Тест-система для диагностики бруцеллеза крс и мрс и северных оленей в рид
В ветеринарии считается достоверным мнение о том, что профилактика бруцеллеза и ликвидация его эпизоотических очагов должна базироваться на своевременной диагностике, которая до сих пор значительно затруднена из-за многообразия форм и недостаточной специфичности ее проявления.
Распознавание источника возбудителя бруцеллезной инфекции — весьма важный аспект действенности эпизоотологического контроля путем полной и безошибочной диагностики, в т.ч. и его скрытых форм.
В настоящее время диагностика, в том числе и скрининг, бруцеллеза в Волгоградской области основывается на показаниях комплекса методов исследований: клинико-эпизоотологического, бактериологического, серологического, аллергического и молекулярно-генетического.
Клиническая картина и эпизоотологический диагноз, как предварительное обследование, должны быть подтверждены хотя бы одному из лабораторных методов исследования.
На бактериологическую диагностику, основанную на обнаружении бактериоскопией бруцелл в мазках из патологического материала, выделении культуры на питательных средах или путём постановки биологической пробы, влияют слишком много объективных и субъективных факторов (количество и правильность направленного материала, время на его доставку в лабораторию, наличие качественных питательных сред и т.д.).
Для проведения молекулярно – генетического исследования (ПЦР) на бруцеллёз необходимо дорогостоящее оборудование и расходные материалы, что не даёт возможности применять его в районных лабораториях.
В борьбе с бруцеллёзом сельскохозяйственных животных имеет большое значение ранняя диагностика заболевания. Чем быстрее будут выявлены больные животные, тем раньше можно принять меры по ликвидации заболевания.
Серологическая диагностика бруцеллёза остаётся самой распространённой в ветеринарной практике, а серологические и иммуноферментный методы отвечают этому требованию более удовлетворительно по сравнению с другими методами.
Бруцеллёзная инфекция протекает своеобразно не только у разных видов животных, но почти и у каждого в отдельности взятого животного (в зависимости от возраста, пола, физиологического состояния, вирулентности возбудителя, времени с момента инфицирования и т. д.), а поэтому динамика титров антител в процессе инфекции (образование, сохранение, нарастание, спад титра антител) у всех разная.
Диагноз на бруцеллёз по реакции агглютинации и реакции связывания комплемента с единым бруцеллёзным антигеном и другим реакциям, основанным на выявлении антител в крови, может быть установлен в близкие и отдалённые сроки после заражения животного бруцеллёзом, а применение двух, трёх или большего количества реакций позволяет распознаванию болезни у большего количества животных.
В продолжение всей истории борьбы с бруцеллёзом животных серологические методы диагностики заболевания находятся в состоянии совершенствования старых методов и разработки новых.
За последние 20 лет специалисты серологического отдела Волгоградской областной ветеринарной лаборатории принимали участие по программе испытаний в производственных условиях нескольких диагностикумов:
- тест-системы для диагностики бруцеллёза крупного и мелкого рогатого скота и северных оленей в РИД;
- набора компонентов для диагностики бруцеллёза крупного и мелкого рогатого скота в реакции непрямой гемагглютинации;
- набора для выявления антител к иерсиниям и бруцеллам в сыворотках крови крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа;
- набора для диагностики бруцеллёза крупного рогатого скота иммуноферментным методом;
- антигена иерсиниозного 09-S, предназначенного для выявления антител к Yersinia enterocolitika серовара 09 S – формы в реакции агглютинации с сыворотками крови крупного рогатого скота;
- набора для диагностики бруцеллёза собак, вызываемого B. canis, в реакции агглютинации;
- тест-системы для диагностики бруцеллёза собак, вызываемого B. canis, в реакции иммунодиффузии в агаровом геле.
Все перечисленные методы достаточно специфичны, имеют высокую чувствительность, по некоторым из них возможен инструментальный учёт результатов анализа, исключающий субъективизм оценки. Большинство из них утверждены и применяются при плановых исследованиях и дифференциации неспецифических реакций.
Но наиболее интересным, с точки зрения практического диагностики, нам представляется определение антител к ЛПС антигену B. abortus и B. melitensis в сыворотке крови крупного рогатого скота и овец с помощью иммунохроматографической тест – системы. Определение основано на принципе иммунохроматографического анализа, при котором анализируемый образец сыворотки крови или молока абсорбируется поглощающим участком тест-полоски. Для исследования этим методом требуется только два компонента: анализируемый образец сыворотки крови (разводится буфером) и иммунохромотографическая тест-полоска, а результат реакции определяется визуально в течение 15 минут.
В период с 18.04.2011 г. по 13.02.2012 г. была проведена апробация тест- системы с использованием образцов сыворотки крови крупного рогатого скота из хозяйств области с разным эпизоотическим статусом по бруцеллёзу.
Результаты апробации иммунохроматографической тест-системы для определения антител к антигенам B.abortus и B.melitensis в сыворотке крови крупного рогатого скота — Таблица 1
| Исследовано проб |
Согласно табличным данным при исследовании животных из хозяйств с разной эпизоотической ситуацией по бруцеллёзу было выявлено проб сыворотки крови положительно и сомнительно реагирующих на бруцеллёз: в РА – 37,5%, в РСК – 40,4%, в РНГА 42,7%, в РБП – 31,1%, в РИД – 33,7% и в ИМХМ – 52,0%.
Анализируя методику постановки реакции и результаты исследований можно сделать вывод, что иммунохромотографическая реакция, в сравнении с другими серологическими методами, обладает следующими преимуществами: быстрота проведения анализа, высокая чувствительность, простота проведения реакции, возможность использования в любых условиях (без специального оборудования, приборов и с минимумом лабораторной посуды) и, как следствие, экономическая выгода.
Внедрение новых методов серологической диагностики бруцеллёза животных
Филиппов Н.В., Роньшина Н.В.
Телефон горячей линии на время ЧМ по футболу +7 (495) 700-01-37
Бруцеллез считается актуальной болезнью для животноводства нашей страны и многих зарубежных стран. Человек также подвержен этому заболеванию. Учреждениями Россельхознадзора ежегодно осуществляется эпизоотологический мониторинг по всей территории Российской Федерации. По результатам мониторинга и плановых противоэпизоотических мероприятий выявляются животные с наличием антител к бруцеллам, также выделяются возбудители бруцеллеза из биологического и патологического материала. Наибольшее количество неблагополучных по бруцеллезу животных пунктов выявляется в Северо- Кавказском федеральном округе.
Бруцеллы существует в двух основных формах - гладкой S-форме и шероховатой R-форме. Они различаются между собой по антигенной структуре клеток и характеру метаболизма.
Главным антигенным отличием является отсутствие у R-вариантов полисахаридной цепи S-эндотоксина, в которой антигенными детерминантами, определяющими бруцеллезную специфичность, являются структуры альфа-2-маннопиранозы.
Средства и методы диагностики бруцеллеза, применяемые в Российской Федерации:
1. Набор компонентов для диагностики бруцеллеза животных в РА, РСК, РДСК (реакция агглютинации (РА), реакция связывания комплемента *(РСК);
2. Набор для серологической диагностики бруцеллеза крупного и мелкого рогатого скота в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) (реакция непрямой гемагглютинации (РНГА);
3. Набор для диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота иммуноферментным методом (непрямой иммуноферментный анализ (ИФА);
5. Набор компонентов для диагностики бруцеллеза животных в роз бенгал пробе (роз бенгал проба (РБП) (экспресс-тест);
6. Набор компонентов для диагностики бруцеллеза животных в кольцевой реакции с молоком (кольцевая реакция с молоком (КР);
7. Тест-система для диагностики
бруцеллеза крупного и мелкого рогатого скота, и северных оленей в РИД (реакция иммунодиффузии в агаровом геле с О-ПС –антигеном);
9. Бруцеллин ВИЭВ (аллергическое исследование)
Вакцины против бруцеллеза, выпускаемые и применяемые в Российской Федерации для иммунизации крупного рогатого скота:
- Вакцина против бруцеллеза из слабоагглютиногенного штамма Бруцелла абортус № 82 живая сухая;
- живая сухая вакцина против бруцеллеза сельскохозяйственных животных из штамма B.abortus 19;
- вакцина против бруцеллеза крупного рогатого скота из штамма B.abortus 75/79-АВ живая сухая;
- адъювант-вакцина из штамма B.abortus КВ 17/100 против бруцеллеза крупного рогатого скота.
Вакцины для иммунизации мелкого рогатого скота:
- Вакцина против бруцеллеза сельскохозяйственных животных из штамма B.abortus 19 живая сухая;
- вакцина против бруцеллеза овец и коз, и инфекционного эпидидимита баранов из штамма Brucella melitensis REV-1 живая сухая.
