Методы микробиологической диагностики стрептококков
Рефераты и конспекты лекций по географии, физике, химии, истории, биологии. Универсальная подготовка к ЕГЭ, ГИА, ЗНО и ДПА!
Микробиологическая диагностика стрептококковых заболеваний
Наиболее частыми возбудителями стрептококковых заболеваний являются: S.pyogenes, S. agalactiae, S. bovis, стрептококки
группы C и G, которые входят в семьи Streptococcaceae, рода Streptococcus.
Материалом для исследования навоз, отделяемое из зева и носа, ликвор, мокрота, кровь, моча, содержимое везикул, пустул.
Материал отбирают одноразовым шприцем или стерильным ватным тампоном, который помещают в пробирку с транспортным питательной средой (СКС- среда для контроля стерильности).
Кровь для бактериологического исследования в объеме 5-10 мл засевают в сахарный бульон непосредственно у постели больного таким образом, чтобы соотношение крови и питательной среды было бы не менее 1:10 - 1:20. Срок передачи патологического материала в бактериологическую лабораторию не должен превышать двух часов.
Микробиологическую диагностику стрептококковых заболеваний проводят микроскопическим, бактериологическим и серологическим методами.
Микроскопический метод. Из материала, который исследуется готовят мазок и красят его по Граму. При микроскопии в мазке обнаруживаются грамположительные кокки, которые располагаются короткими цепочками, иногда попарно или в виде единичных кокков. На основе изучения морфологических и тинкториальных свойств невозможно определить род выявленных в препарате микробов.
Для выявления патогенного стрептококка, в полученном от больного клиническом материале, используют реакцию имунофлюоресценциии (РИФ). В этом случае используют специфические сыворотки, в которых антитела против стрептококков замечены флюорохромом (см. Приложение).
Бактериологический метод является основным в диагностике стрептококковых заболеваний. Взят для исследования материал высевают в среду обогащения, в качестве которого используют среду для контроля стерильности (СКС). После инкубации в термостате материал, исследуется пересевают сахарным бульон и на 5% кровяной агар с целью выделения чистой культуры микробов, изучение культуральных свойств и характера его гемолиза. Посевы помещают в эксикатор с плотно притертой крышкой и зажженной внутри свечой, или в анаэростатах, где создают повышенную концентрацию двуокиси углерода. Инкубируют в термостате при температуре 37 ° С в течение 18-24 часов. На сахарном бульоне S. pyogenes дает придонно- пристеночный рост с образованием мелкозернистого осадка и сохранением полной прозрачности среды. S. bovis вызывает интенсивное помутнение бульона с образованием небольшого гомогенного осадка. В изготовленных из бульонной культуры мазках стрептококки располагаются обычно в виде типичных для них длинных цепочек.
На кровяном агаре стрептококки образуют мелкие (1-2 мм в диаметре) прозрачные или полупрозрачные колонии серовато-белого цвета. По типу гемолиза на кровяном агаре стрептококки разделяют на три группы.
Первая группа представлена β-гемолитическими стрептококками, способными вызвать полный лизис эритроцитов (полное просветление среды) вокруг колоний. Колонии прозрачные, слизистые, круглой формы, напоминают капли росы. Это характерно для свижовидилених штаммов S. pyogenes. Блестящие колонии характерны для многих штаммов S.agalactiae.
Вторая группа представлена α-гемолитическими стрептококками, которые вызывают на кровяном агаре неполный гемолиз в виде полупрозрачной зоны зеленоватого оттенка. Зеленящий стрептококки растут в виде мелких колоний серого цвета с гладкой или шероховатой поверхностью. Такой рост характерен для многих видов стрептококков, вегетирующих на слизистой оболочке полости рта (S.salivarius, S. mutans, S.oralis и др.)
Третья группа представлена негемолитическая γ-стрептококками. Они не вызывают изменений кровяного агара в процессе своего роста, имеют слабо выраженную вирулентность.
С подозрительных колоний готовят мазки, окрашивают по Граму и микро- вскапывают. Колонии, выросшие на кровяном агаре, пересевают на скошенный кровяной агар. Посевы инкубируют в термостате при температуре 37 ° С в течение 18-24 часов. С целью проверки чистоты выделенной культуры, с микробного налета, вырос на скошенном агаре готовят мазок, окрашивают по Граму, микроскопируют. В случае, когда культура микробов чистая, продолжают изучать их биохимические и антигенные свойства. Для установления видовой принадлежности стрептококков наибольшее значение имеют следующие тесты: тип гемолиза на кровяном агаре, проба на каталазу, чувствительность к бацитрацину и сульфаниламидов (сульфаметоксазола и триметоприма), желчно-ескулиновий тест, рост в бульоне с 6,5% NaCl, наличие пиролидонилариламидазы (PYR), гидролиз гипурату натрия.
Проба на каталазу. Тест основан на способности микроорганизмов, которые имеют этот фермент, расщеплять перекись водорода с образованием кислорода и воды. Для постановки этого теста чистую культуру помещают в каплю 3-10% раствора перекиси водорода на предметном стекле и растирают круговыми движениями. В положительном случае наблюдают выделение пузырьков газа. В отличие от стафилококков, стрептококки не имеют этого фермента.
Проба с бацитрацином и сульфаниламидами. Для предварительной идентификации S.pyogenes и β-гемолитических стрептококков групп C и G используют два бумажных диска, один из которых пропитан раствором антибиотика бацитрацином, а второй - смесью сульфаметоксазола и триметоприма. Диски помещают на чашку с кровяным агаром, усеянным культурой, которую испытывают и инкубировать 18-24 часа в аэробных условиях. Любая видимая зона задержки роста вокруг дисков интерпретируется как чувствительна к этим антимикробных препаратов. Абсолютное большинство штаммов S. pyogenes чувствительна к бацитрацину, а стрептококки групп С и G - к сульфаниламидов.
Желчно-ескулиновий тест. Используется для предварительной идентификации стрептококков S.bovis, которые растут на желчно-ескулиновому агаре с образованием колоний темно-коричневого или черного цвета.
Рост в бульоне с 6,5% раствором NaCl. S.agalactiae в отличие от других стрептококков устойчив к высокой концентрации хлористого натрия и дает рост в бульоне через 24-48 часа инкубации в термостате при температуре 37 ° С.
PYR - тест. В основе теста лежит выявление фермента пиролидониламидазы, которая у большинства штаммов S. pyogenes и не встречается в других стрептококков. Культуру, которую исследуют, петлей вносят в питательную бульон содержит 0,01% L-пиролидонил-β-нафтиламиду и инкубируют при температуре 37 ° С в течение 4:00. После добавления одной капли диметиламиноациннамальдегида в положительном случае появляется ярко-красную окраску.
Гидролиз гипурату натрия. В основе данного теста лежит способность S. agalactiae вызвать гидролиз гипурату натрия. Выделенную чистую культуру с помощью петли диспергируют в 1% водном растворе гипурату натрия. Через 2:00 инкубации при температуре 37 ° С добавляют 3,5% раствор нингидрина в смеси бутанола и ацетона (1: 1). При положительном результате после инкубации в течение 10 мин. появляется пурпурное окрашивание.
Дифференциация стрептококков по антигенной структуре. Основывается на выявлении полисахаридного антигена клеточной стенки стрептококка. Например применяют реакцию преципитации с группоспецифической сыворотками групп А, В, С, G. Эти сыворотки наливают в 4 узкие преципитацийни пробирки. Экстракт, полученный после обработки центрифугата чистой культуры стрептококка раствором хлористо-водородной кислоты, осторожно, не смещая жидкости, наслаивают на группоспецифические сыворотки. При положительной реакции на границе двух жидкостей появляется белое кольцо. Конечно реакция преципитации возникает через 5-30 мин.
Серологический метод диагностики стрептококковых заболеваний нашел применение в случае установления диагноза ревматизма. Для этого в сыворотке крови больного определяют титр антител к экстрацеллюлярного продуктов стрептококка - стрептолизина-О. Исследуют парные сыворотки больного с интервалом 7-10 дней. Препарат стрептолизина-О, который выпускают в сухом виде, растворяют и вносят в каждую пробирку с разбавленной сывороткой. В день постановки опыта готовят 5% взвесь эритроцитов дефибринированной крови кролика и также вносят в каждую пробирку.
Реакция базируется на нейтрализации способности стрептолизина-О растворять эритроциты in vitro в случае присутствия в сыворотке больного антител против стрептококка (Антистрептолизин-О). Максимально разведенная сыворотка в пробирке обеспечивает задержку гемолиза эритроцитов и указывает на соответствующее количество антистрептолизина-О.
Титр Антистрептолизин-О у практически здоровых лиц не превышает 250 международных единиц. При острых и хронических стрептококковых инфекциях он нарастает, причем при наличии ревматизма или нефрита с первых дней заболевания отмечается очень высокий титр антител (500 ед. И выше).
Микробиологическая диагностика стрептококковыхинфекцийотражена в схеме 2. Выполняются следующие методы исследования.
Бактериоскопический метод– выявление в мазке из гноя патогенных кокков, располагающихся в виде небольших цепочек. Типичное расположение в виде цепочек характерно для чистых культур стрептококка (рис. 2 цветная вкладка).
| Схема 2. Микробиологическая диагностика стрептококковых инфекций | |
| Материал: гной, раневое отделяемое, пунктаты из полостей и абсцессов, кровь, мокрота, моча, ликвор, рвотные массы, испражнения, остатки пищи. | |
| Микроскопический метод. Выявление грамположительных кокков в виде цепочек в мазках из материала от больного. Бактериологический метод. 1. день. Посев материала на чашки кровяным МПА, пробирки или флаконы с сахарным МПБ. 2 день -учет характера роста колоний (на кровяном МПА - зоны гемолиза, в МПБ –равномерное помутнение). В мазке из колоний в окраске по Граму – кокки в виде цепочек. Оставшуюся часть колонии пересевают на скошенный МПА для получения чистой культуры. Пересев с сахарного МПБ на кровяной МПА | 3 день - идентификация выделенной культуры стрептококка, дифференциация основных видов, определение чувствительности к антибиотикам. Выделение чистой культуры с кровяного МПА. 4 день.Заключение о виде стрептококка. Идентификация культуры, выделенной из сахарного МПБ 5 день.Заключение о виде стрептококка, выделенного из сахарного МПБ. Серологический метод Реакция нейтрализации (РН) для определения антистрептолизина-О (гемолизина) и антигиалуронидазы в сыворотке крови больных стрептококковыми инфекциями. |
Бактериологический метод.Исследуемый материал засевают на кровяной МПА в чашках Петри. После выращивания в термостате при 37 0 С в течение суток учитывают характер роста колоний (колонии очень мелкие, величиной с булавочную головку, круглые, мутноватые, матовые). Слизистые колонии типичны для свежевыделенных штаммов, стрептококка, матовые – для вирулентных стрептококков с высоким содержанием М-протеина, блестящие – для невирулентных штаммов. На кровяном МПА стрептококки вызывают α–гемолиз (зеленоватая зона вокруг колоний) или β-гемолиз (полностью прозрачная зона гемолиза). Негемолитические стрептококки обычно непатогенны. Из типичных для стрептококка колоний готовят мазок в окраске по Граму и после микроскопии (Streptococcus pyogenes окрашивается по Граму положительно, располагается в виде цепочек) делают пересев в пробирки с сахарным МПБ и кровяным МПА. На 3 день учитывают характер роста (на сахарном МПБ рост стрептококка в виде придонно-пристеночного осадка, сама среда прозрачна), готовят мазок в окраске по Граму и проводят идентификацию выделенной культуры стрептококка по антигенным свойствам. Серогруппу стрептококков определяют в реакциях преципитации, латекс-агглютинации или коагглютинации с целью выявления группоспецифического полисахаридного антигена А, используя группоспецифические сыворотки (обычно групп A, B, C, F, G). Большинство патогенных для человека стрептококков являются β-гемолитическими и относятся к группе A. Серовар выделенной культуры стрептококка выявляют с помощью реакции агглютинации (выявление типового протеинового антигена М, по которому выделяют около 100 сероваров) с типоспецифическими стрептококковыми сыворотками.
Для идентификации β-гемолитических стрептококков применяют PYR-тест (на пирролидониламидопептидазу), CAMP-тест (на белок синергидного гемолиза), тест Фогес-Проскауэра (на образование ацетоина), чувствительность к бацитрацину (0,04 ЕД на диск), галотолерантность (рост в присутствии 6,5% хлорида натрия), гидролиз гиппурата натрия, ферментацию трегалозы, сорбита и т.д. α -гемолитические стрептококки идентифицируют, используя тесты на чувствительность к желчи, оптохину, на гидролиз эскулина и т.д. (табл. 3).
PYR -mecm. В МПБ, содержащий 0,01 % L-пирролидонил- β –нафтиламин, вносят петлю агаровой культуры стрептококка, инкубируют при 37 0 С в течение 4 ч. Положительная реакция характеризуется появлением ярко-красного окрашивания после внесения 1 капли специального реактива.
Таблица 3 .Дифференциальные признаки стрептококков
| Свойства | Микроорганизмы | |||
| S. pyogenes | S. agalactiae | Стрептококки групп C и G | S. bovis | |
| Вид гемолиза | Β | β, α | β | α , |
| Гидролиз гиппурата натрия | - | + | - | - |
| CAMP-тест | - | + | - | - |
| PYR-тест | + | - | - | - |
| Желчно-эскулиновый тест | - | - | - | + |
| Рост в солевом МПБ | - | + | - | - |
| Чувствительность к бацитрацину | + | - | - | - |
| Чувствительность к сульфаметоксазолу и триметоприму | - | - | + | + |
Обозначения:(+) - постоянный признак, (-) – отсутствие признака
Исследование крови.Для выделения гемокультуры посев обычно производят в сахарный бульон. При наличии стрептококка на дне флакона появляется хлопьевидный придонный осадок, а в мазках обнаруживаются длинные цепочки стрептококков. Для выделения чистой культуры и определения характера гемолиза делают пересев в чашку с кровяным агаром. Через сутки (3-й день исследования) появляются типичные мелкие колонии, окруженные зоной гемолиза. Дальнейший ход исследования аналогичен описанному выше.
Генодиагностика. Разработан метод ДНК-ДНК-гибридизации для обнаружения специфических фрагментов ДНК стрептококка в исследуемом материале, что дает основание поставить предварительный диагноз стрептококковой инфекции.
Серодиагностика(определение антител к гемолизину – стрептолизину-О) проводится при подозрении на ревматизм. Сущность реакции заключается в нейтрализации антителами сыворотки крови больного гемолитической активности стрептококкового стрептолизина-О. Титр антистрептолизина-О у здоровых людей – до 250 АЕStO. При ревматизме с первых дней болезни титр антистрептолизина-О составляет 500 АЕStO и выше.
Таксономия. Стрептококки относятся к отделу Firmicutes, роду Streptococcus. Род состоит из более чем 20 видов, среди которых есть представители нормальной микрофлоры человеческого тела и возбудители тяжелых инфекционных эпидемических болезней человека.
Морфологические и культуральные свойства. Стрептококки — это мелкие шаровидные клетки, располагающиеся цепочками, грамположительные, спор не образуют, неподвижные. Большинство штаммов образует капсулу, состоящую из гиалуроновой кислоты. Клеточная стенка содержит белки (М-, Т- и R-антигены), углеводы (группоспецифические) и пептидогликаны. Легко переходят в L-формы. Возбудители растут на средах, обогащенных углеводами, кровью, сывороткой, асцитической жидкостью. На плотных средах обычно образуют мелкие серые колонии. Капсульные штаммы стрептококков группы А образуют слизистые колонии. На жидких средах стрептококки обычно дают придонный рост. Стрептококки — факультативные анаэробы. По характеру роста на кровяном агаре они делятся на культуральные варианты: а-гемолитические (зеленящие), в-гемолитические (полный гемолиз) и негемолитические.
Резистентность. Чувствительны к физическим и химическим факторам окружающей среды, могут длительно сохранять жизнеспособность при низких температурах. Устойчивость к антибиотикам приобретается медленно.
Патогенность. На основе полисахаридного антигена делятся на серогруппы (А, В, С. О). Стрептококки группы А вырабатывают более 20 веществ, обладающих антигенностью и агрессивностью. На поверхности клетки имеется белковый антиген М, который тесно связан с вирулентностью (препятствует фагоцитозу). Этот белок определяет типовую принадлежность стрептококков. Кофакторам патогенности относят стрептокиназу (фибринолизин), ДНКазу, гиалуронидазу, эритрогенин. Наиболее патогенны для человека гемолитические стрептококки группы А, называемые S. pyogenes. Этот вид вызывает у человека многие болезни: скарлатину, рожу, ангину, острый эндокардит, послеродовой сепсис, хронический тонзиллит, ревматизм.
Иммунитет: постинфекционный нестойкий, ненапряженный.
Микробиологическая диагностика. Материал для исследования – гной, моча, кровь, мокрота.
Бактериологический метод: Исследуемый материал засевают на кровяной агар в чашку Петри. После инкубации при 37 °С в течение 24 ч отмечают характер колоний и наличие вокруг них зон гемолиза. Из части материала, взятого из колоний, готовят мазок, окрашивают по Граму и микроскопируют. Для получения чистой культуры 1—3 подозрительные колонии пересевают в пробирки со скошенным кровяным агаром и сахарным бульоном. На кровяном агаре Streptococcus pyogenes образует мелкие мутноватые круглые колонии. В бульоне стрептококк дает придонно-пристеночный рост в виде хлопьев, оставляя среду прозрачной. По характеру гемолиза на кровяном агаре стрептококки делятся на три группы: 1) негемолитические; 2) а-гемолитиче-ские 3) β-гемолитические, образующие вокруг колонии полностью прозрачную зону гемолиза. Заключительным этапом бактериологического исследования является идентификация выделенной культуры по антигенным свойствам. По данному признаку все стрептококки делят на серологические группы (А, В, С, D и т. д.). Серогруппу определяют в реакции преципитации с полисахаридным преципитиногеном С. Серовар определяют в реакции агглютинации. Выявленную культуру стрептококка проверяют на чувствительность к антибиотикам методом дисков.
Серодиагностика: устанавливают наличие специфических антигенов в крови больного с помощью РСК или реакции преципитации. Антитела к О-стрептолизину определяют для подтверждения диагноза ревматизма.
Лечение: Антибиотики широкого спектра действия (пенициллины, устойчивые к в-лактамазе).При выделении стрептококка А – пенициллин. Химиотерапия антибиотиками, к которым выявлена чувствительность микроба – левомицетин, рифампицин.
Профилактика: специфической – нет. Неспецифическая - выявление, лечение больных; проведение планового обследования медперсонала, вакцинация стрептококковый бактериофаг(жидкий) – фильтрат фаголизата стрептококка. Применятся наружно, внутрикожно, в/м., О-стрептолизин сухой (лиофильно высушенный фильтрат бульонной культуры стрептококка – активного продуцента О-стрептолизина. Применяется для постановки серологических реакций – определения анти-О-стрептолизина в сыворотке крови больных).
Читайте также:
|
