Пуповинная кровь и вич

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Впервые вирус иммунодефицита человека 1 типа (ВИЧ-1) был выделен в 1983 г. Однако, несмотря на изучение проблемы СПИДа ведущими научно-исследовательскими лабораториями всего мира на протяжении более 30 лет, пандемия ВИЧ остается одной из серьезнейших проблем здравоохранения в области инфекционных заболеваний. Молекулярные механизмы проникновения ВИЧ в клетку-мишень включают в себя специфичное взаимодействие гликопротеина вирусной оболочки gp120 с молекулой CD4 и хемокиновым рецептором CCR5. Одновременная экспрессия молекул CD4 и CCR5 наблюдается в CD4+ лимфоцитах (Т-хелперы 1 типа, дендритные клетки, моноциты, макрофаги).

Полифорфизм CCR5-Δ32 является делецией 32 пары нуклеотидов гена CCR5, мутация потери функции, которая обеспечивает генетическую резистентность инфицированию ВИЧ-1. Мутация обнаруживается в европеоидной популяции с частотой 10–15% гетерозиготные и 1% гомозиготные носители.

Таким образом, на основании гипотезы о том, что трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), содержащих данную мутацию, может стать средством эффективного лечения пациентов с ВИЧ-инфекцией, несколько научно-исследовательских групп начали формирование пула источников таких ГСК. Одним из наиболее перспективных направлений является создание на базе банка пуповинной крови хранилища образцов пуповинной крови, содержащих мутацию CCR5-Δ32 с учетом наиболее часто встречающихся в данном регионе гаплотипов HLA.

Для инфицирования вирусом иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) требуется наличие CD4 рецептора и хемокинового рецептора 5 (CCR5) [1] . У человека белок CCR5 кодируется геном ccr5, расположенным на коротком плече третьей хромосомы в позиции 21 (3p21). Некоторые группы населения унаследовали мутацию ccr5-Δ32, представляющую собой делецию 32 пар нуклеотидов в кодирующей области гена ccr5. Гомозиготные носители этой мутации (ccr5-Δ32/Δ32) устойчивы к ВИЧ-1-инфекции [2–4] .

Однако для каждого региона мира существуют собственные особенности распределения аллелей системы HLA, поэтому образцы, хранящиеся в западноевропейских странах и США с невысокой долей вероятности могли бы подойти российским пациентам. Целью данного исследования является анализ образцов пуповинной крови, находящихся на длительном хранении в Покровском банке стволовых клеток на наличие мутации гена ccr5-Δ32/Δ32 и предварительная оценка данных образцов по количеству ядросодержащих клеток и HLA генотипу. Материал и методы В исследовании использовалась геномная ДНК, выделенная с октября 2011 г. по февраль 2013 г. из 1340 образцов пуповинной крови общественного регистра хранения Покровского банка стволовых клеток.

Получение пуповинной крови

Все образцы ПК были собраны как во время срочных родов, так и во время операции кесарева сечения после подписания роженицами информированного согласия на сбор материала. Получение пуповинной крови осуществлялся сразу после рождения ребенка – пуповина клеммировалась в течение 30 с после рождения ребенка, затем рассекалась между зажимами, и, после обработки антисептиком пуповины в месте предполагаемого прокола, производилась пункция пупочной вены. Кровь поступала в мешок самотеком. Сбор крови проводился до полного опустошения пупочной вены. По окончании сбора крови на трубку рядом с иглой накладывался зажим, игла извлекалась из вены, кровь перемешивалась с антикоагулянтом. Контейнер упаковывался в индивидуальный пластиковый пакет.

При поступлении контейнера с кровью в лабораторию после его идентификации и обработки поверхности антисептиком пакет с кровью переносился в подготовленный ламинарный бокс, где из него перед началом выделения фракции ядросодержащих клеток отбиралось по 1 мл в две микропробирки типа Эппендорф для исследования на гемоанализаторе и HLA-типирования. Микропробирки маркировались.

После получения клеточного концентрата, в ламинарном боксе стерильным шприцем в криопакет вводился рассчитанный объем криопротектора (ДМСО 10%, Pall, Великобритания). Замораживание концентрата осуществлялось в программируемом замораживателе Cryo 560-16 (Planer, Великобритания). Криокоробка с образцом переносилась на длительное хранение при температуре, не превышающей -150°С, в дьюар с жидким азотом.

ДНК выделялась из 0,9 мл замороженной крови с использованием коммерческих наборов Protrans (Германия) и Axygen (США). Скрининг образцов на ccr5Δ32 аллель выполнен методом ПЦР. Использовались следующие праймеры, фланкирующие делеционный сайт:

ПЦР проводилась в амплификаторе BioradMyCycler Version 1.065. Реакция проводилась по следующей программе: 94°С – 5 мин; далее 94°С – 30 с, 56°С – 40 с, 72°С – 40 с в течение 35 циклов; затем 72°С – 10 мин и 15°С – 5 мин. Детекция полиморфизма осуществлялась в 9% полиакриламидном геле с применением вертикального электрофореза. ПЦР фрагменты состояли из 224 пар нуклеотидов при нормальном варианте гена и из 192 пар нуклеотидов при гомозиготном полиморфизме ccr5Δ32.

HLA-типирование образцов пуповинной крови производилось методом SSP (sequencespecificpriming). ДНК выделялась из 0,5–0,7 мл пуповинной крови с применением наборов для выделения ProtransDNABox 500 (Protrans, Германия). Концентрация ДНК оценивалась на спектрофотометре, среднее значение концентрации при выделении данным набором равно 70 мкг/мл.

Далее производилась амплификация с использованием циклерплатных систем Protrans HLA-A*,B*,-DRB1* (Protrans, Германия). После нанесения на планшет, образцы ДНК помещались в термоциклер (MyCycler, Biorad) для проведения реакции амплификации. По окончании термоциклирования производился электрофорез в агарозном геле. После нанесения продуктов амплификации в лунки геля, электрофоретическую ячейку подключали к источнику питания и проводили электрофорез в течение 25 мин при 170V.

Снимок геля выполнялся через трансиллюминатор и заносился в компьютерную базу данных. В каждой из 96 лунок должен был получиться контрольный продукт для оценки проведения корректной амплификации, а также в некоторых лунках должна быть полоска специфичного продукта, что и обуславливало генотип по локусам HLA-A, HLA-B и HLA-DRB1.

Результаты и обсуждение

В результате исследования было выявлено 13 образцов пуповинной крови, содержащих гомозиготную мутацию гена ccr5Δ32, что составило 0,9% от общего количества исследованных образцов. Общее количество ядросодержащих клеток в образцах составило 1059±124×106, количество CD34+ клеток составило 3,95±1,08×106. Результаты HLA типирования приведены в таблице 1. Кроме того, было выявлено 256 гетерозиготных носителей полиморфизма ccr5Δ32 (19,1%).

Как видно из этой таблицы, 46% образцов пуповинной крови, гомозиготных по ccr5Δ32, имеют совпадение по 4–6/6 аллелям комплекса гистосовместимости при сравнении с наиболее часто встречающимися в Северо-Западном регионе аллелями системы HLA (табл. 2).

Известно, что требования к соответствию HLA для трансплантации пуповинной крови значительно менее строгие, чем к костному мозгу и периферической крови. Соответственно, гипотеза исследовательской группы под руководством профессора Л. Петца состоит в том, что лечение ВИЧ-инфекции при помощи трансплантации ГСК с использованием пуповинной крови, полученной из относительно небольшого хранилища криоконсервированных ccr5-Δ32/Δ32 образцов, может быть более выполнима.

Сотрудничество между многочисленными банками пуповинной крови делает высоко вероятным создание специального хранилища ccr5-Δ32/Δ32 образцов пуповинной крови, которое, при необходимости, может быть увеличено. Например, G. Gonzalez с соавт. (2011) подсчитали, что в мире хранится около 400 000 криоконсервированных образцов пуповинной крови, среди которых около 2000–4000 ccr5-Δ32/Δ32 образцов [11] .

Также обязательно учитывается необходимость адекватной дозы клеток, которая сейчас принимается в диапазоне от ≥ 2,5 × 107 кл/кг. Предварительные расчеты показывают, что хранилище объемом 300 единиц обеспечит 73,6% вероятность нахождения адекватного HLA совместимого образца для педиатрических пациентов европеоидной расы и вероятность 27,9% для взрослых пациентов европеоидной расы. Кроме того, после сообщения H.Liu (2011) о том, что при трансплантации пуповинной крови совместно с гаплоидентичной трансплантацией доза клеток пуповинной крови 1×107 кл/кг является достаточной, был произведен расчет для такой минимально необходимой дозы клеток [25] . Этот расчет показал вероятность нахождения адекватного HLA совместимого образца для 85,6% педиатрических пациентов и для 82,1% взрослых пациентов европеоидов. Использование сочетания гаплоидентичной трансплантации и введения пуповинной крови предоставляет существенные преимущества при принятии решения об использовании пуповинной крови для лечения ВИЧ-инфекции у взрослых. Нахождение двух совместимых образцов в хранилище из 300 образцов пуповинной крови будет проблематичным, тогда как использование одного образца, предназначенного для использования вместе с гаплоидентичной трансплантацией, гораздо более реально. Кроме того, при таких трансплантациях, приживление является быстрым, а исследования химеризма показали, что в большинстве случаев через несколько месяцев после трансфузии остаются только клетки пуповинной крови [25] .

Многие врачи до сих пор считают ВИЧ препятствием для трансплантации, и трансплантационные центры часто исключают этих пациентов из своих протоколов [28] . Тем не менее, опыт последних 25 лет свидетельствует об успешных трансплантациях ГСК ВИЧ-инфицированным пациентам с гематологическими заболеваниями, не только при лейкемии и рецидивах лимфом, но и при не злокачественных заболеваниях, таких как апластическая анемия [26] . Действительно, результаты при аллогенных трансплантациях у ВИЧ-инфицированных пациентов, вероятно, лишь незначительно хуже по сравнению с ВИЧ-негативными [26] .

В дополнение к трансплантации ГСК ВИЧинфицированным пациентам с онкогематологическими заболеваниями или другими показаниями к трансплантации, пациенты с развившимся СПИДом, при отсутствии других заболеваний, также могут быть включены в клинические исследования трансплантации ccr5-Δ32/Δ32 пуповинной крови. Оптимизм антиретровирусного лечения нивелируется невозможностью эрадикации вируса, постоянным приемом дорогостоящих лекарственных препаратов по сложным схемам, потенциальными токсическими эффектамии, распространенностью резистентных штаммов [29] . Пациенты со СПИДом, которые плохо отвечают на антиретровирусную терапию и были информированы о значительных рисках и потенциальных выгодах трансплантации ГСК, должны быть включены в клинические исследования, если есть HLAсовместимый ccr5-Δ32/Δ32 образец с достаточной дозой.

Логичный, на первый взгляд, подход к лечению ВИЧ-инфицированных больных трансплантацией ГСК костного мозга и периферической крови, имеющих аллель ccr5 и полученных от взрослых доноров, является для взрослых неприемлемым решением. Тестирование на ccr5-Δ32/Δ32 при регистрации доноров в NMDP (Национальная программа доноров костного мозга) дорого и вряд ли будет эффективным из-за низкой статистической вероятности нахождения как HLA совпадения высокой степени, как это требуется при трансплантации ГСК взрослых доноров, так иccr5-Δ32/Δ32 генотипа у донора. Таким образом, более разумно предложить широкомасштабное тестирование как помещаемой на хранение, так и уже хранящейся пуповинной крови для выявления ccr5-Δ32/Δ32 образцов.

В этой связи, полученные в процессе исследования результаты по доле ccr5-Δ32/Δ32 образцов пуповинной крови в общественном хранилище и их распределению по аллелям HLA позволяют в перспективе создать специальное хранилище таких образцов пуповинной крови. Этот материал при получении результатов клинических исследований мог бы с большой долей вероятности использоваться в лечении ВИЧ-инфицированных пациентов в Российской Федерации. В ближайшей же перспективе, обнаруженные в общественном хранилище НИЛ Клеточных технологий СЗГМУ им. И.И. Мечникова ccr5-Δ32/Δ32 образцы пуповинной крови могли бы быть включены в протоколы клинических исследований, проводимых за рубежом.

Дети, рожденные от ВИЧ + матерей, подвергаются внутриутробному воздействию нескольких препаратов и цитокинов, которые могут модифицировать развивающуюся иммунную систему и влиять на иммунный ответ новорожденного на инфекции и вакцины. Мы проанализировали связь между распределением подмножеств лимфоцитов пуповинной крови и профиля цитокинов у новорожденных ВИЧ-инфицированных матерей, использующих ВААРТ во время беременности, и сравнили их с нормальными новорожденными.

В проспективном контролируемом исследовании было изучено 36 пар мать-ребенок от ВИЧ + матерей и 15 ВИЧ-неинфицированных матерей. Были изучены гематологические особенности и цитокиновые профили матерей на 35 неделе беременности. Подмножества материнских и кормовых лимфоцитов, а также созревание B-клеток в пуповинной крови анализировали с помощью проточной цитометрии. Не стимулированное, а также BCG- и PHA-стимулированное продуцирование IL2, IL4, IL7, IL10, IL12, IFN-γ и TNF-альфа в культурах мононуклеарных клеток у матерей и младенцев определяли количественно с использованием ELISA.

После одного года наблюдения никто из зараженных младенцев не стал серопозитивным к ВИЧ. Увеличение В-лимфоцитов, особенно CD19 / CD5 +, наблюдалось в пуповинной крови ВИЧ-инфицированных новорожденных. Дети ВИЧ + тяжелые наркотики, использующие матерей, также увеличивали незрелые В-клетки. Мононуклеарные клетки пуповинной крови ВИЧ-инфицированных новорожденных продуцировали меньше IL-4 и IL-7 и более IL-10 и IFN-γ в культуре, чем у неинфицированных матерей. Значения цитокинов в супернатантах были сходными у младенцев и их матерей, за исключением IFN-γ и TNF-альфа, которые были выше у ВИЧ-инфицированных матерей, особенно в отношении злоупотребляющих наркотиками. Клетки CD19 / CD5 + лимфоциты пуповинной крови показали положительную корреляцию с кордом IL-7 и IL-10. Более высокий возраст матерей и курение были связаны с уменьшением CD4 + клеток пуповинной крови.

у неинфицированных младенцев, рожденных ВИЧ + женщинами, было обнаружено несколько иммунологических нарушений, связанных с остаточными материнскими иммунными изменениями, вызванными ВИЧ-инфекцией, и теми, которые связаны с антиретровирусным лечением. Курение матерей было связано с изменениями в лимфоцитах CD3 / CD4 корней, а злоупотребление тяжелыми наркотиками матерей ассоциировалось с более выраженными изменениями в линии клеток В-клеток.

ВИЧ-инфекция связана со сложной моделью изменений в кроветворной и иммунной системах, что приводит к аномалиям подсчета периферической крови (ПБ) и изменениям Т-лимфоцитов. Уменьшение Т-хелпера и увеличение цитотоксических лимфоцитов, глубокие изменения в профиле цитокинов и различные аномалии В-лимфоцитов были неоднократно описаны 4. Однако долгосрочная антиретровирусная терапия (АРВ) способна восстановить, по крайней мере частично, иммунную функцию 5.

Внедрение АРВ-терапии у ВИЧ + беременных женщин резко снизило вертикальную передачу ВИЧ 2. Однако при ВИЧ-инфицированных новорожденных, инфицированных новорожденным [1,2,4], было выявлено несколько изменений в подсчетах PB и T CD4 + и CD8 + лимфоцитах и ​​связано с изменениями профиля материнского цитокина, вызванного ВИЧ-инфекцией, а также с помощью АРВ-терапии [ 2,8-14]. Изменения счетчика PB скоро меняются, но некоторые изменения Т-лимфоцитов могут продолжаться до 8 лет [2]. Таким образом, эти младенцы представляют повышенный риск серьезных инфекций. Этот риск еще больше увеличивается, поскольку новорожденные от ВИЧ-инфицированных матерей обычно не получают грудного вскармливания, чтобы избежать вертикальной передачи. Изменения в Т-лимфоцитах могут также влиять на ответ на вакцины, данные в неонатальном периоде [2,10-13].

Изменения в подгруппах Т-лимфоцитов у младенцев были хорошо изучены, но мало что известно о влиянии ВИЧ-инфекции и высокоактивного антиретровирусного лечения (ВААРТ) на неонатальное созревание и функцию В-лимфоцитов [8,15].

Целью нашего исследования было проанализировать созревание В-клеток в пуповинной крови новорожденных, рожденных ВИЧ-инфицированными матерями с использованием ВААРТ. Мы также изучали связь между распределением подмножеств лимфоцитов и продуцированием цитокинов в кратковременных культурах мононуклеарных клеток пуповинной крови, а также в мононуклеарных клетках периферической крови матери на 35 неделе беременности. Мы также искали связь между курением матерей и употреблением тяжелых лекарств во время беременности и субпопуляциями лимфоцитов ребенка.

Мы изучили 36 пар матерей и детей ВИЧ-положительных беременных женщин, которые посещали нашу акушерскую группу высокого риска. Им было> 18 лет, они использовали ВААРТ во время беременности и имели низкую или неопределяемую вирусную нагрузку. У всех из них была срочная доставка. Ни у кого из новорожденных не было мальформации при рождении. Их данные сравнивались с 15 нормальными парами матери и ребенка, которые также посещались в нашем Институте. Матерям контрольной группы было также> 18 лет, не имело никакого патологического состояния: гипертония, диабет, ожирение, аутоиммунные расстройства, инфекции, а также прошлая история повторных инфекций, указывающих на лежащий в основе иммунодефицит, и имели нормальный срок доставки.

Количество периферической крови, а также профиль цитокинов обеих групп матерей, а также вирусная нагрузка ВИЧ + были взяты между 32 и 35 неделями беременности.

После 13-17 месяцев наблюдения ни у одного из зараженных младенцев не развилась ВИЧ-инфекция. Младенцы считались ВИЧ-неинфицированными и определялись как серореверторы, если у них были отрицательные тесты на ВИЧ-полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в возрасте 1 и 3 месяцев или стали ВИЧ-серонегативными после 13-месячного возраста.

Корневую кровь отделяли при доставке и обрабатывали в течение первых 24 часов после сбора. Количество клеток было выполнено на гематологическом счетчике Advia 120 (Bayer, Dublin — Ireland). Подмножества лимфоцитов изучались с помощью проточной цитометрии. Т-лимфоциты анализировали в комбинации CD4 / CD8 / CD3. Их количество выражали в процентах от CD3 + клеток среди всех клеток, зародышевых клеток пуповинной крови. В лимфопоэзе изучали комбинации: CD5 / CD19 / CD45, CD45 / CD34 / CD19 / CD22 и sIgM / CD34 / CD19 / CD10 (фиг. 1). Для каждого случая было приобретено не менее 50000 событий с использованием оборудования FACSCalibur (Beckton Dickinson) (программное обеспечение Cell Quest). Анализ выполнялся с использованием программного обеспечения Paint-a-Gate.

Анализ созревания В-клеток в пуповинной крови нормального новорожденного (контрольная группа). Экспрессию CD34 использовали для идентификации незрелых В-клеток. Созревание изучали с использованием экспрессии CD45, CD22, CD10 и мембранного IgM (sIgM). A) Комбинация CD45 / CD34 / CD19 / CD22 — черный: незрелые клетки — CD45lowCD34 + CD19 + CD22- красный: промежуточные клетки — CD45 — / + CD34lowCD19 + CD22 + желтый: зрелые клетки — CD45 + CD34-CD19 + CD22 +. B) Комбинация sIgM / CD34 / CD19 / CD10 — черный: незрелые клетки — sIgM-CD34 + CD19 + CD10 — / + красный: промежуточные клетки — sIgM + CD34 — / + CD19 + CD10 — / + желтый: зрелые клетки — sIgM + CD34-CD19 + CD10 — / +.

Анализы цитокинов проводились в супернатантах из культур мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) матерей на 35 неделе беременности и мононуклеарных клеток грудной клетки грудной клетки (CBMC). В обоих случаях мононуклеарные клетки выделяли Ficoll-Hypaque 1077 (Sigma, MO, USA). Они суспендировали в RPMI 1640 с 10% человеческой сывороткой, 1% глутамином и 0,1% гентамицином и культивировали в течение 48 часов с живым Bacillus Calmette-Guérin (БЦЖ) (5 × 105 / мл), (Butantan Institute, SP), фитогемагглютинином ( PHA, 7,5 мкг / мл) (Sigma, MO, США) или только в среде (не стимулируется).

Цитокины определяли количественно с помощью иммуноферментного анализа с ферментным связыванием (ELISA) в бесклеточных супернатантах с использованием коммерческих наборов для человеческих IL-2, IL-4, IL-7, IL-10, IL-12, TNF- и IFN-γ ( Duo Set®, R & D Systems Inc, Миннеаполис, MN, США). Эти цитокины были выбраны, поскольку они способны анализировать состояние Th1 и Th2 [15].

Мононуклеарные клетки пуповинной крови (CBMC) выделяли центрифугированием с градиентом плотности над Ficoll-Hypaque (Amersham Biosciences, США), промывали, разбавляли до 1 × 106 клеток / мл в среде RPMI 1640 (Sigma, США), дополняли 10% человеческого AB сыворотку (Sigma, США), 1% глутамина (Sigma, США) и 0,1% гентамицина и стимулировали в течение 6 дней только с помощью PHA или среды при 37 ° C с 5% -ными планшетами для культивирования ткани с 96-луночным CO2 (NUNC, Дания). После сбора в 20 мМ ЭДТА образцы инкубировали с человеческим иммуноглобулином и затем окрашивали флуоресцентными антителами против CD3, CD4 и CD8 (Beckman Coulter, США) против человеческого человека до получения и анализа. В анализе использовались только CD3 + Т-клетки. Отдыхающие и вздутые лимфоциты были закрыты на переднем и боковом участках рассеяния (рис. 2). Мертвые клетки были исключены из всех анализов. Клетки CD4 + и CD8 + идентифицировали в воротах взрывательных лимфоцитов. Пролиферацию измеряли в процентах от CD3 + бластов в PHA-стимулированной лунке, из которой вычитали базальную пролиферацию без стимуляции (PHA, Sigma, USA, 7,5 мкг / мл).

Анализ пролиферации T-клеток не стимулированных (A) и PHA-стимулированных (B) мононуклеарных клеток новорожденного от ВИЧ-инфицированной матери. После стробирования CD3-клеток события анализировались на размер и сложность (прямые и разбросные ворота), из которых были разделены покоящиеся (R1-green) и взрывные клетки (R2-синий). Затем анализировали подмножества T-лимфоцитов. Мертвые клетки (красный) были исключены из всех анализов. Т-клеточная пролиферация была разницей между процентами PHA-стимулированных взрывов и нестимулированных взрывов.

Перевод статьи Этьена де Арвен из Американского журнала врачей и хирургов (Journal of American Physicians and Surgeons Volume 15 Number 3 Fall 2010). Оригинал на английском здесь.

ВИЧ-консенсус

Факторы, придающие кажущуюся обоснованность гипотезе ВИЧ

В многочисленной литературе, посвященной ВИЧ/СПИД можно найти утверждение о ясности, однозначности и исчерпывающей полноте доказательств того, что СПИД вызывается ВИЧ-1 и ВИЧ-2. Эти данные объеденены в четыре группы: (1)определение молекулярных маркеров ретровирусов, (2) наблюдение за ретровирусными частицами при трансмиссии с помощью электронного микроскопа, (3) заявленная эффективность антиретровирусных препаратов и (4) эпидемиологические данные.

(1) Определение молекулярных маркеров ретровирусов

В длинном списке гипотетических молекулярных маркеров ВИЧ наиболее символическая – энзим обратная транскриптаза (ОТ) 34,35 . Важно то, что этот энзим функционирует во всех живых организмах в нашем биологическом универсуме, 36,37 а это должно заставить исследователя проконтролировать выделение вирусных проб перед тем как делать заявление о наличии связи между ОТ и ретровирусами. Заражение проб клеточным материалом может само по себе объяснить присутствие ОТ. Это очень важное замечание, потому, что попытки изолировать и выделить ВИЧ путем постепенной ультрацентрифугации сахарозы, супернатанта, от якобы ВИЧ-инфицированных клеток, привело к тому, что пробы оказались сильно загрязненными микроскопическими пузырьками, что мы и видим под электронным микроскопом 38,39 .

(2) Наблюдения за ретровирусными частицами в электронный микроскоп

Все микрографии частиц, якобы представляющих собой ВИЧ, размещенные как в научных, так и популярных публикациях, были получены с помощью наблюдений за клеточными культурами в электронный микроскоп. Нигде не было продемонстрировано, что ВИЧ-частицы происходят из организма пациента со СПИДом. 50 Все изображения отретушированы с помощью компьютерных методов реконструкции изображений, к микрографиям добавлены красивые цвета и трехмерные эффекты. Огромное количество научных и популярных статей, украшенных элегантными фотографиями, несомненно способствовали принятию гипотезы о существовании ВИЧ за истину среди ученых и общественности.

(3) Заявленная эффективность антиретровирусных препаратов

(4) Эпидемиологические данные

Манипулируя и создавая в масс медиа обстановку страха, государственная политика в области СПИДа прикладывала много усилий ради получения бюджетных денег. 61,62 Апокалиптические предсказания того, что гетеросексуальная передача болезни приведет к мировой пандемии, опирались в основном на статистику ВОЗ и CDC, а эти отчеты, в свою очередь, были созданы на базе гипотезы, что СПИД – заразная болезнь, передающаяся половым путем.

Наиболее авторитетные заключения были представлены в 2008 году опытным эпидемиологом Джеймсом Чин, бывшим главой Департамента глобальной программы по СПИДу во Всемирной Организации Здравоохранения в Женеве. Он опубликовал книгу «Столкновение эпидемиологии и политкорректности 73 , в которой исчерпывающе описал невозможность передачи СПИДа гетеросексуальным путем. Чин заявил, что СПИД остается болезнью небольшой группы гомосексуалистов и внутривенных потребителей наркотиков и что гетеросексуалы не подвержены риску заболевания СПИДом. Утверждения Чин бросили тень на достоверность статистических данных ВОЗ.

Эпидемиологические данные по СПИДу стали еще более запутанными после того, как официальное определение синдрома менялось несколько раз и на данный момент совершенно не отображают постулат о том, что ВИЧ = СПИД.

Ретровирусы на поверхности лимфоцитов из пуповинной крови

Тем не менее, рисунок 2 показывает пузырьки ретровируса на поверхности лимфоцита из человеческой пуповинной крови. Происхождение этого ретровируса нужно еще уточнить.

Лимфоциты из пуповинной крови – это клетки, взятые из плаценты. Человеческая плацента характеризуется высокой концентрацией ЭРВЧ 78 и ретровирусные частицы в плаценте можно увидеть в электронный микроскоп. 79 Поэтому, пуповинная кровь, скорее всего, содержит похожие ЭРВЧ. Исследование, проведенное в 1983 году 52 продемонстрировало, что экспрессия ЭРВЧ частиц была успешно активирована в культивированных лимфоцитах пуповинной крови при добавлении 2 g/ml Полибрена. Но не было продемонстрировано, как ретровирусные частицы, образованные в организме пациентов на стадии перед СПИДом. Исследование контрольной группы, которое уже давно надо было бы провести, должно будет изучать (с помощью электронного микроскопа) культивированные лимфоциты из пуповинной крови для подтверждения результата, полученного в институте Пастера в 1983 году. Дормашкин представил некоторые данные по этому вопросу в 1992 году, 90 но он не добился поставленных целей, потому, что изучаемые им лимфоциты пуповинной крови не были культивированы при условиях, идентичных тем, которые использовали в институте Пастера в 1983 году.

Изображения ретровирусных частиц, полученные в 1983 году, могут быть также объяснены наличием произошедших из плаценты и активированных Полибреном эндогенных ретровирусов человека. Данные микрографии никак не объясняют существование экзогенного ретровируса, приводящего к СПИДу.

Очевидно, что существование ЭРВЧ не может игнорироваться при объективном анализе клинических данных и базовых исследований ВИЧ/СПИДа.

Дискуссия

Всех, кто переосмысливает СПИД, объединяет одно основополагающее убеждение, что ВИЧ не приводит к СПИДу. 91 Относительно того, существует ВИЧ или нет, пока нет однозначного мнения.

И последнее, вопрос о том, существует ли ВИЧ вообще или о том, что ученые изучали безвредный вирус-пассажир, должен быть предметом открытых научных дебатов и тщательной проверки фактов или отсутствия таковых. Альтернативные объяснения имеющихся у нас данных должны приводиться при наличии научных доказательств, а не консенсуса. Чтобы достичь прогресса в исследованиях СПИДа мы не должны идти на компромисс.

Этьен де Арвен (Брюссельском университет). В 1953году стал полноправным членом института Слоан Кеттеринг (Нью-Йорк) и в 1968 — почетным профессором патологии в университете Торонто (Канада).

Стволовые клетки, содержащиеся в пуповинной крови, уже давно привлекают к себе повышенное внимание как исследователей, так и клиницистов. Это связано с уникальной способностью стволовых клеток пуповинной крови к размножению и дифференцировке в экспериментальных и клинических условиях в компоненты самых разнообразных тканей, главным образом – в различные форменные элементы крови. Свойства стволовых клеток побуждают исследователей питать серьезные надежды на разработку принципиально новых подходов к лечению многих заболеваний.

Сегодня трансплантация стволовых клеток активно используется для лечения широкого спектра заболеваний. Прежде всего, это различные формы лейкозов, то есть ситуации, когда необходимо полностью заменить или восстановить систему кроветворения после химиотерапии. Исторически, костный мозг стал первым источником кроветворных стволовых клеток, использованным для трансплантации, однако уже в начале 80-х гг. XX в. стало известно, что богатым источником кроветворных (или гемопоэтических) стволовых клеток является и пуповинная кровь.

В настоящее время сбор и хранение стволовых клеток пуповинной крови представляют собой новую медицинскую технологию, форму страхования здоровья и жизни ребенка. Программы по созданию банков стволовых клеток пуповинной крови активно развиваются практически во всех странах мира. Сегодня в мире насчитывается около 50 активных банков-регистров, в которых хранится в общей сложности примерно 400 тысяч образцов пуповинной крови.

По данным нескольких авторитетных сайтов, посвященных стволовым клеткам пуповинной крови, мы составили обзор наиболее часто задаваемых вопросов, касающихся пуповинной крови.

*В обзоре были использованы материалы сайтов:

Что такое стволовые клетки?

Основными источниками кроветворных или гемопоэтических стволовых клеток являются костный мозг, периферическая кровь (кровь, которая содержится в венах и артериях), пуповинная кровь и плацента.

Что такое пуповинная кровь?

Пуповинная кровь – это кровь ребенка, которая остается в плаценте и пуповине после рождения ребенка. Раньше она считалась бесполезным материалом и не использовалась. Исследования показали, что пуповинная кровь является ценным источником кроветворных стволовых клеток и может быть собрана и заморожена для использования в будущем.

Почему пуповинная кровь является лучшим источником кроветворных стволовых клеток?

Имеет ли смысл сохранять стволовые клетки как из пуповины, так и из плаценты?

Сбор и выделение стволовых клеток одновременно из пуповины и из плаценты позволит сохранить больше материала, чем просто из пуповины. Увеличение общего количества стволовых клеток повысит потенциал этих клеток для успешной трансплантации в будущем.

Когда собирают пуповинную кровь и насколько безопасна эта процедура?

Пуповинную кровь собирают сразу же после рождения ребенка. Это единственная возможность ее получить. После рождения ребенка врач перерезает пуповину, после чего в стерильных условиях в вену пуповины вводят иглу, чтобы собрать кровь в специальный пакет. Весь процесс занимает несколько минут. Процедура проходит быстро, просто и безболезненно. Сбор пуповинной крови не требует общей анестезии и проходит без физического контакта с матерью и ребенком, поэтому процедура абсолютна безопасна. Пуповинную кровь можно собирать как при физиологических родах, так и при родах путем кесарева сечения.

В любом ли роддоме может быть произведен забор пуповинной крови?

Технически несложная процедура забора пуповинной крови может быть произведена в любом роддоме врачом или акушером. В предварительном разговоре с врачом-акушером будущим родителям необходимо сформулировать свое желание собрать пуповинную кровь. При этом нужно помнить, что пуповинная кровь является собственностью родителей, и никто не вправе отказать в ее сборе.

Что происходит после того, как кровь собрана?

После того, как пуповинная кровь собрана, ее упаковывают в специальный контейнер и доставляют в лабораторию, где определяют ее объем и проводят обработку для последующего замораживания и хранения.

Каким образом кровь обрабатывают в лаборатории?

В лабораторию поступает герметичный стерильный пакет, содержащий пуповинную кровь и раствор, препятствующий её свертыванию. В условиях специальной лаборатории из крови путем центрифугирования выделяют концентрат стволовых клеток пуповинной крови. Остающуюся после центрифугирования жидкую часть крови (плазму) направляют на анализы (СПИД, гепатит, цитомегаловирус и т.д.). К полученному концентрату стволовых клеток добавляют криопротектор – вещество, препятствующее разрушению клеток в условиях низкой температуры, смесь разливают в особые герметичные мешки или в криопробирки и замораживают по специальной программе. Далее мешки помещают в жидкий азот, где они и хранятся.

Как хранится пуповинная кровь?

Каждому образцу в банке пуповинной крови присваивают уникальный идентификационный номер. Стволовые клетки хранятся в жидком азоте при температуре -196 0 С.

Как долго могут храниться стволовые клетки?

Большинство исследователей сходится во мнении, что стволовые клетки в условиях глубокой заморозки могут храниться бессрочно. К настоящему времени описан опыт хранения образцов пуповинной крови в течение 20 лет, причем после размораживания клетки сохранили все свои свойства. Серьезные научные предпосылки указывают на то, что кровь может сохраняться без потери своих свойств и более продолжительное время.

Имеет ли значение количество собранных клеток?

Помимо качества клеток, большое значение имеет и их количество. Для успешной трансплантации необходимо определенное количество клеток на единицу веса. На сегодняшний день собранного материала хватает в среднем на вес пациента до 50 кг. Это не означает, что после того, как ребенок вырастет, его клетки не имеет смысла хранить. Сейчас ученые проводят эксперименты, и уже есть успешные клинические испытания по искусственному размножению стволовых клеток пуповинной крови in vitro, и в недалеком будущем проблема количества будет решена. Однако пока чем больше хранится материала, тем лучше. Поэтому даже родителям однояйцовых близнецов, обладающих идентичными генотипами, советуют собирать два комплекта пуповинной крови.

Надо ли сохранять пуповинную кровь более чем одного ребенка?

Каждый ребенок генетически уникален. Сохранение пуповинной крови каждого ребенка обеспечивает подходящий источник стволовых клеток для будущего лечения и увеличивает возможность защиты каждого ребенка.

При лечении каких заболеваний могут использоваться гемопоэтические стволовые клетки?

Клинический опыт использования стволовых клеток в разных странах позволяет говорить о лечении более 70 смертельно опасных заболеваний, в том числе имеющих наследственную природу. Наиболее часто стволовые клетки используются при лечении онкологических заболеваний различной локализации, лейкозах, различных заболеваниях кровеносной системы, сахарном диабете, болезнях лизосомального накопления, иммунодефиците, лейкемии, аутоиммунных заболеваниях, мышечной дистрофии, болезнях Альцгеймера и Паркинсона.

Какие есть конкретные примеры использования стволовых клеток пуповинной крови?

Какова вероятность того, что у ребенка разовьется заболевание, подлежащее лечению гемопоэтическими стволовыми клетками пуповинной крови?

Это открытый вопрос, который широко обсуждается. Критики методики утверждают, что вероятность этого события не превышает 1 к 10 000 или даже к 20 000. Сторонники говорят, что, если рассматривать более широкий список болезней, то 1 к 400. Для сравнения можно взять страховку от пожара: риск того, что конкретный дом сгорит, является мизерным, но страховка от пожара в США и Европе есть у всех. Сбор же пуповинной крови, если рассматривать его как страховку, является еще более важным делом. Дом можно отстроить заново и застраховать его можно в любой момент. Вылечить, спасти ребенка без его собственных стволовых клеток можно далеко не всегда, а собрать его пуповинную кровь можно только раз в жизни – только сразу после его рождения.

Каковы перспективы лечения стволовыми клетками?

Во всем мире исследования, посвященные этой теме, демонстрируют весьма впечатляющие результаты. В частности, ведется изучение вопроса применения стволовых клеток для восстановления всех тканей организма. Стволовые клетки, содержащиеся в пуповинной крови, могут получить в будущем применение в лечении болезни Альцгеймера, диабета, заболеваний сердца и печени, мышечной дистрофии, болезни Паркинсона, повреждениях позвоночника и др.

Могут ли стволовые клетки пуповинной крови быть использованы для лечения родственников ребенка?

Аутологичные (собственные) стволовые клетки на 100% подойдут только самому ребенку. В определенных случаях их можно использовать при близкородственной трансплантации для лечения родственников донора: в большей степени братьев и сестер. Поскольку стволовые клетки, выделенные из пуповинной крови новорожденного, менее иммунореактивны, они реже вызывают осложнения и отторгаются.

Кто может распоряжаться стволовыми клетками пуповинной крови?

Право распоряжаться компонентами крови до достижения совершеннолетия ребенка имеет один из родителей при условии согласия другого. После достижения совершеннолетия аутологичными стволовыми клетками распоряжается ребенок.

Когда ученые впервые осуществили трансплантацию стволовых клеток, выделенных из пуповинной крови?

Впервые такая трансплантация была осуществлена во Франции в 1988 г. больному с анемией Фанкони. С тех пор было сделано уже около 9000 подобных операций, и число это увеличивается с каждым днем.