Разработанная и внедренная в нашей стране с учетом мирового опыта система мер борьбы с бруцеллезом, предусматривающая иммунизацию животных противобруцеллезными вакцинами, позволила значительно снизить количество неблагополучных пунктов, полностью оздоровить от бруцеллеза ряд регионов страны и снизить заболеваемость людей. Тем не менее, с учетом относительной иммуногенной эффективности всех известных на сегодняшний день в мире противобруцеллезных вакцин в случае абортов в хозяйствах, контакта животных с вирулентным возбудителем в большой инфицируемой дозе, не стоит рассчитывать на их успешное применение без соблюдения ветеринарно-санитарных правил при содержании животных. Опыт профилактики и борьбы с бруцеллезом показывает, что проблему бруцеллеза невозможно разрешить, ограничиваясь реализацией только специальных ветеринарных мероприятий.
Существует ряд проблем, затрудняющие искоренение бруцеллеза в Российской Федерации:
- несанкционированное перемещения животных на территории страны;
- торговля вакцинированными животными из субъектов неблагополучных по бруцеллезу, в субъекты благополучные, в которых вакцины не применяют;
- не применение экономических санкций к субъектам неблагополучным по бруцеллезу;
- отсутствие в большинстве субъектов России мясокомбинатов и боен, выполняющих убой больных бруцеллезом животных (что обусловливает несвоевременный убой больных животных);
- неэффективное проведение организационно-хозяйственных мероприятий при бруцеллезе (без наложения ограничений, оздоровление неблагополучных по бруцеллезу хозяйств по правилам для инфицированных В.abortus, введение нетелей и ярок в стада и отары взрослых животных, концентрация поголовья в хозяйствах молочного направления, продолжительное применения способа оздоровления путем периодических исследований и вакцинации в стадах где реагировало на бруцеллез более 20 % животных);
Первостепенное значение для успешной борьбы с бруцеллезом имеет решение проблемы компенсации владельцам убытка, неизбежного при изъятии больных животных, в первую очередь, в условиях отгонного животноводства.
Презентация была опубликована 6 лет назад пользователемНина Сусарина
Презентация на тему: " Бруцеллез (Brucellosis) Скляров О.Д. ФГУ «Всероссийский государственный бюджетный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и." — Транскрипт:
2 ДИАГНОСТИКА БРУЦЕЛЛЕЗА ЖИВОТНЫХ
3 WORLD ORGANISATION FOR ANIMAL HEALTH and RUSSIA Название реакции/теста Международное / Русское Продолжительность постановки Оценка результата 1. Indirect ELISA Непрямой ИФА Подготовка плашек требует 18-часовой инкубации. Сама постановка – 6-7 ч. Предписанный для международной торговли подтверждающий тест. Но: при исследовании вакцинированного скота – более скрининговый, чем подтверждающий. 2. Competitive ELISA Конкурентный ИФА Инкубация плашек – 18 ч. Сама постановка – 6-7 ч. Предписанный для международной торговли подтверждающий тест. 3. Rose bengal test Роз бенгал тест Несколько мин.Предписанный для международной торговли скрининговый тест, как для благополучных, так и для неблагополучных стад. 4. Buffered plate agglutination test (PBAT) Реакция агглютинации на стекле с забуференным Аг Несколько мин.Предписанный для международной торговли скрининговый тест. 5. Complement fixation test (CFT) Реакция связывания комплемента 6-7 ч.Предписанный для международной торговли подтверждающий тест.
4 Название реакции/теста МеждународноеРусское Продолжительность постановки Оценка результата 6. Fluorescence polarization assay (FPA) Реакция поляризацонной флюоресценции Неск. минут.Как для скрининга, так и для подтверждения диагноза. В 2004 г. была предложена в качестве предписанного подтверждающего теста. 7. Milk iELISA ИФА с молоком 6-7 ч.Скрининговый. Особенно подходит для крупных стад. 8. Milk ring test (MRT) КР с молоком Чуть больше 1 чСкрининговый тест. Для небольших стад. 9. Serum agglutination test (SAT) Реакция агглютинации Около сутокВ настоящее время не является ни предписанной, ни альтернативной реакцией 10 Native hapten and poly B tests Нативный гаптен и поли В тесты Альтернативные подтверждающие тесты. 11. Brucellin skin test* Аллергическая проба ч.Альтернативный иммунологический тест. Используется в невакцинированных стадах. Подтверждает специфичность других серологических реакций.
5 Название реакции или метода Вид животных Интерпретация результата 1. Реакция агглютинации (РА) с S-антигеном Крупный рогатый скот, яки, зебу, буйволы, овцы, козы, лошади, верблюды, олени, маралы, собаки, другие виды животных Подтверждающий диагноз 2. РА с R-антигеномСобакиПодтверждающий диагноз 3. Реакция связывания комплемента / реакция длительного связывания комплемента с S-антигеном (РСК/РДСК) Крупный рогатый скот, яки, зебу, буйволы, овцы, козы, лошади, верблюды, олени, маралы, собаки, свиньи, другие виды животных Подтверждающий диагноз РСК с R-антигеномКрупный рогатый скот Подтверждающий диагноз (дифференциальный) 4. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) Крупный рогатый скот, яки, зебу, буйволы, овцы, козы Подтверждающий диагноз (альтернативный) 5. Непрямой иммуноферментный анализ (ИФА) Крупный рогатый скот, овцыПодтверждающий диагноз (альтернативный) 6. Конкурентный иммуноферментный анализ (ИФА) Крупный рогатый скот, яки, зебу, буйволы, мелкий рогатый скот, свиньи, собаки Подтверждающий диагноз (дифференциальный ) Диагностические реакции (методы) на бруцеллез, применяемые в РФ
6 7. Иммунохроматографический (ИХА) Крупный рогатый скот, овцыПодтверждающий диагноз (альтернативный) 8. Реакция иммунодиффузии в агаровом геле с О-ПС –антигеном (РИД) Крупный рогатый скот, яки, зебу, буйволы, овцы, козы, олени, маралы Подтверждающий диагноз (дифференциальный) 9. РИД с R-антигеномСобакиПодтверждающий диагноз 10. Роз бенгал проба (РБП)Крупный рогатый скот, яки, зебу, буйволы, овцы, козы, свиньи, лошади, верблюды, олени, маралы Ориентировочный 11. Кольцевая реакция с молоком (КР) Крупный рогатый скотОриентировочный 12. Аллергическое исследованиеСвиньи Ориентировочный 13. Полимерная цепная реакция (ПЦР) Животные всех видов Подтверждающий диагноз
13 С целью уточнения диагноза необходимо: - исследование этих же образцов сыворотки в других серологических реакциях, а также в ПЦР - на бруцеллез и иерсиниоз; - повторное серологическое исследование данных животных через 15 и 30 суток. 6. Максимально широко использовать способ полной замены поголовья неблагополучного по бруцеллезу пункта здоровыми животными, в частности: - во всех случаях установления диагноза на бруцеллез в благополучных областях, краях, республиках; - в случаях инфицирования крупного рогатого скота, свиней, лошадей B.melitensis; - в неблагополучных областях, краях, республиках при установлении бруцеллеза животных в хозяйствах благополучных районов, не проводящих иммунизацию скота против бруцеллеза; - во всех случаях острого течения бруцеллеза, сопровождающегося массовыми абортами; - в случаях, если оздоровление хозяйств, проводимое с применением или без применения противобруцеллезных вакцин, не достигается в течение 3-х лет.
14 п/п Инв. ном. РАРСКРПБИФА 0,244 РНГА 1: КРПЦР/бак.исследованиеПЦР "Энтеркол " кровьмолокоЛ.узлы, Внутр. органы , /- +10/ , /- Не иссл , /--/-+3/ , /-+/-Не иссл , /-+/-+12/ , /- Не иссл , /- Не иссл , /- -/ , /- Не иссл , /- +1/ , /- +8/ , /-Н.л.Не иссл , /-Н.л.+3/ , /-Н.л.Не иссл.- Всего: положительно /-10/-(6) ,4 % / (5) ,3 % - Результаты исследования на бруцеллез и иерсиниоз образцов сыворотки крови (14), молока (11), лимфатических узлов и внутренних органов (96) от коров из неблагополучного по бруцеллезу хозяйства
15 Кожные пробы на бруцеллин Альтернативным иммунологическим тестом является кожная проба на бруцеллин, которая может использоваться для скрининга невакцинированных стад, при использовании очищенного (свободного от гЛПС) и стандартизированного антигенного препарата (напр. бруцеллин INRA). Обязательно следует использовать стандартизированный, препарат бруцеллина, который не содержит антигена гладкого липополисахарида, поскольку может вызвать неспецифические воспалительные реакции или повлиять на последующие серологические тесты. Кожные пробы на бруцеллин имеют высокую специфичность, такую, что серологически отрицательные невакцинированные животные, которые являются положительно реагирующими при проведении теста на бруцеллин, должны считаться зараженными животными. Так же, результаты этого теста могут содействовать интерпретации серологических реакций, даже являющихся ложно положительными серологическими результатами из-за заражения перекрестно-реагирующими бактериями, особенно в зонах, свободных от бруцеллеза. Однако, не у всех зараженных животных наблюдается реакция, поэтому собственно этот тест не может быть рекомендован в качестве единственного диагностического теста для международной торговли. Хотя внутрикожная реакция на бруцеллин является наиболее специфичным тестом при бруцеллезе (у невакцинированных животных), диагноз не должен ставиться только на основе положительных внутрикожных реакций, наблюдаемых у нескольких животных в стаде, он должен подтверждаться надежным серологическим тестом.
16 СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ПРОФИЛАКТИКА БРУЦЕЛЛЕЗА ЖИВОТНЫХ
17 ВАКЦИНЫ ПРОТИВ БРУЦЕЛЛЕЗА, ВЫПУСКАЕМЫЕ И ПРИМЕНЯЕМЫЕ В РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ (для иммунизации крупного рогатого скота) вакцина против бруцеллеза из слабоагглютиногенного штамма Бруцелла абортус 82 живая сухая; вакцина против бруцеллеза сельскохозяйственных животных из штамма B.abortus 19 живая сухая; вакцина против бруцеллеза крупного рогатого скота из штамма B.abortus 75/79-АВ живая сухая. (для иммунизации мелкого рогатого скота) вакцина против бруцеллеза сельскохозяйственных животных из штамма B.abortus 19 живая сухая; вакцина против бруцеллеза овец и коз и инфекционного эпидидимита баранов из штамма Brucella melitensis REV-1 живая сухая.
18 Сегодня не представляется возможным использовать для профилактики бруцеллеза крупного рогатого скота вакцину из штамма B.abortus 19 вместо наиболее широко применяемой вакцины из штамма B.abortus 82. Также нельзя переоценивать значимость специфической профилактики бруцеллеза животных. В первую очередь по причине относительной иммуногенной активности всех известных в мире бруцеллезных вакцин, в том числе и вакцины из штамма RB-51. Равно как нельзя сразу отказаться от применения вакцин на эндемичных по бруцеллезу территориях. Во-первых, потому что при относительно небольшой дозе возбудителя и умеренной его вирулентности вакцинированные животные успешно противостоят инфицированию. Во-вторых, в случае периодической иммунизации животных, абортов бруцеллезной этиологии, как правило, не наблюдают или их меньше, что имеет важнейшее эпидемическое значение.
20 Антиген вводят коровам, ранее не иммунизированным против бруцеллеза и (или) иммунизированным в возрасте 3-6 месяцев противобруцеллезными вакцинами из штаммов B. abortus 19 и 82 и реиммунизированным через 10 месяцев вакциной из штамма B.abortus 82. В неблагополучных по бруцеллезу и угрожаемых по заносу возбудителя хозяйствах антиген применяют, соответственно, сразу после установления диагноза или при подозрении на заболевание животных. Перед введением антигена проводят серологическое исследование животных на бруцеллез в РА и РСК или РА и РИД или в РНГА или в других серологических реакциях. Всех больных животных сдают на убой. После введения антигена проводят серологическое исследование животных в тех же реакциях через 15 и 30 дней. Больных животных сдают на убой, оставшихся - иммунизируют вакциной из штамма В. аbortus 82. Первое серологическое исследование животных проводят через 1,5 месяца после введения вакцины в РИД с О-ПС антигеном и через 3 месяца в РА и РСК с S-бруцеллезным антигеном (единым для РА, РСК и РДСК) и в РСК с R- бруцеллезным антигеном ВНИВИ.
22 2. Возобновления производства и внедрение в практику инактивированной адъювант-вакцина из штамма B.abortus КВ 17/100 против бруцеллеза крупного рогатого скота или аналогичной.
23 Однако даже в случае реализации всех вышеизложенных предложений искоренение бруцеллеза в РФ будет невозможно без решения следующих проблем: - отсутствия в большинстве субъектов РФ мясокомбинатов и боен, выполняющих убой больных бруцеллезом животных (обусловливает несвоевременный убой и прочее); - компенсации владельцам убытка, неизбежного при изъятии больных животных, в первую очередь, в условиях отгонного животноводства; - несанкционированного перемещения животных на территории страны; - торговли вакцинированными животными из субъектов неблагополучных по бруцеллезу, в субъекты благополучные, в которых вакцины не применяют; - не применения экономических санкций к субъектам неблагополучным по бруцеллезу;
24 - ненадлежащего проведения организационно-хозяйственных мероприятий при бруцеллезе: - без наложения ограничений на неблагополучные по бруцеллезу хозяйства; - введения нетелей и ярок в стада и отары взрослых животных; - концентрация поголовья в хозяйствах молочного направления деятельности; - продолжительное, более 3 лет, применение способа оздоровления путем периодических исследований и вакцинации в стадах, в которых реагировало при серологическом исследовании на бруцеллез более 15 % поголовья.
Лекарственная форма
рег. №: ПВР-1-9.9/02606 от 30.08.10Форма выпуска, состав и упаковка
Набор предназначен для исследования 50 проб сыворотки крови собак в реакции агглютинации (РА) и реакции иммунодиффузии в агаровом геле (РИД).
В состав набора входят:
— антиген R-бруцеллезный для РА - гомогенная взвесь бруцелл в карбонатно-бикарбонатном буферном растворе, инактивированных нагреванием и фенолом. Представляет собой жидкость непрозрачную, серо-белого цвета; при хранении допускается просветление жидкости с образованием осадка микробных клеток, который легко гомогенизируется при встряхивании.
— сыворотка R-бруцеллезная для РА - гипериммунная сыворотка крови кроликов, консервированная борной кислотой. Представляет собой жидкость светло-желтого цвета, прозрачную, слегка опалесцирующую.
— антиген R-бруцеллезный для РИД - ультразвуковой дезинтеграт бруцелл в фосфатно-буферном растворе, консервированный формалином. Представляет собой бесцветную жидкость, прозрачную, слегка опалесцирующую.
— сыворотка R-бруцеллезная для РИД - гипериммунная сыворотка крови кроликов, консервированная борной кислотой. Представляет собой жидкость светло-желтого цвета, прозрачную или слегка опалесцирующую.
— сыворотка негативная - сыворотка крови кроликов или крупного рогатого скота, консервированная борной кислотой. Представляет собой жидкость светло-желтого цвета, прозрачную или слегка опалесцирующую.
Вспомогательные вещества: натрия хлорид, агар.
Компоненты набора расфасованы в стеклянные флаконы вместимостью 10 и 20 мл, укупоренные резиновыми пробками, укрепленными металлическими колпачками:
— антиген R-бруцеллезный для РА по 9 мл - 4 фл.;
— сыворотка R-бруцеллезная для РА по 1 мл - 1 фл.;
— антиген R-бруцеллезный для РИД по 3 мл - 1 фл.;
— антиген R-бруцеллезный для РИД по 2.5 мл - 1 фл.;
— сыворотка негативная по 6 мл - 1 фл.;
— натрия хлорид по 12 г - 1 фл.;
— агар по 12 г - 1 фл.
На флаконы наклеены этикетки с указанием организации-производителя, наименования компонента, количества компонента во флаконе (мл, г), рабочего разведения антигена для РА, титра R - бруцеллезной сыворотки в РА, окончания срока годности (мес., год). Компоненты набора упакованы в картонные коробки с перегородками, обеспечивающими их целостность.
На коробки наклеены этикетки с указанием организации-производителя, ее товарного знака, адреса и телефона, наименований набора и входящих в него компонентов, количества (г), рабочего разведения антигена для РА, титра R-бруцеллезной сыворотки для РА, номера серии набора, даты изготовления (мес., год), срока годности (мес.), условий хранения, регистрационного номера, штрихового года (при наличии), знака соответствия, обозначения настоящего стандарта, надписи "Для животных". В каждую коробку вложена инструкция по применению набора.
Свидетельство о регистрации № ПВР-1-9.9/02606 от 30.08.10
Фармакологические (биологические) свойства и эффекты
Препарат для диагностики бруцеллеза собак.
R-бруцеллезные антигены для реакции агглютинации (РА) и реакции иммунодиффузии (РИД) взаимодействуют соответственно с бруцеллезными R-агглютининами и R-преципитинами, представленными иммуноглобулинами классов М и G и содержащимися в сыворотке крови собак, инфицированных культурами Вrucella canis, с формированием агглютината и преципитата.
Показания к применению препарата НАБОР КОМПОНЕНТОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ БРУЦЕЛЛЕЗА СОБАК, ВЫЗЫВАЕМОГО BRUCELLA CANIS, В РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ И ИММУНОДИФФУЗИИ В АГАРОВОМ ГЕЛЕ
Исследование в РА и РИД сыворотки крови:
— всех племенных собак перед плановой вязкой;
— всех племенных собак с 2-месячного возраста, в течение не более 30 дней перед участием в выставках, продажей, ввозом и вывозом из страны;
— собак, контактировавших с больными бруцеллезом животными;
— собак с нарушением функции органов воспроизводства и опорно-двигательного аппарата;
— сук в случае аборта, рождения мертвого или нежизнеспособного приплода.
Порядок применения
Получение сыворотки крови
Кровь по 7-10 мл берут у собак из поверхностных вен (головной предплечья или латеральной подколенной голени) стерильными инъекционными иглами без шприца в сухие стерильные пробирки. Пробирки с кровью нумеруют, составляют их опись и выдерживают при температуре 37-38°С в течение 30 мин или при комнатной температуре в течение 1.5-2 ч. Свернувшуюся кровь отделяют от стенок пробирки стальной спицей и выдерживают при 4-10°С в течение 3-4 ч. Сыворотку крови с эритроцитами сливают в сухие пробирки, выдерживают при 4-10°С в течение 10-12 ч, отстоявшуюся сыворотку сливают в сухие пробирки.
При взятии крови необходимо соблюдать меры, предупреждающие возможную контаминацию бруцеллами объектов внешней среды.
Сыворотку крови исследуют в свежем виде или консервированную из расчета:
— 0.05 мл (1 капля) 5%-ного раствора фенола на 1 мл сыворотки;
— 4% сухой борной кислоты к объему сыворотки.
Не консервированная сыворотка пригодна для исследования в течение 6 сут со дня взятия крови при условии ее хранения при 4-10°С, консервированная - в течение 30 сут, замороженная - в течение 3 сут после однократного оттаивания.
Мутные, проросшие и гемолизированные сыворотки исследованию не подлежат.
Постановка реакции агглютинации
Реакцию ставят в объеме 1.0 мл. Сыворотку крови собак исследуют в разведениях 1:50, 1:100, 1:200 и 1:400 (конечные разведения после внесения антигена). Исходное разведение 1:25 готовят путем внесения 0.05 мл сыворотки в пробирки с 1.2 мл 0.5%-ного фенолизированного физиологического раствора (или 0.1 мл сыворотки + 2.4 мл физиологического раствора). Одновременно с испытуемыми сыворотками готовят аналогичные разведения R-бруцеллезной и негативной сыворотки. Для приготовления разведений сыворотки крови в пробирки третьего, четвертого и пятого рядов вносят по 0.5 мл фенолизированного физиологического раствора. Из пробирок первого ряда по 0.5 мл сыворотки в разведении 1:25 переносят в пробирки второго и третьего ряда. После пипетирования по 0.5 мл сыворотки в разведении 1:50 из пробирок третьего ряда переносят в пробирки 4 ряда, после выполнения аналогичной операции по 0.5 мл сыворотки в разведении 1:100 из пробирок четвертого ряда переносят в пробирки 5 ряда. После пипетирования по 0.5 мл сыворотки из пробирок 5 ряда удаляют.
Антиген в рабочем разведении 1:10 в 0.5%-ном фенолизированном физиологическом растворе вносят во все пробирки с приготовленными разведениями сыворотки, за исключением пробирок первого ряда.
В отдельную пробирку вносят 0.5 мл физиологического раствора и 0.5 мл антигена в рабочем разведении (контроль антигена на спонтанную агглютинацию).
Штативы с пробирками встряхивают для смешивания компонентов реакции и помещают в термостат при температуре 37-38°С на 16-18 ч, затем выдерживают при комнатной температуре 1 ч и проводят учет реакции.
Допускается постановка реакции в двух разведениях 1:50 и 1:100. При получении положительного результата в РА, проводят исследование таких сывороток в четырех разведениях 1:50,1:100,1:200 и 1:400. Одновременно в таких же разведениях ставят контроль с негативной и R-бруцеллезной сыворотками для РА, а также контроль антигена.
Результаты реакции агглютинации в каждой пробирке учитывают визуально, определяя степень просветления жидкости, внешний вид агглютината (при его наличии) или антигена на дне пробирки и во взвеси после встряхивания пробирки. Следует учитывать, что агглютинат, сформировавшийся при взаимодействии R-бруцеллезного антигена с гомологичными антителами контрольной бруцеллезной сыворотки или сыворотки крови больного животного, легко разбивается при резком встряхивании пробирки с компонентами реакции. Поэтому, при учете результатов реакции в руку одновременно берут 2-4 пробирки и, слегка, постукивая по каждой из них пальцем другой руки, в области дна, поднимают агглютинат.
Реакцию оценивают в крестах:
++++ (4 креста) - полное просветление жидкости при наличии хорошо выраженного осадка в виде "зонтика" на дне пробирки. При легком встряхивании "зонтик" разбивается на крупные хлопья, жидкость остается прозрачной, 100%-ная агглютинация антигена;
+++ (3 креста) - полное просветление жидкости, "зонтик" на дне пробирки хорошо выражен. При встряхивании осадок разбивается на мелкие хлопья, жидкость слегка опалесцирует, 75%-ная агглютинация антигена;
++ (2 креста) - частичное просветление жидкости, "зонтик" выражен. При легком встряхивании "зонтик" разбивается на мелкие хлопья, со дна пробирки поднимается небольшое количество не связавшегося антигена. Жидкость опалесцирует, 50%-ная агглютинация антигена.
+ (1 крест) - частичное просветление жидкости, осадок в виде "зонтика" слабо выражен; при встряхивании жидкость остается мутной с небольшим количеством мелких хлопьев, 25%-ная агглютинация антигена;
- (минус) - отсутствие или частичное просветление жидкости. Осадок антигена в виде "зонтика" отсутствует или в небольшом количестве лежит на дне пробирки в виде "пуговицы". При встряхивании - поднимается в виде "косички", легко разбивается, образуя гомогенную взвесь, 0%-ная агглютинация антигена.
Постановка реакции иммунодиффузии
Приготовление 0.85%-ного раствора хлорида натрия.
Навеску хлорида натрия растворяют в необходимом количестве дистиллированной воды (например, 0.85 г хлорида натрия растворяют в 100 мл).
Приготовление 0.8%-ного раствора агара .
Оставшийся агар хранят при температуре 2-10°С в течение 14 сут.
Пробы сыворотки крови от собак, предназначенные для исследования в РИД, отбирают, консервируют и хранят тем же способом и в тех же условиях, что для исследования в РА.
Для постановки реакции иммунодиффузии используют чашки Петри разного размера. Для исследования до 4 проб - диаметром 40 мм, для исследования 5-40 проб - диаметром 90 мм.
В центральную лунку геля агара вносят 20 мкл антигена, в периферические - по 40 мкл исследуемых проб сыворотки крови.
В каждой чашке ставят контроль антигена с негативной и R-бруцеллезной сывороткой для РИД.
Внутрь крышки каждой чашки вкладывают фильтровальной бумагу, вырезанную по размеру ее наружного диаметра, которую увлажняют 0.5%-ным фенолизированным физиологическим раствором. Чашку плотно прикрывают крышкой и оставляют при 18-24°С.
Учет результатов реакции проводят визуально в косом проходящем свете с помощью осветителя ОИ-19 или аналогичного через 24 и 48 ч после постановки реакции.
Линия преципитации между лунками с антигеном и исследуемой сывороткой, сформировавшаяся через 24 или 48 ч, свидетельствует о положительной реакции.
Диагностическая оценка результатов исследования
При титре РА не ниже 1:100 с оценкой 2 креста и выше и (или) при положительной РИД собак считают больными бруцеллезом, вызываемым Вrucella canis.
При титре РА 1:50 с оценкой 2 креста и выше и отрицательной РИД собак считают сомнительно реагирующими на бруцеллез и исследуют повторно через 15 и 30 дней в РА и РИД с R-бруцеллезными антигенами.
В случае получения двух подряд сомнительных результатов в РА с интервалом не менее 30 дней при отрицательных результатах тестирования в РИД, заболевание животных бруцеллезом исключают.
Особые указания и меры личной профилактики
При работе с Набором следует соблюдать правила личной гигиены и техники безопасности, предусмотренные при работе с лекарственными средствами для животных.
Компоненты набора во флаконах без маркировки, с трещинами, нарушением укупорки, содержащие посторонние примеси, плесень и не разбивающиеся при встряхивании конгломераты, с истекшим сроком годности, подвергшиеся замораживанию выбраковывают, обеззараживают путем кипячения в течение 15 мин и утилизируют.
Условия хранения НАБОР КОМПОНЕНТОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ БРУЦЕЛЛЕЗА СОБАК, ВЫЗЫВАЕМОГО BRUCELLA CANIS, В РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ И ИММУНОДИФФУЗИИ В АГАРОВОМ ГЕЛЕ
Набор следует хранить в сухом, темном, недоступном для детей месте при температуре от 2° до 10°С.
Читайте также:
