Принципы определения каталазной и плазмокоагулазной активности стафилококков
1. Медицинская микробиология. Предмет, методы, задачи.
2. Начальный период развития микробиологии (А. Левенгук и др.).
3. Работы Л. Пастера и Р. Коха. Их значение в становлении и развитии микробиологии.
4. Основные принципы систематики бактерий. Таксономические категории. Критерии вида.
5. Морфология бактерий. Основные формы, постоянные и непостоянные структуры бактериальной клетки.
6. Основные характеристики светового микроскопа (разрешающая способность, общее увеличение). Принцип иммерсионного микроскопа.
7. Особенности фазово-контрастной и темнопольной микроскопии.
8. Основные характеристики электронного микроскопа (разрешающая способность, общее увеличение). Особенности люминесцентной микроскопии.
9. Этапы приготовления мазка для иммерсионной микроскопии.
11.Различия в структуре грамположительных и грамотрицательных бактерий. Протопласты, сферопласты и L-формы бактерий.
12. Окраска по методу Грама. Назначение, основная краска, протрава, обесцвечивающий фактор, дополнительная краска, механизм.
13. Окраска по Циль-Нильсону. Назначение, основная краска, протрава, обесцвечивающий фактор, дополнительная краска, механизм.
14. Окраска по способу Ожешко и Нейссера. Назначение. основная краска, протрава, обесцвечивающий фактор, дополнительная краска, механизм. Основные этапы. Механизм.
15. Актиномицеты. Таксономия. Особенности строения. Общие признаки с бактериями и грибами. Патогенные представители, вызываемые заболевания.
16. Спирохеты. Таксономия. Особенности строения. Общие признаки с бактериями и простейшими. Патогенные представители. Вызываемые заболевания.
17. Особенности строения риккетсий. Общие признаки с бактериями и вирусами, патогенные представители. Вызываемые заболевания.
18. Особенности строения хламидий. Общие признаки с бактериями и вирусами, патогенные представители. Вызываемые заболевания.
19. Морфология и структура микоплазм, патогенные представители. Вызываемые заболевания.
20. Морфология простейших, их классификация. Патогенные представители.
21. Питание бактерий. Механизмы транспорта питательных веществ в бактериальную клетку.
22. Классификация бактерий по типам питания (аутотрофы, гетеротрофы, сапрофиты, облигатные и факультативные паразиты) и источникам энергии (фототрофы и хемотрофы). Примеры.
23.Факторы роста. Ауксотрофы и прототрофы.
24. Ферменты бактерий. Химическая природа. Экзо - и эндоферменты, их зачение в метаболизме клетки. Конститутивные и индуцибельные ферменты. Примеры. Классы ферментов: оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы и синтетазы (лигазы).
25. Методы изучения ферментативной активности бактерий и использование ее для идентификации бактерий.
26. Методы изучения протеолитической активности бактерий (реакции на индол, сероводород и др.)
27. Принципы определения каталазной и плазмокоагулазной активности стафилококков.
28. Пигменты бактерий, классификация по растворимости в воде. Примеры, их значение.
29. Основные типы биологического окисления субстрата бактериями. Аэробы, факультативные анаэробы, микроаэрофилы, анаэробы. Примеры.
30. Рост и размножение бактерий. Фазы размножение бактерий.
31. Механические способы создания анаэробных условий.
32. Физические способы создания анаэробных условий.
33. Химические и биологические способы создания анаэробных условий.
34. Питательные среды для культивирования бактерий. Требования, предъявляемые к ним. Их классификация.
35. Основные питательные среды. Состав, назначение.
36. Элективные питательные среды. Состав, назначение. Примеры.
37. Дифференциально-диагностические среды. Состав, назначение. Примеры.
39. Методы выделения чистых культур аэробов (механические и биологические). Колония, чистая культура.
40. Метод Дригальского, назначение, этапы: I ΙΙ , III, IV.
41. Выделение чистой культуры анаэробов (I, II, III, IV, V этапы).
42. Вирусологические методы. Назначение, принцип.
43. Методы культивирования микоплазм, риккетсий, хламидий и вирусов.
44. Современные принципы классификации и номенклатура вирусов.
45. Понятие о вирионе и вирусе, определение. Морфология и структура вирионов.
46. Репродукция вирусов. Стадии взаимодействия вируса с клеткой хозяина.
47. Особенности репродукции ДНК- и РНК- вирусов.
48. Типы взаимодействия вирусов с клеткой: продуктивный, абортивный, интегративный.
49. Классификация клеточных культур, применяемых в вирусологии.
50. Методы заражения куриного эмбриона. Цель. Этапы.
51. Индикация вирусов по цитопатическому действию, по бляшкообразованию и внутриклеточным включениям. Реакции гемагглютинации и гемадсорбции .
52. Бактериофаги. Морфология и структурные особенности.
53. Распространение фагов в природе.Типы взаимодействия фагов с бактериальной клеткой. Классификация фагов по специфичности (полифаги, монофаги и типовые).
54. Фазы взаимодействия фага с бактериальной клеткой.
55. Вирулентные и умеренные фаги. Профаги. Лизогения. Фаговая конверсия. Дефектные фаги.
56. Методы получения бактериофагов. Индикация и титрование фагов (по Грациа и Аппельману).
57. Использование бактериофагов в микробиологии и медицине. Реакции фаготипирования и фаголизиса.
Поперечные профили набережных и береговой полосы: На городских территориях берегоукрепление проектируют с учетом технических и экономических требований, но особое значение придают эстетическим.
Организация стока поверхностных вод: Наибольшее количество влаги на земном шаре испаряется с поверхности морей и океанов (88‰).
Опора деревянной одностоечной и способы укрепление угловых опор: Опоры ВЛ - конструкции, предназначенные для поддерживания проводов на необходимой высоте над землей, водой.
Бактериологическое исследование молока (секрета) проводят сразу после доставки его в лабораторию. Оставшееся молоко хранят при температуре не выше 6°С.
Посев молока (секрета) проводят на мясо-пептонный агар с цитратной кровью крупного рогатого скота или дефибринированной кровью барана (рецепт 1) и дифференциально-диагностические или элективные среды.
Для идентификации выросших культур микроорганизмов учитывают характер роста колоний и вид гемолиза на кровяном МПА, проводят микроскопию мазков, сделанных из одинаковых по морфологическим свойствам колоний и окрашенных по Грамму, изучают культурально-биохимические свойства.
а) Выделение золотистого стафилококка
Рост на кровяном МПА. Колонии средние и крупные, выпуклые с гладкой или шероховатой поверхностью, ровными краями, золотистого цвета.
Образуют зону гемолиза.
α-гемолиз - зона прозрачная вокруг колонии; β-гемолиз - зона непрозрачная (матовая.), лучше проявляется при выдержке посевов в холодильнике при температуре 5-8°С в течение 24 ч; α и β гемолиз смешанный.
При микроскопии имеют шарообразную форму и располагаются в виде гроздевидных скоплений, тетрами или одиночно. По Грамму красятся положительно.
ДНК-азная активность. Выделение золотистого стафилококка ускоренным методом и определение ДНК-азной активности проводят с использованием элективной, дифференциально-диагностической среды ДНК-новокаинового агара (рецепт 2).
Элективные свойства среды обусловлены ингибирующим действием на постороннюю микрофлору новокаина, дифференцирующие - наличием ДНК, позволяющей идентифицировать золотистый стафилококк по его дезоксирибонуклеазной активности.
Готовят разведение исследуемых проб молока, (секрета) на стерильном физиологическом растворе 1:10 и 1:100. В чашку Петри с ДНК-новокаиновым агаром вносят 0,1 мл молока (секрета) в разведении 1:100 и равномерно распределяют стерильным стеклянным шпателем по всей поверхности питательной среды. Засеянные чашки помещают в термостат крышками вниз и инкубируют при 37-38°С в течение 22-24 ч. Для выделения ДНК-азной активности золотистого стафилококка поверхность среды в чашках с выросшими культурами заливают 5-7 мл 1н раствора соляной кислоты. Чашки с кислотой выдерживают 2-3 мин, затем кислоту сливают и учитывают результаты, просматривая чашки в проходящем свете.
При выделении культуры стафилококка на кровяном агаре и наличии изолированной чистой культуры ДНК-азная активность может быть определена путем посева на ДНК-агар (рецепт 3).
На ДНК-новокаиновом агаре золотистый, стафилококк растет в виде крупных круглых колоний с ровными краями, окруженных зоной просветления с четкими границами.
Для определения количества золотистого стафилококка в 1 мл исследуемого молока (секрета) подсчитывают колонии с зоной просветления по всей поверхности среды и полученное число колоний умножают на 10 (брали 0,1 мл материала) и на 100 (степень разведения).
Каталазная активность. На предметное стекло наносят каплю 10% перекиси водорода и в ней растирают внесенную бактериологической петлей чистую культуру микроорганизмов.
При положительной реакции на каталазу происходит интенсивное газообразование которое проявляется вспениванием капли перекиси водорода. Фермент каталазу содержат стафилококки и микрококки.
Реакция плазмокоагуляции (РПК). Культуру стафилококка высевают в пробирки с мясо-пептонным бульоном и через 3 ч после выращивания в термостате при температуре 37°С используют для постановки РПК с цельной или сухой плазмой крови кролика. Для этого плазму разводят стерильным физиологическим раствором в соотношении 1:5 и разливают в аглютинационные пробирки по 0,5 мл. Бульонную культуру стафилококка по 0,1 мл (2 капли) вносят в пробирки с разведенной кроличьей плазмой. Для контроля в одну пробирку с плазмой не вносят культуру, а в другую засевают заведомо плазмо-аглютинирующий стафилококк. Пробирки помещают в термостат при температуре 37°С и через каждый час в течение 3ч, 18 и 24 ч учитывают результаты.
При положительной реакции РПК образуется сгусток, который не выпадает из пробирки при наклоне или плавает в плазме.
Золотистый стафилококк является плазмокоагулируюшим.
Ферментация манита в анаэробных условиях. Суточную бульонную культуру стафилококка в количестве 0,2 мл (3-4 капли) высевают в пробирку с 0,15% полужидким агаром, содержащим 0,15% манита и индикатор Андраде, под вазелиновым маслом (рецепт 4). Посевы инкубируют в термостате при температуре 37°С. Результаты учитывают через каждые 24 ч, а окончательный результат - через 5 сут.
Появление розового окрашивания (изменение цвета индикатора) указывает на ферментацию манита в анаэробных условиях, что является дифференцирующим признаком для золотистого стафилококка.
б) Выделение стрептококков
Рост на 5% кровяном МПА. Колонии мелкие, росинчатые, образуют зону гемолиза α и β, смешанную или она отсутствует.
При микроскопии имеют шарообразную, бобовидную форму и располагаются в виде коротких или длинных цепочек.
Рост на среде Карташовой (рецепт 5). В пробирку со средой вносят 1 мл исследуемого молока или пересевают выросшие на кровяном агаре росинчатые колонии и инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 18-24 ч.
Из пробирок с измененным цветом среды делаютмазки, окрашивают по Грамму и проводят микроскопию на предмет обнаружения стрептококков.
Каталазная активность. Проводится аналогично как для стафилококков.
Стрептококки не содержат фермент каталазу, поэтому с перекисью водорода дают каталазоотрицательную реакцию.
Устойчивость к желчи. Предварительно культуру стрептококков выращивают в мясо-пептонном бульоне (МПБ) с I% глюкозы (рецепт 6), а затем вносят 1 мл культуры в пробирки с 5 мл МПБ, содержащего 40% желчи (рецепт 7) и ставят в термостат при температуре 37°С на 24 ч.
Полное просветление бульона указывает на лизис культуры, помутнение - на рост.
Рост в МПБ с рН 9,б. 1мл бульонной культуры стрептококков, выращенных на МПБ с глюкозой (рецепт 6), вносят в пробирку с 5 мл МПБ и рН 9,6, инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 24 ч.
Обесцвечивание среды указывает на наличие роста стрептококков, восстанавливающих своими окислительно-восстановительными ферментами метиленовый синий.
Этим свойствам обладают стрептококки серологических групп D и N. (по Ленсфильд).
КАМП-тест. Основан на том, что стрептококки групп В при выращивании на кровяном агаре, содержащем стафилококковый β-токсин, образуют дополнительную, ясно выраженную зону гемолиза эритроцитов барана, крупного рогатого скота.
Суточную бульонную культуру β-гемолитического стафилококка высевают на 5% кровяной агар сплошной линией по диаметру чашки Петри. Перпендикулярно к линии посева стафилококка, не доходя 5-6 мм, высевают ровным штрихом испытуемую культуру стрептококков. На одной чашке можно проверить 8-10 культур.
КАМП-тест считают положительным, если четко выражена зона гемолиза испытуемого стрептококка в виде усеченного треугольника или полукруга в зоне β-гемолитического стафилококка. Наиболее ярко эта зона проявляется после выдержки чашек в холодильнике в течение 18-84.
в) Выделение бактерий группы кишечной палочки (БГКП).
Образцы молока или колоний с кровяного агара, морфологические свойства которых напоминают БРКП, высевают на среду КОДа (рецепт 9) и помешают в термостат при температуре 35°С на 24 ч.
Изменение цвета среды из фиолетового в зеленый свидетельствует о наличии ВГКП.
Идентификацию эшерихий, бактерий рода энтеробактер от сальмонелл и протея проводят на среде Олькеницкого (рецепт 10). Со среды КОДа зеленого цвета посев на среду Олькеницкого в пробирках проводят бактериологической петлей на поверхность скоса среды и внутрь столбика. Посевы инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 24 ч.
Изменение цвета (глюкоза+, лактоза+) скоса и столбика среды из красного в желтый при отсутствии почернения внутри свидетельствует о росте бактерий группы эшерихий.
Изменение скоса среды и столбика в малиновый цвет (мочевина+) и почернение внутри столбика (сероводород+) указывает на рост протея.
Изменение скоса в красный, столбика в желтый и почернение внутри столбика указывает на рост сальмонелл.
г) Выделение синегнойной палочки.
Бактерии этой группы при росте на питательных средах вырабатывают сине-зеленый пигмент - пиоцианин за счет которого происходит окрашивание этих сред.
Образцы молока или колоний с кровяного агара, при микроскопии которых обнаружены грамотрицательные палочки, высевают на МПА и МПБ, культивируют в термостате при температуре 37°С в течение 24-48 ч, дополнительно до 72 ч.
Появление сине-зеленого окрашивания МПБ и МПА, роста гладких плоских колоний с ровными или изрезанными краями указывает на рост синегнойной палочки, вырабатывающей пигмент пиоционин.
Из МПБ и МПА делаютмазки, окрашивают по Грамму и просматривают под микроскопом.
При обнаружении в мазках грамотрицательных палочек и изменении цвета сред в сине-зеленый ставят реакцию для обнаружения пиоционина.
Определение пиоционина. В пробирку с МПБ добавляют 1млхлороформа, пробирку встряхивают.
При положительной реакции хлороформ приобретает зеленый цвет и опускается на дно пробирки.
У пигментообразующих сапрофитных бактерии в хлороформе пигмент не растворяется.
д) Выделение грибов рода Саndida
Пробы молока в количестве по 0,1-0,3 мл высевают на 2 чашки Петри с элективной дифференциально-диагностической средой (рецепт 11), равномерно распределяя материал по поверхности стерильным шпателем. Засеянные чашки помещают в термостат вверх дном при температуре 37°С на 18-20 ч.
Контролем служит посев культуры этого гриба на ту же самую элективную дифференциально-диагностическую среду.
После инкубации чашки Петри просматривают, из подозрительных колоний делают мазки, окрашивают их по Грамму или другими методами, а также делают посев на ту же самую среду для выделения чистой культуры и выявления псевдомицелия. Засеянные пробирки выдерживают в термостате при температуре 37°С в течение 24ч, затем выдерживают при комнатной температуре 2 суток.
Первичный учет делают через 21-24 ч после инкубации материала, а окончательный - на 4-й день исследования.
Колонии грибов рода Саndida гладкие, морщинистые, плоские, беловато-серые, кремо-беловатые, кремовые, мягкой консистенции, кожистые.
При микроскопии обнаруживают псевдомицелий, а также почкующиеся клетки (споры, истинный мицелий, -иногда хламидоспоры).
Схема идентификации кокковой микрофлоры молока по В.Д. Парикову, В.И. Сдободянику и др.
Пробы молока (секрета) высевают на секторы (4,8) кровяного МПА в чашках Петри, выдерживают в термостате 24 ч при температуре 37°С, учитывают характер роста и вид гемолиза. Из колоний, характерных для кокковых микроорганизмов, делают посев на секторы (8) кровяного МПА для получения чистых культур. Из других колоний делают мазки, красятих по Грамму и микроскопируют. Чашки Петри с отсеянными микроорганизмами инкубируют в термостате при температуре 37°С 24 ч.
Выросшие чистые культуры кокковых микроорганизмов проверяют на каталазу с 3% перекисью водорода на предметном стекле, а также готовят мазки, красят по Грамму и микроскопируют. Каталазоположительные микроорганизмы относят к стафилококкам, а каталазоотрицательные - к стрептококкам.
Учет роста на кровяном МПА, вид гемолиза, микроскопию, постановку ТОК проводят как , как описано раньше.
Анаэробная ферментация манита. Среду (рецепт 12) перед применением ставят в водяную баню и кипятят 10-15мин для удаления растворенного кислорода, охлаждают до 45-50°С и вносят на дно пробирки бактериологической петлей чистую культуру стафилококка. Поверхность среды покрывают стерильным вазелиновым маслом или парафином, слоем 2 см. Пробы культивируют в термостате при температуре 37°С в течение 5 дней.
Отсутствие желтого окрашивания или пожелтение только поверхности среды свидетельствует об отсутствии анаэробной ферментации манита.
Анаэробная ферментация глюкозы. Используют среду, приготовленную по рецепту 12, в котором применяют глюкозу вместо манита, и проводят исследование по аналогичной схеме.
б) Дифференциация стрептококков
Каталазоотрицательные культуры кокковых микроорганизмов проверяют по КАМП-тесту на среде с эскулином (рецепт 13) по схемам.
Проводят по наличию просветления в зоне β-гемолиза - гемолитического стафилококка и по цвету колоний. Около 5% штаммов Str. agalactiae дают КАМП тест отрицательный и около 30% штаммов Str. uberis дают КАМП тест положительный.
Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:
Плазмокоагулаза вызывает свертывание плазмы крови. Стафилококки, продуцирующие этот фермент, покрываются фибриновым чехлом, защищающим их от фагоцитоза. Большие концентрации коагу-лазы, циркулирующие в организме больного, приводят к понижению свертываемости крови, нарушению гемодинамики, прогрессирующему кислородному голоданию тканей.
Плазмокоагулазу выявляют путем внесения выделенной культуры в пробирку с цитратной плазмы кролика. У кролика из сердца берут 8 мл крови, вносят в пробирку с 2 мл 5% лимонно-кислого натрия и ставят в холодильник. После полной осадки форменных элементов плазму отсасывают в стерильную пробирку. Она может храниться в холодильнике 8-10 дней. Перед использованием ее разводят 1:5 (1 мл плазмы и 4 мл изотонического раствора хлорида натрия) и разливают в аглютинацийни стерильные пробирки по 0,5 мл. Полную петлю культуры стафилококков эмульгируют в плазме и помещают в термостат на 3 часа, затем оставляют при комнатной температуре на 18-20 часов. Предварительный учет свертывания плазмы проводят через 3 ч, окончательный - на второй день. Очень удобно пользоваться стандартной сухой цитратной плазмы кролика. Перед употреблением в ампулу добавляют 1 мл изотонического раствора хлорида натрия и после полного растворения ее разводят 1:5. Плазма человека малопригодна для постановки реакции плазмокоагуляции, поскольку в ней могут быть консерванты, лекарственные вещества, антитела, которые могут подавлять образование плазмокоагулаза.
Если выделена культура вызывает гемолиз, коагулирует плазму и дает положительную лецитовителазну реакцию, уже на третий день можно выдать результат на наличие S. aureus. Если культура обладает только плазмокоагулаза или только вителазну активность, для окончательного установления вида стафилококка необходимо определить дополнительные критерии патогенности: ферментацию маннита в анаэробных условиях, ДНК-азную активность, продукцию лизоцима, фосфатазы, а также определить чувствительность к новобиоцин.
57) методы определения чувствительности к антибиотикам( скажу честно, это инет-батюшка) ( я еще у Малышевой спрошу)
• Методы определения минимальных ингибирующих и бактерицидных концентраций, т. е. минимального уровня антибиотика, который позволяет предотвратить видимый рост микробов в питательной среде или пол ностью ее стерилизует. Это количественные методы, которые позволяют рассчитать дозу препарата, так как концентрация антибиотика в крови должна быть значительно выше минимальной ингибирующей концентрации для возбудителя инфекции. Введение адекватных доз препарата необходимо для эффективного лечения и профилактики формирования устойчивых микробов.
Для получения достоверных результатов необходимо применять стандартные диски и питательные среды, для контроля которых используются эталонные штаммы, соответствующих микроорганизмов. Метод дисков не дает надежных данных при определении чувствительности микроорганизмов к плохо диффундирующим в агар полипептидным антибиотикам (например, полимиксин, ристомицин). Если эти антибиотики предполагается использовать для лечения, рекомендуется определять чувствительность микроорганизмов методом серийных разведений.
Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом серийных разведений. Данным методом определяют минимальную концентрацию антибиотика, ингибирующую рост исследуемой культуры бактерий. Вначале готовят основной раствор, содержащий определенную концентрацию антибиотика (мкг/мл или ЕД/мл) в специальном растворителе или буферном растворе. Из него готовят все последующие разведения в бульоне (в объеме 1 мл), после чего к каждому разведению добавляют 0,1 мл исследуемой бактериальной суспензии, содержащей 106-107 бактериальных клеток в 1 мл. В последнюю пробирку вносят 1 мл бульона и 0,1 мл суспензии бактерий (контроль культуры). Посевы инкубируют при 37 °С до следующего дня, после чего отмечают результаты опыта по помутнению питательной среды, сравнивая с контролем культуры. Последняя пробирка с прозрачной питательной средой указывает на задержку роста исследуемой культуры бактерий, под влиянием содержащейся в ней минимальной ингибирующей концентрации (МИК) антибиотика.
Последнее изменение этой страницы: 2017-01-19; Нарушение авторского права страницы
Механические методы выделения чистых культур аэробных ифакультативно-анаэробных бактерий основаны на механическом разобщении бактериальных клеток на поверхности твердых питательных сред (рис.7). Чистая культура — это популяция микроорганизмов одного вида. К механическим методам относятся:
1) метод Дригальского – это качественный метод, широко применяется для бактериологической диагностики инфекционных заболеваний;
2) метод пластинчатых разводок Коха – это количественный метод, применяется в санитарной микробиологии;
3) метод клонов – получение колоний из одной бактериальной клетки (клонирование).
Биологические методы – методы, основанные на биологических свойствах бактерий:
1)метод Щукевича. Исследумый материал засевают в конденсационную воду скошенного МПА. Данный метод культивирования применяется при подозрении на инфицирование бактериями рода Proteus (P. vulgaris). В случае роста P. vulgaris обнаруживается ползучий рост – рост по всей поверхности агара за счет выраженной подвижности (рис. 8).;
2) бактериостатический метод, основанный на различном действии некоторых химических веществ (например, 5% серная кислота быстро убивает большинство микробов, а микобактерии туберкулеза выживает в этих условиях) и антибиотиков на бактерии (например, небольшие концентрации пенициллина задерживает рост грамположительных бактерий и не влияет на грамотрицательные;
3) метод прогревания. При прогревании исследумого материала при 80°С в течение 10-15 минут вегетативные формы бактерий погибают, а споры сохраняются;
4) метод обогащения. Исследумый материал засевают на элективные питательные среды, способствующие росту определенного вида микроорганизмов. Например, культивирование стафилококков на желточно-солевом агаре.
5) культивирование в организме лабораторных животных, например, выделение чистой культуры возбудителя чумы (Y. рestis) из материала, загрязненного посторонней микрофлорой, возбудителя туляремии (Fr. tularensis). Бактериологическая диагностика туляремии имеет существенную особенность – выделить возбудителя от больного человека непосредственными высевами не удается, тат как накопление микроба в крови и тканях больных крайне незначительно, поэтому бактериологическое исследование начинают с заражения лабораторных животных, то есть с обогащения биологическим способом.
Метод Дригальского
Цель метода: Выделение чистой культуры аэробных и факультативно-анаэробных бактерий и их идентификации.
Исследуемыми материалами могут быть мокрота, гной, испражнение и др. в зависимости от локализации возбудителя инфекционного заболевания. Метод проводится в 4 этапа, при выделении гемокультуры – 5 этапов. Выделение чистой культуры аэробных и факультативно-анаэробных бактерий изучаем на примере выделения чистой культуры кишечной палочки (E coli) из ее смеси со стафилококком.
1-й этап.Получение изолированных колоний. Колонии – это размножившиеся особи одной бактериальной клетки, выросшие на поверхности твердой питательной среды в виде изолированного скопления.
а) приготовление мазков из данной смеси микробов и окраска по Граму. Под микроскопом видны грамотрицательные кишечные палочки и грамположительные стафилококки ;
б) рассев смеси на чашку с МПА шпетелем (рис.10). Мы засеваем несколько измененным методом Дригальского. Вместо 3-х чашек с МПА берем одну. На поверхность питательной среды в чашке наносят петлёй каплю исследуемого материала в 3-х точках: первые две точки – ближе к стенке чашки, а третью точку – в центре, которую растирают прокаленным и охлажденным шпателем сначала в одном направлении, затем перпендикулярно в другом направлении (рис.11). Чашку надписывают (фамилия студента, номер группы, дата) и ставят в специальный цилиндр вверх дном, чтобы образующиеся капельки паров воды, попадающие на крышу, не стекали на поверхность среды и не размазывали посева;
Рис.11.
в) инкубация посева в термостате при 37 0 в течение 18-24 часов.
2-й этап.Выделение чистой культуры, то есть культуры, содержащей одного вида бактерий.
а) макроскопическое изучение колоний по величине, форме, окраске, характеру поверхности и краев, консистенции, структуре и размеру.
Просматривают чашку (не открывая) со стороны дна в проходящем свете, держа ее на уровне глаз на расстоянии 20-30 см. Видно, что посев смеси дал рост неоднородных колоний. Колонии стафилококка выпуклые, гладкие, блестящие, с ровным краем, размером 1-4 мм в диаметре, прозрачные, золотистые или белого цвета (рис.12). Колонии кишечной палочки слабовыпуклые, полупрозрачные, сероватого цвета, с ровным краем и гладкой блестящей поверхностью, размером 2-3 мм в диаметре (рис.13).
Колонии можно просмотреть с помощью лупы или под микроскопом (при малом увеличении) при этом лучше видна разница в структуре колоний;
б) микроскопическое исследование колоний.
Выбирают изолированные колонии того и другого микроба, из части каждой колонии делают мазки, окрашивают их по Граму и микроскопируют. Убеждаются, что золотистого цвета колонии содержат стафилококки - кокки располагаются скоплениями, грамположительны (рис.14), а серого цвета колонии - кишечные палочки, беспорядочно расположенные, грамотрицательные (рис.15);
в) остатки колоний кишечной палочки и стафилококков пересевают в пробирки с косым агаром. К пробиркам прикрепляют этикетку с указанием даты посева, группы, фамилии студента;
г) инкубация посевов в термостате при 37 0 в течение 18-24 часов.
3-й этап. Идентификация выделенной чистой культуры.
а) макроскопическое определение роста культуры на скошенном МПА. Стафилококк на скошенном агаре растет в виде прозрачного налета золотистого или белого цвета, кишечная палочка - в виде сочного, блестящего, полупрозрачного налёта серого цвета;
б) проверка чистоты культуры. Готовят мазок, окрашивают его по Граму и просматривают под микроскопом (не менее 10 полей зрения). Во всех полях зрения чистая культура должна быть однородной морфологически и тинкториально;
в) идентификация выделенной чистой культуры бактерий проводится по биохимическим, антигенным свойствам, фагочувствительности, токсигенности (вирулентности) и по генетической структуре.
Идентификация E.coli по биохимическим признакам:
б) идентификация по протеолитической активности.
Разложение микробами белка сопровождается образованием индола, сероводорода, аммиака.
Реакция на сероводород.Исследуемую культуру засевают в МПБ, под пробкой укрепляют полоску бумаги, пропитанной ацетатом свинца. Почернение бумаги после инкубации при 37 0 в течение 2-3 суток свидетельствует о наличии сероводорода. E.coli не образует сероводород в отличие от возбудителей брюшного тифа и паратифа В.
Проба на индол: Способ Эрлиха: в пробирку с культурой бактерий прибавляют 2-3 мл эфира, содержимое энергично перемешивают и добавляют несколько капель реактива Эрлиха (спиртовой раствор парадиметиламидобензальдегида с хлороводородной кислотой). В присутствии индола наблюдается розовое окрашивание; при осторожном наслаивании образуется розовое кольцо.
Идентификация стафилококков по биохимическим признакам:
а) определениекаталазной активности
На предметное стекло наносят каплю 1-3% раствора пероксида водорода и вносят в нее петлю с бактериальной культурой. Каталаза разлагает пероксид водорода на кислород и воду. Выделение пузырьков O2 свидетельствует о наличии у данного вида бактерий фермента каталазы. Каталазной активностью обладают стафилококки в отличие от стрептокков;
б) определение плазмокоагулазной активности.Плазмокоагулаза – фермент S.aureus сворачивающий фибрин за счет активации предшествующего в плазме крови протромбина, тем самым, защищая бактерии от клеточных и гуморальных факторов иммунитета.
В пробирку с цитратной плазмой вносят исследуемую культуру, помещают в термостат при (37 +/- 1) °С и через 1, 2, 3, 18 и 24 ч проверяют наличие свертывания плазмы. Реакция считается положительной независимо от степени свертывания плазмы. S.аureus обладает плазмокоагулазной активностью в отличие от других стафилококков.
4-й этап.Учет результатов идентификации и оформление заключения о виде.
Читайте также:
