Лабораторная диагностика кокковых инфекций

Микробиологическая диагностика стрептококковыхинфекцийотражена в схеме 2. Выполняются следующие методы исследования.

Бактериоскопический метод– выявление в мазке из гноя патогенных кокков, располагающихся в виде небольших цепочек. Типичное расположение в виде цепочек характерно для чистых культур стрептококка (рис. 2 цветная вкладка).

Схема 2. Микробиологическая диагностика стрептококковых инфекций
Материал: гной, раневое отделяемое, пунктаты из полостей и абсцессов, кровь, мокрота, моча, ликвор, рвотные массы, испражнения, остатки пищи.
Микроскопический метод. Выявление грамположительных кокков в виде цепочек в мазках из материала от больного. Бактериологический метод. 1. день. Посев материала на чашки кровяным МПА, пробирки или флаконы с сахарным МПБ. 2 день -учет характера роста колоний (на кровяном МПА - зоны гемолиза, в МПБ –равномерное помутнение). В мазке из колоний в окраске по Граму – кокки в виде цепочек. Оставшуюся часть колонии пересевают на скошенный МПА для получения чистой культуры. Пересев с сахарного МПБ на кровяной МПА	3 день - идентификация выделенной культуры стрептококка, дифференциация основных видов, определение чувствительности к антибиотикам. Выделение чистой культуры с кровяного МПА. 4 день.Заключение о виде стрептококка. Идентификация культуры, выделенной из сахарного МПБ 5 день.Заключение о виде стрептококка, выделенного из сахарного МПБ. Серологический метод Реакция нейтрализации (РН) для определения антистрептолизина-О (гемолизина) и антигиалуронидазы в сыворотке крови больных стрептококковыми инфекциями.

Бактериологический метод.Исследуемый материал засевают на кровяной МПА в чашках Петри. После выращивания в термостате при 37 0 С в течение суток учитывают характер роста колоний (колонии очень мелкие, величиной с булавочную головку, круглые, мутноватые, матовые). Слизистые колонии типичны для свежевыделенных штаммов, стрептококка, матовые – для вирулентных стрептококков с высоким содержанием М-протеина, блестящие – для невирулентных штаммов. На кровяном МПА стрептококки вызывают α–гемолиз (зеленоватая зона вокруг колоний) или β-гемолиз (полностью прозрачная зона гемолиза). Негемолитические стрептококки обычно непатогенны. Из типичных для стрептококка колоний готовят мазок в окраске по Граму и после микроскопии (Streptococcus pyogenes окрашивается по Граму положительно, располагается в виде цепочек) делают пересев в пробирки с сахарным МПБ и кровяным МПА. На 3 день учитывают характер роста (на сахарном МПБ рост стрептококка в виде придонно-пристеночного осадка, сама среда прозрачна), готовят мазок в окраске по Граму и проводят идентификацию выделенной культуры стрептококка по антигенным свойствам. Серогруппу стрептококков определяют в реакциях преципитации, латекс-агглютинации или коагглютинации с целью выявления группоспецифического полисахаридного антигена А, используя группоспецифические сыворотки (обычно групп A, B, C, F, G). Большинство патогенных для человека стрептококков являются β-гемолитическими и относятся к группе A. Серовар выделенной культуры стрептококка выявляют с помощью реакции агглютинации (выявление типового протеинового антигена М, по которому выделяют около 100 сероваров) с типоспецифическими стрептококковыми сыворотками.

Для идентификации β-гемолитических стрептококков применяют PYR-тест (на пирролидониламидопептидазу), CAMP-тест (на белок синергидного гемолиза), тест Фогес-Проскауэра (на образование ацетоина), чувствительность к бацитрацину (0,04 ЕД на диск), галотолерантность (рост в присутствии 6,5% хлорида натрия), гидролиз гиппурата натрия, ферментацию трегалозы, сорбита и т.д. α -гемолитические стрептококки идентифицируют, используя тесты на чувствительность к желчи, оптохину, на гидролиз эскулина и т.д. (табл. 3).

PYR -mecm. В МПБ, содержащий 0,01 % L-пирролидонил- β –нафтиламин, вносят петлю агаровой культу­ры стрептококка, инкубируют при 37 0 С в течение 4 ч. По­ложительная реакция характеризуется появлением ярко-крас­ного окрашивания после внесения 1 капли специального реактива.

Таблица 3 .Дифференциальные признаки стрептококков

Свойства	Микроорганизмы
S. pyogenes	S. agalactiae	Стрептококки групп C и G	S. bovis
Вид гемолиза	Β	β, α	β	α ,
Гидролиз гиппурата натрия	-	+	-	-
CAMP-тест	-	+	-	-
PYR-тест	+	-	-	-
Желчно-эскулиновый тест	-	-	-	+
Рост в солевом МПБ	-	+	-	-
Чувствительность к бацитрацину	+	-	-	-
Чувствительность к сульфаметоксазолу и триметоприму	-	-	+	+

Обозначения:(+) - постоянный признак, (-) – отсутствие признака

Исследование крови.Для выделения гемокультуры посев обычно производят в сахарный бульон. При нали­чии стрептококка на дне флакона появляется хлопьевидный при­донный осадок, а в мазках обнаруживаются длинные цепочки стреп­тококков. Для выделения чистой куль­туры и определения характера гемолиза делают пересев в чашку с кровяным агаром. Через сутки (3-й день исследования) появляют­ся типичные мелкие колонии, окруженные зоной гемолиза. Даль­нейший ход исследования аналогичен описанному выше.

Генодиагностика. Разработан метод ДНК-ДНК-гибридизации для обнаружения специфических фрагментов ДНК стрептококка в исследуемом материале, что дает основание поставить предварительный диагноз стрептококковой инфекции.

Серодиагностика(определение антител к гемолизину – стрептолизину-О) проводится при подозрении на ревматизм. Сущность реакции заключается в нейтрализации антителами сыворотки крови больного гемолитической активности стрептококкового стрептолизина-О. Титр антистрептолизина-О у здоровых людей – до 250 АЕStO. При ревматизме с первых дней болезни титр антистрептолизина-О составляет 500 АЕStO и выше.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Стрептококковые инфекции продолжают оставаться в числе наиболее острых проблем здравоохранения во всех странах мира. Бактерии рода Streptococcus классифицируют по антигенным свойствам (на основании имеющихся полисахаридов), выделяя серогруппы, изучают биохимические и гемолитические свойства. Наиболее патогенным для человека является Streptococcus pyogenes группы А, вызывающий у человека гнойно-воспалительные и инфекционно-аллергические заболевания. Диагностика стрептококковых инфекций включает использование бактериоскопического метода, определение стрептококковых антигенов в патологическом материале с помощью ИФА или латекс-агглютинации, бактериологического метода идентификации возбудителей инфекции и серологического метода по определению антител к стрептококкам группы А. В последнее время широко распространен метод ПЦР, позволяющий установить диагноз заболевания в 3 раза чаще по сравнению с классическими бактериологическими методами исследований [1, 2, 4]. Эти данные свидетельствуют о необходимости совершенствования микробиологической диагностики стрептококковых инфекций. Стрептококки колонизируют кожные покровы, слизистые оболочки, носоглотку, желудочно-кишечный тракт и влагалище [5]. Для возбудителей инфекции характерна множественность механизмов и факторов передачи, но наиболее характерен воздушно-капельный механизм передачи. У школьников в холодный сезон года носительство стрептококков в носоглотке достигает 25% [6].

В большинстве случаев возникновение стрептококковых инфекций связано с оказанием медицинской помощи (ИСМП). Причинами роста заболеваемости гнойно-воспалительными стрептококковыми инфекциями являются селекция и формирование госпитальных штаммов, обладающих высокой вирулентностью и множественной лекарственной устойчивостью, что требует совершенствования систем надзора и контроля за ИСМП [7].

Описан общепринятый способ получения чистой культуры стрептококков [6], который имеет следующие недостатки: изолированные колонии можно получить только на 3-й день микробиологического исследования, в процессе культивирования бактерий не удаляется посторонняя сопутствующая микрофлора слизистых оболочек зева и миндалин, на 2-й день пересева материала на кровяной мясопептонный агар (МПА) не всегда удается определить микробы, подозрительные на стрептококк, и поэтому приходится делать пересев на кровяной МПА бактерий, не относящихся к стрептококкам, что требует большего расхода питательных сред для выделения изолированной колонии стрептококков. Известно также, что гемолитические свойства стрептококков не являются диагностическим тестом для выявления патогенных стрептококков. Патогенные стрептококки под влиянием антибиотиков и факторов внешней среды могут утратить гемолитическую активность, что существенно затрудняет выделение стрептококков из исследуемого материала.

А.С. Лабинская [3] предложила способ получения изолированных колоний стрептококков по результатам выделения возбудителя со слизистых оболочек носоглотки при посеве на чашки Петри с 3% кровяным МПА с последующим изучением культуральных свойств и морфологических признаков стрептококков. Исследуемый материал вносили на чашки Петри с 3% кровяным МПА методом отпечатков, а затем шпателем распределяли микробные клетки по всей поверхности питательной среды. Через 18-20 часов роста в условиях термостата при температуре 37°С учитывали рост колоний. Идентифицировали штаммы стрептококков серологической группы А, образующие колонии трех видов: мукоидные, шероховатые и гладкие. Предложенный способ не обеспечивает 100% выделение стрептококков из исследуемого материала, так как методом отпечатков тампоном удается произвести посев лишь небольшого количества бактерий, находящихся на поверхности слизистых оболочек носоглотки; не удаляется выделенная со слизистых оболочках носоглотки сопутствующая микрофлора, обладающая антагонистическими свойствами, а также удается идентифицировать только штаммы стрептококков серологической группы А, а патогенные для человека штаммы стрептококков серогруппы С и G не определяются. Использование предложенных питательных сред и культивирование в аэробных условиях не позволяет выделять стрептококки с анаэробным типом дыхания.

Итак, сложность лабораторной диагностики и эпидемиологические предпосылки циркуляции стрептококков в лечебно-профилактических учреждениях (ЛПУ) дают основания для совершенствования методов лабораторной диагностики стрептококковых инфекций.

Цель исследования - повышение эффективности выделения возбудителей стрептококковых инфекций из исследуемого материала при возникновении ИСМП.

Задача исследования. На основании изу­чения антибиотикограмм сопутствующей микрофлоры стрептококковым инфекциям выявить антибиотик, обладающий бактерицидным действием на сопутствующую микрофлору, но не влияющим на снижение репродуктивной активности стрептококков. Добавление данного антибиотика в питательную среду для роста стрептококков позволит разработать способ получения изолированных колоний стрептококков.

Материал и методы исследования

В период с 1997 по 2011 г. обследовано 5300 больных. В содержимом из зева выделена сопутствующая микрофлора стрептококковой инфекции. Для определения чувствительности выделенной сопутствующей микрофлоры к антибиотикам использовали диско-диффузионный метод. В опытах использовано 16-20 часовых культур бактерий. Концентрацию бактерий доводили по стандарту мутности до 0,5 ед. по McFarland на физиологическом растворе хлорида натрия (рН 7,2-7,4). Приготовленную взвесь вносили на чашки Петри с 5% кровяным МПА в количестве 0,2 мл и равномерно распределяли на поверхности питательной среды. Через 15 минут на поверхность питательной среды наносили диски с антибиотиками. Посевы инкубировали при 37°С в течение 24 часов с последующим определением задержки роста бактерий вокруг дисков с антибиотиками. Использовали следующие диски с антибиотиками: стрептомицин, эритромицин, гентамицин, амикацин, линкомицин, бензилпенициллин, олеандомицин, цефаклор, цефуроксим, цефатоксим, цефалексин.

Для выделения стрептококков, обладающих анаэробными свойствами, проводили посев исследуемого материала на печеночный бульон Китта-Тароцци. Через 18‒20 часов роста бактерий при 37°С проводили пересев взвеси бактерий со среды Китта-Тароцци на 5% кровяной МПА. На поверхность кровяного МПА вносили 0,1 мл взвеси бактерий и шпателем равномерно распределяли их по поверхности плотной питательной среды. На поверхность посевов помещали диски с гентамицином в количестве 8-9 штук на чашку Петри и распределяли их на равном расстоянии друг от друга. Через 18-20 часов роста бактерий при температуре 37°С вокруг дисков с гентамицином отмечался рост изолированных колоний стрептококков, обладающих анаэробными свойствами.

Предложенный способ получения изолированных колоний стрептококков поясняется графическим материалом. На рисунке представлена схема получения изолированных колоний стрептококков.

Схема получения изолированных колоний стрептококков. Обозначения: 1 - сбор исследуемого материала от больного (слизь из зева и с миндалин), 2-5% кровяной МПА, 3 - среда Кита-Тароцци для выращивания бактерий с анаэробным типом дыхания, 4 - диски с гентамицином, 5 - выросшие изолированные колонии стрептококков на кровяном МПА, обладающих аэробными и анаэробными свойствами

Результаты исследований и их обсуждение

Результаты исследований показали, что в мазках из зева сопутствующая микрофлора была чувствительна к гентамицину в 90-96% случаев, а выделенные культуры стрептококков были резистентны к гентамицину. На основании результатов анализа антибиотикограмм сопутствующей микрофлоры стрептококковой инфекции предложен способ выделения изолированных колоний стрептококков из смешанных микробных популяций. Способ заключается в следующем: с помощью тампона берут налет, слизь с миндалин и слизистых оболочек зева, затем методом штриха проводят посев исследуемого материала на 5% кровяной МПА, равномерно распределяя бактерии по поверхности питательной среды. На поверхность кровяного МПА с посевом исследуемого материала наносили диски с гентамицином в количестве 8-9 штук, равномерно распределяя их на поверхности питательной среды. Через 18-20 часов роста бактерий при температуре 37°С на поверхности кровяного МПА вокруг дисков с гентамицином наблюдался рост изолированных колоний стрептококков. Для выделения стрептококков, обладающих анаэробными свойствами, предварительно делали посев исследуемого материала на печеночный бульон Китта-Тароцци, а затем через 18-20 часов роста бактерий при 37°С проводили пересев взвеси бактерий со среды Китта-Тароцци на 3% кровяной МПА. На поверхность кровяного МПА вносили 0,1 мл взвеси бактерий, равномерно распределяя их на поверхности плотной питательной среды. На посевы с микробной взвесью помещали диски с гентамицином в количестве 8-9 штук. Через 18-20 часов роста бактерий при температуре 37°С вокруг дисков с гентамицином отмечался рост изолированных колоний стрептококков, обладающих анаэробными свойствами. С помощью предложенного метода выделено 34 культуры стрептококков.

По сравнению с традиционными методами микробиологической диагностики стрептококковых инфекций предложенный способ позволяет уменьшить расход питательных сред, повысить процент выделения стрептококков из исследуемого материала, что позволяет своевременно и в более полном объеме проводить противоэпидемическое расследование и осуществлять мероприятия, направленные на предупреждение возникновения ИСМП стрептококковой этиологии.

Следует отметить, что сложность и низкая эффективность выделения стрептококков из исследуемого материала при диагностике инфекционных заболеваний связана с тем, что сопутствующая микрофлора по сравнению со стрептококками более устойчива во внешней среде, неприхотлива к питательным средам, как правило, обладает антагонистическими свойствами и поэтому при инфекционных заболеваниях выделенную микрофлору от больных часто выделяют и идентифицируют преимущественно из группы условно-патогенной сопутствующей микрофлоры. При обследовании ожоговых больных в популяциях сопутствующей микрофлоры наиболее часто определялся эпидермальный стафилококк.

Итак, стрептококки, в отличие от условно-патогенной микрофлоры и стафилококков, менее устойчивы во внешней среде, часто обладали анаэробными свойствами и медленнее размножались на питательных средах. Поэтому не всегда удается выделять чистую культуру стрептококков традиционными микробиологическими методами.

Предложенный способ позволил повысить процент выделения стрептококков из исследуемого материала, сократить время проведения микробиологических исследований по выделению изолированных колоний стрептококков, уменьшить количество ложноотрицательных результатов исследований и снизить расход питательных сред в процессе лабораторной диагностики стрептококковых инфекций. Сокращение сроков проведения лабораторных исследований позволяет в ранние сроки и в более полном объеме проводить противоэпидемические мероприятия при возникновении ИСМП, вызываемых стрептококками.

Материалом для исследования являются гной, мокрота, слизь из зева и носа, кровь, при отите – отделяемое из слухового прохода.

Микроскопический метод включает приготовление мазка и окраску его по Граму; выявляются грамположительные цепочки кокков. В случае обнаружения пневмококков определяются диплококки ланцетовидной формы, окруженные общей капсулой.

Бактериологический метод – основной, проводят посев на чашки Петри с кровяным агаром. Обращают внимание на рост гемолитических и зеленящих колоний, характерных для стрептококков. S. pyogenes и S. agalactiae дают β-гемолиз, пневмококки и зеленящие стрептококки – α-гемолиз.

Из колоний делают мазки, окрашивают по Граму. При обнаружении грамположительных цепочек кокков ставят каталазный тест, который у стрептококков отрицательный. Колонии пересевают на сывороточный бульон или тиогликолевую среду, где стрептококки дают придонный рост.

Далее определяют серогруппу методом преципитации с группоспецифическими сыворотками к полисахаридным АГ или методом ИФА. Следующий этап – определяют серовар возбудителей путем постановки реакции латекс-агглютинации с М-антисыворотками.

Пневмококк типируют в реакции с сыворотками против полисахаридного капсульного антигена.

Проводят дифференциально-диагностические тесты (см. таблицу 5), позволяющие отличить друг от друга основных возбудителей: S. pyogenes, S. agalactiae, S. pneumoniae, зеленящих стрептококков (S. mutans, S. mitis и других).

S. pyogenes чувствителен к антибиотику бацитрацину. Кроме того, это единственный вид, который дает положительный ПИР-тест (гидролиз пирролидонил-β-нафтиламида). Не гидролизует гиппурат натрия.

S. agalactiae гидролизует гиппурат натрия. Также этот возбудитель дает положительный САМР-тест (назван в честь австралийских исследователей Cristie R., Atkins N.E. и Munch-Petersen E., предложивших в 1944 г. данный метод).

Для этого проводят совместное выращивание на глюкозно-кровяном агаре исследуемой культуры стрептококка и штамма стафилококка, вырабатывающего бета-гемолизин. Посев бактерий выполняют взаимно перпендикулярными штрихами.

При наличии S. agalactiae в месте пересечения культур наблюдается гемолиз, приобретающий форму бабочки.

S. pneumoniae (пневмококк) чувствителен к действию химических факторов. Он не растет в присутствии антисептика оптохина, а также в присутствии желчи. Способен разлагать инулин.

Иногда для обнаружения S. pneumoniae используют биологический метод. Внутрибрюшинно заражают белых мышей исследуемым материалом. Погибших мышей вскрывают, делают мазки-отпечатки, посев крови и органов на кровяной агар с последующей идентификацией возбудителя. Метод имеет ограниченное применение, так как не все серовары пневмококков патогенны для мышей.

Зеленящие стрептококки (S. mutans, S. mitis и другие) не имеют капсулы, устойчивы к действию оптохина и желчи.

В диагностике ревматической лихорадки используют серологические исследования, в которых определяют титры антител к ферментам и токсинам стрептококка (антистрептолизиновый тест, определение АТ к гиалуронидазе, дезоксирибонуклеазе). Повышенными считают титры не менее 250 Ед.

Все стрептококки серогруппы А чувствительны к β-лактамным антибиотикам, включая бензилпенициллин, в меньшей степени – к макролидам и азалидам

Бензилпенициллин (пенициллин G) остается препаратом выбора для лечения внегоспитальных пневмококковых пневмоний, хотя резистентность к нему постепенно увеличивается. Также для лечения пневмоний используют другие β-лактамы (амоксициллин, цефалоспорины), макролиды и азалиды, фторхинолоны (левофлоксацин).

Для предупреждения развития хронических стрептококковых инфекций, связанных с персистенцией возбудителя и образованием L-форм, необходимо проведение адекватной антибиотикотерапии. За детьми, перенесшими повторные ангины, скарлатину устанавливают диспансерное наблюдение.

Специфическая профилактика пневмококковых заболеваний проводится с помощью вакцин, приготовленных из высокоочищенных капсульных полисахаридов тех серовариантов, которые чаще вызывают заболевания. В настоящее время имеются две такие вакцины – 23-валентная пневмококковая полисахаридная вакцина (PPSV23, Пневмо23) и 7-валентная конъюгированная пневмококковая вакцина (PCV7), которая рекомендуется для вакцинации детей моложе 5 лет.

Материал	Метод исследования	Результаты
Гной, эксудат, некроти-ческие массы	1. Микроскопический 2. Бактериологический Посев на ЖСА, МСА А. Микроскопия мазков из колоний Б. Выделение чистой культуры Установление принадлежности культуры к роду Staphylococcus А. Микроскопический Б. Культуральное определение ферментации глюкозы в анаэробных условиях Видовая идентификация I. Коагулаза Определение признаков патогенности 1. Плазмокоагуляция 2. Лецитиназа 3. Гемолизин 4. Гиалуронидаза 5. ДНК-аза	Гр+кокки Рост пигментированных кокков Гр+кокки Гроздекокки Пигментообразование. Ферментация с образо-ванием кислоты Коагулазоположительные

Идентификация стафилококков

Целью первичной идентификации является установление принадлежности выделенной культуры к семейству Micrococcaceae и роду Staphylococcus. Для установления принадлежности культур к семейству микрококков используют тест на каталазу.

Отмечают способность представителей семейства микрококков, имеющих фермент каталазу, расщеплять перекись водорода, образуя воду и газообразный кислород.

В отличие от микрококков представители родственного семейства стрептококков каталазы не имеют.

Видовая идентификация стафилококков

Последним этапом исследования является дифференциация S. aureus от представителей двух коагулазоотрицательных видов стафилококков. Если установлено, что штамм относится к виду S. aureus, проводят его идентификацию.

Идентификация S. aureus

Ориентировочные данные о принадлежности культуры к Staphylococcus можно получить при изучении характера колоний, выросших после посева исходного материала на элективную среду (для стафилококков – молочно-желточный солевой агар).

Определение лецитоветиллазы (лецитиназы)

Хлористый натрий является элективным фактором, так как подавляет рост большинства представителей микрофлоры, главным образом, грамотрицательной. Из компонентов яичного желтка – лецитоветиллаза является субстратом для фермента лецитоветиллазы. При расщеплении лецитоветиллина вокруг лецитиназоположительной колонии на поверхности среды образуется радужный венчик. Добавление в среду молока путем сложных химических процессов стимулирует образование стафилококками золотистого или лимонно-желтого пигмента, относящегося к группе каротиноидов.

Как правило, штаммы S. aureus обладают лецитиназой и пигментом, а культуры двух других видов лишены их. Возможны, однако, исключения: некоторые штаммы S. aureus не имеют пигмента или лецитиназы, а ряд штаммов S. epidermidis обладают лецитиназной активностью.

Реакция плазмокоагуляции

Принцип. Под действием фермента плазмокоагулазы активизируется естественная система свертывания крови (плазминогенротромбин).

Приготовление свежей плазмы. Стерильно взятую из сердца кровь кролика в количестве 3 мл вносят в пробирку с 2 мл стерильного 5 % раствора лимоннокислого натрия, смешивают и центрифугируют для осаждения форменных элементов крови в течение 10 минут при 1500 об/мин.

Плазму отсасывают, разводят в 5 раз стерильным физиологическим раствором и разливают в стерильные пробирки по 0,5 мл.

Ход исследования. В пробирку вносят 1 петлю суточной агаровой культуры исследуемого штамма, которую суспензируют в плазме. Штатив с пробиркой помещают в термостат при 37 °С и регистрируют результаты через 1, 2, 4 и 18 часов инкубации.

Оценка результатов. Появление на дне пробирки студнеобразного сгустка любого размера считается положительным результатом реакции. Отсутствие свертывания плазмы в течение 18 часов расценивается как отрицательный результат. В качестве контроля рекомендуется ставить реакцию с заведомо коагулирующим и некоагулирующим штаммами, а также оставлять одну пробирку с плазмой незасеянной.

Окончательная идентификация S. aureus требует постановки еще двух тестов. На первом этапе определяют наличие у штаммов плазмокоагулазы. Если после этого штамм идентифицировать не удается, дополнительно определяют один из двух следующих признаков: наличие ДНК-азы (что предпочтительнее) или способность ферментировать маннит в анаэробных условиях.

При наличии положительного результата в реакции плазмокоагуляции и хотя бы в одном из двух предварительных тестов (пигмент лецитиназа) исследуемый штамм может быть отнесен к виду S. aureus (варианты 2-3).

Отсутствие плазмокоагулазы и хотя бы одного из двух первых признаков дает основание считать, что штамм не принадлежит к S. aureus (варианты 5-7).

Расхождения между результатами реакции плазмокоагуляции, с одной стороны, и двух предварительных тестов – с другой (варианты 4 и 8), требует постановки одного из двух дополнительных тестов (ДНК-азы или ферментации маннита в анаэробных условиях). В случае совпадения результатов дополнительного теста с результатами реакции плазмокоагуляции штамм считается либо относящимся к виду S. aureus при положительных результатах (варианты 4а и 4в), либо не относящимся к нему (при отрицательных, варианты 8б и 8г), или отрицательных (принадлежность к другим видам, варианты 4б и 4г) результатов.

Проводить идентификацию S. aureus лишь на основании результата одного теста не рекомендуется.

Определение ДНК-азы

Принцип. Под действием ДНК-азы (дезоксирибонуклеазы) добавленная в плотную среду высокополимерная ДНК распадается на низкополимерные фрагменты. При этом мутная, среда становится прозрачной.

Определение ферментации маннита в анаэробных условиях

Определение ферментации глюкозы в анаэробных условиях. Определение проводят аналогичным путем, в качестве субстрата используют 1% раствор маннита.

Идентификация S. epidermidis и S. saprophyticus

Те штаммы, которые после исследований, описанных выше, признаны не относящимися к S. aureus, подвергаются дальнейшей идентификации для установления их видовой принадлежности.

Дифференциацию S. epidermidis; и S. saprophyticus рекомендуется проводить в трех тестах:

1) определение устойчивости к новобиоцину;

2) наличие фосфатазы;

3) способность окислять маннит.

Для штаммов S. epidermidis характерны: чувствительность к новобиоцину, наличие фосфатазы, неспособность окислять маннит; для штаммов S. saprophyticus – противоположные свойства. Поскольку не все стафилококки по своим характеристикам укладываются в указанную схему, такие штаммы следует обозначать Staphylococcus Spp.

Вопросы для обсуждения

1. Общая характеристика патогенных кокков.

2. Морфология, тинкториальные и культуральные свойства стафилококков.

3. Токсины и ферменты "агрессии".

4. Классификация стафилококков.

5. Способы обнаружения токсинов и ферментов "агрессии".

6. Лабораторная диагностика.

7. Препараты, применяемые для специфического лечения и профилактики стафилококковых заболеваний.

Севастопольское государственное бюджетное образовательное учреждение

протокол методической цикловой комиссии

от ______________20__г №___

Зам. директора по учебной работе

Специальность: 31.02.01 Лечебное дело

Составила Олейник Наталья Васильевна

Методической целью практического занятия является формирование профессиональных компетенций, соответствующих основным видам профессиональной деятельности в рамках темы данного практического занятия.

Методическая разработка содержит информацию об основных этапах, методах и формах обучения, методах контроля знаний, необходимых для изучения данной темы. Кроме того, представлены приложения, с помощью которых осуществляется контроль исходного уровня знаний, закрепление изученного материала, указания по выполнению внеаудиторной самостоятельной работы с эталонами ответов.

I . Методический блок

ТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ КАРТА ПРАКТИЧЕСКОГО ЗАНЯТИЯ

Количество учебных часов : 2

Патогенные кокки (в основном стафилококки и стрептококки) вызывают различные по своим проявлениям гнойно-воспалительные процессы, обладая способностью поражать любой орган и любую ткань. Стафилококковые инфекции занимают одно из первых мест среди бактериальных инфекций, что связано с развитием у возбудителей устойчивости к антибиотикам. Значительную роль стафилококки играют в развитии внутри больничных инфекций. Зачастую постановку диагноза заболевания значительно облегчают лабораторные методы исследования. В связи с этим, каждая медсестра должна в совершенстве овладеть методикой забора материала для лабораторного исследования от больных и контактных.

III . Цель: Определить основные характеристики патогенных кокков. Ознакомиться со схемой лабораторного исследования при кокковых инфекциях. Изучить основные методики исследования при данных инфекциях и методы профилактики.

Учебные цели занятия:

Студент должен знать:

роль микроорганизмов в жизни человека и общества;

морфологию, физиологию и экологию микроорганизмов, методы их изучения;

основные методы асептики и антисептики;

основы эпидемиологии инфекционных болезней, пути заражения, локализацию микроорганизмов в организме человека,

основы химиотерапии и химиопрофилактики инфекционных заболеваний;

факторы иммунитета, его значение для человека и общества, принципы иммунопрофилактики и иммунотерапии болезней человека, применение иммунологических реакций в медицинской практике.

Студент должен уметь:

проводить забор, транспортировку и хранение материала для микробиологических исследований;

проводить простейшие микробиологические исследования;

дифференцировать разные группы микроорганизмов по их основным свойствам;

осуществлять профилактику распространения инфекции.

Воспитать у студентов аккуратность и прилежание в процессе выполнения самостоятельной работы,

Привить чувство ответственности при выполнении самостоятельной работы.

Повышение мотивации к учебе.

Развитие устойчивого интереса к дисциплине, активация познавательной деятельности по овладению программным учебным материалом.

Развитие творческих подходов в выполнении поставленных задач.

Тип занятия : практическое занятие

Время проведения : 90 мин

ІV. Формирование общих компетенций:

Формирование профессиональных компетенций:

ПК 1.2. Проводить диагностические исследования.

ПК 1.3. Проводить диагностику острых и хронических заболеваний.

ПК 2.1. Определять программу лечения пациентов различных возрастных групп.

ПК 2.2. Определять тактику ведения пациента.

ПК 3.6. Определять показания к госпитализации и проводить транспортировку пациента в стационар.

ПК 4.2. Проводить санитарно-противоэпидемические мероприятия на закрепленном участке.

ПК 4.3. Проводить санитарно-гигиеническое просвещение населения.

ПК 4.5. Проводить иммунопрофилактику.

ПК 4.7. Организовывать здоровье сберегающую среду.

ПК 4.8. Организовывать и проводить работу Школ здоровья для пациентов и их окружения.

ПК 6.4. Организовывать и контролировать выполнение требований противопожарной безопасности, техники безопасности и охраны труда на ФАПе, в здравпункте промышленных предприятий, детских дошкольных учреждениях, центрах, офисе общей врачебной (семейной) практики.

V. Схема интеграционных связей:

1. Междисциплинарные связи:

Внутри дисциплинарные связи:

Знать виды микроорганизмов

Уметь различать микроорганизмы по их свойствам

Знать специфическую профилактику и специфическое лечение инфекционных заболеваний.

Уметь применять иммунологические препараты для профилактики, лечения и диагностики инфекционных заболеваний

VI. Оснащение занятия:

Методическое: методическая разработка практического занятия, мультимедийная презентация, материалы контроля исходного, промежуточного и конечного уровня знаний, инструкция к практическому занятию, методические рекомендации к выполнению внеаудиторной самостоятельной работы студентов

Техническое: мультимедийный проектор.

Материальное: иммунологические препараты, видеоролик .

VII. Методы и приемы обучения:

Формирование умений и навыков использования и применения полученных знаний.

выполнение практических заданий, работа по алгоритму.

Обогащают знания, формируют умения и навыки, трудолюбие, наблюдательность, систематичность и аккуратность в работе.

2. Проблемное изложение

Раскрытие в изучаемом учебном материале различных проблем и показ способов их разрешения.

Постановка проблемы, анализ, установление причинно-следственных связей.

Развивает самостоятельность мышления, быстроту реакции, способствует развитию творческих решений.

VIII. Перечень обязательной, нормативной и дополнительной литературы:

Наименование учебно-методической литературы (автор(ы), место издания, издательство, год издания, кол-во страниц)

Наличие электронной версии

Основы микробиологии и иммунологии/К.С. Камышева.- Ростовн/Д: Феникс, 2015.-381с.

IХ . Организационно-деятельностная структура занятия

Основные этапы занятия, их функции и содержание

Материалы метод. обеспечения: контроля, наглядности, ТСО, инструкции

- проверка внешнего вида, заполнение журнала

- мотивация учебной деятельности

контроль исходного уровня знаний:

Отмечает отсутствующих, выясняет причины, обращает внимание на внешний вид студентов.

Сообщает тему занятия, обращает внимание студентов на актуальность изучаемой темы,

цели и задачи, стоящие перед студентами, важность знания предмета для успешного овладения профессией в целом

Проводит тестирование студентов согласно учебным целям.

Анализирует ответы, корректирует ошибки.

Студенты готовят тетради для записей, ручки, карандаши

Записывают тему и план занятия в тетради.

Отвечают на вопросы тестов

Техническое обеспечение: компьютер, презентация по теме.

Активизация мыслительной деятельности студентов на тему занятия, привлечение внимания и осознание её значимости для будущей работы.

Формирование профессиональ-ных умений и навыков:

1. Изучить методику и призвести забор слизи из з е ва и носа.

2. Изучить методику посева крови на сахарный бульон.

3. Заполнить сопроводительную документацию4. Изучить методику и провести определение чувствительности кокков к антибиотикам.

Создает условия для проведения самостоятельной аудиторной работы студентов, демонстрирует нормативные документы, обращает внимание на основные аспекты, проводит коррекцию ответов.

Оценивает работу студента

Студенты бригады демонстри-руют результаты аудиторной самостоя-тельной работы. Представляют результаты внеаудиторной самостоя-тельной работы

Инструкция к практическому занятию (приложение 2).

Презентация темы занятия.

Техническое обеспечение: компьютер, доска маркерная.

1. Обобщение и систематизация усвоенных знаний .

2.Контроль и коррекция уровня умений и навыков.

- Контроль конечного уровня знаний.

2. Подведение итогов занятия.

Проверяет выполненные работы

Проводит итоговый контроль знаний

Оценивает бригаду в целом и каждого студента индивидуально, обращает внимание на сложные моменты темы, выставляет оценку каждому студенту с комментариями.

Систематизируют полученную информа-цию

Отвечают на вопросы ситуацион-ных задач и вопросы индиви-дуального опроса

Соотнесе-ние результатов деятельнос-ти с поставлен-ной целью и задачами, осуществление самооценки

Мотивация следующего занятия, активация самоподготовки.

Даёт указания по уборке рабочего места

Слушают, записывают задание, задают вопросы.

Приводят в порядок рабочее место

Рабочая тетрадь Часть 2, СРС №2.

II. Информационный блок

Изучаемые вопросы Уровень усвоения

Изучить методику посева крови на сахарный бульон.

Изучить правила заполнения сопроводительной документации.

Изучить методику и провести определение чувствительности кокков к антибиотикам.

Патогенные для человека кокки относятся к трем семействам:

Micrococcaceae , Streptococcaceae , Neisseriaceae .

Стафилококки (от греч. stafilos – виноградная гроздь) широко распространены во внешней среде – воздухе, воде, почве. В организме человека стафилококки обитают на кожных покровах, а также на слизистых оболочках верхних дыхательных путей и пищеварительного тракта.

Внедряясь, стафилококки вызывают гнойные поражения, в том числе сепсис. Практически все органы и ткани организма человека могут быть поражены воспалительными процессами, вызванными стафилококками. В зависимости от локализации развиваются: фурункулез, пиодермия, экземы, абсцессы, пневмонии, аппендициты, холециститы, энтероколиты, сепсис и т.д. Стафилококки часто выступают как возбудители внутри больничных инфекций.

Исследуемый материал – гной, моча, кровь, мокроту, отделяемое слизистых оболочек; при токсикоинфекциях – рвотные массы, промывные воды желудка, испражнения.

Используют бактериоскопический и бактериологический методы исследования.

При бактериоскопическом методе исследования используют окраску по Граму, определяя в мазке типичные морфологические признаки.

Бактериологический метод: для выделения чистой культуры производят посев на молочно-солевой, желточно-солевой и кровяной агары, кровь при подозрении на сепсис сеют на сахарный бульон.

Идентификацию проводят по гемолитическим свойствам, лецитовителлазной активности, плазмокоагулирующей и гиалуронидазной активности и характеру пигмента. Обязательным тестом на болезнетворность является подтверждение способности расщеплять маннит в анаэробных условиях. Затем проводят фаготипирование, для выявления источника инфекции, определяют чувствительность к антибиотикам.

Стрептококки имеют шаровидную и овальную форму, размер около 2 мкм, в мазках располагаются попарно или образуют цепочки. Спор не образуют, неподвижны, способность к образованию капсул имеет Str . Pneumoniae , который представляет собой диплококк, состоящий из двух ланцетовидных клеток, окруженных капсулой, Г + .

По признаку выраженности гемолитической активности они подразделяются на три группы: β-гемолитические, ά-зеленящие, γ-негемолитические.

Стрептококки могут поражать любую ткань и любой орган. Входными воротами инфекции могут служить – миндалины, лимфоидная ткань верхних дыхательных путей, поврежденная кожа и т.д. стрептококковые инфекции разделяют на нагноительные (ангины, пневмонии, рожистые воспаления, импетиго, сепсис и др..) и ненагноительные (скарлатина, ревматизм).

Материал для исследования – мокрота, гнойное отделяемое, кровь, моча, испражнения.

Используют бактериоскопический, бактериологический и серологический методы исследования.

Схема микробиологического исследования при стафилококковых инфекциях.

2. Распечатка иллюстративного материала для мультимедийного сопровождения