Иммунологические исследования и методы диагностики инфекционных заболеваний в клинической практике

Инфекционные болезни — это заболевания, вызванные проникновением в организм бактерий, грибков или вирусов. Самая важная часть диагностики инфекций — это определение возбудителя и его концентрации. Для этих целей используются разнообразные лабораторные методы, которые позволяют выяснить, чем именно и как давно атакован организм, а в некоторых случаях — спрогнозировать эффективность лечения тем или иным препаратом.

Особенности диагностики инфекционных заболеваний

В клинической практике данный тип заболеваний встречается очень часто. Именно они, по данным Всемирной организации здравоохранения, становятся причиной 26% всех смертей. В список самых распространенных инфекционных заболеваний входят инфекционная пневмония и другие воспалительные заболевания дыхательных путей, гепатит, ВИЧ, туберкулез, малярия, воспаления органов половой системы и мочевыводящих путей, гистоплазмоз, ротавирусные инфекционные заболевания, ветряная оспа, герпес, вирус папилломы человека и еще несколько десятков болезней. Хотя бы раз в жизни каждый из нас сталкивается с инфекционными заболеваниями и необходимостью быстрой постановки диагноза.

Все инфекционные болезни делятся на пять типов — прионные, вирусные, бактериальные, протозойные и грибковые поражения. Далее будут рассмотрены последние четыре типа как наиболее распространенные. Разные возбудители иногда могут вызывать одно и то же заболевание. В частности, пневмония может быть результатом как вирусной, так и бактериальной инфекции. Лечение зависит не от проявлений, а от возбудителя болезни. Противовирусные препараты бесполезны в борьбе с бактериями и грибками, антибиотики не действуют на вирусы. Поэтому основная задача лабораторной диагностики инфекционных заболеваний — выявление типа возбудителя.

Способы лабораторной диагностики инфекционных болезней можно разделить на два типа: неспецифические и специфические методы.

К неспецифическим относятся общий анализ крови и исследование соотношения ее белковых фракций, печеночные пробы, общий анализ мочи и кала. Эти методы не дают информации о виде возбудителя, но позволяют узнать, в какой мере болезнь затронула органы и системы организма, что именно в их работе нарушено и насколько далеко зашел процесс.

Специфические — вирусологический и бактериологический методы, микроскопическое исследование возбудителей, анализы на антигены и антитела — направлены непосредственно на обнаружение возбудителя.

Современная медицина располагает множеством методов выделения возбудителей бактериальной инфекции:

Бактериоскопический . Исследуется окрашенный специальным образом мазок.

Бактериологический . Биоматериал высеивается в питательную среду, и через некоторое время специалист исследует колонию бактерий, выросшую в ней.

Биологический . Направлен на определение патогенности микроорганизмов.

Серологический . Выявляет антитела и антигены в сыворотке крови — особые вещества, которые вырабатываются организмом при контакте с возбудителем определенной болезни.

Чаще всего для исследований используют кровь или сыворотку крови, реже — слюну, мочу, кал, клетки эпителия (мазок и соскоб) и другой биоматериал.

В лабораторной диагностике вирусных заболеваний используются:

Вирусологическое исследование . Световая и электронная микроскопия дает возможность выявить наличие вирусных включений и сами вирусы и идентифицировать их.

Серологическое исследование для обнаружения антител и антигенов. Этот метод дает возможность быстро выявить агрессора, как и в случае с бактериальными инфекциями. Для диагностики используются разнообразные способы исследования материала — реакции гемадсорбции, гемагглютинации или метод непрямой иммунофлюоресценции. Имунноблоттинг, в частности, позволяет выявлять антитела сразу к нескольким инфекциям и считается современным и точным диагностическим методом.

Молекулярно-генетические методы . Последнее слово в лабораторной диагностике. Позволяют обнаружить вирус даже тогда, когда его концентрация ничтожно мала — то есть на самых ранних стадиях. Самым известным из этих методов является ПЦР, при которой фрагмент вируса многократно копируется до тех пор, пока специалист не получит достаточно материала для определения типа вируса и его изначальной концентрации.

Для выявления вирусов обычно требуется сделать анализ крови.

Так называют инфекции, вызванные простейшими паразитами, например, амебами. Малярия, амёбиаз, токсоплазмоз, лямблиоз, трихомониаз, сонная болезнь — вот неполный список самых распространенных протозойных инфекций. Лабораторная диагностика таких заболеваний включает в себя следующие методы:

Микроскопический . Простейшие паразиты выявляются путем исследования под микроскопом окрашенных образцов биоматериала. Самый простой и надежный метод для многих возбудителей.

Культуральный . Посев биоматериала в питательную следу для дальнейшего исследования размножившихся простейших. У этого метода есть существенный недостаток: результатов нужно ждать долго, сам процесс может занять не менее 5-6-ти дней.

Серологический . Используют редко ввиду малой информативности.

Аллергический . Также не является распространенным. Кожные аллергопробы делают для того, чтобы подтвердить лейшманиоз и токсоплазмоз. Это вспомогательный диагностический метод.

В качестве биоматериала для исследований в основном используется кровь, иногда — – кал или моча.

Микроскопическое исследование . Препарат окрашивается и рассматривается под мощным микроскопом. Посредством иммунофлюоресцентной микроскопии исследуется проба, помеченная флюоресцеинами — специальным красителем. Наиболее быстрый способ выявления грибка по сравнению с другими методами.

Культуральный . Происходит посев пробы на питательную среду и дальнейшее исследование полученной в результате колонии грибков.

Серологический . Используется для выявления грибковых поражений, однако для микозов он считается не особенно точным.

Гибридизация нуклеиновых кислот . Самый современный способ выявления грибковых инфекций, его применяют для идентификации основных возбудителей системных микозов. Из культуры извлекается РНК и вносится особым способом помеченная молекула ДНК. Если в пробе наличествует один из основных патогенных грибков, ДНК объединится с его РНК, создав легко различимую структуру. Несомненным преимуществом метода является возможность определить инфекцию на самых ранних стадиях.

Биоматериалом для исследований являются клетки кожи, волос и ногтей, клетки слизистых оболочек (мазок или соскоб), мокрота, моча, секрет простаты, сперма, грудное молоко.

Современные методики диагностики инфекций позволяет выявить их на начальном этапе, Чем раньше болезнь будет обнаружена, тем проще ее вылечить. Поэтому сдавать анализы на инфекции желательно регулярно, даже если вы ни на что не жалуетесь и не замечаете никаких перемен в самочувствии.

Пе­ред сда­чей био­ма­те­ри­а­ла для ис­сле­до­ва­ний иног­да тре­бу­ет­ся опре­де­лен­ная под­го­тов­ка. Так, кровь обыч­но сда­ют с ут­ра, на­то­щак, а пе­ред за­бо­ром маз­ка не ре­ко­мен­ду­ет­ся при­ни­мать душ. Эти тре­бо­ва­ния очень важ­ны: они обес­пе­чи­ва­ют точ­ность ре­зуль­та­та, по­это­му узнай­те у вра­ча за­ра­нее о под­го­то­ви­тель­ных ме­рах и точ­но сле­дуй­те всем его ре­ко­мен­да­ци­ям.

[youtube.player]

Иммунологические методы используются в диагностических исследова­ниях, проводящихся в двух направлениях:

• иммунодиагностика инфекционных заболеваний;

• характеристика функционального состояния иммунной системы.

Для инфекционных заболеваний характерно наряду с неспецифическими проявлениями патологии появление во внутренней среде организма также специ­фических для данного возбудителя (антигены, токсины и т.п.) и иммунного ответа.

Иммунодиагностика инфекционных заболеваний включает в себя: 1) специ­фическое распознавание маркеров возбудителя и реагирующих с микробными продуктами комплементарных структур (антител, рецепторов клеточной поверх­ности, участков молекул нуклеиновых кислот); 2) определение изменения функ­циональной активности различных компонентов иммунной системы (количества и функциональной активности лимфоцитов, соотношения их субпопуляций, актив­ности клеток фагоцитарной системы, концентрации иммуноглобулинов и т.п.).

В основе наиболее часто используемого для выявления антител или анти­генов иммунохимического анализа лежит формирование иммунного комплекса антиген-антитело в результате взаимодействия антигенной детерминанты с ком­плементарной областью иммуноглобулина (активный центр). В процессе реак­ции антиген-антитело происходит возникновение мультимолекулярных комплек­сов при участии огромного числа молекул антигена и антител и формирование воспринимаемого визуально преципитата. Преципитационные методы проводят­ся в растворе (нефелометрия и турбодиметрия, основанные на рассеивании све­та частицами преципитата) или в геле (иммунодиффузия и иммуноэлектрофо-рез). В настоящее время наиболее распространена одиночная радиальная им­мунодиффузия по О.Мапст! для количественного анализа (антиген радиально диффундирует из лунки в гель, содержащий антитела, причем образуется об­ласть преципитации, площадь которой прямо пропорциональная количеству ан­тигена в лунке) и двойная радиальная иммунодиффузия для качественной ха-

рактеристики (антиген из центральной лунки и антитела из радиально располо­женных вокруг лунок диффундируют навстречу друг другу, образуя или нет поло­сы преципитации, что позволяет делать вывод об антигенных свойствах данного антигена). К иммуноэлектрофоретическим методам относятся методики, основан­ные на явлении миграции компонентов иммунных комплексов в электрическом поле. Электрофорети ческое разделение смеси антигенов в геле сочетается с пре-ципитационным выявлением их с помощью двойной ^ммунодиффузии-

Для диагностики инфекций параллельно с методами преципитации, начи­ная с конца 19 века, широко использовались методы, в основе которых лежит взаимодействие корпускулярных антигенов (эритроциты, бактериальные клет­ки) с антителами (прямая агглютинация). Методы пассивной агглютинации ис­пользуют частицы, сенсибилизированные антигенами или антителами, для вы­явления бактериальных и вирусных антигенов или антител к ним.

В настоящее время наиболее широко распространены индикаторные ме­тоды, использующие для выявления реакции антиген-антитело различного рода метки (радиоактивные, флюоресцентные. ферментные).

Методики, при выполнении которых наличие иммунного комплекса выяв­ляется с помощью радиоактивной метки, введенной предварительно в состав одного из компонентов (антитела или антигена), называются радиоиммунноло-гическим анализом (РИА). Наиболее известны 2 разновидности РИА; радиоим-мунопреципитация (РИП) и твердофазный радиоиммунологический анализ (ТФРИА). Количественный анализ преципитата, образовавшегося в процессе РИП, проводится с помощью счетчиков радиоактивности либо с помощью ауто-радиографии. Использование ТФРИА, в котором антиген или антитело изначаль­но иммобилизуется на больших по размерам частицах или пластике, а при про­ведении реакции на иммобилизованный компонент сорбируются остальные, дает возможность удалятьиз реакционной смеси не вошедшие в иммунный комплекс макромолекулы с помощью простой отмывки.

В клинической практике нашли широкое применение иммунофлюоресцен-тные методы, использующие антигены или антитела с введенными в их состав флюоресцентными метками. О наличии или отсутствии иммунного комплекса, сформированного в результате реакции антиген-антитело, судят по интенсив­ности флюоресценции. Наиболее распространенными являются два варианта (прямой и "сэндвич" методы) иммунофлюоресцентной микроскопии (ИФМ). ИФМ позволяет не только удостовериться в наличии антигена вирусов или бактерий в клиническом образце, но и установить локализацию его в определенных клеточ­ных или субклеточных структурах.

В настоящее время интенсивно развиваются более чувствительные мето­дики с использованием для метки антигенов или антител положительно заря­женных ионов редкоземельных элементов — лантанидный иммунофлюоресцен-тный анализ (ЛИФА).

Особенно широко в последние годы в медицине используется твердофаз­ный иммуноферментный анализ (ИФА или Е1-15А). В качестве индикаторной мо­лекулы в ИФА используется молекула фермента. Чувствительность ИФА может быть очень высокой, так как одна молекула фермента может модифицировать большое число молекул субстрата. Один из участников реакции антиген-антите­ло иммобилизуется на твердом носителе. Для обнаружения в клинических об­разцах бактериальных или вирусных антигенов на твердую подложку (полисте-рол) последовательно сорбируются первичные антитела, выявляемый антиген И вторичные антитела с введенной в них ферментной меткой. Для обнаружения

386

антител в биологических жидкостях антиген иммобилизуется на твердом носи­теле, затем исследуемая сыворотка контактирует с иммуносорбентом. Адсорб­ция специфических к данному антигену антител выявляется с помощью меченых антивидовых антител.

Благодаря развитию молекулярной биологии и генетических исследова­ний, разрабатывается направление в диагностике, использующее методы ген­ного зондирования, в основе которых лежит способность нуклеиновых кислот к гибридизации (образованию двухцепочечных структур за счет взаимодействия комплементарных нуклеотидов: А-Т, Г-Ц). Основной принцип генного зондиро­вания (взаимодействие комплементарных структур) методически реализуется способами индикаторных методов иммунодиагностики, при использовании тех же индикаторов (радиоактивные изотопы, флюоросцеины, биотин). На присут­ствие инфекционного агента проводится анализ образцов сыворотки крови, мочи, уретральных соскобов, цельной крови и т.п. Осуществляется лизис клеток, де­натурация ДНК (переход в одноцепочечную форму), затем фиксация на носите­ле (нитроцеллюлозной или нейлоновой мембране), инкубация в вакууме при 80°С, гибридизация с зондом (участки ДНК или РНК, выдепенные из возбудителя или синтезированные химически олигонуклеотиды), детекция образовавшегося ком­плекса. Использование полимеразной цепной реакции (ПЦР) позволяет увели­чить концентрацию определенной последовательности ДНК в пробе за счет син­теза многочисленных копий \п уИго. Для этого к исследуемому образцу ДНК до­бавляют препарат ДНК-полимеразы, избыток ол иго нуклеотидов и 2 праймера, соответствующие концевым участкам интересующей последовательности ДНК. Затем производится плавление (денатурация ДНК). ПЦР позволяет существен­но повысить чувствительность анализа, что важно при низком содержании воз­будителя или при исследовании субмикроскопического количества патологичес­кого материала.

Вторым важным направлением использования иммунологических методов является характеристика функционального состояния отдельных звеньев иммун­ной системы и факторов неспецифической защиты, взаимодействующих с ними. Выявление дефицита какого-либо из них позволяет своевременно начать соот­ветствующую и ммун о корригирующую терапию.

Среди большого набора тестов, существующих в настоящее время для оценки любого компонента иммунной системы, выделяют тесты, с помощью ко­торых можно диагностировать наиболее частые нарушения или получить наибо­лее важную информацию о состоянии иммунной системы, так называемые тес­ты 1-го уровня. Они дают возможность выявить грубые поломки в иммунной си­стеме. Тесты 2-го уровня позволяют установить их механизмы.

Для оценки активности системы фагоцитов используют тесты 1 -го уровня:

абсолютное число нейтрофилов и моноцитов, интенсивность поглощения мик­робов фагоцитами, способность фагоцитов убивать микробы.

Нейтрофилы, являясь одним из активных факторов в системе клеточно-гуморальной кооперации, принимают непосредственное участие не только в противомикробной, но и в противовирусной защите через феномен антитело-зависимой клеточной цитотоксичности либо путем прямой адсорбции вирусов на поверхности клетки с последующим фагоцитозом и дезинтеграцией их в фа-гол и зосо мах.

Оценка фагоцитарной активности нейтрофилов проводится с использова­нием методов, основанных на способности этих клеток к поглощению корпуску­лярных агентов, находящихся всреде, фагоцитарное число (среднее числочас-

тиц, поглощенных одной клеткой) и фагоцитарный индекс (число активнофаго-цитирующих клеток) определяются после инкубирования клеток частицами ла­текса или эритроцитами. Широко используемым чувствительным и информатив­ным способом оценки функционального состояния нейтрофилов является тест восстановления нитросинего тетразолин (НСТ). Восстановление НСТ в фагоци­те прямо зависит от эффективности метаболических путей в клетке, в которой вырабатываются активные формы кислорода с выраженными антимикробными свойствами. Усиленная активация кислородного метаболизма у фагоцитов яв­ляется одним из самых чувствительных индикаторов возбуждения поли- и моно-нуклеарных фагоцитов, хотя и косвенным критерием фагоцитарной активности. Она может регистрироваться также с помощью хемилюминесценции. Важным принципом исследования фагоцитов в клинике является выяснение способнос­ти клеток реагировать на стандартный стимул, что может служить показателем их функционального резерва.

Применяемые для оценки интенсивности хемотаксиса фагоцитов и экс­прессии молекул адгези и (СОИ а, СОПЬ, С011с и др.) на поверхностной мемб­ране нейтрофилов методы относятся ктестам 2-го уровня.

Оценка В-системы иммунитета проводится с использованием следующих методов: 1) определение иммуноглобулинов О, А, М в сыворотке крови; 2) оп­ределение иммуноглобулинов Ев сыворотке крови; 3) определение количества В-лимфоцитов.

Важным параметром служит концентрация иммуноглобулинов, которая оп­ределяется в сыворотке крови методом радиальной иммунодиффузии или мето­дом нефелометрии. Отклонения в уровнях иммуноглобулинов могут быть связаны с инфекцией, поликлональной активацией, аутоиммунным процессом. Иммуно-дефициты, связанные с биосинтезом антител, проявляются прежде всего в виде длительно протекающих рецидивирующих инфекций респираторного тракта, хро­нических синуситов, отитов и др. Дефицит 1дА ассоциируется с аутоиммунными и аллергическими заболеваниями, при которых часто повышен уровень 1дЕ.

Наиболее важными тестами 2-го уровня являются: определение субклас­сов иммуноглобулинов, особенно 1дС, секреторного 1дА, специфических анти­тел к белковым и полисахаридным антигенам, способности лимфоцитов отве­чать пролиферацией на В- (липополисахарид, стафилококк) и Т-В-митогены (ми-тоген лаконоса). Определение дефицита по субклассам !д0 может иметь опре­деленную диагностическую значимость. Например, дефицит !дй2, содержащих преимущественно антитела против полисахаридов инкапсулированных бактерий, ведет к повышенной заболеваемости респираторными инфекциями.

С разработкой гибридомной техники появились уникальные возможности использовать моноклональные антитела как инструмент изучения и идентифи­кации различных популяций и субпопуляций лимфоцитов по наличию на поверх­ности клеток структур с определенными свойствами и тканевой специфичнос­тью (12). Все основные антигенные маркеры лимфоцитов и других клеток им­мунной системы в соответствии с международной классификацией получили название кластеров дифференцировки (СО), Используя меченные флюорохро-мами моноклональные антитела, с помощью флюоресцентной микроскопии или проточной цитофлюорометрии можно определить процент и абсолютное коли­чество В-лимфоцитов (С019, С020) в периферической крови.

Оценку Т-системы иммунитета проводят с применением тестов 1-го уров­ня: общего числа лимфоцитов, процента и абсолютного числа зрелых Т-лимфо-цитов (СОЗ) и двух основных их субпопуляций (С04 и С08), пролиферативного

388

ответа на Т-митогены (ФГА и Кон А). Выявление нарушений в Т-клеточном звене иммунитета имеет диагностическую ценность, так как для них характерны пнев­монии, вызванные Рпеитасузйссаппп, хронический кандидоз, хроническая ди­арея, токсоплазмоз, атипические микобактериальные инфекции, цитомегалови-русная инфекция и т.д., —заболевания, где этиологическим фактором являются факультативно- и обл и гатно-внутри клеточные паразиты.

Оценка функциональной активности Т-системы иммунитета исключитель­но важна, так как она может быть существенно изменена при нормальном коли­честве Т-клеток и их субпопуляций. Наиболее простым методом оценки функци­ональной активности лимфоцитов является реакция бласттрансформации, ко­торую оценивают по способностиклеток отвечать пролиферацией на митогены (фитогем агглютинин, конканавалин А, митоген лаконоса). О пролиферативной активности судят по включению радиоактивной метки в ДНК лимфоцитов, кото­рую определяют по числу сцинтилляций с помощью р-счетчика радиоактивнос­ти. Пролиферативный ответ на митогены понижен практически при всех хрони­ческих инфекционно-воспалительных заболеваниях, при иммунодепрессивной терапии, при СПИДе, первичных Т-клеточных иммунодефицитах.

Определение продукции цитокинов, пролиферативного ответа на специ­фические антигены, кожные тесты с микробными антигенами относят к тестам 2-го уровня. Выявление нарушения синтеза ИЛ-2 сочетается с повышением чув­ствительности организма к внутриклеточным микроорганизмам. Велика роль провоспалительных цитокинов (ФНО, ИЛ-1,у-ИФН) в этиопатогенезе различных острых и хронических воспалительных процессов инфекционной и аутоиммун-ной природы. Провоспалительные иммуноцитокины, секретируемые моноцита­ми и лежащие в основе запуска каскада иммунопогических и острофазовых вос­палительных реакций, связаны с развитием инфекционного заболевания. Повы­шенное образование этих цитокинов определяется в случаях бактериальных ин­фекций. На фоне антибактериальной терапии концентрация их снижается. Со­хранение ги пер продукции провоспалительных цитокинов и выявление высоких их уровней в сыворотке крови и/или ликворе расценивается как неблагоприят­ный прогностический признак, так как часто сопровождается развитием септи­ческого шока и летальным исходом (13).

Наиболее часто исследуемыми в клинике цитокинами являются интерфе-роны, обладающие антивирусной, антипролиферативной и иммуномодулирую-щей активностью. В ответ на стимуляцию вирусами или клеточными активатора­ми лейкоциты и макрофаги продуцируют ИФН-а (лейкоцитарный), фиброблас-ты и эпителиальные клетки ИФН-р (фибробластный), Т-лимфоциты ИфН-у (им­мунный). Определение интерферонового статуса у больных проводят путем ко­личественного измерения титра сывороточного ИФН, уровня спонтанной про­дукции ИфН лейкоцитами, интерфероновой реакции лейкоцитов в ответ на ин­дукторы ИФН: ИФН-а — вирус болезни Ньюкастла (ВБН), — ИФН-а,р — ридос-тин, ИФН-у — фитогемагглютинин. За единицу активности ИФН принимают ве­личину, обратную его разведению, ингибирующую на 50% цитопатическое дей­ствие вируса энцефаломиокардита мышей (ЕМС) на монослой клеток-фиброб-ласговМ-19. Для больных с инфекционными заболеваниями характерно повы­шение уровня сывороточного и спонтанно продуцируемого !п УИто ИФН при сни­женной способности к индуцированному синтезуИФН.

Одной из причин инфекционно-воспалительных заболеваний новорожден­ных является интраамниотическая инфекция (ИАИ). Ранний диагноз ИАИ труден в связи с поздним появлением клинических симптомов. При лабораторном ис­следовании амниотической жидкости также не существует золотого стандарта.

389

В последнее время к таким методам как подсчет лейкоцитов, окраска мазков по Граму, культуральные тесты, определение активности лейкоцитарной эстеразы и концентрации глюкозы, присоединяется идентификация интерлейкинов. Вы­соко предсказательным в отношении микробной инвазии амниотической жид­кости и неонатальной заболеваемости недоношенных новорожденных является определение одного из главных провоспалительных цитокинов, которые опос-редуют ответ хозяина на инфекцию, —ИЛ-6 (14). Определение воспалительных медиаторов ассоциируется с гистологически диагностируемой предродовой инфекцией и церебральными параличами. Найдена высокая связь повреждения белого вещества головного мозга у новорожденных, отнесенных в группу риска по выявлению присутствия гистологических хориоамнионитов и повышенных концентраций ИЛ-6 и ИЛ-1 (15,16).

Даже краткое описание арсенала методов, существующих в настоящее время, позволяет представить себе методические возможности для оценки со­стояния защитных средств организма.

Дата добавления: 2018-02-28 ; просмотров: 644 ;

[youtube.player]

Иммунологическая диагностика инфекционных заболеваний основана на выявлении антител в организме пациента к возбудителю инфекции методами серологических исследований. В их основе - взаимодействие антигена и антитела с образованием иммунных комплексов. Серологические реакции применяются в двух направлениях:

1. Обнаружение с диагностической целью антител в сыворотке крови обследуемого.

2. Установление родовой, видовой и типовой принадлежности микроба или вируса.

Реакция агглютинации (РА). Принимают участие антигены в виде частиц (микробные клетки, эритроциты и др. корпускулярные антигены), которые склеиваются антителами и выпадают в осадок. Различают реакцию микробной агглютинации, гемагглютинации, латексагглютинации, коаглютинации и т.д. (от вида иммунодиагностикума). Различают прямую и непрямую реакции агглютинации.

Реакция прямой агглютинации. В этой реакции антитела (агглютинины) непосредственно агглютинируют корпускулярные антигены (агглютиногены). Обычно используется взвесь инактивированных микроорганизмов. Для определения вида микроорганизмов используют специальные диагностические агглютинирующие сыворотки, полученные путем гипериммунизации лаб. животных взвесью бактерий. Титром такой сыворотки является ее наибольшее разведение, при котором наблюдается отчетливая агглютинация соответствующего антигена.

Реакция связывания комплемента (РСК). Помимо антигена и антител принимает участие третий компонент - комплемент, который способен связываться с комплексом антиген-антитело. Образование комплексов антиген-антитело и фиксация комплемента не сопровождаются видимыми изменениями. Для обнаружения связывания комплемента используют дополнительную индикаторную гемолитичесчкую систему (эритроциты барана, обработанные гемолитической антисывороткой). В присутствии комплемента (сыворотки морской свинки) происходит лизис эритроцитов. Если в опытной системе образовались комплексы антиген-антитело, которые связывают комплемент, то лизис эритроцитов в индикаторной системе не произойдет (реакция положительная). Используется при определении антител к вирусу Коксаки, при лабораторной диагностике сифилиса - реакция Вассермана.

Реакция лизиса. Сущность реакции состоит в том, что при взаимодействии специфических антител с антигенами клеток (эритроцитов, бактерий), на их поверхности образуется комплекс, который активирует комплемент по классическому пути, вследствие этого происходит лизис этих клеток. Эта реакция используется при типировании антигенов системы HLA на лимфоцитах. К типируемым лимфоцитам добавляют антисыворотки против различных HLA-антигенов, затем их отмывают и добавляют комплемент. Присутствие соответствующего антигена приводит к лизису лимфоцитов.

Реакция иммунофлюоресценции. Прямой метод иммунофлуоресценции (по Кунсу) основан на взаимодействии антител, меченных флуорохромом с антигеном, который находится на клетке, в клетке или тканях. В качестве флуорохрома часто используют флуоресцеинизотиоцианат (ФИТЦ). Этот краситель дает зеленое свечение в ультрафеолетовых лучах, а тетраметилродаминизотиоцианат (ТРИТЦ) - оранжево-красное свечение. Прямой метод одноэтапный: на фиксированный мазок клеток с антигеном наносят диагностическую сыворотку с мечеными антителами, инкубируют, отмывают и учитывают свечение в люминесцентном микроскопе. Непрямой метод иммунофлуоресценции заключается в том, что антиген обрабатывают обычной диагностической сывороткой, а для обнаружения образовавшегося комплекса антиген-антитело используют антисыворотку, меченную флуорохромом. Непрямой метод позволяет обнаруживать различные комплексы антиген-антитело с помощью одной меченной антиглобулиновой сыворотки. Метод иммунной флуоресценции применяют для идентификации бактерий, вирусов, клеточных рецепторов и антигенов.

Иммуноферментный анализ (ИФА). В методах иммуноферментного анализа используют иммунореагенты, меченные ферментами. Наиболее широко используется твердофазный ИФА. В качестве твердой фазы используют полистироловые или поливиниловые планшеты или шарики, на которых адсорбированы антигены или антитела. Для выявления антител известный антиген адсорбируют в лунках полистироловой пластины. Затем вносят исследуемую сыворотку, в которой хотят обнаружить антитела к данному антигену. После инкубации лунки промывают для удаления несвязавшихся белков и вносят в них антииммуноглобулиновые антитела, меченые ферментом. После инкубации и отмывания в лунки добавляют специфичный для фермента субстрат и хромоген для регистрации конечных продуктов расщепления субстрата. О наличии и количестве антител судят по изменению цвета и интенсивности окраски раствора. Методы ИФА обладают высокой чувствительностью и специфичностью и получили наиболее широкое распространение среди иммунологических методов клинико-лабораторной диагностики.

Радиоиммунологический анализ. Принцип радиоиммунологического анализа (РИА) основан на выявлении комплекса антиген-антитело, в котором один из иммунореагентов был мечен радиоактивным изотопом. Обычно используют изотопы йода (I-125 и I-131). Учет реакции проводят по убыванию или по возрастанию радиоактивности (в зависимости от методики РИА) с помощью специальных счетчиков ионизирующего излучения.

Иммуноблотинг. Вариант ИФА, повышающий чувствительность метода при изучении гетерогенной смеси антигенов. Смесь антигенов подвергают дискэлектрофорезу в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Полученные таким образом индивидуальные полосы антигенов переносят на нитроцеллюлозные полоски с помощью специального аппарата для переноса. В дальнейшем ход реакции сводится к гетерогенному не конкретному ИФА. Нитроцеллюлозные полоски с перенесенными на них антигенами обрабатывают испытуемой сывороткой. Имеющиеся в ней антитела связываются с индивидуальными антигенами, представленными в виде отдельных полос. Связавшиеся антитела проявляют при обработке конъюгатом фермента с антителами к иммуноглобулинам человека. На последнем этапе определяют активность фермента. Таким образом, можно определить против каких антигенов смеси направлены антитела сыворотки больного. На основе реакции иммуноблотинга созданы диагностические наборы для определения в сыворотке больного антител к вирусу гепатита С и ВИЧ-1-2.

Гибридизационный анализ (ГА). Проводится определение нуклеиновых кислот по связыванию с ДНК- и РНК- зондами. Метод ГА основан на отжиге одноцепочечного фрагмента нуклеиновой кислоты на комплиментарный ему участок другой молекулы анализируемой нуклеиновой кислоты с образованием двух цепочечной гибридной молекулы. Зонд может быть получен либо химическим синтезом олигонуклеотидов. Либо с помощью синтеза ДНК на одной из нитей детектируемой ДНК с помощью фермента ДНК-полимеразы (для РНК с помощью РНК-зависимой ДНК-полимеразы). Полученная копия может быть встроена в плазмиду и затем размножена в составе каких-либо бактерий. Зонд должен иметь репортерную группу, выявляемую ферментативно или физическим методом. В настоящее время в медицинской практике успешно применяются ДНК-зонды, в которых в качестве репортерных групп используют биотин, дегоксигенин, комплексы платины и др. Введение меток может производиться с помощью химических, физических, фотохимических и ферментативных реакций. В частности при амплификации. Также разнообразны методы детекции образовавшегося гибрида нуклеиновых кислот: с помощью хромогенных и хемилюминесцентных субстратов высокоактивных ферментов (пероксидаза, щелочная фосфатаза), люминесценции и др. На основе нерадиоизотопного ГА созданы диагностикумы для выделения вируса папилломы, герпеса, хламидий и уреаплазмы.

Билет № 14

Поперечные профили набережных и береговой полосы: На городских территориях берегоукрепление проектируют с учетом технических и экономических требований, но особое значение придают эстетическим.

[youtube.player]