Новости лабораторной диагностики инфекционных заболеваний
Обзор
Данный документ является обновлением предыдущего документа от 2013 г. и позволит помочь врачам в решении какие необходимы микробиологические тесты для диагностики инфекционных заболеваний.
94-страничный документ содержит информацию по сбору, маркировке и транспортировке проб для анализа, а также новые достижения по диагностике, такие как тесты амплификации нуклеиновой кислоты (NAAT), которые способны достаточно быстро и относительно недорого классифицировать инфекционные патогены. Информация представлена в форме таблиц, удобных для поиска нужной информации.
1. Общие вопросы транспортировки проб.
2. Лабораторная диагностика посевов крови по возбудителям.
3. Рекомендуемые объемы крови для посева у детей.
4. Лабораторные методы диагностики инфицированных аневризм и сосудистых трансплантатов.
5. Лабораторная диагностика перикардита и миокардита.
6. Лабораторная диагностика менингита.
7. Лабораторная диагностика энцефалита.
8. Лабораторная диагностика фокальных инфекций паренхимы головного мозга.
9. Лабораторная диагностика инфекций шунтов ЦНС.
10. Лабораторная диагностика субдуральной эмпиемы, эпидурального абсцесса и гнойного интракраниального тромбофлебита.
11. Лабораторная диагностика инфекций около-глазных структур / коньюктивита, орбитальной и периорбитальной флегмоны, лакримальные инфекции и инфекции век.
12. Лабораторная диагностика инфекций около-глазных структур / кератита.
13. Лабораторная диагностика эндофтальмита.
14. Лабораторная диагностика инфекций ротовой полости и прилежащих структур и тканей, вызванных одонтогенной и орофарингеальной флорой.
15. Лабораторная диагностика мастоидита и злокачественного наружного отита, вызванных орофарингеальными и экзогенными патогенами.
16. Лабораторная диагностика среднего отита.
17. Лабораторная диагностика синусита.
18. Лабораторная диагностика фарингита.
19. Лабораторная диагностика бронхиолита, бронхита и коклюша.
20. Лабораторная диагностика внебольничной пневмонии.
21. Лабораторная диагностика внутрибольничной и ИВЛ-ассоциированной пневмоний.
22. Лабораторная диагностика инфекций плевральной полости.
23. Лабораторная диагностика легочных инфекций у пациентов с муковисцидозом.
24. Лабораторная диагностика пневмонии у пациентов с иммунодефицитом.
25. Лабораторная диагностика эзофагита.
26. Лабораторная диагностика гастрита.
27. Лабораторная диагностика гастроэнтерита, инфекционной и токсин-индуцированной диареи.
28. Лабораторная диагностика проктита.
29. Этиологические возбудители при интра-абдоминальных инфекциях.
30. Забор и транспортировка проб при интра-абдоминальных инфекциях.
31. Лабораторная диагностика остеомиелита.
32. Лабораторная диагностика нативной инфекции суставов и бурситов.
33. Лабораторная диагностика инфекций протезированных суставов.
34. Лабораторная диагностика цистита и пиелонефрита.
35. Лабораторная диагностика простатита.
36. Лабораторная диагностика эпидидимита и орхита.
37. Лабораторная диагностика генитальных поражений.
38. Лабораторная диагностика бактериального вагиноза, грибкового вагинита и трихомониаза.
39. Лабораторная диагностика патогенов при цервиците / уретрите.
40. Лабораторная диагностика патогенов при воспалительных заболеваниях органов малого таза и эндометрите.
41. Лабораторная диагностика инфекций ожоговых ран.
42. Лабораторная диагностика ран от укусов человеком.
43. Лабораторная диагностика ран от укусов животных.
44. Лабораторная диагностика кожных инфекций, связанных с травмой.
45. Лабораторная диагностика инфекций операционных ран.
46. Лабораторная диагностика грибковых инфекций кожи и подкожной клетчатки.
47. Лабораторная диагностика клещевых инфекций.
48. Лабораторная диагностика ВИЧ инфекции.
49. Лабораторная диагностика инфекции вируса Эпштейна-Барра.
50. Лабораторная диагностика цитомегаловирусной инфекции.
51. Лабораторная диагностика инфекции вируса варицеллы зостер.
52. Лабораторная диагностика инфекции вируса простого герпеса.
53. Лабораторная диагностика инфекции человеческого герпесвируса Типа 6.
54. Лабораторная диагностика инфекции парвовируса В19.
55. Лабораторная диагностика коревой инфекции.
56. Лабораторная диагностика паротита.
57. Лабораторная диагностика краснухи.
58. Лабораторная диагностика вируса ВК.
59. Лабораторная диагностика инфекции вирусом JC.
60. Лабораторная диагностика инфекции вирусом денге.
61. Лабораторная диагностика гепатита А и Е.
62. Лабораторная диагностика гепатита В и Д.
63. Лабораторная диагностика вируса гепатита С.
64. Лабораторная диагностика энтеровирусной и парэховирусной инфекции.
65. Лабораторная диагностика респираторно-синцитиальной инфекции.
66. Лабораторная диагностика гриппа А и В.
67. Лабораторная диагностика инфекции вируса западного нила и других эндемических арбовирусов.
68. Лабораторная диагностика аденовирусных инфекций.
69. Лабораторная диагностика инекции вирусом бешенства.
70. Лабораторная диагностика инфекции вируса лимфоцитарного хориоменингита.
71. Лабораторная диагностика инфекции вируса Зика.
72. Подход к диагностике паразитарных инфекций крови и тканей.
73. Обобщение лабораторных методов обнаружения бабезиоза и малярии.
[youtube.player]УТВЕРЖДАЮ
Министр здравоохранения Российской Федерации
УТВЕРЖДАЮ
Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
М.А. Мурашко
А.Ю. Попова
Временные методические рекомендации
ПРОФИЛАКТИКА, ДИАГНОСТИКА И ЛЕЧЕНИЕ НОВОЙ КОРОНАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ (2019-nCoV)
Версия 1 (29.01.2020)
Введение
1. Этиология и патогенез…. . 2
2. Эпидемиологическая характеристика…. 4
3. Диагностика коронавирусной инфекции . 6
3.1. Алгоритм обследования пациента с подозрением на новую
коронавирусную инфекцию, вызванную 2019-nCoV…. 6
3.2. Клинические особенности коронавирусной инфекции . 9
3.3. Лабораторная диагностика коронавирусной инфекции . 10
4. Лечение коронавирусной инфекции . 12
4.1. Этиотропная терапия…. 12
4.2. Патогенетическая терапия…. 14
4.3. Симптоматическая терапия . 17
4.4. Особенности клинических проявлений и лечения заболевания у
детей…. 17
4.4.1. Особенности клинических проявлений…. 17
4.4.2. Особенности лечения…. 20
4.5. Терапия неотложных состояний при коронавирусной инфекции…. 24
4.5.1. Интенсивная терапия острой дыхательной недостаточности….
4.5.1.1 Проведение неинвазивной и искусственной вентиляции легких….
4.5.1.2 Проведение экстракорпоральной мембранной оксигенации….
4.5.2. Лечение пациентов с септическим шоком…. 26
5. Профилактика коронавирусной инфекции…. 27
5.1. Специфическая профилактика коронавирусной инфекции…. 27
5.2. Неспецифическая профилактика коронавирусной инфекции…. 28
5.3. Медикаментозная профилактика коронавирусной инфекции…. 30
6. Маршрутизация пациентов и особенности эвакуационных мероприятий больных или лиц с подозрением на новую коронавирусную инфекцию, вызванную 2019-nCoV…. 30
6.1. Маршрутизация пациентов и лиц с подозрением на новую коронавирусную инфекцию, вызванную 2019-nCoV…. 30
6.2. Особенности эвакуационных мероприятий больных или лиц с подозрением на новой коронавирусную инфекцию, вызванную 2019— nCoV, и общие принципы госпитализации больного, подозрительного на заболевание коронавирусной инфекцией . 34
Приложение 1-4. 44
1
ВВЕДЕНИЕ
Появление в декабре 2019 г. заболеваний, вызванных новым коронавирусом (2019-nCoV), поставило перед специалистами в области охраны здравоохранения и врачами трудные задачи, связанные с быстрой диагностикой и клиническим ведением больных c этой инфекцией. В настоящее время сведения об эпидемиологии, клинических особенностях, профилактике и лечении этого заболевания ограничены. Известно, что наиболее распространенным клиническим проявлением нового варианта коронавирусной инфекции является пневмония, у значительного числа пациентов зарегистрировано развитие острого респираторного дистресс— синдрома (ОРДС).
Рекомендации, представленные в документе, в значительной степени базируются на фактических данных, опубликованных специалистами ВОЗ, китайского и американского центра по контролю за заболеваемостью, а также Европейского Центра по контролю за заболеваемостью в материалах по лечению и профилактике этой инфекции.
Методические рекомендации предназначены для врачей лечебно— профилактических учреждений инфекционного профиля, а также врачей— реаниматологов отделений интенсивной терапии инфекционного стационара.
1. ЭТИОЛОГИЯ И ПАТОГЕНЕЗ
Коронавирусы (Coronaviridae) – это большое семейство РНК— содержащих вирусов, способных инфицировать человека и некоторых животных. У людей коронавирусы могут вызвать целый ряд заболеваний – от легких форм острой респираторной инфекции до тяжелого острого респираторного синдрома (ТОРС). В настоящее время известно о циркуляции среди населения четырех коронавирусов (HCoV-229E, -OC43, -NL63 и —
HKU1), которые круглогодично присутствуют в структуре ОРВИ, и, как правило, вызывают поражение верхних дыхательных путей легкой и средней тяжести.
По результатам серологического и филогенетического анализа коронавирусы разделяются на три рода: Alphacoronavirus, Betacoronavirus и Gammacoronavirus. Естественными хозяевами большинства из известных в настоящее время коронавирусов являются млекопитающие.
До 2002 года коронавирусы рассматривались в качестве агентов, вызывающих нетяжелые заболевания верхних дыхательных путей (с крайне редкими летальными исходами). В конце 2002 года появился коронавирус (SARS-CoV), возбудитель атипичной пневмонии, который вызывал ТОРС у людей. Данный вирус относится к роду Betacoronavirus. Природным резервуаром SARS-CoV служат летучие мыши, промежуточные хозяева – верблюды и гималайские циветты. Всего за период эпидемии в 37 странах по миру зарегистрировано более 8000 случаев, из них 774 со смертельным исходом. С 2004 года новых случаев атипичной пневмонии, вызванной SARS-CoV, не зарегистрировано.
В 2012 году мир столкнулся с новым коронавирусом MERS (MERS— CoV), возбудителем ближневосточного респираторного синдрома, также принадлежащему к роду Betacoronavirus. Основным природным резервуаром коронавирусов MERS-CoV являются верблюды. С 2012 года зарегистрировано 2494 случая коронавирусной инфекции, вызванной вирусом MERS-CoV, из которых 858 закончились летальным исходом. Все случаи заболевания географически ассоциированы с Аравийским полуостровом (82% случаев зарегистрированы в Саудовской Аравии). В настоящий момент MERS-CoV продолжает циркулировать и вызывать новые случаи заболевания.
Новый коронавирус 2019-nCoV (временное название, присвоенное Всемирной организацией здравоохранения 12 января 2020 года) представляет собой одноцепочечный РНК-содержащий вирус, относится к семейству Coronaviridae, относится к линии Beta-CoV B. Вирус отнесен ко II группе патогенности, как и некоторые другие представители этого семейства (вирус SARS-CoV, MERS-CoV).
Коронавирус 2019-nCoV предположительно является рекомбинантным вирусом между коронавирусом летучих мышей и неизвестным по происхождению коронавирусом. Генетическая последовательность 2019— nCoV сходна с последовательностью SARS-CoV по меньшей мере на 70%.
Патогенез новой коронавирусной инфекции изучен недостаточно. Данные о длительности и напряженности иммунитета в отношении 2019— nCoV в настоящее время отсутствуют. Иммунитет при инфекциях, вызванных другими представителями семейства коронавирусов, не стойкий и возможно повторное заражение.
2. ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА
Пути передачи инфекции: воздушно-капельный (при кашле, чихании, разговоре), воздушно-пылевой и контактный. Факторы передачи: воздух, пищевые продукты и предметы обихода, контаминированные 2019-nCoV.
Установлена роль инфекции, вызванной2019-nCoV, как инфекции, связанной с оказанием медицинской помощи. По состоянию на 23.01.2020 в одной из больниц г. Ухань выявлено 15 подтвержденных случаев заболевания среди врачей, контактировавших с больными 2019-nCoV.
Стандартное определение случая заболевания новой коронавирусной инфекции 2019-nCoV
Подозрительный на инфекцию, вызванную 2019-nCoV, случай:
— наличие клинических проявлений острой респираторной инфекции, бронхита, пневмонии в сочетании со следующими данными эпидемиологического анамнеза:
— посещение за последние 14 дней до появления симптомов эпидемиологически неблагополучных по 2019-nCoV стран и регионов (главным образом г. Ухань, Китай);
— наличие тесных контактов за последние 14 дней с лицами, находящимися под наблюдением по инфекции, вызванной новым коронавирусом2019-nCoV, которые в последующем заболели;
— наличие тесных контактов за последние 14 дней с лицами, у которых лабораторно подтвержден диагноз 2019-nCoV.
Вероятный случай инфекции, вызванной 2019-nCoV:
— наличие клинических проявлений тяжелой пневмонии, ОРДС, сепсиса в сочетании с данными эпидемиологического анамнеза (см. выше).
Подтвержденный случай инфекции, вызванной 2019-nCoV:
1.Наличие клинических проявлений острой респираторной инфекции, бронхита, пневмонии в сочетании с данными эпидемиологического анамнеза (см. выше).
2. Положительные результаты лабораторных тестов на наличие РНК 2019-nCoV методом ПЦР.
3. ДИАГНОСТИКА КОРОНАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ
3.1. АЛГОРИТМ ОБСЛЕДОВАНИЯ ПАЦИЕНТА С ПОДОЗРЕНИЕМ НА НОВУЮ КОРОНАВИРУСНУЮ ИНФЕКЦИЮ, ВЫЗВАННУЮ 2019-NCOV
Диагноз устанавливается на основании клинического обследования,
данных эпидемиологических анамнеза и результатов лабораторных исследований.
1. Подробная оценка всех жалоб, анамнеза заболевания,
эпидемиологического анамнеза. При сборе эпидемиологического анамнеза обращается внимание на посещение в течение 14 дней до первых симптомов, эпидемически неблагополучных по 2019-nCoV стран и регионов (в первую очередь г. Ухань, Китай), наличие тесных контактов за последние 14 дней с лицами, подозрительными на инфицирование2019-nCoV, или лицами, у которых диагноз подтвержден лабораторно.
2. Физикальное обследование, обязательно включающее:
— оценку видимых слизистых оболочек верхних дыхательных путей,
— аускультацию и перкуссию легких,
— пальпацию лимфатических узлов,
— исследование органов брюшной полости с определением размеров печени и селезенки,
— термометрию,
с установлением степени тяжести состояния больного.
3. Лабораторная диагностика общая:
-выполнение общего (клинического) анализа крови с определением уровня эритроцитов, гематокрита, лейкоцитов, тромбоцитов, лейкоцитарной формулы;
-биохимический анализ крови (мочевина, креатинин, электролиты, печеночные ферменты, билирубин, глюкоза, альбумин). Биохимический анализ крови не дает какой-либо специфической информации, но обнаруживаемые отклонения могут указывать на наличие органной дисфункции, декомпенсацию сопутствующих заболеваний и развитие осложнений, имеют определенное прогностическое значение, оказывают влияние на выбор лекарственных средств и/или режим их дозирования;
-исследование уровня С-реактивного белка (СРБ) в сыворотке крови. Уровень СРБ коррелирует с тяжестью течения, распространенностью воспалительной инфильтрации и прогнозом при пневмонии;
— пульсоксиметрия с измерением SpO2 для выявления дыхательной недостаточности и оценки выраженности гипоксемии. Пульсоксиметрия является простым и надежным скрининговым методом, позволяющим выявлять пациентов с гипоксемией, нуждающихся в респираторной поддержке и оценивать ее эффективность;
— пациентам с признаками острой дыхательной недостаточности (ОДН) (SрO2 менее 90% по данным пульсоксиметрии) рекомендуется исследование газов артериальной крови с определением PaO2, PaCO2, pH, бикарбонатов, лактата;
— пациентам с признаками ОДН рекомендуется выполнение коагулограммы с определением протромбинового времени, международного нормализованного отношения и активированного частичного тромбопластинового времени.
4. Лабораторная диагностика специфическая:
4. ЛЕЧЕНИЕ КОРОНАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ
[youtube.player]Инфекционные заболевания человека представляют собой группу болезней, вызываемых специфическими болезнетворными возбудителями, которые могут передаваться от зараженного человека здоровому. Для каждой инфекции характерен свой возбудитель и определенный путь передачи. Возбудителями инфекций могут быть бактерии, вирусы, риккетсии (микроорганизмы, сочетающие в себе особенности бактерий и вирусов), спирохеты, грибки, протозойные (паразитирующие простейшие, одноклеточные), глисты, которые выводятся из организма больного человека или животного при выдохе, мочеиспускании, дефекации, кашле, рвоте, и когда при определенных условиях этот биологический патологический материал становится источником заражения здорового человека. Известны инфекционные болезни, вызываемые, так называемыми арбовирусами – вирусами, передающимися людям через укусы насекомых: например клещей, комаров, блох и др. Согласно литературным данным в настоящее время известно 1415 возбудителей инфекционных и паразитарных болезней. Наиболее обширную группу составляют болезни, вызываемые бактериями и риккетсиями (538 нозологий). Второе место принадлежит паразитарным болезням - 353 нозологии. Вирусные инфекции составляют 217 нозологий. Постоянно возникают новые или впервые выявленные инфекционные заболевания. Так, начиная, с 1970-х годов ежегодно регистрируется, по крайней мере, одно инфекционное заболевание. За последние годы стали известны более 30 инфекционных заболевании, это и ВИЧ, легионеллез, эпидемический ротавирусный гастроэнтерит и ряд африканских лихорадок (например лихорадка Эбола).
Инфекционные заболевания вызывают у пациента значительные изменения в картине крови. При многих инфекционных болезнях изменяется функция различных внутренних органов – печени, сердца, легких, мозга, почек, кишечника. Практически все инфекционные заболевания протекают с изменениями широкого спектра биохимических параметров, отражающих различные стороны патогенеза. Установлено также, что, к примеру, вирусы краснухи, герпеса, коксаки, полиомиелита, цитомегаловирус и эховирусы (род энтеровирусов) могут вызывать серьезные нарушения в развитии плода и новорожденного.
Диагноз инфекционного заболевания основывается на анамнезе больного, эпидемиологическом анамнезе, включает инструментальные методы обследования и, как правило, диагностика инфекционных заболеваний не обходится без использования комплекса лабораторных методов.
Диагностика инфекционного заболевания начинается с базовых лабораторных методов исследования. Это:
1. клинический анализ крови;
2. общий анализ мочи является лабораторным тестом, который часто используется при исследования инфекционных заболеваний не только почек, но и инфекций другой локализации. Так некоторые инфекционные заболевания сопровождаются протеинурией нефротического типа (количество белка в моче не менее 3г/л). Например хронические инфекционные заболевания могут стать причиной нефротического синдрома. Развитие протеинурии нефротического типа могут вызвать, например, бактериальный эндокардит, туберкулез, сифилис, лепра, гепатит В и С, мононуклеоз, цитомегаловирусная инфекция, ветряная оспа, малярия, токсоплазмоз, шистосомиаз. Появление в моче бактерий и возникновение воспаления указывает на наличие инфекционного заболевания мочеполовой системы.
3. Достаточно эффективным при инфекционных заболеваниях является использование комплекса биохимических тестов, поскольку количественные и качественные изменения биохимических показателей в крови, происходящие во время болезни, отражают происходящие при заболевании биохимические нарушения и позволяют следить за динамикой патологического процесса и адекватностью лечения. К таким эффективным биохимическим параметрам, относится – спектр белков сыворотки крови (белки острой фазы), ферменты и некоторые другие биохимические показатели.
Также, в арсенале специалистов в настоящее время есть новейшие, появившиеся в последние десятилетия и нашедшие широкое применение в практике, разнообразные методы лабораторной диагностики.
Клиническая лабораторная диагностика является наиболее динамично развивающейся отраслью медицины, активно внедряющей и использующей современные научные достижения. Для оценки морфофункционального состояния отдельных органов и систем, диагностики многих болезней используют сотни различных лабораторно-клинических показателей (тестов). Глубина познания физиологических и патологических процессов, диагностическая значимость и надежность исследований зависят от правильности подбора лабораторно-клинических показателей.
В диагностике инфекционных болезней используют многочисленные лабораторно-инструментальные методы, среди которых важнейшее место занимают специфические методы (бактериологический, вирусологический, паразитологический, серологический), имеющие целью установление этиологического (нозологического) диагноза.
Материал для специфических методов исследования в зависимости от характера, формы и периода болезни может быть самым разнообразным: кровь, цереброспинальная жидкость, мокрота, фекалии, моча, дуоденальное содержимое, пунктаты и биоптаты органов, рвотные массы, отделяемое язв, смывы со слизистых оболочек, трупный материал.
Паразитологическое обследование основано на микроскопии толстой капли и мазков крови (при малярии), мазков крови и пунктатов лимфатических узлов (при трипаносомозе, токсоплазмозе), кала (при амебиазе, балантидиазе), испражнений и дуоденального содержимого (при лямблиозе).
Бактериологическое исследование включает посев материала, взятого у больного на питательные среды, выделение чистой культуры возбудителя и его идентификацию. Определение типовой принадлежности микроба-возбудителя имеет эпидемиологическое значение при выявлении источника инфекции.
Вирусологическая диагностика по сравнению с бактериологической более сложна и трудоемка, что связано с особенностями биологии вирусов. Среди них наиболее важной является облигатный внутриклеточный паразитизм вирусов, что и накладывает отпечаток на методы их выделения с использование тканевых культур или куриных эмбрионов.
Иммунологические методы применяются для определения неизвестных антигенов (АГ) с помощью известных антител (АТ), содержащихся в иммунных диагностических сыворотках, а также для серологической диагностики—определения неизвестных АТ с помощью известного АГ-диагностикума. В настоящее время существует множество методик, в основе которых лежат указанные принципы. К наиболее известным и широко распространенным иммунологическим методам относятся:
- Реакция агглютинации (РА)
- Реакция непрямой (пассивной) агглютинации (РНГА/РИГА)
- Реакция преципитации (РП)
- Реакция иммуноэлектрофореза (РИЭФ)
- Реакция связывания комплемента (РСК)
- Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)
- Иммуноферментный анализ (ИФА)
Указанные методы давно применяются для диагностики инфекционных заболеваний и прочно вошли в медицинскую практику. В настоящее время на базе этих, уже ставших классическими, методов разработаны современные методики, такие как латекс-агглютинация, иммунохроматографические тесты, позволяющие быстро получать результаты. Достижением последнего десятилетия стало создание различных приборов, обеспечивающих автоматизацию процессов выполнения и анализа результатов исследований.
- Латекс-агглютинация (РЛА) – агглютинация антителами частиц латекса, на поверхности которых адсорбирован антиген или гаптен. Для постановки РЛА применяют сенсибилизированные частицы полистирольного латекса, которые в присутствии гомологичного реагента склеиваются. Обычно эта реакция проходит очень быстро (3-8 минут), что позволяет применить ее в качестве экспресс-метода для выявления антигенов и антител. Преимущество РЛА в том, что частицы латекса в отличие от эритроцитов не имеют перекрестно реагирующих антигенов, поэтому она специфичнее РНГА.
- Иммунохроматографический анализ (ИХА) – метод определения наличия определенных концентраций вещества в биологических материалах (моча, цельная кровь, сыворотка или плазма крови, слюна, кал и т.д.). Данный вид анализа осуществляется при помощи индикаторных полосок, палочек, панелей или тест-кассет, которые обеспечивают быстроту проведения тестирования. ИХА – сравнительно молодой метод анализа, он часто обозначается в литературе также как метод сухой иммунохимии, стрип-тест, QuikStrip cassette, QuikStrip dipstick, экспресс-тест или экспресс-анализ. Эти названия связаны с быстротой проведения теста.
- Иммунофлюоресцентная диагностика, основанная на специфическом свечении комплекса антиген-антитело, позволяет получить ответ через несколько минут после обработки препарата из первичного материала специфической флюоресцирующей сывороткой.
- Масс-спектрометрия (MALDI-TOF MS) – спектральный метод изучения целых бактериальных клеток и их основных компонентов, основанный на измерении массы молекул или атомов, позволяющий проводить как прямое белковое профилирование для видовой идентификации микроорганизмов, так и обнаружение генетических маркеров лекарственной устойчивости. Преимуществами данного метода является высокая скорость видовой идентификации микроорганизмов (2-5 мин.), возможность автоматизации и роботизации всех стадий исследования, а также высокая специфичность.
Все более востребованными становятся молекулярно-генетические методы, такие как полимеразная цепная реакция (ПЦР) и, на основе него, анализ эволюционно-консервативных генов, фрагментация генома и анализ спектра фрагментов, гибридизация на микрочипах, геномная гибридизация, геномная амплификация и секвенирование/пиросеквенирование.
В основе метода ПЦР лежит комплементарное достраивание ДНК матрицы, осуществляемое in vitro с помощью фрагмента ДНК-полимеразы. Эта реакция носит название репликации ДНК. Преимущества метода ПЦР как метода диагностики инфекционных заболеваний – это прямое определение наличия возбудителей. Многие традиционные методы диагностики, например иммуноферментный анализ, выявляют белки-маркеры, являющиеся продуктами жизнедеятельности инфекционных агентов, что дает лишь опосредованное свидетельство наличия инфекции. Выявление специфического участка ДНК возбудителя методом ПЦР дает прямое указание на присутствие возбудителя инфекции. Применение ПЦР-диагностики также очень эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов. Следует отметить, что методом ПЦР возможно выявление возбудителей не только в клиническом материале, полученном от больного, но и в материале, получаемом из объектов внешней среды (вода, почва и т.д.).
Таким образом, современная лабораторная диагностика инфекционных болезней обладает широким спектром разнообразных методов и способов исследований, сочетание которых позволяет оперативно решать поставленные задачи, доступных для использования в рутинной практике.
Значение диагностики, как процесса распознавания болезней, состоит в том, что ранний, точный, исчерпывающий и максимально конкретный диагноз является основой для проведения рациональной и эффективной терапии, позволяет в большинстве случаев предсказать возможные варианты дальнейшего течения и исходов заболевания, а в инфекционной патологии служит еще и исходным моментом в проведении своевременных и направленных противоэпидемических и профилактических мероприятий.
[youtube.player]То, что этиологическая диагностика инфекционных заболеваний человека является важным сегментом лабораторной медицины, определяется не только тем, что она осуществляется медицинскими лабораториями. Очевидность такого положения постоянно подтверждается все новыми фактами. В последние десятилетия мы все чаще лечим больных различными инфекционными заболеваниями не в инфекционных стационарах.
При соблюдении необходимого режима в таких стационарах лечат, например, больных инфекционными заболеваниями, возбудитель которых не передается от больного человека здоровому или пациенту с другими заболеваниями, что требует выполнения анализов для определения возбудителя.
В организационном плане реальность такова, что в терапевтических стационарах лечат даже больных с вирусными и бактериальными пневмониями, возбудители которых передаются контактным воздушно-капельным путем. В таких случаях неинфекционные стационары также должны заниматься этиологической диагностикой инфекционной патологии.
Международная классификация болезней, действующая до сегодняшнего дня, разделяет соматические, онкологические и инфекционные заболевания, хотя для все большего числа заболеваний, по классификации не отнесенных к инфекционным, уже установлены инфекционные агенты. Теперь известно, что возбудителем рака язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки является Helicobacter pylori, причиной гепатокарциномы – вирусы парентеральных гепатитов человека, для рака шейки матки практически в 100% случаев установлена этиологическая роль вирусов папилломы человека.
Каковы успехи и проблемы лабораторной диагностики инфекционных болезней?
Все больше осознается важность методологии в этиологической диагностике инфекций. В этом аспекте необходимо разделять принципы и технологии такой диагностики. Принципиально различные диагностические лабораторные подходы, известные сегодня, разнообразны: микро- и макроскопия биопроб для визуального опознания возбудителя, выделение потенциального возбудителя из биопроб с последующим определением его таксономически значимых характеристик; определение в биопробах фрагментов возбудителя (специфические для возбудителя фрагменты ДНК, РНК, таксономически значимые антигены и, возможно, ферменты и т.д.), определение физических характеристик возбудителя – обычно инфракрасный спектр; определение сопутствующих возбудителю других организмов (фаги), определение антигенспецифического (адаптивного) иммунного ответа человека на предполагаемый возбудитель (антитела, лимфоциты с рецепторами к таксономически значимому антигену).
Для большинства этих принципов разработано и применяется много технологий. При использовании методов выделения возбудителя используют различные среды для культивирования, что определяется особенностями потенциального возбудителя. Для определения фрагментов возбудителя применяют различные технологии ПЦР, различные серологические реакции (преципитации, многие варианты агглютинации, ИФА и др.) с использованием поли- или моноклональных сывороток и их применением в виде растворов или сорбированных препаратов, различные субстраты для соответствующих ферментов.
Для диагностики по адаптивному клеточному или гуморальному иммунному ответу применяют разнообразные серологические технологии с использованием таксономически значимых антигенов возбудителя в виде растворимых или чаще сорбированных иммунореагентов (агглютинационные тесты, ELISA (ИФА), ELISPOT и др.). Полностью осознана необходимость этапного принципа лабораторной диагностики, особенно при проведении скрининговых исследований. Арсенал принципов и технологий диагностики постоянно расширяется, разрабатываются новые приборы для автоматизации выполнения анализов и объективизации получаемых результатов, что уже обеспечило значительные успехи в диагностике инфекционных заболеваний.
Однако в сфере этиологической диагностики инфекционной патологии существуют и значительные проблемы. К основным из них нужно отнести: сложности дифференциации клинически выраженного заболевания и, так называемого, здорового носительства при исследовании ряда биопроб; необходимость дифференциального диагноза между инфекциями, вызванными возбудителями со сходными антигенами, особенно при сходной клинической симптоматике и использовании серологических тестов на антигены и антитела; сложности надежной иммунологической диагностики при беременности (особенно при использовании агглютинацинных тестов и РСК), отсутствие стандартных методов ранней этиологической диагностики. Серьезной проблемой остается отсутствие тесной связи клиники и лаборатории при разработке плана лабораторного обследования и интерпретации полученных лабораторных результатов.
Эти нерешенные проблемы снижают эффективность диагностики и, соответственно, качество лечения, а также точность и своевременность принятия противоэпидемических мер предупреждения распространения заболевания.
Необходимость дифференциации клинически выраженного заболевания и здорового носительства важна при принятии решения о лечении обследуемого. Однако, это затруднительно при выделении возбудителя ряда инфекций из фекалий (возбудители брюшного тифа, паратифов и др.), из зева (возбудители дифтерии, стафилококки, стрептококки) или из влагалища (возбудители ряда инфекций, передающихся половым путем) и т.п. Не всегда помогает даже оценка наличия или отсутствия клинической симптоматики, так как нередко заболевание протекает в стертой форме. Положительный результат ПЦР, полученный в мазках из влагалища, также не позволяет дифференцировать клинически выраженное заболевание и носительство некоторых возбудителей, передающихся половым путем.
Индикация антигенов потенциального возбудителя в фекалиях и даже в моче может быть результатом не текущей инфекции, а наступившего после нее реконвалесцентного периода и длится значительно дольше, чем принято считать для периода клинической реконвалесценции, что является результатом длительного периода элиминации антигенавозбудителя после перенесенной инфекции. Даже фрагменты ДНК возбудителя, определяемые методом ПЦР в мазках из влагалища, могут определяться дольше, чем наступает выздоровление от инфекции, передающейся половым путем.
Надежность дифференциальной диагностики инфекций, вызванных возбудителями с близкими по специфичности антигенами, видимо, можно преодолеть, если разработать для определения антител иммунодиагностические сорбированные препараты из рекомбинантных пептидов, специфичных только для одного из возбудителей.
Для определения антигенов с целью указанной дифференциации нужно разработать иммунные сыворотки против соответствующих рекомбинантных пептидов узкой таксономической специфичности или использовать специально выбранные гибридомы для получения соответствующих моноклональных сывороток. В том и другом случае такие препараты антител для агглютинацинных тестов или ИФА нужно сорбировать на носителе.
Для использования ПЦР с аналогичной целью при разработке диагностических тест-систем нужно подбирать праймеры, специфичные только для одного из возбудителей таких инфекций.
Диагностика этиологии инфекционного заболевания по регистрации иммунного антигенспецифического ответа на возбудитель только на первый взгляд кажется безукоризненным подходом. Для своевременного назначения адекватной этиотерапии результаты тестов на антитела всегда запаздывают: наиболее специфичные антитела, oсобенно IgG изотипа, появляются сравнительно поздно, тем более, что для надежной диагностики сыворотку предпочтительно исследовать в динамике – надежность диагноза по оценке нарастания активности антител у больного в течение заболевания существенно выше, чем при однократном выявлении условного диагностического уровня активности.
В результате запаздывания лабораторного результата на практике врач назначает лечение, ориентируясь в основном на клиническую симптоматику, в лучшем случае, с учетом эпидемиологических данных. Поэтому, а также потому, что результаты культуральных тестов тоже запаздывают, врачи вынуждены назначать пациенту антимикробные препараты широкого спектра действия, что ускоряет распространение в популяции резистентных штаммов и снижает в дальнейшем эффективность этиотропной терапии.
Обойти многие из отмеченных выше трудностей можно, используя некоторые, уже хорошо известные факты, и разрабатывая методы надежной ранней диагностики инфекционных заболеваний.
Специалисты знают, что надежность диагноза зависит от характера анализируемой биопробы. Например, если возбудитель брюшного тифа, паратифов выделен из фекалий (копрокультура), это не всегда клинически выраженная инфекция. Тот же результат может быть получен при обследовании носителя. Если возбудитель выделен из крови (гемокультура), это клинически выраженная инфекция. Если Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis или Haemophilus influenzae выделены из крови или ликвора, нужно диагностировать менингит соответствующей этиологии. Но выделение подобных возбудителей из зева может быть как при клинически выраженной инфекции, так и носительства.
Высокая доказательность выделения гемокультур для постановки надежного диагноза известна, но в практических лабораториях выделяют их не часто. Для повышения частоты выделения кровь у пациента нужно брать в начале острого заболевания, то есть при первой встрече с медработником и использовать для посева различные культуральные среды с учетом особенностей потенциальных возбудителей.
Методы ранней надежной диагностики по регистрации иммунного ответа должны быть направлены на использование технологий выявления лимфоцитов со специфическими рецепторами к потенциальному возбудителю. Это обусловлено тем, что эффекторный (антигенспецифический) ответ на антиген возбудителя начинается с формирования клеток со специфическими рецепторами к антигену. Необходимо широко изучать диагностические возможности обнаружения лимфоцитов с рецепторами для антигена как принципа ранней диагностики различных инфекционных заболеваний.
С этой целью в течение ряда лет в эксперименте и в клинике мы использовали принцип взаимодействия лимфоцитов с иммунореагентом (носитель, на котором сорбирован таксономически значимый антиген соответствующего возбудителя). Если лимфоцит имеет специфические рецепторы к антигену возбудителя (антигенсвязываюший лимфоцит – АСЛ), он связывает такой иммунореагент. АСЛ появляются раньше развития эффекторной фазы иммунного антигенспецифического ответа (антитела) и исчезают намного раньше исчезновения антител. Таким образом, выявление АСЛ является индикатором острого заболевания или обострения хронической инфекции. В таблице 1 приведен перечень инфекций, при которых в эксперименте и клинике изучена диагностическая эффективность такого теста для ранней диагностики.
Специфичность теста АСЛ доказана не только во многих экспериментах по отмене положительного результата гомо- и гетерологичными антигенами, но и при обследовании больных, в том числе по сопоставлению частоты выявления АСЛ при наличии/отсутствии определенных, но не строго патогномоничных клинических симптомов.
Чувствительность метода АСЛ при диагностике различных инфекций выше чувствительности обычных серологических реакций. Это показано при бруцеллезе и других инфекционных заболеваниях.
При обследовании больных сифилисом обнаружено, что тест АСЛ обеспечивает, в отличие от реакций агглютинации (микрореакция), реакций связывания комплемента и даже РИФ, получение строго специфических результатов. Это обеспечивает надежную дифференциацию положительных и биологических ложноположительных результатов.
Возможность подобной дифференциации имеет важное значение для интерпретации результатов иммунодиагностического обследовании беременных не только на сифилис, но и на другие инфекции, например, бруцеллез (таблица 3) и определения на этой основе тактики ведения беременности.
Таким образом, выявление АСЛ важно для ранней этиологической диагностики инфекционных заболеваний, повышения специфичности этиологического диагноза и контроля эффективности лечения. Необходимо разрабатывать технологии определения АСЛ, доступные для практических лабораторий.
Из-за весьма вариантного течения инфекций (от здорового носительства до тяжелых форм клинически выраженной инфекции и ее хронизации), из-за многих факторов, значимых для каждого диагностического принципа и технологии получения диагностических реагентов (специфичность результата, чувствительность теста; зависимость результата от состояния обследованного, стадии заболевания и характера анализируемой биопробы; характеристика применяемых методов и препаратов при наличии точной информации в инструкции по применению; существование возбудителей различных заболеваний, но со сходными антигенами и т.д.) интерпретация лабораторных результатов во многих случаях и сегодня является непростой задачей. Чаще всего этим занимается врач-клиницист, сопоставляя лабораторные результаты с клинической характеристикой пациента. Но его компетенции часто недостаточно для точной интерпретации комплекса лабораторных данных.
Подготовка всех клиницистов, даже инфекционистов, для такой работы, как показывает опыт, вряд ли реальна. С нашей точки зрения, решить подобную задачу более реально, готовя врачей - клинических лаборантов широкого профиля. Это потребует серьезных организационных усилий для введения такой специальности и, что не менее обязательно, больших усилий для обеспечения качественной многопрофильной подготовки таких специалистов. Работа этих специалистов в многопрофильных медицинских учреждениях могла бы обеспечить более качественное планирование (совместно с клиницистом) лабораторного обследования и более точную интерпретацию комплекса лабораторных результатов.
Есть еще один важный организационный вопрос. Преподавание микробиологии и вирусологии на всех факультетах ведется в, основном, одинаково. Но будущим врачам лечебных профилей не обязательно знать детали технологии анализов, хотя совершенно необходимо быть хорошо информированными об особенностях микроорганизмов и принципах диагностических методов, их возможностях и ограничениях. Вводить такой материал на первых курсах, до подготовки на клинических кафедрах нецелесообразно. Сегодня есть понимание важности таких дисциплин как, например, клиническая фармакология, клиническая биохимия и т.д.
Поэтому в заключительные годы вузовской подготовки врачей-клиницистов было бы важно выделять время для преподавания основ клинической лабораторной диагностики. Вместе со штатным врачом клиническим лаборантом они обеспечили бы более надежное планирование лабораторного обследования пациента и интерпретацию комплекса лабораторных данных, что, в конечном счете, неизбежно должно привести к повышению качества лечения больных, а в случаях инфекционной патологии – и к обеспечению своевременного принятия противоэпидемических мер.
[youtube.player]Читайте также:
