Окраска мазков по грамму на сибирскую язву

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ (обзор литературы)

Сибирская язва (лат. — Febris carbunculosa; англ. — Anthrax) — особо опасная, острая септическая болезнь животных многих видов и человека, вызываемая Bacillus anthracis, характеризующаяся септицемией, поражением кожи, кишечника, легких, лимфатических узлов и гибелью заболевших животных.

При подозрении на сибирскую язву вскрывать трупы запрещается. Для исследования от трупа животного берут кровь из надреза уха, периферических сосудов или отрезают и отсылают в лабораторию ухо. Если подозрение на сибирскую язву появилось в процессе вскрытия трупа, вскрытие тотчас же приостанавливают и для исследования посылают ухо, как указано ниже.

Подозрение на заболевание сибирской язвой свиней обычно возникает при наличии опухоли в области шеи. Если подозрение возникло во время вскрытия трупа свиньи, то дальнейшее вскрытие прекращают, а для бактериологического исследования берут участки отечной соединительной ткани, заглоточные лимфатические узлы.

Место надреза предварительно тщательно дезинфицируют и после взятия крови прижигают огнем или раскаленным металлическим предметом. Кровь наносят на стекло толстым слоем и высушивают на воздухе без дополнительной фиксации.

Из патологического материала для микроскопии готовят мазки, часть красят по Граму и обязательно на капсулы по Михину и Ольту. Обнаружение типичных по морфологии капсульных палочек является важным диагностическим признаком.

Окраска по Граму:

На фиксированный мазок накладывают небольшие кусочки фильтровальной бумаги и наливают основной краситель - генцианвиолет или метиленовый синий. Спустя 3-5 минут снимают окрашенную фильтровальную бумагу.

Заливают мазок раствором Люголя на 1 минуту. При этом препарат темнеет.

Сливают раствор Люголя и обрабатывают мазок чистым этиловым спиртом: капают несколько капель на препарат, спустя 20 секунд сливают. Промывают стекло с исследуемым препаратом дистиллированной водой.

Производят дополнительное окрашивание - докрашивают препарат фуксином. Спустя 1-2 минуты краситель смывают.

После просушивания фильтровальной бумагой на предметное стекло наносят масло и изучают мазок под микроскопом.

Микроскопическая картина: Грамположительные бактерии будут иметь сине-фиолетовый цвет, грамотрицательные - розовый или красный.

Техника окраска капсул по методу Ольта. Свежий горячий 2%-ный раствор сафранина наносят на фиксированный мазок, окрашивают 5-7 минут. Быстро промывают водой и высушивают. Тело клетки окрашивается в красно-кирпичный цвет, капсула в - желто-оранжевый.

Микроскопическая картина: капсулы — бледно-желтого, а бактерии —коричневого цвета.

Способ Михина. Фиксированный мазок (преимущественно из крови или селезеночной пульпы) окрашивают леффлеровской метиленовой синькой в течение 2—3 минут при подогревании (до появления паров). Затем краску быстро смывают водой и мазок высушивают фильтровальной бумагой. Лучше окрашивать старым раствором краски.

Микроскопическая картина (рисунок 1): капсулы — светло-розовые, бактерии —темно-синие.

Рисунок 1 - Окраска капсул по Михину

При посевах на чашки Петри с питательным агаром после суточной инкубации при (36±1) °С микроб формирует крупные шероховатые сухие матовые колонии в R-форме, с "шагреневой" поверхностью, с неровными краями и отходящими от них волнистыми отростками. При малом увеличении под микроскопом (7x10) они напоминают локоны волос или львиную гриву.

Характерный придонный рост сибиреязвенного микроба в МПБ или 1%-й пептонной воде похож на комочек ваты, с трудом разбивающийся при встряхивании, при этом бульон остается прозрачным (рисунок 2).

Рисунок 2 - Сибирская язва в МПБ

Сибиреязвенный микроб способен разлагать с образованием кислоты без газа глюкозу, мальтозу, сахарозу и некоторые другие сахара, но не разлагает лактозу. Обладает относительно низкой протеолитической активностью и при посеве уколом в столбик 10-12%-го мясопептонного желатина и выращивании при 22 °С рост микроба напоминает елочку, опрокинутую верхушкой вниз; на 3-5 день желатин разжижается в виде воронки (рисунок 3).

Рисунок 3 - Сибирская язва при посеве на мясопептонный желатин.

Диагноз на сибирскую язвы ставят на основании эпизоотологических данных, патолого-морфологических изменений и результатов лабораторного исследования.

Список используемой литературы

Андреев, Г.М. Справочник ветеринарного фельдшера [Текст]: учебное пособие / Г.М. Андреев, И.Д. Баранцев. – М.: Агропромиздат, 2015. – 354с.

Волина, Е.Г. Частная микробиология [Текст]: учебное пособие / Е.Г. Волина, Л.Е. Саруханова. - М.: РУДН, 2016. - 222 c

Макаров, В.В.Эпизоотологический метод исследования [Текст]: учебное пособие / В.В., Макаров, - М.:Колос, 2016. - 221 с.

Стационарность, периодичность, сезонность болезни

4. Клинические признаки и па­то­ло­гоа­на­то­ми­че­ские из­ме­не­ния при сибирской язве.

Ин­ку­ба­ци­он­ный пе­ри­од длит­ся 1-3 дня, ре­же - доль­ше. При си­бир­ской яз­ве на­блю­да­ют ме­ст­ную фор­му (кар­бун­ку­лез­ную, ан­ги­ноз­ную, ле­гоч­ную, ки­шеч­ную), ати­пич­ную про­яв­ле­ние и сеп­ти­че­скую фор­му бо­лез­ни. Бо­лезнь про­те­ка­ет мол­ние­нос­но, ост­ро, по­до­ст­ро, хро­ни­че­ски и абор­тив­но.

У жвач­ных жи­вот­ных и ло­ша­дей бо­лезнь ча­ще про­яв­ля­ет­ся в сеп­ти­че­ской фор­ме, про­те­ка­ет мол­ние­нос­но и ост­ро с по­ра­же­ни­ем ки­шеч­ни­ка и яв­ле­ния­ми сеп­ти­це­мии. Од­на­ко воз­мож­но и ати­пич­ное про­яв­ле­ние бо­лез­ни. У сви­ней ча­ще об­на­ру­жи­ва­ют ме­ст­ные по­ра­же­ния, бо­лезнь про­те­ка­ет по­до­ст­ро, ино­гда ост­ро, не­ред­ко хро­ни­че­ски.

При мол­ние­нос­ном те­че­нии жи­вот­ное мо­жет по­гиб­нуть вне­зап­но, без ка­ких-ли­бо кли­ни­че­ских при­зна­ков. Ес­ли бо­лезнь не­сколь­ко за­тя­ги­ва­ет­ся, то по­яв­ля­ют­ся не­ко­то­рые кли­ни­че­ские при­зна­ки. На­блю­да­ют силь­ное воз­бу­ж­де­ние, тем­пе­ра­ту­ра те­ла по­вы­ше­на, пульс уча­щен, ды­ха­ние глу­бо­кое, ви­ди­мые сли­зи­стые циа­но­тич­ны. Обыч­но жи­вот­ные гиб­нут че­рез не­сколь­ко ми­нут по­сле по­яв­ле­ния пер­вых сим­пто­мов бо­лез­ни во вре­мя силь­но­го кон­вуль­сив­но­го при­пад­ка.

Ост­рое те­че­ние ха­рак­те­ри­зу­ет­ся вы­со­кой тем­пе­ра­ту­рой те­ла (41-42 0 С). Ли­хо­рад­ке со­пут­ст­ву­ет мы­шеч­ная дрожь. Пульс 80-100 уда­ров в ми­ну­ту, сер­деч­ные толч­ки сту­ча­щие, ды­ха­ние ус­ко­рен­ное и пре­ры­ви­стое. Жи­вот­ное от­ка­зы­ва­ет­ся от кор­ма, уси­ли­ва­ет­ся жа­ж­да. Ви­ди­мые сли­зи­стые обо­лоч­ки циа­но­тич­ные. Жи­вот­ное уг­не­те­но, взгляд не­под­виж­ный, рас­те­рян­ный. Рот от­крыт, язык сви­са­ет изо рта, ноз­д­ри рас­ши­рен­ны.

По­до­строе те­че­ние про­яв­ля­ет­ся те­ми же кли­ни­че­ски­ми призна­ка­ми, что и ост­рое. Раз­ли­чие за­клю­ча­ет­ся в том, что при по­до­ст­ром те­че­нии сим­пто­мы бо­лез­ни на­рас­та­ют мед­лен­но и вре­ме­на­ми мо­гут ос­ла­бе­вать. В этот пе­ри­од жи­вот­ные ка­жут­ся здо­ро­вы­ми: они по­еда­ют корм. Од­на­ко че­рез не­сколь­ко ча­сов со­стоя­ние их рез­ко ухуд­ша­ет­ся. При­сту­пы бо­лез­ни мо­гут по­вто­рить­ся 2-3 раза, на по­след­ней ста­дии вид ис­пу­ган­ный, пу­че­гла­зие, за­стыв­ший взгляд, за­жа­тый корм в ро­то­вой по­лос­ти. У овец, коз и у круп­но­го ро­га­то­го ско­та ино­гда по­яв­ля­ют­ся оте­ки и ги­пе­ре­мия ко­жи на внут­ре­нней сто­ро­не та­зо­вых ко­неч­но­стей. У сви­ней от­ме­ча­ют сон­ли­вость, они за­мет­но из­бе­га­ют во­ды.

Хро­ни­че­ское те­че­ние длит­ся бо­лее 2 месяцев и ха­рак­те­ри­зу­ет­ся у жвач­ных и ло­ша­дей обыч­но сла­бым подъ­е­мом тем­пе­ра­ту­ры те­ла, про­грес­си­рую­щим ис­то­ще­ни­ем и про­фуз­ным по­но­сом. У с­ви­ней мо­гут по­ра­жать­ся лим­фа­ти­че­ские уз­лы в об­лас­ти шеи. Од­на­ко оча­ги по­ра­же­ния в ор­га­низ­ме вы­яв­ля­ют лишь при по­сле­убой­ном ос­мот­ре.

Ати­пич­ное те­че­ние на­блю­да­ет­ся очень час­то, но из-за не­зна­чи­тель­ных и не­ти­пич­ных при­зна­ков при нем не­ред­ко ста­вят не­пра­виль­ный диа­г­ноз и лишь при ла­бо­ра­тор­ном ис­сле­до­ва­нии мя­са и суб­про­дук­тов вы­яв­ля­ют воз­бу­ди­те­ля си­бир­ской яз­вы.

Кар­бун­ку­лез­ная фор­ма мо­жет быть са­мо­стоя­тель­ной или со­пут­ст­во­вать сеп­ти­це­мии, ост­ро­му и по­до­ст­ро­му те­че­нию бо­лез­ни. Кар­бун­ку­лы мо­гут воз­ни­кать на раз­лич­ных час­тях те­ла и дос­ти­гать ино­гда боль­ших раз­ме­ров. В цен­тре кар­бун­ку­ла тка­ни нек­ро­ти­зи­ру­ют­ся, от­па­да­ют, в ре­зуль­та­те об­ра­зу­ет­ся яз­ва. Тем­пе­ра­ту­ра те­ла по­вы­ша­ет­ся не­зна­чи­тель­но.

Ан­ги­ноз­ная фор­ма как пра­ви­ло ха­рак­те­ри­зу­ет­ся дли­тель­ным те­че­ни­ем. Тем­пе­ра­ту­ра те­ла по­вы­ше­на не­зна­чи­тель­но. Обыч­но по­ра­жа­ют­ся под­че­лю­ст­ные, за­гло­точ­ные и шей­ные лим­фа­ти­че­ские уз­лы. Бо­лезнь на­чи­на­ет­ся в ви­де ан­ги­ны. В об­лас­ти шеи об­ра­зу­ет­ся при­пух­лость. Ко­жа в об­лас­ти шеи при­об­ре­та­ет си­не­ва­то-крас­ный от­те­нок. Об­на­ру­жи­ва­ют оте­ки язы­ка и твер­до­го не­ба.

Ки­шеч­ная фор­ма со­про­во­ж­да­ет­ся рас­строй­ством ор­га­нов пи­ще­ва­ре­ния. Вна­ча­ле от­ме­ча­ют за­пор, ко­то­рый сме­ня­ет­ся диа­ре­ей. Тем­пе­ра­ту­ра те­ла вы­со­кая и удер­жи­ва­ет­ся до 10 дней.

Не­смот­ря на на­ли­чие оп­ре­де­лен­ных кли­ни­че­ских при­зна­ков у жи­вот­ных, ди­аг­ноз на си­бир­скую яз­ву толь­ко по кли­ни­че­ским сим­пто­мам ус­та­но­вить труд­но, так как при мол­ние­нос­ном те­че­нии они обыч­но не вы­ра­же­ны, а при ост­ро­м и по­до­ст­ром те­че­ни­ях по­хо­жи на при­зна­ки дру­гих бо­лез­ней. Наи­бо­лее обос­но­ван­ное по­доз­ре­ние на си­бир­скую яз­ву бы­ва­ет лишь при кар­бун­ку­лез­ной фор­ме или при на­ли­чии оте­ков в под­че­лю­ст­ной фор­ме. Осо­бен­но слож­ны слу­чаи, ко­г­да си­бир­ская яз­ва про­те­ка­ет у жи­вот­ных ати­пич­но. Иг­но­ри­рование лабо­ра­тор­ных ме­то­дов ис­сле­до­ва­ния может привести к ошибке при по­ста­нов­ке окончательного ди­аг­но­за.

Па­та­ло­гоа­на­то­ми­че­ские из­ме­не­ния за­ви­сят от фор­мы про­яв­ле­ния и ост­ро­ты те­че­ния бо­лез­ни. Тем яр­че они вы­ра­же­ны, чем мед­лен­нее про­те­ка­ет бо­лезнь, за ис­клю­че­ни­ем ати­пич­но­го и хро­ни­че­ско­го те­че­ния. Осо­бен­но ха­рак­тер­ные па­то­ло­ги­че­ские из­ме­не­ния бы­ва­ют при ост­ром и по­до­ст­ром те­че­ни­ях бо­лез­ни.

Труп силь­но вздут, око­че­не­ние от­сут­ст­ву­ет или вы­ра­же­но очень сла­бо. Из ес­те­ст­вен­ных от­вер­стий вы­де­ля­ет­ся пе­ни­стая кро­вя­ни­стая жид­кость, а ино­гда и кровь. Очень бы­ст­ро, осо­бен­но в лет­нее вре­мя, на­сту­па­ет раз­ло­же­ние тру­па.

Под­кож­ная клет­чат­ка про­ни­за­на то­чеч­ны­ми ге­мор­ра­гия­ми и про­пи­та­на се­роз­но-гем­мо­ра­ги­че­ским ин­фильт­ра­том жел­то­ва­то­го цве­та.

Мыш­цы кир­пич­но-крас­но­го цве­та, дряб­лой кон­си­стен­ции. В брюш­ной и груд­ной по­лос­тях, в сер­деч­ной сум­ке со­дер­жит­ся боль­шое ко­ли­че­ст­во мут­ной крас­но­ва­той жид­ко­сти. На серд­це под эпи­кар­дом име­ют­ся кро­во­из­лия­ния. Лим­фа­ти­че­ские уз­лы уве­ли­че­ны, соч­ные, на раз­ре­зе кир­пич­но-крас­ные. Се­ле­зен­ка силь­но уве­ли­че­на (ино­гда в нор­ме), пол­но­кров­ная. Пе­чень и поч­ки уве­ли­че­ны не­зна­чи­тель­но. Они кир­пич­но-крас­но­го или виш­не­во­го цве­та. Мо­че­вой пу­зырь ги­пе­ре­ми­ро­ван, мно­же­ст­вен­ные то­чеч­ные кро­во­из­лия­ния на сли­зи­стой обо­лоч­ке. Тонкий отдел кишечника припухший, слизистая оболочка гиперемирована. Тол­стый отдел кишечника по­ра­жа­ет­ся ред­ко. Лег­кие пол­но­кров­ные, отеч­ные. Сли­зи­стая обо­лоч­ка ды­ха­тель­ных пу­тей ги­пе­ре­ми­ро­ва­на, отеч­на, усея­на эк­хи­мо­за­ми. Го­лов­ной и спин­ной мозг ги­пе­ре­ми­ро­ва­ны с кро­во­из­лия­ния­ми в ве­ще­ст­во моз­га и его обо­лоч­ки.

5. Методы лабораторного диагноза.

5.1. Отбор патологического материала

С целью личной безопасности отбор проб патологического материала выполняется в спецодежде и резиновых перчатках.

При подозрении сибирской язвы для постановки прижизненного диагноза у больного животного (кроме свиней) берут кровь из уха. Для этого участок кожи с хорошо выраженным сосудом тщательно дезинфицируют и, надрезав сосуд, наносят капли крови на обезжиренные предметные стёкла. Место надреза сосуда тщательно дезинфицируют. Затем, после подсушивания мазка, стёкла прокладывают спичками, плотно обёртывают пергаментной бумагой, перевязывают и помещают в герметичный полиэтиленовый пакет. Пакет помещают в термос. К данному материалу прилагают сопроводительный документ с указанием хозяйства, вида животного, даты отбора проб крови. В лаборатории мазки после окраски по Граму исследуют под световым микроскопом с целью обнаружения капсул и делают посевы на питательные среды.

У павшего животного при подозрении сибирской язвы также берут пробу крови. Если количества крови недостаточно, то проводят следующие манипуляции. Ухо со стороны, на которой лежал труп, перевязывают шпагатом в двух местах, ближе к основанию и отсекают между перевязкой. Места разреза прижигают калёным железом. Затем отрезанное ухо помещают в герметичный пакет и в термос. Вскрытие трупа недопустимо ! Если вскрытие сделано, то с предосторожностью отбирают лимфатические узлы, кусочки селезёнки и печени, помещают в двойные герметичные полиэтиленовые пакеты и в термос. От свиней пробы крови не берут. В качестве патологического материала используют кусочки воспалённой ткани в области отёка и заглоточные лимфатические узлы.

Для исследования кожевенного сырья от каждой кожи отрезают участок величиной 3х3 см и надевают на бечёвку, маркируют и обеззараживают в камере Крупина при 0,7 атм. в течение 1 часа 45 минут.

5.2. Лабораторные исследования

В ве­те­ри­нар­ных ла­бо­ра­то­ри­ях в за­ви­си­мо­сти от их ос­на­ще­ния мо­гут быть про­ве­де­ны сле­дую­щие ис­сле­до­ва­ния: мик­ро­ско­пия маз­ков, бак­те­рио­ло­ги­че­ские ис­сле­до­ва­ния с це­лью вы­де­ле­ния чис­той куль­ту­ры и изу­че­ния их свойств, иден­ти­фи­ка­ция вы­де­лен­ной куль­ту­ры, био­про­ба на ла­бо­ра­тор­ных жи­вот­ных, се­ро­ло­ги­че­ские ис­сле­до­ва­ния.

5.2.1. Мик­роскопические ис­сле­до­ва­ния. Из дос­тав­лен­но­го па­то­ло­ги­че­ско­го ма­те­риа­ла де­ла­ют маз­ки, фик­си­ру­ют эти­ло­вым спир­том с до­бав­ле­ни­ем 3% пе­ре­ки­си во­до­ро­да, ок­ра­ши­ва­ют по Гра­му и на кап­су­лу - по Ми­хи­ну, Ре­би­ге­ру, Оль­ту или Ро­ма­нов­ско­му-Гим­за; при на­ли­чии лю­ми­нес­цент­ных сы­во­ро­ток ис­поль­зу­ют ме­тод флюо­рес­ци­рую­щих ан­ти­тел.

В мас­ках, ок­ра­шен­ных по Грам­у, Bac. anthracis - грам­по­ло­жи­тель­ная па­лоч­ка (пря­мая). Па­лоч­ки рас­по­ла­га­ют­ся ко­рот­ки­ми це­поч­ка­ми или по­пар­но, кон­цы их, об­ра­щен­ные друг к дру­гу, рез­ко об­руб­ле­ны, сво­бод­ные кон­цы обыч­но за­круг­ле­ны. В от­дель­ных слу­ча­ях (ча­ще в маз­ках от сви­ней) фор­ма мик­ро­бов си­бир­ской яз­вы мо­жет быть не­ха­рак­тер­ной (ко­рот­кие тол­стые или изо­гну­тые, ино­гда зер­ни­стые па­лоч­ки со взду­ти­ем по­се­ре­ди­не или на кон­це, воз­мож­но на­ли­чие "те­ней" мик­ро­бов).

В ок­ра­ше­нных спе­ци­аль­ны­ми ме­то­да­ми маз­ках из па­то­ло­ги­че­ско­го ма­те­риа­ла и сре­ды ГКИ си­би­ре­яз­вен­ные па­лоч­ки ок­ру­же­ны кап­су­лой.

В фик­си­ро­ван­ных пре­па­ра­тах кап­су­лы ба­цилл хо­ро­шо ок­ра­ши­ва­ют­ся все­ми спо­со­ба­ми: Ми­хи­на, Ре­би­ге­ра, Оль­та, Ро­ма­нов­ско­го-Гим­зы, Бур­це­ва, Ио­не, Ка­уф­ма­на.

Окраска по Михину. Мазок окрашивают леффлеровской метиленовой синью в течение 2-3 минут, при этом его подогревают до появления паров. Краску быстро смывают водой, а мазок высушивают фильтровальной бумагой. Бациллы - тёмно-синие, капсулы- светло-розовые.

Окраска по Ребигеру . 15-20 г генцианвиолета растворяют в 100-150 мл 40% формалина, тщательно и многократно взбалтывают и дают отстоятся несколько часов, затем фильтруют. Полученным раствором окрашивают нефиксированные мазки. Бациллы -тёмно-фиолетовые, капсулы фиолетово-розового цвета.

Окраска по Ольту. В 100 мл кипящей дистиллированной воды растворяют 3 г сафранина, после охлаждения фильтруют. Красят 1-2 мин. Бациллы - красные, капсулы - жёлтые.

Окраска по Романовскому-Гимзе. На фиксированный мазок наносят краску, выдерживают в течение 15-20 минут и быстро смывают. Бациллы тёмно-синие, капсула розовая или бледно-розовая.

У павшего животного при подозрении сибирской язвы также берут пробу крови. Если количества крови недостаточно, то проводят следующие манипуляции. Ухо со стороны, на которой лежал труп, перевязывают шпагатом в двух местах, ближе к основанию и отсекают между перевязкой. Места разреза прижигают калёным железом. Затем отрезанное ухо помещают в герметичный пакет и в термос. Вскрытие трупа недопустимо ! Если вскрытие сделано, то с предосторожностью отбирают лимфатические узлы, кусочки селезёнки и печени, помещают в двойные герметичные полиэтиленовые пакеты и в термос. От свиней пробы крови не берут. В качестве патологического материала используют кусочки воспалённой ткани в области отёка и заглоточные лимфатические узлы.

Для исследования кожевенного сырья от каждой кожи отрезают участок величиной 3х3 см и надевают на бечёвку, маркируют и обеззараживают в камере Крупина при 0,7 атм. в течение 1 часа 45 минут.

5.2. Лабораторные исследования

В ве­те­ри­нар­ных ла­бо­ра­то­ри­ях в за­ви­си­мо­сти от их ос­на­ще­ния мо­гут быть про­ве­де­ны сле­дую­щие ис­сле­до­ва­ния: мик­ро­ско­пия маз­ков, бак­те­рио­ло­ги­че­ские ис­сле­до­ва­ния с це­лью вы­де­ле­ния чис­той куль­ту­ры и изу­че­ния их свойств, иден­ти­фи­ка­ция вы­де­лен­ной куль­ту­ры, био­про­ба на ла­бо­ра­тор­ных жи­вот­ных, се­ро­ло­ги­че­ские ис­сле­до­ва­ния.

5.2.1. Мик­роскопические ис­сле­до­ва­ния. Из дос­тав­лен­но­го па­то­ло­ги­че­ско­го ма­те­риа­ла де­ла­ют маз­ки, фик­си­ру­ют эти­ло­вым спир­том с до­бав­ле­ни­ем 3% пе­ре­ки­си во­до­ро­да, ок­ра­ши­ва­ют по Гра­му и на кап­су­лу - по Ми­хи­ну, Ре­би­ге­ру, Оль­ту или Ро­ма­нов­ско­му-Гим­за; при на­ли­чии лю­ми­нес­цент­ных сы­во­ро­ток ис­поль­зу­ют ме­тод флюо­рес­ци­рую­щих ан­ти­тел.

В мас­ках, ок­ра­шен­ных по Грам­у, Bac. anthracis - грам­по­ло­жи­тель­ная па­лоч­ка (пря­мая). Па­лоч­ки рас­по­ла­га­ют­ся ко­рот­ки­ми це­поч­ка­ми или по­пар­но, кон­цы их, об­ра­щен­ные друг к дру­гу, рез­ко об­руб­ле­ны, сво­бод­ные кон­цы обыч­но за­круг­ле­ны. В от­дель­ных слу­ча­ях (ча­ще в маз­ках от сви­ней) фор­ма мик­ро­бов си­бир­ской яз­вы мо­жет быть не­ха­рак­тер­ной (ко­рот­кие тол­стые или изо­гну­тые, ино­гда зер­ни­стые па­лоч­ки со взду­ти­ем по­се­ре­ди­не или на кон­це, воз­мож­но на­ли­чие "те­ней" мик­ро­бов).

В ок­ра­ше­нных спе­ци­аль­ны­ми ме­то­да­ми маз­ках из па­то­ло­ги­че­ско­го ма­те­риа­ла и сре­ды ГКИ си­би­ре­яз­вен­ные па­лоч­ки ок­ру­же­ны кап­су­лой.

В фик­си­ро­ван­ных пре­па­ра­тах кап­су­лы ба­цилл хо­ро­шо ок­ра­ши­ва­ют­ся все­ми спо­со­ба­ми: Ми­хи­на, Ре­би­ге­ра, Оль­та, Ро­ма­нов­ско­го-Гим­зы, Бур­це­ва, Ио­не, Ка­уф­ма­на.

Окраска по Михину. Мазок окрашивают леффлеровской метиленовой синью в течение 2-3 минут, при этом его подогревают до появления паров. Краску быстро смывают водой, а мазок высушивают фильтровальной бумагой. Бациллы - тёмно-синие, капсулы- светло-розовые.

Окраска по Ребигеру. 15-20 г генцианвиолета растворяют в 100-150 мл 40% формалина, тщательно и многократно взбалтывают и дают отстоятся несколько часов, затем фильтруют. Полученным раствором окрашивают нефиксированные мазки. Бациллы -тёмно-фиолетовые, капсулы фиолетово-розового цвета.

Окраска по Ольту. В 100 мл кипящей дистиллированной воды растворяют 3 г сафранина, после охлаждения фильтруют. Красят 1-2 мин. Бациллы - красные, капсулы - жёлтые.

Окраска по Романовскому-Гимзе. На фиксированный мазок наносят краску, выдерживают в течение 15-20 минут и быстро смывают. Бациллы тёмно-синие, капсула розовая или бледно-розовая.

По ре­зуль­та­там мик­ро­ско­пи­че­ско­го ис­сле­до­ва­ния не­мед­лен­но да­ют пред­ва­ри­тель­ный от­вет. В слу­чае об­на­ру­же­ния кап­суль­ных форм ба­цилл ди­аг­ноз на си­бир­скую яз­ву счи­та­ют ус­та­нов­ле­нным и даль­ней­шие ис­сле­до­ва­ния про­дол­жа­ют в со­от­вет­ст­вии с ин­ст­рук­ци­ей.

5.2.2. По­сев на пи­та­тель­ные сре­ды. По­се­вы из ис­ход­но­го па­то­ло­ги­че­ско­го ма­те­риа­ла де­ла­ют в МПБ и на МПА или в буль­он и на агар Хот­тин­ге­ра (рН 7,4). Од­но­вре­мен­но мож­но де­лать по­се­вы на диф­фе­рен­ци­аль­но-ди­аг­но­сти­че­скую сре­ду с 0,01 % фе­нол­фта­ле­ин­фос­фа­та на­трия, а так­же на же­ла­тин, кро­вя­ной буль­он и агар, сре­ду ГКИ (60 % сте­риль­но­го рас­тво­ра Хен­кса без ан­ти­био­ти­ков и 40 % сте­риль­ной не­кон­сер­ви­ро­ван­ной сы­во­рот­ки круп­но­го ро­га­то­го ско­та, инак­ти­ви­ро­ван­ной при 56-58 0 С в те­че­нии 30 мин, рН 7,2-7,4).

По­се­вы ин­ку­би­ру­ют 18-24 ч при тем­пе­ра­ту­ре 37-38 (С и при от­сут­ст­вии рос­та вы­дер­жи­ва­ют при той же тем­пе­ра­ту­ре еще 48 часов.

5.2.3.Био­ло­ги­че­ская проба. Ис­сле­дуе­мый па­то­ло­ги­че­ский ма­те­ри­ал (в день по­сту­п­ле­ния) сус­пен­ди­ру­ют в не­боль­шом объ­е­ме 0,9%-но­го рас­тво­ра на­трия хло­ри­да, вво­дят двум бе­лым мы­шам в до­зе 0,2-0,5 мл под ко­жу спи­ны бли­же к кор­ню хво­ста или 0,5-1 мл двум мор­ским свин­кам под­кож­но в об­лас­ти жи­во­та. Ги­бель жи­вот­ных на­сту­па­ет че­рез 1-3 сут, ино­гда поз­же.

5.2.4. Ок­ра­ска си­би­ре­яз­вен­ных спор. Для этой це­ли ис­поль­зу­ют ме­то­ды: Ау­е­ски, Зла­то­го­ро­ва, Дор­не­ра, Пеш­ко­ва, Мюл­ле­ра, Тру­хи­льо, Клей­на, Шеф­фе­ра, Фул­то­на и др. Луч­ше ок­ра­ши­ва­ют­ся спо­ры ме­то­дом Ау­е­ски и осо­бен­но Тру­хи­льо.

5.2.5. Реакция преципитации по Асколи.

Реакцию ставят в уленгутовской пробирке. Для этого в уленгутовскую пробирку вносят 0,2-0,3 мл прозрачной преципитирующей сибиреязвенной сыворотки и затем осторожно наносят равное количество экстракта проб специально подготовленного (горячий или холодный способ) патологического материала. При положительной реакции через 10-12 минут на границе соединения компонентов обнаруживают характерный серовато-белый диск (преципитирующее кольцо).

5.2.6. Иден­ти­фи­ка­ция воз­бу­ди­те­ля си­бир­ской яз­вы.

Применительно к возбудителю сибирской язвы имеется большая группа микробов-сапрофитов, близкородственных Bac.anthracis по основным культурально-морфологическим и биохимическим свойствам (Bac. anthracoides, Bac.pseudoanthracis, Bac. cereus, Bac. mesentericus, Bac.megaterium, Bac. subtilis, Bac. mycoides).

Идентификацию про­во­дят по сле­дую­щим при­зна­кам: мор­фо­ло­гия мик­ро­ба, вклю­чая на­ли­чие кап­сул в маз­ках из ис­ход­но­го па­то­ло­ги­че­ско­го ма­те­риа­ла или ор­га­нов пав­ших под­опыт­ных жи­вот­ных (сапрофиты капсул не имеют); куль­ту­раль­ные свой­ст­ва; па­то­ген­ность для ла­бо­ра­тор­ных жи­вот­ных (ги­бель хо­тя бы од­но­го из двух ла­бо­ра­тор­ных жи­вот­ных, за­ра­жен­ных сус­пен­зи­ей из ис­ход­но­го па­то­ло­ги­че­ско­го ма­те­риа­ла или по­лу­чен­ной куль­ту­рой воз­бу­ди­те­ля, с по­сле­дую­щим вы­де­ле­ни­ем ее из ор­га­нов мы­ши или мор­ской свин­ки. Сапрофиты непатогенны для морских свинок и кроликов)

При на­ли­чии в маз­ках ха­рак­тер­ных мор­фо­ло­ги­че­ских и куль­ту­раль­ных свойств и кап­сул из ис­ход­но­го па­то­ло­ги­че­ско­го ма­те­риа­ла даль­ней­шее изу­че­ние куль­ту­ры не про­во­дят. В слу­чае по­лу­че­ния не­чет­ких ре­зуль­та­тов по од­но­му из пер­вых двух свойств, не до­жи­да­ясь ре­зуль­та­тов био­про­бы, оп­ре­де­ля­ют чув­ст­ви­тель­ность куль­ту­ры к си­би­ре­яз­вен­ным бак­те­рио­фа­гам и пе­ни­цил­ли­ну.

Про­ба бак­те­рио­фа­гом ос­но­ва­на на использовании сибиреязвенных бактериофагов (вирусов сибиреязвенных бацилл), которые при взаи­мо­дей­ст­вии с си­би­ре­яз­ве­ной куль­ту­рой вызывают её разрушение (ли­зис). Сибиреязвенные бактериофаги не лизируют сапрофитные бациллы. Ре­ак­ция вы­со­ко­спе­ци­фич­на и при­ме­ня­ют её для иден­ти­фи­ка­ции воз­бу­ди­те­ля си­бир­ской яз­вы и диф­фе­рен­циа­ции его сапрофитных бацилл.

Тест "жем­чуж­но­го оже­ре­лья.

Сибиреязвенные бациллы при посева на мясо-пептонный агар с пенициллином имеют вид жемчужного ожерелья. Спорообразующие сапрофитные аэробные микробы в аналогичных условиях вырастают в виде обычных форм.

Вы­де­лен­ную куль­ту­ру от­но­сят к Bac. anthracis при на­ли­чии кап­сул в маз­ках из ис­ход­но­го па­то­ло­ги­че­ско­го ма­те­риа­ла или ор­га­нов пав­ше­го за­ра­жен­но­го жи­вот­но­го и дру­гих ха­рак­тер­ных мор­фо­ло­ги­че­ских и куль­ту­раль­ных свойств воз­бу­ди­те­ля: при от­сут­ст­вии кап­сул, но на­ли­чии дру­гих харак­тер­ных мор­фоло­ги­че­ских и куль­ту­раль­ных свойств воз­бу­ди­те­ля, чув­ст­ви­тель­ность его к си­би­ре­яз­вен­но­му фа­гу и пе­ни­цил­ли­ну.

5.2.7. Постановка диагноза.

Ди­аг­ноз на си­бир­скую яз­ву у жи­вот­но­го счи­та­ют ус­та­нов­ленным в од­ном из сле­дую­щих слу­ча­ев:

- об­на­ру­же­ние кап­суль­ных форм Bac. anthracis в па­то­ло­ги­че­ском ма­те­риа­ле;

- ги­бель хо­тя бы од­но­го ла­бо­ра­тор­но­го жи­вот­но­го из двух, за­ра­жен­ных сус­пе­зи­ей из ис­ход­но­го па­то­ло­ги­че­ско­го ма­те­риа­ла, с по­сле­дую­щим вы­де­ле­ни­ем из его ор­га­нов куль­ту­ры Bac. anthracis да­же при от­сут­ст­вии рос­та куль­ту­ры воз­бу­ди­те­ля из па­то­ло­ги­че­ско­го ма­те­риа­ла;

Глава 30. Возбудитель сибирской язвы

Возбудитель сибирской язвы Bacillus anthracis включен в семейство Bacillaceae, род Bacillus. Название болезни - "углевик" дано русским врачом Андриевским, который в конце XVIII века изучал это заболевание в Сибири во время большой эпизоотии среди коров.

Возбудитель сибирской язвы был открыт Паллендером в 1849 г. Большой вклад в изучение этого заболевания внесли Р. Кох, Л. Пастер и Л. С. Ценковский.

Морфология. Возбудители сибирской язвы - крупные палочки 6-8 × 1-1,5 мкм с обрубленными или несколько вогнутыми концами. Грамположительны. В организме они располагаются попарно или в виде коротких цепочек. На питательных средах встречаются длинные цепочки. Бациллы сибирской язвы неподвижны. В организме образуют капсулу, окружающую одну, две особи или всю цепочку. Бациллы сибирской язвы образуют споры овальной формы, расположенные в центре и не превышающие поперечника микробной клетки. Спорообразование лучше всего происходит при доступе кислорода и температуре 30-40° С. При температуре выше 43° С и ниже 15° С спорообразование прекращается. В период образования спор цитоплазма клетки почти полностью лизируется, клеточная стенка разрывается и спора выходит наружу (рис. 47).

Рис. 47. Морфологические и культуральные свойства возбудителя сибирской язвы (Bacillus anthracis). а - В. anthracis (в крови мыши); б - образование капсул; в - споры; г - рост колонии; д - рост культуры на МПБ; е - рост культуры на желатине

Культивирование. Возбудители сибирской язвы - факультативные анаэробы. Неприхотливы. Растут при температуре 35-38° С и рН среды 7,2-7,6. На МПА образуют крупные колонии с неровными бахромчатыми краями (R-форма). От края колонии отходят пучки нитей. Вид колоний напоминает голову медузы или львиную гриву. R-форма является характерной для вирулентных штаммов сибиреязвенных бацилл. В старых культурах появляются гладкие S-формы колоний - не вирулентные.

В бульоне рост сибиреязвенных бацилл характеризуется придонным ростом. На дне пробирки образуется осадок в виде комка ваты, при этом среда остается прозрачной.

При посеве на 10-12% желатин после 2-3-дневной инкубации появляется рост по ходу укола в виде белых тяжей, уменьшающихся книзу (вид опрокинутой елочки).

При посеве возбудителей на МПА с пенициллином (на пластинчатом агаре) наблюдается распад бацилл на шары, цепь из которых напоминает жемчужное ожерелье. Характер роста на средах имеет диагностическое значение (см. рис. 47).

Ферментативные свойства. Сибиреязвенные бациллы обладают выраженной ферментативной активностью. Сахаролитические свойства: расщепляют глюкозу, лактозу, мальтозу, левулезу и другие сахара до образования кислоты.

Протеолитические свойства выражаются в пептонизации молока, разжижении желатина, свертывании молока (медленно). Они образуют сероводород и аммиак, переводят нитраты в нитриты, гидролизируют крахмал и т. д. Не гемолизируют эритроциты, чем отличаются от Вантракоида. Лизируются противосибиреязвенным фагом. Сибиреязвенные бациллы образуют ферменты: диастазу, пероксидазу, липазу.

Токсинообразование. В. anthracis образует токсин - протеиновый комплекс, содержащий отечный и летальные факторы. Этот токсин называют "мышиный токсин" (ввиду высокой чувствительности мышей). Большая роль в вирулентности сибиреязвенных бацилл принадлежит капсуле, которая связана с токсическим веществом.

Антигенная структура. Бациллы сибирской язвы содержат два антигена: 1) соматический (полисахаридный), который находится в клеточной стенке микроба. Термоустойчив. Против этого антигена антитела не продуцируются. Этот антиген длительно сохраняется в культурах и трупном материале. На его обнаружении основана реакция преципитации Асколи; 2) капсульный (протеиновый) антиген, обусловливающий антифагоцитарное действие.

Находясь в организме или на средах, содержащих экстракты тканей, бациллы сибирской язвы вырабатывают протективный термолабильный антиген, который является атоксичным, но обладает иммунизирующей способностью.

У сибиреязвенных бацилл имеется общий антиген с антракоидом и другими спорообразующими сапрофитами (В subtilis, B. cereus и др.).

Устойчивость к факторам окружающей среды. Вегетативные формы возбудителей сибирской язвы малоустойчивы. При 100° С они погибают мгновенно, температура 55-60° С губит их через 30-40 мин. Обычные концентрации дезинфицирующих растворов убивают их через несколько минут. Капсулы сибиреязвенных бацилл обладают большой устойчивостью. При исследовании трупов животных, подвергнутых действию гнилостной микрофлоры, можно обнаружить пустые капсулы (тени). Споры устойчивы: они выдерживают кипячение на протяжении 15-20 мин. Автоклавирование (120° С) убивает их через 20 мин. К низким температурам не чувствительны. В сухом состоянии сохраняются до 30 лет, в почве - десятилетия.

Обычные растворы дезинфицирующих веществ губят их через 2-3 сут (табл. 46).

Таблица 46. Свойства возбудителей сибирской язвы

Примечание. B. anthracoides обладают слабой подвижностью, вызывают гемолиз эритроцитов, непатогенны для морских свинок.

Восприимчивость животных. К сибиреязвенным бациллам чувствительны коровы, овцы, лошади, олени, свиньи. Заражаются они друг от друга пищевым путем, поглощая с кормом споры возбудителя.

Из лабораторных животных наиболее восприимчивы белые мыши, морские свинки, кролики. Эти животные после заражения погибают через 2-4 сут от септицемии. На месте введения наблюдаются отек и гиперемия. Кровь у погибших животных густая и темно-красного цвета, так как сибиреязвенные бациллы обладают антикоагулирующим действием.

Источники заболевания. Больные животные.

Пути передачи. Контактно-бытовой, воздушно-пыльевой, пищевой (при использовании продуктов, зараженных бациллами сибирской язвы).

Человек от человека обычно не заражается, тем не менее при заболевании человека сибирской язвой принимаются все необходимые меры предосторожности.

Патогенез. Входными воротами являются кожа и слизистые оболочки дыхательных путей и пищеварительного тракта. В зависимости от локализации различают кожную, легочную и кишечную формы. Каждая форма может генерализоваться.

Кожная форма - в месте проникновения появляется покраснение, переходящее в папулу (зудящую). Папула медно-красного цвета переходит в везикулу с серозно-геморрагическим содержимым, после подсыхания образуется черный струп (углевик).

Легочная форма - развивается специфическая пневмония, протекающая по типу отека легких. Обычно заканчивается летально.

Кишечная форма - все вышеописанные явления развиваются в слизистой кишечника. Обычно заканчивается летально.

Иммунитет. Довольно стойкий, антимикробный и антитоксический. Зависит от образования протективных антител. Большая роль принадлежит фагоцитарной реакции. В сыворотке переболевших сибирской язвой обнаруживаются антитела, разрушающие капсульную субстанцию бацилл.

При сибирской язве развивается гиперчувствительность, регистрируемая в аллергической пробе с антраксином.

Профилактика. Все мероприятия по предупреждению сибирской язвы проводят совместно с ветеринарной службой Они предусматривают своевременное выявление, изоляцию больных животных, тщательную дезинфекцию территории.

Специфическая профилактика. В настоящее время используют вакцину СТИ, которая была изготовлена в 1942 г. Н. Н. Гинсбургом из бескапсульной культуры. Вакцинируют обычно людей, которые по характеру своей работы связаны с сельскохозяйственными животными. Для экстренной профилактики (людям, контактировавшим с больными) вводят противосибиреязвенный иммуноглобулин и антибиотики.

Лечение. Противосибиреязвенный иммуноглобулин, антибиотики: пенициллин, стрептомицин, тетрациклин.

1. Опишите морфологию возбудителя сибирской язвы.

2. Опишите культуральные свойства и какая форма: S или R является вирулентной?

3. Какими свойствами обладает сибиреязвенный токсин?

4. Пути передачи и формы заболевания сибирской язвой.

5. Какие факторы обусловливают иммунитет при сибирской язве.

Цель исследования: выявление возбудителей сибирской язвы и дифференциация его от антракоида, выявление антигенов возбудителя.

Работа с возбудителем сибирской язвы проводится в строго режимных условиях!

1. Содержимое везикул, карбункула, отторгнутый струп (кожная форма).

2. Мокрота (легочная форма).

3. Испражнения (кишечная форма).

4. Кровь (септическая форма).

5. Почва, шерсть животных (для постановки реакции Асколи).

Способы сбора материала

5. Реакция преципитации Асколи.

Первый день исследования

1. Посевы вынимают из термостата. Изучают рост на плотной и жидкой питательной среде. Колонии на плотной питательной среде изучают под микроскопом при малом увеличении. При наличии подозрительных колоний выделяют чистую культуру на скошенный МПА. Посевы инкубируют в термостате.

2. Из бульонной культуры (рост в виде комка ваты на дне, бульон прозрачный) делают висячую каплю (для установления неподвижности - дифференциации от антракойда).

3. Ставят тест "жемчужного ожерелья" (ускоренный метод исследования). С этой целью к бульону Хоттингера добавляют 30% инактивированной лошадиной сыворотки и пенициллин из расчета 0,5 ЕД на 1 мл бульона. Приготовленную среду разливают в пробирки по 2-3 мл и в каждую вносят 2 капли исследуемой бульонной культуры. Посевы инкубируют в термостате 3 ч при температуре 37° С. Затем вынимают их из термостата. Из каждой пробирки делают 2-3 мазка, высушивают на воздухе и фиксируют в жидкости Карнуа (6 частей этилового спирта + 3 части хлороформа + 1 часть ледяной уксусной кислоты). Фиксацию проводят до полного испарения жидкости. Полученные мазки окрашивают метиленовым синим и микроскопируют.

В мазках сибиоеязвенные бациллы обнаруживаются в виде цепи шаров, напоминающих жемчужное ожерелье - результат действия пенициллина.

4. Осматривают зараженных животных. Павших животных вскрывают, делают мазки и мазки-отпечатки, которые фиксируют, окрашивают и изучают под микроскопом. При наличии подозрительных палочек производят посевы на МПА и МПБ.

Вынимают посевы из термостата, делают мазки, микроскопируют. На МПА и МПБ бациллы сибирской язвы растут в виде бескапсульных особей. Производят посев на сахара, лакмусовое молоко, желатин, на чашки с 2% кровью и ставят пробу с сибиреязвенным бактериофагом. Посевы инкубируют в термостате.

Вынимают посевы из термостата и учитывают полученные результаты (см. табл. 46).

Исследование мокроты, испражнений и крови после специальной обработки ведут так же.

Для диагностики сибирской язвы используют аллергическую пробу с сибиреязвенным антигеном (антраксин). Для этого внутрикожно на внутренней поверхности предплечья вводят антраксин. Реакцию учитывают через 24-48 ч. Положительная реакция проявляется с первых дней заболевания.

Реакцию ставят для обнаружения специфического антигена бацилл сибирской язвы в шерсти животных, коже, трупах, почве и т. д.

Приготовление антигена: исследуемый материал измельчают в ступке, заливают 25-50-кратным объемом изотонического раствора натрия хлорида и кипятят (антиген термоустойчив). Полученный экстракт фильтруют через смоченную тем же раствором фильтровальную бумагу. Фильтрат-термоэкстракт - прозрачная жидкость. Для реакции используют преципитирующую сибиреязвенную сыворотку и для контроля сибиреязвенный антиген (рис. 48).

Рис. 48. Реакция Асколи. 1 - преципитирующая сыворотка + исследуемый термоэкстракт; 2 - преципитирующая сыворотка + стандартный сибиреязвенный антиген (контроль); 3 - преципитирующая сыворотка + антиген из шерсти здорового животного (чужеродный антиген); 4 - преципитирующая сыворотка + изотонический раствор хлорида натрия; 5 - нормальная сыворотка + испытуемый антиген

Постановка реакции: 1-я пробирка - преципитирующая сыворотка + исследуемый термоэкстракт;

2-я пробирка - преципитирующая сыворотка + стандартный сибиреязвенный антиген (контроль).

3-я пробирка - преципитирующая сыворотка + термоэкстракт из шерсти здорового животного (контроль).

При положительной реакции в первых двух пробирках образуется преципитационное кольцо, в третьей - кольцо отсутствует.

Реакция эта очень чувствительна (см. рис. 48).

МПА, МПБ, желатиновая среда (см. главу 7).

1. Какой материал используют для бактериологического исследования?

2. Основные методы микробиологического исследования.

3. Какие имеются ускоренные методы исследования? Как получить тест "жемчужного ожерелья?"

4. Каким методом можно выявить сибиреязвенные бациллы во внешней среде?

Нарисуйте схему лабораторного исследования сибирской язвы но дням.

Престижные индивидуалки согласны оттянуться в полный рост с вами предельно пышным отдыхом сексуального характера. Они изящные проститутки будут рады, если вы насвистите им в пустое время и посоветуйте увидеть друг друга.