Возбудители чумы туляремии бруцеллеза сибирской язвы

ЛЕКЦИЯ № 17. Возбудители зооантропонозных инфекций

Возбудитель чумы относится к роду Yersinia, вид Y. pestis.

Это грамотрицательные полиморфные мелкие палочки с закругленными концами. Они неподвижны. Спор не образуют. В организме больного и при размножении на питательных средах образуют капсулу. В окрашенных метиленовым синим мазках выявляется биполярность.

Являются факультативными анаэробами. Размножаются на простых питательных средах, но лучше при добавлении гемолизированной крови. Оптимальная температура для культивирования – 28 °C.

Иерсинии чумы хорошо переносят низкие температуры, могут длительно сохранять жизнеспособность в окружающей среде и в организме человека и животных.

Чувствительны к УФ-облучению, высушиванию, действию высоких температур.

Биохимическая активность: расщепляют углеводы с образованием кислоты, слабая протеолитическая активность – желатин не разжижают, молоко не свертывают.

Антигены палочки чумы:

1) О-антиген (соматический, локализуется в клеточной стенке);

2) F-антиген (поверхностный белковый термостабильный антиген);

3) V– и W-антигены (обладают антифагоцитарной активностью).

1) наличие антигенов, обладающих антифагоцитарной активностью;

2) образование пестицинов;

3) способность ассимилировать гемин и синтезировать пурины;

Основными хозяевами иерсиний чумы в природе являются грызуны (суслики, тарбаганы и др.). Заражение человека происходит трансмиссивным (переносчики – блохи), контактным и алиментарным путями. Больные легочной формой чумы заражают окружающих аэрогенным путем.

Клинические проявления чумы зависят от входных ворот инфекции. Различают следующие формы заболевания:

Основное место размножения возбудителя – лимфатические узлы. Недостаточная барьерная функция лимфоузлов приводит к развитию первично-септической формы чумы.

Вторично-септическая форма развивается на фоне бубонной или легочной форм.

После перенесенного заболевания остается прочный продолжительный иммунитет.

Чума – особо опасная инфекция. Работа с материалами, содержащими возбудитель болезни, проводится в специальных лабораториях, подготовленным персоналом, при соблюдении установленных мер безопасности.

1) бактериологическое исследование. Материалы – гной из бубонов, отделяемое язвы, мокрота. Посевы подвергаются холодовому обогащению;

2) серодиагностика – РПГА;

3) реакции иммуноиндикации.

Лечение: проводится антибиотикотерапия стрептомицином, противочумным иммуноглобулином.

Специфическая профилактика: живая или химическая чумная вакцина; создается стойкий иммунитет на 6 месяцев.

2. Сибирская язва

Возбудитель относится к роду Bacillus, вид B. anthracis.

Это грамположительные крупные неподвижные палочки. Вне организма в присутствии кислорода образуют споры, располагающиеся центрально. Споровые формы отличаются особенной стойкостью во внешней среде. В организме и на питательных средах образуют капсулу. В мазках располагаются цепочками.

Возбудитель является аэробом или факультативным анаэробом. Хорошо размножается на простых питательных средах. На поверхности агара образует шероховатые колонии с неровными краями. Рост в бульоне характеризуется появлением белых хлопьев, оседающих на дно пробирки.

1) разжижают желатин;

2) расщепляют углеводы;

3) восстанавливают нитраты;

4) гидролизуют крахмал, казеин.

Антигены сибиреязвенных бацилл:

1) видовой капсульный антиген белковой природы;

2) групповой соматический антиген полисахаридной природы; локализован в клеточной стенке, термостабильный.

1. Токсин, состоящий из трех компонентов:

1) отечного фактора, вызывающего дермонекротическую реакцию;

2) летального токсина, вызывающего отек легких и тяжелую гипоксию;

3) протективного антигена.

2. Капсула; обладает антифагоцитарной активностью; бескапсульные культуры невирулентны.

В естественных условиях сибирской язвой болеют животные: крупный и мелкий рогатый скот, лошади, свиньи, олени, верблюды. Патологический процесс развивается в кишечнике.

Человек заражается от больных животных при непосредственном контакте, через инфицированные предметы, изделия из зараженного сырья, мясо больных животных. Возможен трансмиссивный путь передачи.

Клинические формы заболевания:

1) кожная – образование карбункула;

2) кишечная – тяжелая интоксикация, рвота, тошнота, понос с кровью;

3) легочная – тяжелая бронхопневмония.

У переболевших создается прочный иммунитет. В течение болезни создается специфическая сенсибилизация.

1) бактериологическое исследование; материал для исследования определяется клинической формой заболевания;

2) аллергическая проба с антраксином; положительная реакция определяется с первых дней заболевания и сохраняется в течение многих лет после выздоровления;

3) серодиагностика – термопреципитация по Аксоли.

1) противосибиреязвенный иммуноглобулин;

2) антибиотики (пенициллин, стрептомицин).

1) живая сибиреязвенная вакцина; создает иммунитет на год;

2) экстренная профилактика – противосибиреязвенный иммуноглобулин.

Возбудитель туляремии относится к роду Francisella, вид F. tularensis.

Это очень мелкие полиморфные, кокковидные или палочковидные грамотрицательные бактерии. Спор не образуют. Жгутиков не имеют. Образуют небольшую капсулу.

Факультативные анаэробы. На простых питательных средах не растут. Для размножения требуется введение в среду цистеина. Возможен рост на средах, содержащих яичный желток, на кровяном агаре с добавлением глюкозы и цистеина. На плотных средах образуют небольшие колонии беловатого цвета.

В окружающей среде возбудитель долго сохраняет жизнеспособность. Малоустойчив к действию высокой температуры.

Биохимические свойства нестабильны, ферментативная активность маловыраженна. Продуцируют сероводород.

Антигены – О-антиген; соматический, локализуется в клеточной стенке, индуцирует синтез агглютининов и преципитинов.

Фактор патогенности – эндотоксин.

Естественные хозяева возбудителя – грызуны (водяные крысы, полевки, домовые мыши, хомяки, зайцы).

Заражение человека происходит при прямом контакте с больными животными или трупами погибших, через инфицированную воду и пищевые продукты. Переносчиками заболевания могут быть клещи, комары, слепни. В организм человека возбудитель попадает через кожу и слизистые оболочки глаз, рта, носа, дыхательных путей и пищеварительного тракта. Затем возбудитель оказывается в лимфатических путях, где интенсивно размножается и появляется в крови.

Клинические формы туляремии:

Сопровождается развитием специфической аллергической реакции, возникающей на 3—5-й дни заболевания и сохраняющейся после выздоровления в течение многих лет.

После перенесенного заболевания остается стойкий, длительный иммунитет.

1) серодиагностика; со 2-й недели заболевания определяют антитела в сыворотке крови в реакциях агглютинации и РНГА; при повторных исследованиях наблюдается нарастание титра антител;

2) заражение исследуемым материалом (пунктатом из бубона, сосков, язвы, отделяемым конъюнктивы, налетом из зева, мокротой, кровью) белых мышей или морских свинок; из органов животных делают мазки и посев на свернутую желточную среду;

3) реакция термопреципитации;

4) постановка аллергической пробы с турярином; проба становится положительной с 3—5-го дней заболевания.

Лечение: применяют антибиотики – стрептомицин, тетрациклин, хлорамфеникол.

Специфическая профилактика: живая вакцина Гайского-Эльберта; создается иммунитет на 5–6 лет.

Возбудитель относится к роду Brucella.

Патогенны для человека три вида:

Это мелкие грамотрицательные коккобактерии. Жгутиков не имеют. Спор не образуют. Свежевыделенные штаммы могут образовывать нежную капсулу.

Бруцеллы требовательны к питательным средам. Используют специальные среды с добавлением сыворотки крови, глюкозы, тиамина, биотина. Рост очень медленный. На плотных питательных средах образуют мелкие выпуклые бесцветные с перламутровым блеском колонии. В жидких средах образуют равномерное помутнение. Под влиянием антибиотиков переходят в L-формы.

Являются строгими аэробами.

Обладают большой устойчивостью к действию факторов окружающей среды, длительно сохраняют жизнеспособность при низких температурах, высокочувствительны к высокой температуре и дезинфектантам.

Биохимические свойства бруцелл:

1) расщепляют глюкозу и некоторые другие углеводы;

2) разлагают мочевину и аспарагин;

3) гидролизуют белок, пептоны, аминокислоты;

4) имеют ферменты, такие как каталаза, гиалуронидаза, пероксидаза, липаза, фосфатаза.

1) Vi-антиген (поверхностный);

2) соматические видоспецифические антигены А и В.

У B. melitensis преобладают М-антигены, у B. abortus и B. suis – А-антигены.

2) ферменты агрессии и защиты: гиалуронидаза, нейраминидаза и т. д.;

3) способность размножаться в клетках лимфоидно-макрофагальной системы.

Естественные хозяева возбудителя различны в зависимости от вида: B. melitensis вызывает заболевание у мелкого рогатого скота, B. abortus – у крупного рогатого скота, B. suis – у свиней. Человек заражается контактным, алиментарным и воздушно-капельным путем.

Чаще заболевание носит профессиональный характер – болеют животноводы, работники мясокомбинатов, зоотехники, ветеринары и т. д.

Возбудитель способен проникать в организм через неповрежденные слизистые оболочки. После проникновения распространяется лимфогенным путем, попадает в кровь, а затем в селезенку, костный мозг, лимфоузлы, где локализуется внутриклеточно. Может длительно сохраняться в организме.

С первых дней болезни возникает реакция гиперчувствительности замедленного типа, сохраняющаяся длительное время после выздоровления.

1) бактериологическое исследование; материал – кровь, испражнения, моча;

2) серологическое исследование – реакция агглютинации Райта, РСК, РНГА. Неполные антитела выявляют в реакции Кумбса.

Лечение: применяют антибиотики (стрептомицин, эритромицин, левомицетин и др.).

Специфическая профилактика: живая бруцеллезная вакцина используется редко.

Эти возбудители вызывают инфекции, относящиеся к группе особо опасных (из бактериальных инфекций к их числу относят чуму, холеру, сибирскую язву, туляремию, сап и бруцеллез).

Возбудитель сибирской язвы - Bacillus anthracis относится к роду Bacillus семейства Bacillaceae (к бациллам).

Морфология. Крупная грамположительная палочка, часто с закругленными концами. В отличии от других бацилл - неподвижна, хорошо окрашивается анилиновыми красителями. В клинических материалах расположены парами или в виде коротких цепочек, окруженных общей капсулой (образуется только в организме человека и животных или на специальных средах с кровью, сывороткой крови). На средах возбудитель образует длинные цепочки в виде “бамбуковой трости” (с уточщениями на концах и сочленениями клеток). На агаре, содержащем пенициллин, происходит разрушение клеточных стенок, образуются шаровидные протопласты в виде цепочек (“жемчужное ожерелье”). Возбудитель сибирской язвы образует эндоспоры, которые располагаются центрально, их диаметр не превышает диаметра бактериальной клетки. Споры образуются только вне организма, при наличии (доступе) кислорода и определенной температуре (от +12 до +43 о С, оптимум при 30-35 о С). Споры проявляют очень высокую устойчивость во внешней среде (десятилетия). Сибирская язва - прежде всего почвенная инфекция.

Культуральные свойства. Возбудитель растет в аэробных и факультативно - анаэробных условиях. Температурный оптимум +37 о С, рН -7,2-7,6. Растет на простых питательных средах, в т.ч. на картофеле, настое соломы, экстрактах злаковых и бобовых культур. Дает характерный рост при посеве уколом в желатин (“перевернутая елочка”). Вирулентные R- формы на плотных средах образуют шероховатые серовато - белые колонии волокнистой структуры (“голова медузы” или “львиная грива”). На жидких средах образуется осадок в виде комочка ваты. Возбудитель сибирской язвы может образовывать также гладкие (S), слизистые (М) или смешанные (SM) колонии, особенно в микроаэрофильных условиях. В S- форме возбудитель утрачивает вирулентность.

Биохимические свойства. B.anthracis биохимически высоко активна. Она ферментирует с образованием кислоты без газа глюкозу, сахарозу, мальтозу, трегалозу, образует сероводород, свертывает и пептонизирует молоко.

Антигенная структура. Выделяют три основных группы антигенов - капсульный антиген, токсин (кодируются плазмидами, при их отсутствии штаммы авирулентны), соматические антигены.

Капсульные антигены отличаются по химической структуре от К- антигенов других бактерий, полипептидной природы, образуются преимущественно в организме хозяина.

Соматические антигены - полисахариды клеточной стенки, термостабильны, долго сохраняются во внешней среде, трупах. Выявляют их в реакции термопреципитации Асколи.

Токсин включает протективный антиген (индуцирует синтез защитных антител), летальный фактор, отечный фактор.

Факторы патогенности - капсула и токсин.

Краткая эпидемиологическая характеристика. Сибирская язва - зоонозная инфекция. Основной источник для человека - травоядные животные. Их заражение происходит преимущественно алиментарным путем, споры длительно сохраняются в почве и заглатываются животными преимущественно с кормами, травой). Особую опасность представляют сибиреязвенные скотомогильники (в них споры длительно сохраняются, при их разрывании, размывании и других процессах попадают на поверхность почвы и растения). Человек заражается при контакте с инфицированным материалом (уход за больными животными, разделка и употребление в пищу инфицированных мясных продуктов, контакт со шкурами сибиреязвенных животных и др.).

Основные формы клинического проявления зависят от входных ворот инфекции - кожная (карбункул), кишечная, легочная, септическая. Характерна высокая летальность (меньше при кожной форме).

Лабораторная диагностика. Материал для исследования от больных зависит от клинической формы. При кожной форме исследуют содержимое пузырьков, отделяемое карбункула или язвы, при кишечной - испражнения и мочу, при легочной - мокроту, при септической - кровь. Исследованию подлежат объекты внешней среды, материал от животных, пищевые продукты.

Бактериоскопический метод используют для обнаружения грамположительных палочек, окруженных капсулой, в материалах от человека и животных, спор - из объектов внешней среды. Чаще применяют метод флюоресцирующих антител (МФА), позволяющий выявлять капсульные антигены и споры.

Основной метод - бактериологический применяется в лабораториях особо опасных инфекций по стандартной схеме с посевом на простые питательные среды (МПА, дрожжевая среда, среда ГКИ), определением подвижности, окраской по Граму и изучением биохимических особенностей. В дифференциации от других представителей рода Bacillus существенное значение имеет биологическая проба. Белые мыши погибают в пределах двух суток, морские свинки и кролики - в течение четырех суток. Определяют также лизабельность бактериофагами, чувствительность к пенициллину (жемчужное ожерелье). Для ретроспективной диагностики используют серологические тесты, аллергическая проба с антраксином, для выявления соматического антигена - реакция Асколи, которая может быть результативна при отрицательных результатах бактериологических исследований.

Лечение. Применяют противосибиреязвенный иммуноглобулин, антибиотики (пенициллины, тетрациклины и др.).

Профилактика. Применяют живую споровую безкапсульную вакцину СТИ, протективный антиген.

Род Brucella. Бруцеллез.

Род объединяет мелкие неподвижные палочки или коккобациллы, обладающие значительным полиморфизмом. Аэробы, оптимум температуры около +37 о С, рН - 6,6- 7,4. Факультативные внутриклеточные паразиты, хорошо окрашиваемые анилиновыми красителями.

Патогенные для человека четыре вида - B.melitensis (распространена преимущественно среди мелкого рогатого скота, вызывает наиболее тяжелые поражения у человека), B.abortus (связана с крупным рогатым скотом), B.suis, B.canis. Основным хозяином B.suis 4 биовара являются северные олени, этот возбудитель часто называют B.rangiferis. От грызунов выделены бруцеллы вида B.neotomae, от овец - B.ovis. B.melitensis разделена на 3 биовара, B.abortus - на 9, B.suis - на 5 биоваров. Бруцеллы - возбудители зоонозной инфекции человека и животных - бруцеллеза. Возбудитель легко диссоциирует, переходя из S- в R- форму.

Культуральные свойства. Лучше растут на обогащенных средах сложного состава с добавлением крови или сыворотки крови, глюкозы, глицерина. Используют печеночный агар Хеддльсона, кровяной агар, мясо - пептонный бульон. Колонии возбудителя в S- форме мелкие, выпуклые, гладкие, с перламутровым оттенком, при диссоциации образуют широховатые R- формы колоний. Характерен медленный рост бруцелл в первых генерациях - колонии образуются через 2-4 недели. Рост бруцелл на жидких средах сопровождается равномерным помутнением сред.

Антигенная структура. Бруцеллы имеют общий соматический родоспецифический антиген, поэтому бруцеллы разных видов дают перекрестную агглютинацию. Два главных поверхностных антигена - А (преобладает у B.abortus) и М (преобладает у B.melitensis) встречаются в различных количественных соотношениях у различных видов бруцелл. Для их идентификации используют соответствующие антисыворотки.

Бруцеллы имеют поверхностный L- антиген (сходен с Vi- антигенами сальмонелл). Шероховатые формы содержат специфический R- антиген, для его идентификации используют специфические антисыворотки, применяемые при серотипировании. Колонии B.canis, B.ovis и B.suis 5 биотипа всегда имеют R- форму. Многие антигенные фракции бруцелл обладают выраженным аллергизирующим действием. У бруцелл имеются перекрестнореагирующие антигены с возбудителем туляремии, Bordetella bronchiseptica и Y.enterocolitica серотипа 09.

Биохимические свойства. Бруцеллы ферментируют углеводы, однако при дифференциации на виды и биотипы используют ряд дополнительных признаков, в т.ч. способность расти на средах в присутствии обладающих бактериостатическим действием на отдельные виды бруцелл красителей (основной фуксин, тионин, сафранин), выделять сероводород, образовывать ферменты (уреазу, фосфатазу, каталазу), окислять различные аминокислоты.

Эпидемиологические особенности. Бруцеллез - зооноз преимущественно сельскохозяйственных и домашних животных. Человек инфицируется от животных или при контакте с инфицированным сырьем животного происхождения. Бруцеллез может носить профессиональный характер (уход за инфицированными животными) или быть связан с употреблением недостаточно термически обработанных молочных или мясных продуктов. Возбудитель может внедряться в организм человека через поврежденную кожу, слизистые дыхательных путей (аэрогенно) и желудочно - кишечного тракта (алиментарным путем), при заносе возбудителя на конъюнктиву глаза. Пути заражения - контактный, алиментарный и аспирационный. Бруцеллы обладают относительно высокой устойчивостью во внешней среде.

Патогенез и факторы патогенности. Патогенность бруцелл связана с наличием эндотоксина, гиалуронидазы и других ферментов, наличием низкомолекулярных продуктов, способствующих подавлению фагоцитоза и окислительного взрыва в макрофагах, наличием аллергизирующих субстанций.

По лимфатическим путям бруцеллы попадают в регионарные лимфоузлы, где размножаются в макрофагах, частично подвергаются внутриклеточному уничтожению. Продукты жизнедеятельности бруцелл ингибируют фагосомо - лизосомальное слияние. Морфологически в лимфоузлах формируется “первичный бруцеллезный комплекс” с формированием гранулем Новицкого с преобладанием крупных эпителиоидных клеток. Из разрушенных макрофагов в лимфоузлах бруцеллы попадают в кровь, распространяются по организму и поражают лимфатическую систему, печень, селезенку, нарушаются функции опорно - двигательного аппарата, нервной и половой систем.

Болезнь может иметь длительное хроническое течение (по сути - хрониосепсис). В патогенезе бруцеллеза имеет значение цикличность процессов, связанных с повторными проникновениями бруцелл в кровь из очагов с развитием местной воспалительной и общей реакций, на формирование которых существенное влияние оказывает специфическая сенсибилизация (реакция ГЗТ). Существенное значение в патогенезе, кроме аллергической перестройки и интоксикации, имеет преимущественное вовлечение в инфекционный процесс тех или иных органов и тканей.

Лабораторная диагностика осуществляется с использованием бактериологических методов, биопробы, серологических реакций, аллергической пробы Бюрне, генетических методов.

Материалом для бактериологических исследований служат кровь, костный мозг, грудное молоко (у кормящих), моча, околосуставная жидкость. Чаще выделяют гемо- и миелокультуры. Чистые культуры изучают по биохимическим свойствам, определяют их способность расти на средах с добавлением бактериостатических красителей, типируют в РА.

На практике чаще используют различные серологические методы диагностики:

- развернутую реакцию агглютинации Райта - основной метод и ускоренные микрометоды на стекле - агглютинации (Хеддельсона), роз- бенгал, латекс - агглютинации;

- реакцию Кумбса - для выявления неполных антител с применением антиглобулиновой сыворотки;

- РНИФ, РПГА с антигенным эритроцитарным диагностикумом, ИФА.

При отрицательных результатах бактериологических и серологических исследований применяют аллергическую кожную пробу с бруцеллином (пробу Бюрне).

Для выделения бруцелл из объектов внешней среды и от животных широко используют биопробу, для серодиагностики у животных - РСК, для исследования молока - кольцевую пробу.

Специфическая профилактика. В очагах козье - овечьего бруцеллеза применяют живую бруцеллезную вакцину ЖБВ. Разработана химическая бруцеллезная вакцина, которая отличается от живой вакцины более низкой реактогенностью.

ВНИМАНИЕ! САЙТ ЛЕКЦИИ.ОРГ проводит недельный опрос. ПРИМИТЕ УЧАСТИЕ. ВСЕГО 1 МИНУТА.

▲ План

▲ Программа

1. Биологические свойства возбудителей зооантропоноз-ных инфекций, их патогенность, экология, особенность инфекций и эпидемиология вызываемых заболеваний.

2. Микробиологическая диагностика чумы, туляремии, бруцеллеза, сибирской язвы, лептоспироза.

3. Особенности лабораторной работы с возбудителями

4. Диагностические, профилактические и лечебные пре
параты.

▲ Демонстрация

1. Мазки из чистых культур: Brucella abortus, Bacillus ап-thracis, Francisella tularensis (окраска по методу Грама).

2. Yersinia pestis в гное из бубона (окраска метиленовым синим).

3. Культура лептоспиры в темном поле.

4. Рост B.anthracoides на питательной среде.

5. Реакция агглютинации Райта для серодиагностики бруцеллеза.

6. Реакция агглютинации для серодиагностики туляремии.

7. Диагностические, профилактические и лечебные препараты.

А Задание студентам

1. Микроскопировать и зарисовать препараты возбудителей зоонозных инфекций.

2. Учесть результаты реакции агглютинации Райта для серодиагностики бруцеллеза.

3. Проанализировать результаты РИГА для серодиагностики бруцеллеза.

4. Оценить результаты реакции агглютинации с парными сыворотками больного для серодиагностики туляремии.

5. Оценить результаты реакции термокольцепреципита-ции по Асколи с исследуемым материалом (термоэкстракт из шкуры животного).

6. Отметить результаты реакции агглютинации-лизиса лептоспир для серодиагностики лептоспироза и сделать заключение.

7. Ознакомиться с диагностическими, профилактическими и лечебными препаратами.

А Методические указания

• Микробиологическая диагностика чумы

МАТЕРИАЛДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: гной из бубонов, пунктат лимфатических узлов, мокрота, промывные воды желудка, кровь, патолого-анатомический материал.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериоскопическое исследование(схема 16.1.1). Из исследуемого материала готовят мазки, окрашивают по методу Грама и водным раствором метиленового синего. Y.pestis представляют собой грамотрицательные палочки овоидной формы (0,5x1,7 мкм). В мазках, окрашенных метиленовым синим, хорошо заметно биполярное распределение краски (рис. 16.1.1; на вклейке). Встречаются полиморфные клетки.

Бактериологическое исследование.Исследуемый материал засевают на чашки с питательным агаром. Посевы инкубируют при 25—28 "С. Первичное изучение посевов производят через 10—12 ч. К этому сроку появляются колонии в виде батистового платочка, которые образованы вирулентными R-формами. Мало- и авирулентные бактерии формируют S-формы колоний. Идентификацию чистой культуры проводят по морфологии бактериальных клеток, характеру роста, антигенным и биохимическим свойствам, чувствительности к специфическому фагу и с помощью молекулярно-биологических методов. Иногда также используют биопробу.

На бульоне Y.pestis образуют пленку со спускающимися нитями, напоминающими сталактиты; ферментируют многие сахара до кислоты, индола не образуют, желатин не разжижают. Y.pestis содержат групповой термостабильный соматический антиген и специфический термолабильный капсульный антиген, который обнаруживается только у вирулентных штаммов. В случае исследования материала, взятого у погибших грызунов, проводят дифференциальную диагностику с возбудителями псевдотуберкулеза (Yersinia pseudotuberculosis) на основании

характера роста на специальных средах, биохимических свойств (ферментация рамнозы, адонита) и других признаков.

Биопроба.Проводят для выделения чистой культуры из материала, загрязненного посторонней микрофлорой. Наиболее чувствительными лабораторными животными являются морские свинки. Материал вводят подкожно или внутрибрюшинно в том случае, если он не загрязнен другими бактериями. При контаминации посторонней микрофлорой материал втирают морской свинке в выбритый участок кожи в области живота. После гибели животных (на 3—7-й день в зависимости от способа введения материала) делают вскрытие, отмечают патологические изменения органов и проводят бактериологическое исследование по схеме 16.1.1.

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохимические и молекулярно-биологические исследования.Иммунохимические исследования. Иммунофлюоресцентный метод позволяет обнаружить присутствие антигенов возбудителя как в патологическом материале, так и в объектах окружающей среды (вода, почва), а также в пищевых продуктах и эктопаразитах. С этой целью используют люминесцентную ви-доспецифическую противочумную сыворотку, люминесцентные противокапсульную и противосоматическую сыворотки. РИГА применяют для обнаружения антигенов возбудителя чумы в исследуемом материале с помощью стандартной противочумной сыворотки, антитела которой нагружены на эритроциты.

Биохимические и молекулярно-биологические исследования. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР. В случае обнаружения соответствующих молекул можно поставить предварительный диагноз.

• Микробиологическая диагностика туляремии

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: гной из бубонов, пунктат лимфатических узлов, мокрота, кровь, патолого-ана-томический материал.

Бактериоскопическое исследование(схема 16.1.2). Из исследуемого материала готовят мазки, окрашивают по методу Грама и метиленовым синим. Для F.tularensis характерен выраженный полиморфизм. В чистой культуре они представляют собой очень мелкие (0,3—0,5 мкм) кокки (рис. 16.1.2; на вклейке). В мазках из органов преобладают палочковидные формы. Спор не образуют, грамотрицательны, иногда выражена биполярная окраска. В биоптатах тканей и мазках F.tularensis могут располагаться как вне, так и внутри клеток. Бактерии слабо окрашиваются по методу Грама и плохо выявляются в материале

при обычных методах микроскопии. Для обнаружения используют преимущественно метод иммунофлюоресценции (см. ниже).

Бактериологическое исследование.Применяют для выделения чистой культуры F.tularensis. Бактериологическую диагностику осуществляют в специальных лабораториях. Выделение возбудителя проводят на свернутой яично-желточной среде, глюкозоцистиновом кровяном агаре и других богатых питательных средах сложного состава. Для подавления роста сопутствующей микрофлоры в среды добавляют пенициллин. Вирулентные штаммы образуют S-формы колоний — мелкие, гладкие, беловатого цвета с голубоватым оттенком. Идентификацию чистой культуры проводят по морфологии бактериальных клеток, характеру роста, биохимическим, антигенным свойствам и с помощью молекулярно-биологических методов. Биохимические свойства F.tularensis выявляют на специальной плотной среде с ограниченным содержанием белка. Бактерии содержат оболочечный антиген, с которым связаны их вирулентные и иммуногенные свойства, и О-соматический антиген. По антигенным свойствам близки к бруцеллам.

Биопроба.Наиболее чувствительными животными являются белые мыши и морские свинки, которые погибают при подкожном введении единичных бактерий.

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохимические и молекулярно-биологические исследования.Иммунохимические исследования. Метод ИФ позволяет обнаружить присутствие антигенов бактерий в патологическом материале. Используют люминесцентную противотуляремийную сыворотку. В положительном случае в препарате видны светящиеся микроорганизмы. Антигены возбудителя в материале от больного могут быть обнаружены с помощью ИФА.

Серодиагностика.Ставят реакцию агглютинации с туляре-мийным диагностикумом. Относительно позднее появление антител-агглютининов в крови (на 2-й неделе болезни) затрудняет применение этой реакции для ранней диагностики, однако их длительное сохранение делает возможной ретроспективную диагностику. Диагностический титр реакции 1:100. Обязательно прослеживается нарастание титра агглютинации (в парных сыворотках). Более чувствительным методом серодиагностики туляремии является РИГА, которая бывает положительной в конце 1-й — начале 2-й недели заболевания. Титры антител в сыворотке в разгар заболевания достигают 1:1280— 1:2560 и выше. Используют также ИФА.

Для ускоренной диагностики применяют кровяно-капель-

ную реакцию: кровь из пальца больного наносят на обезжиренное предметное стекло, добавляют каплю дистиллированной воды (для лизиса эритроцитов), вносят каплю диагности-кума и смешивают стеклянной палочкой. При наличии в крови агглютининов в диагностическом титре (1:100 и выше) в капле немедленно наступает агглютинация диагностикума; при титрах ниже диагностических агглютинация происходит через 2—3 мин.

Кожно-аллергическая проба.Для диагностики применяют внутрикожную и накожную пробы со специфическим аллергеном — тулярином. Пробы высокочувствительны и дают положительные результаты у больных начиная с 3—5-го дня болезни. Положительные результаты регистрируются также у переболевших и вакцинированных, поэтому оценка реакции должна проводиться с осторожностью.

• Микробиологическая диагностика бруцеллеза

МАТЕРИАЛ ДЛЯИССЛЕДОВАНИЯ: кровь.

Бактериологическое исследование(схема 16.1.3). Для получения гемокультуры 5—10 мл крови, взятой из локтевой вены больного, засевают в два флакона с 50—100 мл печеночного бульона. Один из них (для выделения культуры B.melitensis) инкубируют в обычных аэробных условиях, другой (для выделения первичной культуры B.abortus) — в атмосфере с 10 % С0₂. В первых генерациях бруцеллы растут очень медленно, поэтому посевы выдерживают в термостате не менее месяца. В то же время рост лабораторных культур наблюдается через 1—2 сут. На агаре бруцеллы образуют бесцветные с перламутровым блеском колонии, в бульоне — помутнение и слизистый осадок. В мазках, окрашенных по методу Грама, обнаруживаются мелкие (от 0,3—0,5 до 1,5 мкм) грамотрицательные кок-ковидные или более удлиненные формы (рис. 16.1.3; на вклейке). Они неподвижны, спор не образуют.

Для быстрой идентификации бруцелл ставят РА со специфическими агглютинирующими сыворотками на стекле и определяют чувствительность к специфическому фагу. Все виды бруцелл не ферментируют углеводы. Их дифференцируют по образованию H₂S, чувствительности к С0₂, способности окрашиваться анилиновыми красителями (основным фуксином и тионином) и другим признакам. Используют также молекуляр-но-биологические методы.

Биопроба.Применяют для выделения чистой культуры из материала, загрязненного посторонней микрофлорой или содержащего небольшое количество бруцелл. Исследуемый материал вводят морским свинкам или белым мышам подкожно в паховую область. Мышей вскрывают через 20 дней после за-

ражения, морских свинок — через 30. Кусочки органов и лимфатических узлов засевают на питательные среды для получения чистой культуры и ее идентификации.

Экспресс-методы диагностики.Биохимические и моле-кулярно-биологические исследования. Исследуемый материал используют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР. В случае обнаружения соответствующих молекул можно поставить предварительный диагноз.

Серодиагностика.Чаще всего используют реакцию агглютинации Райта с бруцеллезным диагностикумом. Реакция достаточно специфична. Положительные результаты отмечаются спустя 1—2 нед после начала заболевания и сохраняются у переболевших многие годы. Диагностический титр реакции 1:200. Для ускоренной серодиагностики применяют реакцию агглютинации Хеддельсона, которую ставят с неразведенной сывороткой больного и концентрированным антигеном — диагностикумом, окрашенным метиленовым синим.

Обезжиренное квадратное стекло размером 9x12 см делят на 5 квадратов, в которые микропипеткой вносят ингредиенты, как указано в табл. 16.1.1. Капли смешивают палочкой, начиная с минимальной дозы сыворотки. Стекло осторожно подогревают над пламенем горелки примерно до 37 °С в течение 2 мин. При положительной реакции в первые минуты появляются хлопья синего цвета. Реакция положительна при наличии агглютинации на "++" в дозах сыворотки 0,02—0,01 мл.

Таблица 16.1.1. Постановка пластинчатой реакции агглютинации Хеддельсона

Ингредиент	Количество материала, мл
квадрат 1	квадрат 2	квадрат 3	квадрат 4	квадрат 5
контроль сыворотки	контроль диагнос- тикума
Сыворотка Диагностикум Изотонический раствор хлорида натрия	0,04 0,03	0,02 0,01 0,03 0,03	0,02 0,03	0,03 0,03

Кроме того, для серодиагностики бруцеллеза используют РИГА, реакцию непрямой ИФ, опсонофагоцитарную реакцию, РСК, метод определения неполных антител и реакцию Кумбса и др. Эти серологические реакции обладают достаточно высокой специфичностью и чувствительностью. В поздние периоды

заболевания процент положительных серологических реакций (РА, РИГА и РСК) начинает снижаться и большее диагностическое значение приобретают кожно-аллергическая проба и реакция Кумбса, поэтому комплексный серо-аллергический метод является наиболее надежным в диагностике бруцеллеза.

Кожно-аллергическая проба (реакция Бюрне).На ладонную поверхность предплечья внутрикожно вводят 0,1 мл бруцелли-на. При наличии ГЗТ уже через 6—8 ч могут появиться гиперемия кожи и болезненная отечность. Учет реакции производят через 24 ч (см. рис. 10.4.1). Реакция обладает высокой чувствительностью и появляется не только у больных и переболевших, но и у вакцинированных людей, в связи с чем ее диагностическая оценка должна производиться с осторожностью.

• Микробиологическая диагностика сибирской язвы

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: экссудат из очага поражения (сибиреязвенного карбункула), мокрота, фекалии, кровь.

Бактериоскопическое исследование(схема 16.1.4). Изучение окрашенных по методу Грама мазков из патологического материала (экссудат, мокрота) позволяет обнаружить возбудителя, представляющего собой грамположительную крупную (1—2 х 6—10 мкм) неподвижную стрептобациллу. В организме больных и на белковой питательной среде микроорганизмы образуют капсулу (рис. 16.1.4; на вклейке), в неблагоприятных условиях (почве) — споры (см. рис. 2.2).

Бактериологическое исследование.Исследуемый материал засевают на чашки с питательным и кровяным агаром, а также в пробирку с питательным бульоном. Посевы инкубируют при 37 "С в течение 18—20 ч. В бульоне культура B.anthracis растет в виде хлопьевидного осадка; на агаре вирулентные штаммы образуют колонии R-формы, имеющие под малым увеличением микроскопа вид львиной гривы или головы медузы. Авиру-лентные или слабовирулентные бактерии образуют S-формы колоний.

Для идентификации возбудителя изучают биохимические свойства и ряд других признаков (гемолитическую активность, способность к образованию L-форм и др.). B.anthracis обладает сахаролитическими свойствами, медленно разжижает желатин (в виде елочки верхушкой вниз), лишен гемолитической активности. Под действием пенициллина образует сфероплас-ты, имеющие вид жемчужин. Это явление используется для дифференциации B.anthracis от непатогенных бацилл. Применяют также молекулярно-биологические методы идентификации.

Биопроба.Исследуемый материал вводят подкожно белым мышам, морским свинкам или кроликам. Павших животных вскрывают, готовят мазки из крови и внутренних органов, делают посевы для выделения чистой культуры возбудителя. Капсульные формы B.anthracis в экссудате, полученном через 5—18 ч после заражения животного, можно обнаружить методом иммунофлюоресценции (см. ниже).

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохимические и молекулярно-биологические исследования.Иммунохимические исследования. Мазки из экссудата обрабатывают противокапсульной сибиреязвенной антисывороткой, а затем флюоресцирующей антикроличьей сывороткой, меченной родамином. В препаратах, содержащих капсульные бациллы, наблюдается желто-зеленое свечение возбудителя.

Антигены B.anthracis (секретируемые белки — "протектив-ный антиген" и токсины) в исследуемом материале из очага инфекции могут быть обнаружены с помощью чувствительных серологических реакций (ИФА и др.).

Реакцию термокольцепреципитации Асколи для исследования трупного материала ставят при необходимости диагностировать сибирскую язву у павших животных или у людей, умерших от неизвестной болезни, напоминающей висцеральную форму сибирской язвы, а также для определения зараженности сырья (кожа, мех, шерсть). Образцы исследуемого материала измельчают и кипятят в пробирке с изотоническим раствором хлорида натрия в течение 5—10 мин, после чего фильтруют до полной прозрачности. Преципитирующую сибиреязвенную сыворотку получают путем гипериммунизации лошадей убитой культурой B.anthracis. Испытуемый термоэкстракт осторожно наслаивают на поверхность сыворотки в преципитационной пробирке. В положительном случае через 1—2 мин в месте соприкосновения появляется белое кольцо преципитации, что свидетельствует о присутствии в материале антигенов возбудителя. Контрольный термоэкстракт готовят из того же материала, взятого от здорового животного (см. табл. 10.1.1).

Кожно-аллергическая проба.Ставится на внутренней поверхности предплечья — внутрикожно вводят 0,1 мл антраксина. При положительной реакции через 24 ч появляются гиперемия и инфильтрат. Положительная реакция регистрируется у 90 % больных сибирской язвой, начиная со 2-й недели заболевания, и сохраняется у переболевших в течение всей жизни, в связи с чем ее диагностическая оценка должна производиться с осторожностью.

Читайте также: