Диагностикум эритроцитарный туберкулезный антигенный

Семейство: Mycobacteriaceae. Род: Mycobacterium .Вид: Micobacterium tuberculosis, bovis, africanum.

Микобактерии туберкулеза- гр.положительны ,неподвижны, спор не образуют, имеют микрокапсулу. Клеточная стенка содержит миколовую кислоту, что обеспечивает плохое восприятие анилиновых красителей(используют метод по Цилю- Нельсену). Также высокое содержание липидов в клеточной стенке обеспечивает устойчивость к кислотам, щелочам спирту. Характеризуются выраженным полиморфизмом, имеют форму прямых или слегка изогнутых палочек, встречаются зернистые , кокковидные и L формы. М.туберкулеза относят к аэробам, требовательны к питательным средам, глицеринзависимые. Им необходимы факторы роста: витамины группы В, аспарагиновая и глютаминовая кислоты, глицерин и глюкоза , лецитин. Оптимум рH 6,8-7,2, t-37-38. Характерно вильчатое ветвление с образованием мицелиоподобных нитей .На жидких средах через 5-7 дней дают рост в виде морщинистой пленки кремового цвета, на плотных средах рост отмечается через 15-20 день в виде светло-кремового чешуйчатого налета с неровным краями, кот. принимает бородавчатый вид. Растут только при t37гр. и образуют ниацин, в отличие от условно-патогенных микобактерий. Антигенными свойствами обладают белковые, липидные (фтионовая кислота) и полисахаридные компоненты. Антитела образуются на туберкулиновые протеиды(вызывают реакцию гиперчувствительности 4 типа),корд-фактор, полисахариды. Фосфатидная фракция липидов в комплексе с туберкулопротеинами вызывают сенсибилизацию макроорганизма.

71.Характеристика туберкулезной инфекции у человека.

Туберкулез- хроническое инфекционное заболевание , сопровождающееся легочными и внелегочыми поражениями( туберкулез кожи, костей, суставов,почек.) Пути заражения : чаще аэрогенный ,реже алиментарный, котактный, траспланцентарный .Основной источник инфекции-больной туберкулезом органов дыхания,кот. с моткротой выделяет возбудители в окр.среду. Входными воротами являются полость рта, миндалины, бронхи и легкие.В развитии заболевания выделяют первичный туберкулез, диссеминированный , вторичный. Первичный туберкулез развивается при первом инфицировании организма и характеризуется образованием первичного аффекта, лимфангита и лимфаденита. В основе специф.воспалительной реакции лежит реакция гиперчувствительности 4 типа, сопровождающаяся образованием эпителиоидно-клеточных гранулем , состоящих из очага казеозного некроза в центре , окруженного клетками Пирогова-Лангерганса. Образовавшийся в легком казеозный очаг может подвергаться петрификации , заживлению и заканчивается это образованием очага Гона( в этом очаге персистируют L-формы возбудителя).Другие варианты развития первичного туберкулеза- генерализация процесса, характеризуется образованием туберкулезных бугорков в других органах и тканях или процесс принимает хронический характер. При гематогенной генерализации процесса поражаются кости, суставы, почки,половые органы,кожа, печень, эндокринные железы, ЦНС.

Противотуберкулезный иммунитет формируется в ответ на проникновение в организм микобактерий в процессе инфекции или в процессе вакцинации .Иммунитет нестерильный, носит инфекционный характер за счет персистенции L-форм. Он появляется через 4-8 недель после инфицирования организма.

72. Методы диагностики туберкулеза . Общая характеристика каждого из них.

Лабораторная диагностика туберкулеза включает бактериоскопический, бактериологический, серологический и аллергологический. См. ниже.

73. Микроскопический метод диагностики туберкулеза. Комочки гноя, взятого из мокроты больного наносят на предметное стекло и растирают между двумя стеклами. Спиномозговую жидкость оставляют на холоде . Через 18-24 ч в ней образуется сетка фибрина, кот. и будут микроскопировать. Мочу центрифугируют и делают мазки из осадка. Мазки высушивают в пламени горелки и окрашивают по Цилю-Нильсену. Микобактерии туберкулеза имеют ярко-красный (рубиновый ) цвет. Имеют вид тонких ,длинных, слегка изогнутых или коротких прямых палочек, иногда в них обнаруживается зернистость. Микобактерии располагаются поодиночке или неправильными группами. При получении отрицательных результатов прибегают к методам обогащения материала_: флотации и гомогенизации. Чаще используется метод флотации:мокроту гомогенизируют , затем добавляют углевод(ксилол, толуол) и встряхивают в теч.10-15 мин. Добавляют дистиллированную воду и оставляют на 1-2 часа при комнатной температуре. Капельки углевода адсорбируют микобактерии и всплывают, образуя кольцо на поверхности. Кольцо снимают и готовят микропрепараты, окрашенные по Цилю- Нельсену. Метод гомогенизации: к исследуемой мокроте добавляют гидроксид натрия и гомогенизируют в течт 10-15 мин.После центрифугирования к надосадочной жидкости добавляют 2-3 капли соляной кислоты.Из осадка готовят мазки и окрашивают по Цилю- Нильсену.

Метод люминесцентной микроскопии основан на способности липидов микобактерий воспринимать анилиновые красители и давать свечение.

74.Бактериологическая диагностика туберкулеза. Спин.жидкость,гной, экссудат, кровь наносят пипеткой на пит. среду, и втирают тщательно петлей по все поверхности.Пробки в пробирках заливают парафином и инкубируют в термостат при 37гр. В теч 6-8 недель. На яичной среде Левенштейна-Йенсена выраженный рост микобактерий выявляется на 21-28 день. Колонии непегментированные морщинистые, с неровными краями, напоминают бородавки. При отсутствии роста на 12 дент результат считается отрицательным. Выросшие культуры микроскопируют и проводят идентификацию по диф. признакам. Проводят ниациновую пробу Конно, основанную на способности M.Tuberculosis в отличие от других микобактерий продуцировать ниацин. Для этого к культуре микобактерий добавляют 1 мл раствора KCN и 1 мл. хлорамина Б. Ярко-красное окрашивание будет свидетельствовать о наличии ниацина. Кроме этого определяют устойчивость к лек. препаратам.

75. Аллергодиагностика туберкулеза. Аллергическую кожную пробу (внутрикожная роба Манту с туберкулином) используется главным образом для определения инфицированности людей микобактериями туберкулеза. Специальным туберкулиновым шприцем строго внутрикожно в область средней трети плеча вводят 0,1 мл туберкулина. Результаты учитывают через 24-48-72 часа. Если диаметр инфильтрата на месте введения туберкулина не превышает 1 мм , пробу считают отрицательной. При диаметре инфильтрата 2-5 мм- проба сомнительная, боле 5 мм-проба положительная..Положительная аллергическая реакция свидетельствует об инфицированности организма, но не является признаком активного процесса. Отрицательная реакция у взрослых свидетельствует об отсутствии иммунитета к туберкулезу. Появление положительной реакции у детей, ранее не реагировавших на туберкулин, ( вираж туберкулиновой пробы) указывает на недавнее заражение и служит показанием для проведения лечебных мероприятий. Как диагностический тест этот метод имеет значение для выявления туберкулеза в детском возрасте, отбора контингентов , подлежащих ревакцинации, определения инфицированности населения туберкулезом.

ИФА( определение неизвестных АТ): ингредиенты- диагностикум, сод.АГ микобактерий туберкулеза, сыворотка от больного, конъюгат(меченная ферментом антиглобулиновая сыворотка), хромогенный субстрат. Все эти ингредиенты в указанной последовательности вносят в лунки планшета. Результаты учитывают через 4-6 часов. Проводят фотометрирование лунки, результаты учитываются с помощью спец. прибора. Математическая обработка показывает наличие и количество характерных АТ в пробе( измеряют оптическую плотность , находящейся в ячейке жидкости и сравнивают ее с шаблонным образцом , подсчитывают концентрацию АТ на единицу объема.

77.Туберкулин-это общее название препаратов , полученных из микобактерий человеческого или бычьего типов , вакцинного штамма БЦЖ . К ним относят : 1.старый туберкулин Коха- альттуберкулин(АТК) ,его получают путем выпаривания жидкой среды, на кот.выращивались бактерии туберкулеза .2 Сухой очищенный туберкулин получают посредством добавления к фильтрату бактерий осаждающих белок химических веществ, с последующей очисткой . 3. Жидкий очищенный туберкулин в стандартном разведении , разработанный Ленниковой, его получают путем стандартных разведений сухого очищенного туберкулина( применяют для про Манту). Вакцины используются для профилактики туберкулеза, создания специфического иммунитета,для диагностических целей.

78.Вакцина БЦЖ. Используется для осуществления специфической профилактики путем введения живой вакцины БЦЖ, полученной А. Кальметтом и С. Гереном путем длительного культивирования М.bovis на картофельном агаре с добавлением бычьей желчи. Содержит живую лиофильно высушенную культуру А патогенного штамма микобактерий туберкулеза Прививочная доза 0,05 мг препарата в 0,1 мл растворителя. При правильной технике введения должна образоваться пульпа . Вакцинации проводят у новорожденных на 2-5-й день в роддоме внутрикожно с последующей ревакцинацией в соответствии с календарем прививок. Ревакцинацию проводят лицам с отрицательной туберкулиновой пробой с интервалом в 5-7 лет до 30 летнего возраста .Создают таким образом инфекционный иммунитет, при кот. возникает реакция ГЗТ.

79. Эритроцитарный туберкулезный диагностикум. Антиген- содержащий препарат, в кот. туберкулезные палочки адсорбированы на поверхности эритроцитов барана,взятых их яремной вены, лиофильно высушен.Препарат стабилизируют формалином. Используется для серодиагностики в РНГА с парными сыворотками. Реакция положительная при наличии зонтика, при наличии пуговки- отрицательная.

Туберкулинодиагностику применяют при обследовании населения на туберкулез. Положительная реакция на введение туберкулина бывает только у инфицированных микобактериями туберкулеза или после вакцинации БЦЖ и БЦЖ-М. Виды туберкулиновых проб: накожные (пластырная, мазевая), внутрикожные (проба Манту), подкожные (проба Коха), скарификационные (градуированная проба Гринчара-Карпиловского), уколочные (проба Гиффа).

Туберкулин состоит из белков (туберкулопротеины), полисахаридов, липидной фракции и нуклеиновых кислот. Туберкулин относят к неполным антигенам — гаптенам. Он не способен вызвать заболевание или сформировать иммунитет к туберкулезу, но запускает специфическую ответную реакцию. Туберкулиновая аллергия начинает проявляться через 6-8 часов после инъекции и относится к реакциям гиперчувствительности замедленного типа (ГЧЗТ).

Туберкулин активирует специфические рецепторы на лимфоцитах, клеточные медиаторы вовлекают макрофаги в процесс разрушения антигена. В месте введения туберкулина в первые 24 часа появляется отек, экссудация всех слоев кожи, а в более поздние сроки (72 часа) — мононуклеарная реакция с большим числом гистиоцитов.

Уколочная реакция — на коже в месте введения туберкулина проявляется инфильтрат и гиперемия, а при гиперергических реакциях — везикулы, буллы, лимфангит, некроз;
Общая реакция — головная боль, артралгии, повышение температуры тела, изменения в общем анализе крови и др.;
Очаговая реакция — при легочных процессах очаговая реакция может проявиться усилением кашля, увеличением количества отделяемой мокроты, кровохарканьем, рентгенологически — нарастанием воспалительных изменений в зоне поражения.

Препараты туберкулина

Очищенный туберкулин — purified protein derivative (PPD) — готовят из смеси убитых нагреванием фильтратов культуры МБТ человечьего и бычьего видов, очищенных ультрафильтрацией, осажденных трихлоруксусной кислотой, обработанных этиловым спиртом и эфиром.

ВОЗ в 1952 году в качестве международного стандарта утвердил очищенный туберкулин-Зейберт или стандарт-туберкулин — PPD-S. В России с 1954 года используют отечественный очищенный туберкулин Линниковой — ППД-Л. Активность туберкулинов выражается в туберкулиновых единицах (ТЕ) и сопоставляется с международным стандартом.

Аллерген туберкулезный очищенный жидкий (очищенный туберкулин в стандартном разведении);
Аллерген туберкулезный очищенный сухой (сухой очищенный туберкулин).

Аллерген туберкулезный очищенный жидкий (очищенный туберкулин в стандартном разведении) — готовые к употреблению растворы туберкулина. Препарат представляет собой раствор очищенного туберкулина в фосфатном буфере с твином-80 в качестве стабилизатора и фенолом в качестве консерванта. Бесцветная прозрачная жидкость. Препарат выпускается в ампулах в виде раствора, содержащего 2 ТЕ ППД-Л в 0,1 мл. Возможен выпуск 5 ТЕ, 10 ТЕ в 0,1 мл и других дозировок препарата. Выпуск готовых к употреблению разведений ППД-Л (модификация Линниковой) позволяет использовать для массовой туберкулинодиагностики стандартный по активности препарат и избежать ошибок при разведении туберкулина на местах его применения.

Аллерген туберкулезный очищенный сухой (сухой очищенный туберкулин) — это растворенный в фосфатном буфере с сахарозой лиофильно высушенный очищенный туберкулин. Препарат имеет вид сухой компактной массы или порошка белого (слегка сероватого или кремового) цвета, легко растворяющегося в прилагаемом растворителе — карболизированном изотоническом растворе натрия хлорида. Выпускается в ампулах, содержащих 50000 ТЕ. Сухой очищенный туберкулин используется для диагностики туберкулеза и туберкулинотерапии только в противотуберкулезных диспансерах или стационарах.

Диагностикум эритроцитарный туберкулезный антигенный сухой;
Тест-система иммуноферментная для определения антител к возбудителю туберкулеза.

Диагностикум эритроцитарный туберкулезный антигенный сухой из бараньих эритроцитов, сенсибилизированные фосфатным антигеном МБТ, пористая масса или порошок красновато-коричневого цвета. Предназначен для выявления в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) специфических антител МБТ.

Тест-система иммуноферментная для определения антител к возбудителю туберкулеза представляет собой набор ингредиентов для проведения иммуноферментного анализа на твердофазном носителе. Предназначена для выявления антител к возбудителю туберкулеза в сыворотке крови больных.

Массовая туберкулинодиагностика

При массовой туберкулинодиагностике применяют только единую внутрикожную туберкулиновую пробу Манту с 2 ТЕ ППД-Л.

Отбор на иммунизацию против туберкулеза;
Формирование групп риска по заболеванию туберкулезом;
Ранняя диагностика туберкулеза у детей и подростков;
Оценка и прогноз эпидемической ситуации по туберкулезу.

План туберкулинодиагностики в зоне обслуживания амбулаторно-поликлинических учреждений составляют главные врачи учреждений при участии противотуберкулезных диспансеров.

Учет детей, подростков и взрослых, подлежащих ежегодной туберкулинодиагностике, с выделением возрастных групп, подлежащих ревакцинации;
Календарный план обследования контингентов;
Подготовка медицинского персонала для проведения туберкулинодиагностики;
Приобретение необходимого количества инструментария;
Расчет потребности в туберкулине.

Важно. Потребность в очищенном туберкулине в стандартном разведении (2 ТЕ ППД-Л) для проведения массовой туберкулинодиагностики исчисляют из расчета две дозы по 0,1 мл на каждого обследуемого. При этом необходимо учитывать, что в ампуле содержится 30 доз (3 мл), которые используют на постановку пробы 15-ти пациентам. Один литр туберкулина содержит 10000 доз, которые используют для обследования 5000 человек.

Уточнить списки детей, подлежащих туберкулинодиагностике: на организованных детей по группам и классам и на неорганизованных детей — по годам рождения;
Проверить наличие прививочных форм №063/у в соответствии со списочным составом;
Уточнить наличие медицинских отводов: учетные формы №063/у промаркировать в зависимости от сроков медицинских отводов, внести сведения о наличии медицинских отводов в списки, составленные по группам и классам;
Промаркировать форму №063/у на лиц, состоящих на учете в противотуберкулезном диспансере (ПТД) в целях углубленного анализа результатов туберкулинодиагностики и оперативной связи с ПТД.

Туберкулинодиагностика проводится специально обученным медицинским персоналом, имеющим справку-допуск. Справка-допуск на проведение пробы Манту должна обновляться ежегодно.

Бригадный метод проведения массовой туберкулинодиагностики в организованных коллективах является более предпочтительным. Формирование специальных бригад (2 медсестры и 1 врач) и графика их работы возлагается на детские поликлиники. Неорганизованным детям раннего и дошкольного возраста проба Манту ставят в детской поликлинике.

Абсолютные — индивидуальная непереносимость.

Относительные — кожные заболевания, острые и хронические инфекционные и соматические заболевания (в т.ч. эпилепсия) в период обострения; аллергические состояния (бронхиальная астма, идиосинкразии с выраженными кожными проявлениями) в период обострений; карантин по детским инфекциям. Пробу Манту ставят через 1 месяц после исчезновения клинических симптомов или сразу после снятия карантина.

Применяют только одноразовые однограммовые туберкулиновые шприцы с тонкими короткими иглами с коротким косым срезом.

Внимание. Использование инсулиновых шприцев для проведения туберкулинодиагностики запрещается.

Иглой №0845 из ампулы в шприц набирают 0,2 мл (2 дозы) туберкулина, насаживают иглу туберкулинового шприца, выпускают раствор до метки 0,1 мл (1 доза) в стерильный ватный тампон.

Место введения — внутренняя поверхность средней трети предплечья, четный год — правая рука, нечетный год — левая рука. Кожу обработать 70 градусным спиртом, просушить стерильной ватой.

При правильной технике введения в коже образуется папула беловатого цвета размером не менее 7-9 мм в диаметре.

Результаты пробы Манту оценивают через 72 часа. Измеряют поперечный по отношению к предплечью размер инфильтрата, а при отсутствии инфильтрата измеряют размер гиперемии.

Отрицательная — инфильтрат и гиперемия полностью отсутствуют, имеется уколочная реакция 0-1 мм;
Сомнительная — инфильтрат 2-4 мм или только гиперемия любого размера;
Положительная — инфильтрат 5 мм и более.

Слабоположительные — размер инфильтрата 5-9 мм;
Средней интенсивности — размер инфильтрата 10-14 мм;
Выраженные — размер инфильтрата 15-16 мм;
Гиперергические — размер инфильтрата 17 мм и более, а также везикуло-некротические реакции независимо от размера инфильтрата с лимфангоитом или без него.

С впервые положительной реакцией на пробу Манту (папула 5 мм и более), не связанной с иммунизацией вакциной БЦЖ.
С усиливающейся на 6 мм и более по сравнению с предыдущим годом чувствительностью к туберкулину. Диагноз: Инфицирование МБТ с нарастанием туберкулиновой чувствительности.
С гиперчувствительностью к туберкулину (папула 17 мм и более, а также везикуло-некротическая реакция или лимфангоит независимо от размера инфильтрата). Диагноз: Инфицирование МБТ с гиперергической чувствительностью к туберкулину.

О вакцинации (ревакцинации) против туберкулеза;
О результатах туберкулиновых проб по годам;
О контакте с больным туберкулезом;
О флюорографическом обследовании окружения ребенка;
О перенесенных хронических и аллергических заболеваниях;
О предыдущих обследованиях у фтизиатра;
Данные клинико-лабораторного обследования (общий анализ крови и мочи);
Заключения соответствующих специалистов при наличии сопутствующей патологии.

Немедленная аллергическая реакция (отек Квинке, анафилактический шок);
Развитие аутоиммунных заболеваний (гломерулонефрит, тромбоцитопеническая пурпура и т. д.);
Общая реакция организма (туберкулиновый шок): недомогание, повышенная температура тела, нарушение сознания;
Наследственная гиперергическая чувствительность к туберкулину (генетически обусловленная повышенная чувствительность к туберкулину);
Усиление местной аллергической реакции у пациентов с соматическими и аллергическими заболеваниями (отек и зуд предплечья, усиление чувствительности к туберкулину);
Обострение существующих аллергических реакций (бронхоспазм у больных с бронхиальной астмой, кожные высыпания у больных аллергическими дерматозами, риноконъюнктивальный синдром и т.д.).

Важно!!! Факты индивидуальной непереносимости туберкулина и наследственной гиперергической чувствительности к туберкулину устанавливаются в специализированном учреждении после исключения туберкулеза органов дыхания и внелегочной локализации.

Индивидуальная туберкулинодиагностика

Индивидуальная туберкулинодиагностика применяется для диагностики локального туберкулеза по клиническим показаниям, независимо от срока постановки предшествующей пробы. Единственное противопоказание — индивидуальная непереносимость туберкулина. Диагностическую туберкулиновую пробу с использованием очищенного туберкулина можно проводить только в ПТД, туберкулезных стационарах и санаториях.

СПОСОБ ЦОЛУЧЕЙИЯ. ТУБЕРКУЛЕЗНОГО даАГНОСТИКУMA, включающий культивирование микобактерий туберкулеза , вьвделение и очистку фосфатидного антигена из микробной массы ацетоном и метанолом с последующей сенсибилизацией им сорбента, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью повышения активности целевого продукта, культивируют микобактерий Dt/St и Valu, после мйтаноловой очистки фосфатидный антигенвыпаривают до появления осадка, обрабатывают хлороформом и сенсибилизируют эритроциты из расчета 0,4 1 ,0 мг антигена на 1 мл 10%-ной взвеси эритроцитов.

РЕСПУБЛИК (5в А 61 В 10/00

К ABTOPCHOlVIV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3413780/28-13

Красного Знамени педиатрический медицинский институт (53) 615.375(088.8) (56) 1.Takahashi Y. and Katsuo О.

Study on the Passive Hemagglutination Reaction ду the Phosphatide

of М. Tuberculosos, 2 Conditions

of the Reaction. вЂ” Amer. Rev. Resp.

Dis. 1961, Р 83, р. 386-393.

„„SU„„.106 78 А (54 ) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ. ТУБЕРКУЛЕЗНОГО ДИАГНОСТИКУМА, включающий культивирование микобактерий туберкулеза, выделение и очистку фосфатидного антигена из микробной массы ацетоном и метанолом : с последующей сенсибилизацией им сорбента, отличающийся тем, что, с целью повьпаения активности целевого продукта, культивируют микобактерии Dt/St и Valu, после метаноловой очистки фосфатидный антиген выпаривают до появления осадка, обра« батывают хлороформом и сенсибилизируют эритроциты из расчета 0,4

1,0 мг антигена на 1 мл 10%-ной взвеси эритроцитов.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для получения антигенного эритроцитарного туберкулезного диагностикума.

Известен способ получения туберкулезного диагностикума, включающий культивирование микобактерий туберкулеза, выделение и очистку фосфатидного антигена из микробной массы ацетоном и метанолом с последующей сенсибилизацией им каолина (1 .

Однако известный способ не позволяет получить диагностикум с высокой активностью и, кроме того, сложен в исполнении.

Цель изобретения - повышение активности диагностикума.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения туберкулезного диагностикума, включающему культивирование микобактерий 20 туберкулеза, выделение и очистку фосфатидного антигена иэ микробной массы ацетоном и метанолом с последующей сенсибилизацией им сорбента, культивируют микобактерии Dt/St и UBlu, после метаноловой очистки фосфатидный антиген выпаривают до появления осадка, обрабатывают хлороформом и сенсибилизируют эритроциты из расчета 0,4-1,0 мг анти- 3О гена на 1 мл 10Ъ-ной взвеси эритроцитов.

Способ осуществляют следующим образом.

Иикобактерии туберкулеза Dt/St и Ualu выращивают в отдельных матрицах, заполненных средой Линниковой и Могилевского (состав среды: вода дистиллированная 200 л, гликокол 1,7 кг, аммоний лимоннокислый однозамещенный 1,0 кг; натрий углекислый безводный О,б кг, натрий хлористый 0,4 кг, магний сернокислый 0,2 кг, железо лимоннокислое окисное 0,01 кг; глицерин 14 кг, ортофосфорная кислота 60-90 мл; калий фосфорнокислый двузамещенный

О,б кг), в течение 6-8 недель при

38 С. После этого проводят стерилизацию микробных культур автоклавированием текучим паром в течение 1 ч. 50

Затем микробные культуры смешивают в равных объемах, после чего для получения микробных тел. культуральную жидкость удаляют путем фильтрации через асбестовые пластины. .55

Полученные микробные клетки высушивают обработкой ацетоном.

Обработанные ацетоном клетки заливают метанолом из расчета 0,5 л метанола на 50 r клеток и встряхивают в течение 5 ч при 37 С, после чего микробные клетки отделяют центрифугированием. Эту операцию также проводят два раза.

Кетаноловые экстракты первого и второго извлечения (по укаэанной операции) объединяют и помещают в вакуум-сушильный шкаф, в котором проводят выпаривание метанолового экстракта до появления осадка фосфатидного антигена. Выпаривание целесообразно проводить при разрежении 0,8-0,6 кгс/см и температуре

48-52 С. Окончание операции выпаривания устанавливают либо визуально по выпадению осадка (для чего вакуумсушильный шкаф должен иметь прозрачное окно для наблюдения), либо по времени, предварительно установленного в зависимости от используемой аппаратуры и конкретного режима выпаривания из расчета выпаривания до

1/3 объема. Выпаривание до 1/3 исходного объема метанолового экстракта достаточно для выпадания осадка фосфатидного антигена без соосаждения примесей.

Образовавшийся осадок фосфатидного антигена отделяют центрифугированием и растворяют в хлороформе.

К этому раствору добавляют два объема ацетона для осаждения фосфатидного антигена. Осажденный антиген промывают ацетоном и высушивают в вакуум-эксикаторе.

Полученный полуфабрикат (фосфатидный антиген) до проведения операции сенсибилизации эритроцитов хранят в ампулах, запаянных под азотом.

Навеску фосфатидного антигена растворяют в метаноле. Этот раствор добавляют по каплям в физраствор, после чего производят выпаривание метанола при 50 С на магнитной мешалке до первоначального объема физраствора.

Таким путем получают рабочий раствор фосфатидного антигена для сенсибилизации им эритроцитов, поскольку непосредственно в физрастворе фосфатидный антиген не растворяется.

Объем физраствора при приготовлении фосфатидной эмульсии зависит от требуемой концентрации фосфатидного антигена, обеспечивающей высокий титр противофосфатидных антител в соответствующих иммунных сыворотках и экономное расходование- фосфатидного антигена. Целесообразно брать такое количество физраствора, чтобы весовая концентрация фосфатидного антигена в нем составила 0,4

1,0 мг/мл. При этом для сенсибилизации используют 10%-ную взвесь формалинизированных эритроцитов в объеме, равном объему использованного для

1069783 приготовления фосфатидной эмульсии физраствора. Этим сараям обеспечивается сенсибилиэация эритроцитов при соотношении ингредиентов: О, 41,0 мг фосфатидного антигена на

1 мл 10%-ной взвеси эритроцитов.

9перацию сенсибилизации проводят соединением равных объемов фосфатидной эмульсии и 10%-ный формалинизированных эритроцитов с последующим выдерживанием данной смеси в течение 14 ч при 37ОС при постоянном перемешивании ° Эатем производят центрифугирование и отмывание осадка физраствором. Из осадка отмытых

Титр антител в иммунной кроли туберкулезными диагностиками, эритроцитов различными дозами. сенсибилизировацных эритроцитов приготавливают 10а-нyю взвесь добавлением защитной среды. В качестве защитной среды может применяться

5%-ный раствор сахарозы, сахарозожелатиновый стабилизатор, 5%-ный пептон или Мясопептонный бульон (MIB> с добавлением сахарозы и баратно-янтарного буфера. В выбранной защитной среде целевой продукт подвергают лиофилизации.

Сведения о предпочтительности режима сенсибилизации эритроцитов и выбора защитной среды прриведены в табл. 1 и 2.

Таблица 1 чьей сыворотке в РНГА с. полученными сенсибилизацией фосфатидного aBmHreна

Доза антигена, мг на 1 мл

10%-ной взвеси эритроцитов

1 8 1:16 1:32 1г64 1:128 1 256 1 512

Титр антител в иммунной кроличЬей сыворотке в РНГА с эритроцитарным диагности кумом, лиофилизированным в различных защитных средах

Титры антител в зависимости от сроков храненйя препарата при 20 С

0,5-r 1г 1,5 г 2 г 2,5 г ЗГ

1:128 0 Сахарозо-желатиновый стабилизатор

ПРодолжение табл 2

Титры антител в зависимости от сроков хранения препарата при 20 С

0,5 r 1 г 1,5 r 2 г 2,5 г 3 г

1164 1:32 1:8 0 0 0

Остальное 1:128 1:128 1:128 1:128 1:64 1:64

Данные табл. 1 иллюстрируют проведение операции сенсибилизации эритроцитов барана различными дозами фосфатидного антигена. Как видно из табл. 1 оптимальной сенсибилизирующей дозой является 0,4-0,6 мг/мл, так как .меньшая доза не обеспечивает достаточного выявления антител, .а большие дозы приводят в неэкономному расходованию антигена. 3(Как видно из табл. 2, наиболее предпочтительной для лиофилизации и хранения препарата является защитная среда следующего состава:

Иясопептонный бульон, 35 об. В

Боратно-янтарный.: буфер Остальное

Лиофилизированный в этой среде 4п препарат может храниться 3 года, тогда как при использовании других защит, ных сред срок хранения не более

Используемые в предлагаемом спосо-4 бе штавмы являются новыми только по отношению к выбранному прототипу.

Они используются в укаэанной технологии получения туберкулина. При этом штамм 0 78с является штаммом человеческого типа. Он получен иэ США (r.Вашингтон, комиссия земледелия) и хранится в коллекции ГИСК им. Л.A.ÒàðàcåÜè÷à. Штамм Valu является штаммом бычьего типа. Он по лучен из ЦНИИ туберкулеза и хранится в коллекции ГИСК им. Л.A.Тарасевича. Ксерокопии паспортов штаммов прилагаются.

Замена штаммов произведена в связи с тем, что использовавшиеся в 60 способе-прототипе штаммы, особенно

ВС4,приводили к выявлению антител, характеризующих, главным образом, поствакцинальный иммунитет, что снижает специфичность этого серологиI E l 1 ческого теста. Кроме того, достигнутое использование одних и тех же штаммов как для приготовления туберкулина, так и предлагаемого туберкулезного диагностикума, дает возможность осуществить.безотходное производство одновременно обоих препаратов: при этом в технологической схеме их получения общей стадией будет культивирование продуцентов после чего из культуральной жидкости извлекают туберкулин, а из микробной массы (которая ранее являлась отходом производства) выделяют фосфатидный антиген для предлагаемого получения туберкулезного диагностикугла.

Использование только одного из этих штаммов в предлагаемом способе так же, как и при получении туберкулина, недостаточно для полного выявления соответствующих антител у больных туберкулезом.

Обработка фосфатндного антигена хлороформом введена для растворения целевого продукта, что позволяет освободить его от нерастворимых в хлороформе балластных веществ, нродуцируемых используемыми штаммами микобактерий туберкулеза. При этом важным является выпаривание метанолового экстракта не полностью, а только до появления осадка (в котором содержится фосфатидный антиген(. Экспернментально установлено, что в противном случае (т.е. при полном выпаривании метанолового экстракта до получения сухого осадка) осадок приобретает темную окраску, что свидетельствует о соосаждении балластных пигментированных веществ, и не поддается растворению в хлороформе. Возможно, что это требование обусловлено использованием названных штаммов.

Использование в качестве сорбента эритроцитов позволяет получить препарат в виде эритроцитарного туберкулезного диагностикума, так как его применяют не в РКА, а в реакции непрямой гемагглютинации (РИГА). 5

Кроме того, эритроцитарный диагностикум подлежит лиофилизации, что увеличивает срок его годности.

Пример. Матрацы, предварительно простерилизованные температурной обработкой, емкостью 1,5 л стерильно заполняют синтетической питательной средой Линниковой и Могилевского из расчета по 600 мл на 1 матрац. „. рН среды равен 6,9-7,1. Одну половину матрацев засевают штаммом Dt/st, а другую - штаммом Valu.. Выращивание микобактерий туберкулеза в этих матрацах производят при 38 С в течение

6-8 недель. В течение этого срока ежедневно посевы просматривают для выявления матрацев с ростом посторонней флоры, которые отбраковывают и обеззараживают, Матрацы с 6-8-недельными хорошо выросшими туберкулезными культурами помещают в оцинкованные ящики, в которых обеззараживают эти культуры автоклавированием текучим паром в течение 1 ч при 120 С..

Обеззараженные культуры смешивают ЗО поштаммно путем сливания их в 20литровые бутыли 1в равных объемах для каждого штамма). Для приготовле.ния фосфатидного антигена берут 1012 л смешанной культуры обоих штам- 35 мов.

Смешанную культуру фильтруют через асбестовые пластины для получения микробных клеток, которые затем . промывают 7 л дистиллированной воды 4р и 3 л ацетона.

После этого производят экстрагирование ацетонорастворииых компонентов путем обработки одного объема микробной массы двумя объемами ацетона при 38 С в течение 3 ч, по истечении которых ацетон сливают °

Данную операцию проводят дважды.

Обработанные ацетоном клетки заливают метанолом из расчета 0,5 л метанола на 50 г клеток и помещают на шуттель-аппарат в термостат при

37.С, осуществляя встряхивание реакционной смеси в течение 5 ч. Осадок отделяют центрифугированием при факторе разделения F = 1500 в течение 20 мин, после чего производят повторное экстрагирование метанолом при тех же условиях.

Метаноловые экстракты первого и второго извлечений объединяют и выпаривают в вакуум-сушильном шкафу при 0,7 кгс/см и 50 С в течение 5 ч. За это время происходит упаривание раствора до 1/3 от первоначального объема, что достаточно 65 для выпадения осадка фосфатидного антигена без соосаждения примесей.

Осадок фосфатидного антигена отделяют центрифугированием при указанном режиме, затем промывают ацетоном при 40"С, вновь центрифугируют и растворяют в хлороформе из расчета на один объем использованного метанола 0,1 объема хлороформа. К хлороформенному раствору фосфатидного антигена добавляют двойной объем предварительно охлажденного до +4ОС ацетона. Выпавший осадок фосфатидного антигена отделяют центрифугированием при том же режиме, промывают 3 раза ацетоном и высушивают. в вакуум-эксикаторе при комнатной температуре в течение 48 ч.

Выход сухого фосфатидного антигена составляет 2-2,5 г из 50 г микробных клеток.

Фосфатидный антиген )расфасосывают в ампулы по 10 мг и запаивают последние под азотом. Установлено, что в таком виде фосфатидный антиген может храниться 5 лет.

Для сенсибилизации формалинизированных эритроцитов барана взятую из ампулы навеску фосфатидного антигена е,0 мг растворяют в 3,0 мл метанола. Этот раствор добавляют по каплям к 12 мп 0,85%-ного изотонического раствора хлористого натрия, после чего производят выпаривание метанола на магнитной мешалке при

50ОС до первоначального объема физраствора (т.е. до 12 мп ).

Полученные 12 мл фосфатидной эмульсии соединяют с 12 мл 10%-ных формалинизированных эритроцитов при постоянном перемешивании. При этом концентрация фосфатидного антигена составляет 0,5 мг на 1 мл 10%-ных формалинизированных эритроцитов (барана). Приготовленную смесь выдерживают 1 ч в водяной бане при

37 С и при постоянном перемешивании.

Затем производят центрифугчрование взвеси при факторе разделения F =

2000, после чего осадок дважды отмывают от избытка антигена физраствором рН 7,0-7,2.

Из осадка отмытых сенсибилизированных эритроцитов приготавливают

104-ную взвесь добавлением 12 мл защитной среды следующего состава:

Мясопептонный бульон, об.%- 25

Сахароза, вес.Ъ 5

Боратно-янтарный буфер Остальное

Полученный жидкий препарат эрнтроцитарного туберкулезного диагностикума разливают по 1,0 мл в ампулы и замораживают до -70 С, после чего препарат лиофилизируют °

При указанном соотношении ингредиентов получают 12 ампул сухого

1069783 агностики туберкулеза применяют, как правило, туберкулин, наиболее принципиальным является сравнение эффективности использования полученного препарата с туберкулином. Данные для сравнительного анализа приведены в табл. 3.

Результаты серологических реакций по основным группам обследования

РНГА с применением эритроцитарного туб. ди агности кума

Обследо- Полоиитель вано ная реакчеловек ция, Ъ

Читайте также: