патологические изменения, характерные для туберкулеза, были выявлены только через 10 месяцев от начала лечения.
Лечение проводилось фтивазидом и пиразинамидом. Контроль результатов пробы Манту с 2 ТЕ ППД-Л провели через 5 месяцев - папула 12 мм. В динамике, через 6 месяцев лечения индекс стимуляции составил 5,5.
Таким образом, с помощью мРБТЛ с ППД-Л была подтверждена активность первичной туберкулезной инфекции и эффективность проводимой химиотерапии.
Пример 2. Адена С., 10 л. 11 мес, карта стационарного больного №141/03, поступила в стационар 10.11.2003 г. с целью исключения туберкулеза мочевой системы.
При поступлении в стационар проявлений туберкулезной интоксикации не наблюдалось. При осмотре по органам и системам патологических изменений выявлено не было. Была проведена проба Коха с 50 ТЕ ППД-Л, результат отрицательный.
Был определен уровень специфического клеточного ответа в мРБТЛ с ППД-Л, индекс стимуляции составил 4,8, что соответствует уровню инфицирования микобактериями туберкулеза.
Таким образом, на основании полученных данных туберкулез был исключен. Ребенок был выписан из стационара 05.12.2003 г. с клиническим диагнозом: Врожденная аномалия развития МВС. Хронический пиелонефрит, рецидивирующее течение. Нейрогенная дисфункция мочевого пузыря.
Пример 3. Ольга Г., 14 лет, карта стационарного больного №77/03, поступила в стационар 18.06.2003 г. для уточнения диагноза и лечения. Клинический диагноз: Туберкулез мочевой системы: паренхиматозный туберкулез почек, двусторонний, МБТ±?
С 2001 г. наблюдается у фтизиатра в связи с нарастанием туберкулиновых проб, однократно при посеве мочи обнаружены микобактерии туберкулеза, установлен семейный контакт. Вакцинация БЦЖ при рождении и ревакцинация в 7 лет, один рубец 3 мм. Проба Манту с 2 ТЕ ППД-Л в мае 2003 г. - инфильтрат 15 мм.
При поступлении в стационар проявлений туберкулезной интоксикации не наблюдалось. При осмотре по органам и системам патологических изменений выявлено не было. Была проведена проба Коха с 50 ТЕ ППД-Л, результат сомнительный. При рентгенологическом обследовании органов грудной клетки патологии не выявили. На экскреторных урограммах патологических изменений со стороны почек и мочевых путей не было выявлено.
Был определен уровень специфического клеточного ответа в мРБТЛ с ППД-Л, индекс стимуляции составил 22,9, что подтвердило специфичность инфекции и ее активность.
Лечение проводилось изониазидом, рифампицином, стрептомицином. Отметили положительную клиническую динамику.
Пример 4. Вера М., 6 л. 8 мес, индивидуальная карта ребенка ф. №026/у, поступила в санаторный сад 03.10.2002 г. на санаторное лечение. Клинический диагноз: Тубинфицирование? Лимфаденопатия внутригрудных лимфатических узлов неясной этиологии. Дисметаболическая нефропатия.
При поступлении в санаторный сад жалобы на частые простудные заболевания, нарушение стула (склонность к поносам). При осмотре кожные покровы чистые, обычной окраски, язык был обложен беловатым налетом, имелись кариозные зубы, гипертрофия небных миндалин до II размера. При пальпации определялись множественные, увеличенные до II-III размера периферические лимфатические узлы в 3 группах (передне-шейные, задне-шейные, аксилярные). Лимфатические узлы были плотно-эластичной консистенции, не спаянные с окружающей тканью, безболезненные. При аускультации выслушивали систолический шум в точке Боткина. По другим органам и системам без особенностей. Проба Манту с 2 ТЕ ППД-Л - инфильтрат 9 мм. Был определен уровень специфического клеточного ответа в мРБТЛ с ППД-Л, индекс стимуляции составил 2,6, что свидетельствовало об отсутствии туберкулезной инфекции. При рентгенологическом обследовании органов грудной клетки в прямой проекции корни обогащены, структура правого корня была нечеткая, в боковой проекции патологических изменений не выявили.
В течение 3 месяцев была проведена подготовка к пробе Манту, контроль в ноябре 2002 г. - инфильтрат 3 мм (результат при повторном обследовании в апреле 2003 г. тот же). При рентгенологическом контроле в ноябре 2002 г. патологии не выявили. При контрольном иммунологическом исследовании через четыре месяца сохранялась невыраженная пролиферация на туберкулин (индексе стимуляции 2,0).
Таким образом, было подтверждено отсутствие инфицирования, а имевшие место изменения были расценены как проявление неспецифической инфекции.
По нашему мнению, учитывая высокую специфичность и чувствительность метода, использование мРБТЛ с ППД-Л в клинической практике в сочетании с другими методами позволит повысить качество диагностики специфического воспаления, оценить эффективность специфического лечения, сократить сроки диагностики инфекционной аллергии, следовательно, провести своевременную профилактику развития локальных форм туберкулеза у детей.
Способ ранней диагностики туберкулезной инфекции у детей, включающий оценку состояния специфического клеточного иммунитета с помощью реакции бластной трансформации лимфоцитов (РБТЛ) с туберкулином (ППД-Л), отличающийся тем, что РБТЛ проводят с использованием микрокультур цельной крови с аллергеном туберкулезным (ППД-Л) в 6 разведениях, оценивают уровень специфического клеточного ответа по определению индекса стимуляции и при показателях индекса стимуляции менее 3,2 диагностируют отсутствие инфицирования микобактериями туберкулеза, при индексе стимуляции более 3,2 диагностируют инфицирование микобактериями туберкулеза, а при показателе более 12,1 - активный туберкулезный процесс.
| Классы МПК: | G01N33/60 с использованием радиоактивных меченых веществ G01N33/53 иммунологический анализ, анализ биоспецифического связывания, материалы для этого |
| Автор(ы): | Веремеевич Людмила Ивановна (RU) , Лысов Анатолий Васильевич (RU) , Пацула Юрий Иванович (RU) , Плеханова Мария Александровна (RU) , Соботюк Николай Васильевич (RU) |
| Патентообладатель(и): | ГОУ ВПО Омская государственная Медицинская академия (RU) |
| Приоритеты: |
