Тест-наборы на определение кори

Набор реагентов для иммуноферментного количественного и качественного определения иммуноглобулинов класса G к вирусу кори в сыворотке (плазме) крови.

Регистрируясь, Вы соглашаетесь с политикой конфиденциальности сайта(открыть) и политикой в отношении обработки персональных данных(открыть)

Корь – высококонтагиозное антропонозное острое инфекционное заболевание с воздушно-капельным путем передачи. Возбудитель кори – РНК содержащий вирус (семейство Paramyxoviridae, род Morbillivirus). Только 1% восприимчивых лиц не заболевает корью при первом тесном контакте с больным.

Корь начинается с продромального периода, для которого характерны повышение температуры тела до 38°С и выше, кашель, насморк, чихание, покраснение глаз и светобоязнь, энантема в полости рта (пятна Филатова-Коплика). С 4-5 дня болезни наблюдается поэтапное высыпание пятнисто-папулезной сыпи (на первый день сыпь появляется на лице и шее, на второй день – на туловище, на третий день – на ногах и руках), на месте сыпи остается пигментация и отрубевидное шелушение. Инкубационный период длится в среднем около 10 дней (от 7 до 18 дней) с момента инфицирования дыхательных путей и до повышения температуры.

Несмотря на наличие доступных высокоиммуногенных вакцин, корь все еще остается одной из основных причин детской смертности в развивающихся странах и периодически приводит к возникновению крупных вспышек в индустриально развитых странах. В 2010-2011 годах крупные вспышки кори были зарегистрированы в ряде стран Африки, Юго-Восточной Азии и Европы (Франция, Германия, Болгария, Румыния). Особенно тревожная ситуация сложилась в 2012 году на Украине, где за три месяца заболело более 10000 человек. В Российской Федерации, большинство административных территорий которой в январе 2011 года были сертифицированы на отсутствие эндемичной кори, ситуация осложнилась в 2011-2012 годах в Южном и Северокавказском Федеральных округах, в Москве, Санкт-Петербурге и ряде других городов.

Вирус кори присутствует в крови, носоглоточных выделениях и моче во время продромального периода и в течение 3-4 дней с момента появления сыпи. АТ к вирусу кори впервые можно обнаружить в крови с момента появления сыпи. Максимальный уровень содержания АТ IgM в крови приходится на 4-7 дни после появления сыпи, они сохраняются в течение 28 дней, в редких случаях их можно обнаружить спустя 8 недель с момента появлении сыпи. АТ IgG начинают вырабатываться с момента появления сыпи и достигают максимального уровня через 2 недели; их можно выявить в течение долгих лет после перенесенной инфекции.

Дифференциальная диагностика. Заболевания, протекающие с мелкопятнистой экзантемой (краснуха, скарлатина, инфекционный мононуклеоз, лекарственные и аллергические экзантемы, протекающие с повышением температуры тела).

Этиологическая лабораторная диагностика включает выделение вируса кори, выявление РНК вируса кори, обнаружение АТ к вирусу кори.

Материал для исследования

• Сыворотка крови – выявление АТ;
• моча, назофарингиальные смывы, лимфоциты периферической крови – выделение вируса кори;
• мазки из носоглотки и ротоглотки – выявление РНК вируса.

Сравнительная характеристика методов лабораторной диагностики. Лабораторная диагностика коревой инфекции в рамках Программы элиминации кори в РФ проводится только в вирусологических лабораториях Региональных центров по эпидемиологическому надзору за корью с помощью тест-систем, рекомендованных ВОЗ. Для лабораторной диагностики кори применяют главным образом выявление АТ к вирусу (серологическая диагностика). Для диагностики кори используют как обнаружение АТ отдельных классов (IgM и IgG), так и количественное определение специфических АТ в крови для установления их значимого прироста при одновременном исследовании двух проб, полученных от больного в остром периоде и в период реконвалесценции (парные сыворотки).

Для выявления вирусоспецифических АТ IgM и IgG в настоящее время используется преимущественно метод ИФА. Благодаря высокой чувствительности и специфичности, простоте и скорости выполнения, возможности автоматизации исследования, метод доступен любой лаборатории. Для получения корректных результатов и облегчения их интерпретации большое значение имеет правильно выбранное по отношению к появлению клинических симптомов кори время забора образца.

Для выявления изменения уровня суммарных АТ с использованием реакции нейтрализации (РН) цитопатического действия вируса кори, требуется наличие двух образцов сыворотки крови, взятых у больного в остром периоде заболевания и на стадии реконвалесценции. Метод обладает 100% чувствительностью по отношению к клинически подтвержденным случаям. Этот тест не является легким в применении, потому что он требует наличия высококвалифицированного персонала, имеющего опыт работы с культурами клеток. Результаты анализа могут быть получены через 10 дней после получения сыворотки реконвалесцента.

Оценка изменения содержания специфических АТ с использованием метода РТГА также требует наличия двух образцов сыворотки крови, полученных у больного в остром периоде и на стадии реконвалесценции. У вакцинированных лиц метод демонстрирует 98% чувствительность. Этот тест также не является легким в применении, потому что требует высококвалифицированного персонала, а также наличие свежих эритроцитов обезьян. Результаты анализа могут быть получены через 2 дня после получения сыворотки реконвалесцента.

Выделение вируса кори выполняют на культуре клеток Vero. Обнаружение и идентификация вируса кори на культуре клеток может занять несколько недель, поэтому не рекомендуется использовать этот метод для первичной диагностики инфекции, изоляция вируса кори проводится в специализированных лабораториях.

Выявление РНК вируса методом ПЦР с обратной транскрипцией не получило пока широкого распространения. Секвенирование генома вируса кори применяется в целях определения генотипа возбудителя кори. Генетический анализ позволяет сравнивать штаммы, полученные из различных мест в разные годы, что позволяет получить информацию о происхождении вирусов и проследить пути их передачи.

Показания к применению различных лабораторных исследований. Для диагностики кори ВОЗ рекомендует использовать обнаружение вирус-специфических IgM методом ИФА в образце сыворотки крови, взятом после четвертого дня от момента появления сыпи. Взятие крови для исследований осуществляется на 4-7 день с момента появления сыпи.

Для определения напряженности иммунитета к вирусу кори ВОЗ рекомендует применять выявление АТ IgG в сыворотке крови методом ИФА.

Для выявления вируса кори и его РНК используют биоматериалы, взятые в продромальный период заболевания и в первые три дня после появления сыпи. При взятии образцов следует учитывать, что интенсивность экскреции вируса быстро падает.

Особенности интерпретации результатов лабораторных исследований. Вирусоспецифические АТ IgM появляются в течение первых дней с момента высыпания, спустя месяц их уровень начинает быстро снижаться. Их наличие в крови пациента достоверно свидетельствует об острой свежей инфекции. АТ IgM также вырабатываются при первичной вакцинации и, хотя их уровень снижается быстрее, чем уровень АТ IgM, вырабатывающихся в ответ на инфицирование диким вирусом, специфические АТ IgM к дикому или вакцинному вирусу не могут быть разделены используемыми в рутинной диагностике методами. В этом случае для интерпретации полученных результатов следует обратиться к истории вакцинации конкретного пациента.

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, пользовательских данных (сведения о местоположении; тип и версия ОС; тип и версия Браузера; тип устройства и разрешение его экрана; источник откуда пришел на сайт пользователь; с какого сайта или по какой рекламе; язык ОС и Браузера; какие страницы открывает и на какие кнопки нажимает пользователь; ip-адрес) в целях функционирования сайта, проведения ретаргетинга и проведения статистических исследований и обзоров. Если вы не хотите, чтобы ваши данные обрабатывались, покиньте сайт.

Copyright ФБУН Центральный НИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, 1998 - 2020

! Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, пользовательских данных (сведения о местоположении; тип и версия ОС; тип и версия Браузера; тип устройства и разрешение его экрана; источник откуда пришел на сайт пользователь; с какого сайта или по какой рекламе; язык ОС и Браузера; какие страницы открывает и на какие кнопки нажимает пользователь; ip-адрес) в целях функционирования сайта, проведения ретаргетинга и проведения статистических исследований и обзоров. Если вы не хотите, чтобы ваши данные обрабатывались, покиньте сайт.

Комплексный антиген вируса кори, используемый в качестве компонента иммуноферментной тест-системы для диагностики антител к вирусу кори, получен из культуральной жидкости, содержащей штаммы вируса кори Ленинград 16 с титром не менее 10 5.0 ТЦД 50 /мл, Эдмонстон - не менее 10 6.0 ТЦД 50 /мл, NovO/96 - не менее 10 8.0 ТЦД 50 /мл путем инактивации ее инфекционной активности детергентом и выделением белка из клеточного лизата хроматографической очисткой в количестве не менее 2 мкг/мл с чистотой не менее 70%. Культуральная вируссодержащая жидкость получена при раздельном культивировании штаммов вируса кори Ленинград 16, Эдмонстон и NovO/96 на монослое культуры клеток Vero с последующим смешением культуральных вируссодержащих жидкостей в соотношении 1:1:1 по объему. Использование изобретения позволит повысить чувствительность и специфичность комплексного антигена, обладающего свойством выявлять антитела в сыворотке крови. 1 з.п. ф-лы, 4 табл.

Изобретение относится к новому комплексному антигену вируса кори для использования в качестве компонента иммуноферментной диагностической тест-системы и может быть использовано в медицинской вирусологии и микробиологии.

Известен антиген вируса кори, полученный на основе штамма вируса кори Ленинград 16 (Л-16), используемый в качестве компонента диагностической тест-системы (Руководство по вакцинному и сывороточному делу под ред. Академика АМН П.Н.Бургасова. М.: "Медицина", 1978. - с.220-223). Отработка технологии получения антигена вируса кори штамм Л 16 на тканевой культуре из эмбрионов японских перепелок (Васильева Г.А., Бойчук Л.М. - "Специфическая профилактика кори". - Материалы научно-практической конференции ЛНИИЭМ им. Пастера. - Л., 1970. - с.206-210).

Однако данный антиген вируса кори обеспечивает недостаточную чувствительность и специфичность выявления антител с использованием тест-систем на его основе.

Известен антиген вируса кори, полученный на основе штамма вируса кори Эдмонстон (Патент США № 4211843, МПК A01N 1/02; А61К 39/12, опубл. 08.07.1980 г.). Штамм Эдмонстон депонирован в Американской Коллекции Клеточных Культур (АТСС - VK-24, 4/92). В ГНЦ ВБ "Вектор" прошел четыре пассажа на культуре клеток Vero. Подлинность штамма установлена методом положительной цепной полимеразной реакции со специфическими праймерами. Штамм относится к генотипу А. Максимальные титры вируса достигают на 5-6 сутки после заражения монослоя клеток Vero и составляют 5×10 6 ТЦПД 50 /мл [Агафонов А., и соавт.// Вопр.вирусол., 1997, N.1, с.102-205]. Антигенные свойства штамма: выявляет антитела к вирусу кори в сыворотках больных и вакцинированных людей.

Однако данный антиген вируса кори обеспечивает недостаточную чувствительность и специфичность выявления антител с использованием тест-систем на его основе.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является антиген вируса кори, полученный на основе штамма вируса кори NovO/96 и используемый в качестве компонента иммуноферментной тест-системы для диагностики антител к вирусу кори (патент РФ № 2230785, МПК C12N 7/00, опубл. 20.06.2004 г.). Вирус нарабатывают на монослое клеток Vero, клетки разрушают замораживанием-оттаиванием, лизат клеток получают центрифугированием и ультрафильтрацией. Антиген для ИФА очищают от чужеродных белков ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы, который инактивируют прогреванием при 56°С в течение 30 мин.

Однако данный антиген вируса кори также обеспечивает недостаточную чувствительность и специфичность выявления антител с использованием тест-систем на его основе.

Техническим результатом заявляемого изобретения является повышение чувствительности и специфичности комплексного антигена вируса кори, обеспечивающего выявление антител в сыворотке крови.

Указанный технический результат достигается получением комплексного антигена вируса кори, используемого в качестве компонента иммуноферментной тест-системы для диагностики антител к вирусу кори, полученного из культуральной жидкости, содержащей штаммы вируса кори Ленинград 16 с титром не менее 10 5.0 ТЦД 50 /мл, Эдмонстон - не менее 10 6.0 ТЦД 50 /мл, NovO/96 -не менее 10 8.0 ТЦД 50 /мл путем инактивации ее инфекционной активности детергентом и выделением белка из клеточного лизата хроматографической очисткой в количестве не менее 2 мкг/мл с чистотой не менее 70%.

Культуральная вируссодержащая жидкость получена при раздельном культивировании штаммов вируса кори Ленинград 16, Эдмонстон и NovO/96 на монослое культуры клеток Vero с последующим смешением культуральных вируссодержащих жидкостей в соотношении 1:1:1 по объему.

Антигенные свойства комплексного антигена. Выявляет все специфические антитела к вирусу кори в сыворотках больных и вакцинированных людей в более высоких титрах, чем при использовании каждого антигена в отдельности (табл.1).

- иммуносорбента - комплексного антигена вируса кори, сорбированного в лунках полистироловых разборных планшетов;

- К1+ - положительный контрольный образец № 1 - сыворотка крови человека, содержащая антитела к вирусу кори и не содержащая антитела к БИЧ-1, ВИЧ-2, ВГС,

- Treponema pallidum и HBs-антиген, инактивированная прогреванием при температуре 56°С в течение 3 ч - 1 фл., 2 мл;

- К2+ - слабоположительный контрольный образец № 2 - сыворотка крови человека, содержащая антитела к вирусу кори в минимальном достоверно определяемом количестве, не содержащая антитела к ВИЧ-1, ВИЧ-2, ВГС, Treponema pallidum и HBs-антиген, инактивированная прогреванием в течение 3 ч при температуре 56°С - 1 фл., 2 мл;

- К- - отрицательный контрольный образец - сыворотка крови человека, не содержащая антитела к вирусу кори, ВИЧ-1, ВИЧ-2, ВГС, Treponema pallidum и HBs-антиген, инактивированная прогреванием при температуре 56°С в течение 3 ч - 1 фл., 3 мл;

- РК - раствор конъюгата - раствор моноклональных антител мыши к Ig человека, конъюгированных с пероксидазой хрена - 1 фл., 11 мл;

- РХ - раствор хромогена, содержащий ТМБ - 1 фл., 13 мл;

- ФСБ-Т(×25) - 25-кратный концентрат фосфатно-солевого буферного раствора с твином - 1 фл., 26 мл;

- стоп-реагент - 1 фл., 6 мл.

Пример 1. Способ получения комплексного антигена вируса кори

Получение вируссодержащей жидкости

Исходные клетки Vero хранят в жидком азоте и выращивают путем серийных пересевов. В качестве ростовой среды используют раствор Игла МЕМ с 8-10% эмбриональной сыворотки КРС. Культуру клеток выращивают в течение 3-4 суток при посевной концентрации клеток 5-10×10 5 кл/мл среды и пересевают общепринятым способом.

Соответствующим вирусом кори (штаммы Л-16, Эдмонстон, NovO/96) раздельно заражают 1-литровые культуральные сосуды с монослоем культуры клеток Vero (множественность заражения 1:10). После инкубации при 20-25°С в течение 40 минут в культуральные сосуды добавляют 200 мл питательной среды Игла МЭМ, содержащей 4,0±0,1 мл сыворотки крупного рогатого скота, 0.001% - трипсина, 200 ед/мл бензилпеницилина и 200 нг/мл стрептомицина. После инкубации в течение 5-7 суток при (36±1)°С сливают питательную среду. Титр вируса кори, штамм Л-16, в КВЖ составляет не менее 10 5.0 ТЦД 50 /мл, штамм Эдмонстон - не менее 10 6.0 ТЦД 50 /мл, штамм NovO/96 - не менее 10 8.0 ТЦД 50 /мл.

Получение лизата клеток Vero

Пример 2. Подбор условий хроматографической очистки комплексного антигена

Пример 3. Хроматографическая очистка комплексного антигена

Колонку с ДЕАЕ-целлюлозой уравновешивают буфером 20 мМ Трис-HCl, рН 7,6. Объединенную суспензию антигенного материала трех штаммов вируса кори наносят на колонку из расчета 1 мл суспензии на 1 мл сорбента. После нанесения колонку промывают тем же буфером, содержащим 0,2 М NaCl. Элюцию целевого комплексного антигена проводят 0,4 М NaCl в том же буфере. Целевую фракцию контролируют на соответствие качества антигена по чувствительности и специфичности методом ИФА.

Выход высокоочищенного комплексного антигена с 3 л КВЖ и лизата клеток составляет 15-20 мг.

Пример 4. Изготовление иммуносорбента

Иммуносорбент готовят добавлением 0,20±0,06 мл комплексного антигена вируса кори после очистки на колонке (см. Пример 3) к 1,00±0,01 л р-ра для сорбции. Состав р-ра для сорбции: 2,00±0,01 г натрия углекислого, 0,50±0,01 г натрия азида, 0,400±0,012 мл 2% фенолфталеина, вода очищенная - до 1 литра. Иммуносорбент перемешивают на магнитной мешалке в течение 1 ч при температуре от 18°С до 24°С.

Пример 5. Методика применения набора реагентов для одностадийного ИФА "Анти-корь Ig Трисорбент"

Для проведения анализа используется сыворотка или плазма крови человека. Для проведения анализа достаточно 10 мкл образца. Для выявления антител класса G к вирусу кори можно использовать сыворотку (плазму) крови человека как свежеприготовленную, так и хранившуюся не более 7 суток при температуре от 2°С до 8°С при условии отсутствия микробной контаминации либо не более 12 месяцев при температуре минус 20°С. Допускается замораживание сыворотки (плазмы) до температуры минус 20°С не более двух раз.

Для проведения реакции во все лунки планшета вносят по 90 мкл р-ра для разведения образца (состав: 2,00±0,01 г натрия углекислого, 0,50±0,01 г натрия азида, 0,400±0,012 мл 2% фенолфталеина, вода очищенная - до 1 литра). В лунку планшета А1 вносят 10 мкл К1+, в лунки В1 и С1 вносят по 10 мкл К2+. В лунку D1 вносят 10 мкл К-. В остальные лунки планшета вносят по 10 мкл исследуемых сывороток (конечное разведение контрольных и исследуемых образцов - 10 раз). Раствор перемешивают пипетированием и инкубируют в течение 40 мин при температуре 37°С. По окончании инкубации содержимое лунок удаляют и планшет промывают семь раз рабочим раствором ФСБ-Т. В каждую лунку вносят по 100 мкл р-ра хромагена и планшет помещают на 15 мин в защищенное от света место при температуре 37°С. Реакцию останавливают внесением в каждую лунку планшета по 50 мкл стоп-реагента.

Величину ОП растворов в лунках иммуносорбента измеряют на спектрофотометре в двухволновом режиме: основной фильтр - 450 нм, референс-фильтр - в диапазоне от 620 до 700 нм. Результаты теста считают положительными, если ОП исследуемой сыворотки больше ОПК2+ср. (нижняя граница положительных значений соответствует 0,28 МЕ/мл). Результаты теста считают отрицательными, если ОП исследуемой сыворотки меньше ОПК2+ср. - 20% (верхняя граница отрицательных значений соответствует 0,12 МЕ/мл).

Псыв. рассчитывают по формуле:

где ОПсыв. - значение ОП исследуемой сыворотки.

Асыв. (титр антител в МЕ) рассчитывают по формуле:

где а и b - константы, специфичные для каждой серии (указаны в Инструкции, которая сопровождает каждый набор).

Пример расчета полученных данных приведен в таблице 4.

В образцах больных методом ПЦР был обнаружен генетический материал (РНК) вируса кори. Секвенирование показало принадлежность вируса, вызвавшего вспышку, к генотипу Н.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Комплексный антиген вируса кори, используемый в качестве компонента иммуноферментной тест-системы для диагностики антител к вирусу кори, полученный из культуральной жидкости, содержащей штаммы вируса кори Ленинград 16 с титром не менее 10 5.0 ТЦД 50 /мл, Эдмонстон - не менее 10 6.0 ТЦД 50 /мл, NovO/96 - не менее 10 8.0 ТЦД 50 /мл путем инактивации ее инфекционной активности детергентом и выделением белка из клеточного лизата хроматографической очисткой в количестве не менее 2 мкг/мл с чистотой не менее 70%.

2. Комплексный антиген по п.1, отличающийся тем, что культуральная вируссодержащая жидкость получена при раздельном культивировании указанных в п.1 штаммов вируса кори на монослое культуры клеток Vero с последующим смешением культуральных вируссодержащих жидкостей в соотношении 1:1:1 по объему.

Читайте также:

• Эмбрион вакцина против оспы птиц из штамма кэм
• Стадии болезни розового лишая
• Кровь в кале при ветрянке
• Skillet джон купер и кори купер с детьми
• Косметический гель от герпеса

Пожалуйста, не занимайтесь самолечением!
При симпотмах заболевания - обратитесь к врачу.