Днк риккетсий методом пцр

Риккетсии — плеоморфные паразиты, обитающие внутри клеток организма человека и вызывающие многочисленные инфекционные заболевания с преимущественно трансмиссивным механизмом передачи. В своей жизнедеятельности риккетсии тесно связаны с членистоногими — их переносчиками и первичными хозяевами. Патогенные свойства микробов реализуются в организме человека. Они вызывают острые лихорадочные заболевания — риккетсиозы. К роду Rickettsia относятся десять видов, объединенных в три биотипа. Типовой вид рода — R. prowazekii.

Эти своеобразные микробы имеют ряд общих свойств: обитают внутри клетки хозяина, не растут на простых питательных средах, паразитируют у членистоногих, имеют особое строение и размножение, обладают уникальными биологическими и иммунологическими свойствами, вызывают заболевания со своеобразной клиникой и эпидемиологией.

поражение кожи на участке укуса клеща

Риккетсиозы – группа инфекционных заболеваний, связанных общностью этиологии, эпидемиологии, патогенеза, патоморфологии и клиники. У больных возникает первичный аффект, лихорадка и интоксикация, развивается генерализованный васкулит, появляются высыпания на коже. Риккетсии размножаются в месте укуса клеща, пенетрируют кожу и слизистые оболочки, проникают в эндотелий венул, артериол и капилляров. Это приводит к развитию васкулита, проявляющегося характерной сыпью и признаками нейротоксикоза. Осложнениями риккетсиозов являются: геморрагический некроз кожи, гангрена пальцев, инфекционно-токсический шок, олигоурия, анурия, азотемия, анемия, гипонатриемия, гипохлоремия, отек, делирий и кома.

В группу риккетсиозов человека входит большое количество остро протекающих циклических патологий, среди которых выделяют основные и самые распространенные: сыпной тиф, клещевые лихорадки, пароксизмальные риккетсиозы, лихорадку цуцугамуши и лихорадку Ку. Риккетсиозы распространены повсеместно. Чаще всего они встречаются в развивающихся странах. На европейском континенте риккетсиозы регистрируются редко, а в Азии и Австралии эта инфекция широко распространена.

Этиология

Риккетсии — микроорганизмы, имеющие разнообразную форму: кокковидную, палочковидную, нитевидную. Чаще всего они представляют собой мелкие, короткие палочки, не имеющие жгутиков и капсулы. Их форма и размеры могут изменяться в зависимости от фазы роста. При изменении определенных условий они легко образуют клетки неправильной формы.

Для определения типового вида бактерий изучают морфологию клеток, особенности размножения в желточных мешках куриных эмбрионов, воспроизводят экспериментально инфекционный процесс на лабораторных животных, проводят серологический анализ антигенной структуры.

Морфология. Снаружи клетка имеет микрокапсулярный слой, на котором располагается риккетсиозный антиген. Под ним находится мембрана клеточной стенки и цитоплазма. Клеточная оболочка напоминает по химическому составу клеточную стенку бактерий. В цитоплазме располагается нуклеоид, рибосомы, РНК, ДНК. На поверхности риккетсий имеются фимбрии, с наличием которых связана их подвижность.

Тинкториальные свойства. По Грамму микробы окрашиваются в красный цвет. При окраске карболовым фуксином риккетсии становятся розовыми или малиновыми. Риккетсии плохо воспринимают анилиновые красители. Обычно для микроскопического исследования используют метод Романовского-Гимзе.

Физиология. Благодаря особенностям метаболизма риккетсии приспособились к внутриклеточному существованию и утратили способность к жизнедеятельности вне клетки. Риккетсии свободно размножаются в цитоплазме эукариотической клетки без окружения паразитофорной вакуолью. Вне клеток хозяина культивирование микробов невозможно. Они не растут на искусственных питательных средах. В естественным условиях бактерии обитают в живом организме позвоночных и членистоногих, а в лабораторных — в эпидермальных клетках желточного мешка куриного эмбриона, в легочной ткани белых мышек или в культуре живых клеток, культивируемых in vitro. Температурный оптимум роста 32-35°С. Риккетсии медленно растут и размножаются бинарным делением в течение 8-9 часов. Риккетсии имеют ограниченную ферментативную активность, независимую от клетки-хозяина. Они токсичны и гемолитически активны.

Устойчивость. Риккетсии не устойчивы во внешней среде. Они быстро погибают при нагревании и под воздействием дезинфектантов, спирта, эфира, хлороформа. Высушивание и гипотермию микробы переносят относительно легко.

Патогенность. Патогенные свойства риккетсий обусловлены их способностью к пенетрации чувствительной клетки, где они размножаются и продуцируют токсин. Своеобразный термолабильный токсин не секретируется во внешнюю среду и не взывает интоксикацию после гибели возбудителя. Эндотоксин оказывает вазопаралитическое действие, вызывает значительные нарушения ЦНС и расстройства кровообращения. Почти все виды рода Rickettsia патогенны для человека. Микробы обладают тропизмом к клеткам эндотелия сосудов кишечника основных своих хозяев — насекомых. У человека они поражают практически все органы и ткани. При этом клетки, зараженные паразитом, быстро разрушаются.

Антигенные свойства. Антигенная активность обусловлена растворимым группоспецифическим и корпускулярным видоспецифическим антигенами. Они являются иммуногенными и протективными.

Жизненный цикл данных микроорганизмов очень прост. Они могут существовать в двух основных формах — вегетативной и покоящейся. В вегетативной стадии микробы имеют форму палочек, являются подвижными и быстро делятся пополам. Покоящиеся формы — сферические и неподвижные клетки, располагающиеся в клетках членистоногих и теплокровных. Зачастую такие формы могут находиться в организме до 10 лет, сохраняясь и при благоприятных условиях снова активируясь.

Эпидемиология

Риккетсиозы бывают двух видов — антропонозные и зоонозные. В первом случае источником инфекции является больной человек, а переносчиком – вши, во втором происходит передача микробов от животных через укусы блох и клещей. Риккетсии на протяжении длительного времени могут сохраняться в слюнных железах кровососущих насекомых. При заражении членистоногие обычно погибают.

Заражение переносчиков-членистоногих происходит через инфицированные яйца от одного поколения к другому, а также через кровь больного человека во время укуса. Возможно распространение инфекции через промежуточных хозяев – крыс, мышей, собак. У них наблюдается здоровое носительство или латентная форма инфекции без каких-либо клинических признаков. Опасность для человека также представляет моча больных коров и их фекалии. При сыпном тифе резервуаром инфекции является человек. Скрытое течение при неблагоприятных условиях сменяется острым, а инфекция, распространяясь, приобретает характер эпидемии.

Кроме трансмиссивного пути заражения риккетсиозом возможен гемотрансфузионный и трансплацентарный, в отдельных случаях – контактный, аспирационный, алиментарный путь. Входные ворота инфекции большинстве случаев — кожа человека.

Патогенетические звенья риккетсиозов:

1. Укус кровососущего насекомого,
2. Размножение риккетсий в месте внедрения,
3. Развитие местной воспалительной реакции – первичного аффекта,
4. Проникновение риккетсий в кровь,
5. Размножение возбудителя в макрофагах и гистиоцитах,
6. Распространение микробов с током крови по всему организму,
7. Выраженный интоксикационный синдром,
8. Размножение риккетсий в эндотелии капилляров,
9. Генерализованный васкулит с тромбозом,
10. Поражение ЦНС и сердечно-сосудистой системы,
11. Появление характерной экзантемы.

После перенесенных риккетсиозов обычно остается стойкий иммунитет.

Симптоматика

Инкубационный период при риккетсионой инфекции составляет 1–2 недели.

Общие симптомы риккетсиозов:

• Головная боль,
• Миалгия,
• Лихорадка,
• Озноб, сменяющийся жаром,
• Развитие носовых кровотечений,
• Нарушение сознания,
• Судороги,
• Проблемы со зрением и слухом,
• Сыпь на коже конечностей и туловища,
• Струп на месте укуса насекомого,
• Лимфаденит,
• Апатия,
• Слабость во всем теле,
• Сухой кашель,
• Симптомы поражения ЦНС,
• Брадикардия,
• Головокружения,
• Артериальная гипотония.

Сыпной тиф манифестирует с лихорадки и симптомов интоксикации. У больных краснеет и отекает лицо, инъецируются склеры, появляется энантема на мягком небе. На коже боковой поверхности груди, живота, рук появляется яркая розеолезно-петехиальная сыпь, которая держится неделю, а потом бледнеет и исчезает. Одновременно нормализуется температура тела, проходит интоксикация. Постинфекционная астения сохраняется несколько дней. В тяжелых случаях поражается ЦНС, развивается менингит или энцефалит с характерной клиникой.

фото: клещевой риккетсиоз

Типичным признаком клещевого риккетсиоза является первичный аффект или струп – воспалительная реакция кожи в месте проникновения возбудителя. У больных повышается температура тела, развивается регионарный лимфаденит и интоксикационный синдром, брадикардия, гипотония, гепатоспленомегалия. На коже в области суставов появляются полиморфные розеолезно-папулезными элементы, нередко трансформирующиеся в прыщи. На фоне лихорадки и интоксикации возникает боль в горле, гиперемия слизистой, конъюнктивит. На месте сыпи появляется и длительно сохраняется пигментация. В отличии от сыпного тифа при клещевом риккетсиозе поражаются преимущественно сосуды кожи, а не головного мозга. Деструкция эндотелиальных клеток сосудов менее выражена.

Пароксизмальные риккетсиозы проявляются приступами лихорадки, во время которых температура повышается до 40°С. Больных знобит. У них болят кости, мышцы, суставы. Все остальные признаки, характерные для прочих риккетсиозов, обычно отсутствуют. Течение патологии затяжное, но доброкачественное.

Лихорадка Ку часто протекает по типу ОРЗ, гриппа, бруцеллеза. Заболевание начинается остро с подъема температуры, озноба, гипергидроза, цефалгии, артралгии и миалгии. Осложнения развиваются практически у всех больных: гепатолиенальный синдром, интерстициальная пневмония, тромбофлебит, панкреатит, эндокардит.

Диагностика

Диагностические мероприятия при подозрении на риккетсиоз включают сбор эпиданамнеза, анализ клинических данных и лабораторную верификацию возбудителя.

1. Серологическое исследование заключается в постановке реакции связывания комплимента, реакции агглютинации, иммунофлюоресценции, иммуноферментного анализа. Эти методы позволяют идентифицировать возбудителя путем определения его антигенов и специфических антител. Результаты серодиагностики следует интерпретировать с большой осторожностью, поскольку часто встречается между штаммами различных видов бактерий перекрестная активность.
2. Бактериологическое исследование — выделение риккетсий из крови, мочи, ликвора, биоптата струпа. В лаборатории заражают морских свинок, белых мышей или развивающийся куриный эмбрион. Выделение возбудителя – абсолютный диагностический критерий. Работать с риккетсиями разрешено только в специально оборудованных лабораториях, имеющих высокую степень защиты. Именно поэтому выделение возбудителя осуществляют редко.
3. Проведение кожно-аллергических проб позволяет установить диагноз. Внутрикожная аллергическая проба становится положительной у больных к середине заболевания.
4. Проба Музера-Нейла — введение в брюшко морской свинки венозной крови лихорадящего больного. Если у животных появляются симптомы лихорадки, некроз тканей, отек мошонки, диагноз подтверждается. Чаще всего животное погибает.

Лечение

Лечением риккетсиозов занимаются инфекционисты. Оно заключается в проведении этиотропной, симптоматической и патогенетической терапии.

Такое лечение длится около месяца. Проводится оно обязательно в стационаре под наблюдением медицинских работников. Специальные боксы инфекционного отделения не допустят распространения инфекции. Персонал больницы должен быть защищен от заражения. Сотрудники должны носить специальные защитные костюмы и выполнять все манипуляции в строгом соответствии с правилами безопасности.

Профилактика

Простые правила, позволяющие обезопасить себя от болезнетворных микробов и избежать развития патологии:

1. Ношение одежды с длинным рукавом и шляпы с широкими полями в парках, скверах, лесах, зоопарках и других местах, где возможен контакт с кровососущими насекомыми,
2. Использование репеллентов,
3. Осмотр своего тела на предмет укусов,
4. Борьба с клещами, вшами, блохами,
5. Уничтожение мышей и крыс в канализации, на свалках и подвалах,
6. Соблюдение правил личной гигиены.

Видео: риккетсия – учебный фильм по биологии

Что такое риккетсии

К одним из самых маленьких по размеру бактерий относятся риккетсии (латинское название Rickettsia). Они могут выглядеть как кокковидные, палочковидные или полиморфные клетки.

В это семейство входят как бактерии-сапрофиты, так и микроорганизмы, способные вызывать специфические заболевания.

Общая характеристика риккетсий:

• являются облигатными внутриклеточными паразитами, биологически связаны с членистоногими;
• не растут на бесклеточных питательных средах, чем отличаются от большинства бактерий;
• характеризуются рядом отличий и особенностей во всех сферах жизнедеятельности в сравнении с другими бактериями;
• заболевания, чаще всего лихорадочные, вызываемые этими микроорганизмами, имеют специфическую клиническую картину;
• даже методы изучения эти бактерии имеют особенные – риккетсиологические.

По своим свойствам риккетсии занимают промежуточное положение между бактериями и фильтрующимися вирусами:

• по строению, ферментной активности и чувствительности к антибиотикам близки к бактериям;
• по способности существовать только как внутриклеточный паразит – к вирусам.

К риккетсиям относят 29 видов (май 2017 г.) микроорганизмов, и в большей своей части они не патогенны для млекопитающих. К наиболее известным патогенным видам относятся Rickettsia prowazekii (возбудитель сыпного тифа), Rickettsia conorii (возбудитель марсельской лихорадки) и другие.

Таксономия и классификация

Согласно современной классификации, таксономическое положение этих бактерий выглядит следующим образом: они принадлежат к домену Бактерии, типу Протеобактерии, классу Альфа-протеобактерии, порядку Rickettsiales, семейству Rickettsiaceae, к которому относятся три рода, содержащие виды, патогенные для млекопитающих.

К ним относятся:

Согласно общепринятой систематике, виды бактерий входят в состав рода.

К роду Rickettsia относятся восемь видов микроорганизмов, их принято подразделять на следующие группы.

Вшиво-блошиные сыпные тифы:

• Rickettsia prowazekii (риккетсии Провачека);
• Rickettsia typhi, Ber; H. Mooser (риккетсии Музера).

Клещевые пятнистые лихорадки:

• Rickettsia rickettsia;
• Rickettsia conorii;
• Rickettsia australis;
• Rickettsia sibirica;
• Rickettsia akari.

Японская речная лихорадка: Rickettsia tsutsugamushi (R. orientalis) – возбудитель лихорадки цуцугамуши (краснотелково-клещевая лихорадка).

Род Rochalimaea включает в себя Rickettsia quintana, возбудитель траншейной лихорадки.

К роду Coxiella относят Coxiella burnetii (риккетсии Бернета), вызывающие Ку-лихорадку.

Описание и морфология

Морфология риккетсий достаточно разнообразна, так как они относятся к плеоморфным бактериям – микроорганизмам, обладающим морфологической изменчивостью. Внешние условия способны оказывать большое влияние не только на размеры, но и на форму бактерий.

При благоприятных условиях риккетсии соизмеримы с крупными вирусами и имеют характерную палочкообразную форму (например, риккетсии Бернета) с размерами:

• ширина в среднем 0,5 мкм;
• длина от 0,4 до 2,0 мкм.

При наступлении неблагоприятных условий микробы могут изменять форму на кокки, нитевидные или клетки неправильного вида.

Строение клетки риккетсий соответствует нормам клеточного строения типичных прокариотов. В ней присутствует клеточная оболочка, протоплазма, ядерный материал. Как и все микробы, риккетсия не имеет ядра, а содержит ДНК, рибосомы и РНК. Наличие спор и капсул у этих бактерий не выявлено.

Нехарактерным для грамположительных, но типичным для грамотрицательных микроорганизмов принято считать наличие у бактерий (например, Rickettsia conorii) трехслойной мембраны и поверхностного микрокапсулярного слоя.

Характерная окраска – общая характеристика патогенных риккетсий:

• окрашивание по Граму отрицательное;
• окраска по Здродовскому насыщенно окрашивает микробы в рубиновый цвет, что позволяет легко их обнаружить на фоне синего клеточного ядра или голубой цитоплазмы;
• по Романовскому-Гимзе микроорганизмы окрашиваются в сиреневый цвет.

Исследования при помощи электронного микроскопа позволили выявить у некоторых видов рода Rickettsia волосовидные фимбрии (ворсинки на поверхности клетки), роль которых в физиологии этих микроорганизмов не выяснена.

Для морфологии и ультраструктуры риккетсий характерны ряд особенностей, отличающие их от других прокариотов:

• Клеточные стенки имеют капсулообразный слизистый покров.
• Наличие в значительном количестве ненасыщенных жирных кислот в составе мембраны, что нехарактерно для бактерий.
• В состав нуклеоида входит кольцевая хромосома.
• Хотя все риккетсии – внутриклеточные паразиты (ни о каком симбиозе или мутуализме нет и речи), их метаболизм независим от обменных процессов, протекающих в клетке-хозяине.
• Способность к индукции фагоцитоза посредством клеток эукариотов.
• Клетки бактерий обладают адгезивными свойствами, что способствует их креплению и колонизации чужого организма.
• Источником энергии для микробов является глутамат.

Риккетсии с вирусами и другими бактериями имеют как сходные черты, так и различия. Микробиологи считают их переходным звеном от вирусов к бактериям.

Биохимическая активность

Биохимическая активность риккетсий не выявлена. Реакция агглютинации риккетсий представляет собой специфическое взаимодействие агглютининов (антител) с целой клеткой, с образованием осадка (агглютината). Данная реакция применяется при серологическом методе исследования инфекционных болезней, а также при определении антигенной структуры микроба.

У бактерий выявлено два антигена:

• термостабильный групповой;
• термолабильный специфический.

Реакция пассивной гемагглютинации (непрямой РНГА), с использованием сухого антигена из риккетсий Провачека, является более чувствительной – в ней используют фиксацию антител на обработанных формалином эритроцитах.

Первым тестом при серодиагностике риккетсиозов была реакция агглютинации с протеями (Вейля-Феликса), исключение составляет лихорадка Скалистых гор, вызванная Rickettsia rickettsia.

Бактериальным токсином риккетсий является термолабильный эндотоксин. Ферментативные и биохимические свойства бактерий рода Rickettsia не выражены.

Особенности дыхания и питания

Группа микроорганизмов рода Риккетсии (Rickettsia conorii) по типу дыхания является аэробной и может развиваться только при наличии кислорода, в отличие от анаэробов, которым кислород для жизнедеятельности не нужен.

По типу питания представители рода Rickettsia являются хемоорганотрофами, облигатными (нежизнеспособными вне организма-хозяина) паразитами.

Для этих микроорганизмов характерен тип питания, при котором источником энергии для бактериальной клетки служат химические соединения, а углеводы она получает из органических веществ.

Рост и размножение

Ростом клетки называют согласованное воспроизведение клеточных компонентов, приводящее к увеличению клеточной массы. Чаще всего бактерии растят на различных питательных средах, но, являясь внутриклеточными паразитами, риккетсии размножаются и растут только внутри клетки-хозяина.

Размножением бактерий принято называть увеличение количества клеток внутри одной популяции. Размножение риккетсий происходит посредством простого бинарного деления, и оно случается в значительной степени благодаря получению паразитами от клеток-хозяев насыщенных энергией соединений.

Весь жизненный цикл риккетсий состоит из двух стадий:

Являясь облигатными паразитами, риккетсии способны размножаться, только (за малым исключением) находясь в живых тканях. Единственным известным видом, способным к внеклеточному росту, является возбудитель траншейной лихорадки Rickettsia quintana.

Покоящаяся форма бактерий обеспечивает им наилучшую сохранность в окружающей среде.

Культивирование

В связи с паразитарной природой культивирование риккетсий, которые способны к росту исключительно внутри живой клетки, осуществляют на следующих препаратах:

• различных тканях;
• живых лабораторных животных;
• курином эмбрионе.

Особенности культивирования риккетсий связаны с тем, что микроорганизмы – облигатные паразиты, не осуществляют рост ни на каких бесклеточных питательных средах.

• Выращивание микроорганизмов с использованием методов культивирования осуществляют на переживающих (временно сохранена клеточная жизнеспособность) материалах. Они представляют собой мелкодисперсную взвесь тканей или частей органов в солевом (возможно, в питательном) растворе.
• Хорошо показал себя метод выращивания микробов на двенадцатидневном курином эмбрионе, с поддержанием температурного оптимума роста (37°С) в течение шести дней. Метод прекрасно зарекомендовал себя для приготовления диагностических препаратов и получения вакцин из риккетсий.
• Успешно культивируют микробы в организме живых белых мышей – наибольшее количество бактерий собирается в легких грызунов.
• Микроорганизмы культивируют, инфицируя вшей дисперсной взвесью активных микробов (метод Вейгля-Мосинга), а также выращивают на их личинках (Пшеничнов-Райхер).

Где обнаруживаются риккетсии

В естественных условиях микроорганизмы, не вызывая заболеваний, обитают в клеточных тканях членистоногих, таких как:

• клещи преимущественно из рода Dermacentor;
• блохи;
• вши.

Основываясь на природе переносчика бактерий, все риккетсиозы делят на две большие группы, к ним относятся:

• клещевая пятнистая лихорадка;
• сыпной тиф.

Иксодовые клещи, преимущественно из рода Dermacentor, являются основными переносчикам возбудителей заболеваний группы клещевой пятнистой лихорадки. Инфекция передается через слюну во время укуса. В обеих Америках клещи видов D. andersonii и D. variabilis являются основными переносчикам Пятнистой лихорадки. В Сибири иксодовые клещи видов D. nuttali и D. silvarum разносят Rickettsia sibirica – причину заражения человека сибирским (североазиатским) риккетсиозом.

Платяная вошь переносит риккетсии, вызывающие сыпной тиф (Rickettsia prowazekii), и выделяет эти микроорганизмы с фекалиями. Способ передачи возбудителя – трансмиссивный, через контаминацию (заражение через втирание фекалий в момент расчесывания укусов).

Возбудители риккетсиоза успешно размножаются в клетках любых позвоночных – грызунов, овец, крупного рогатого скота и человека.

Эпидемиология

Передача инфекции в человеческий организм происходит по трансмиссивному пути. Попадая в организм, патогенные риккетсии вызывают протекающие в тяжелой форме риккетсиозы.

В истории человечества переоценить значение риккетсиозов невозможно. Только от сыпного тифа, возбудителем которого является R. prowazekii, человечество страдало многие века, а число жертв исчислялось миллионами. Во время военных действий эпидемия тифа (его еще называли военной лихорадкой) зачастую оказывала решающее влияние на исход военных действий.

У больных тифом быстро развивалось недомогание и поднималась высокая температура с ознобом и тошнотой. При проявлении лихорадки платяная вошь сразу покидает хозяина и переходит к другому – таким образом переносчик разносит инфекцию.

Типичным представителем трансмиссивного пути передачи инфекции посредством инокуляции (заражение здорового человека при укусе инфицированным насекомым) является марсельская лихорадка. Марсельская, или средиземноморская, лихорадка (возбудитель Rickettsia conorii) является острым зоонозным риккетсиозом. Переносчиком инфекции является собачий клещ, резервуаром считают собак, шакалов, различных грызунов и ежей.

Марсельская лихорадка характеризуется спорадическим (случайным) и ярко выраженным сезонным характером (май-октябрь). Географически марсельская лихорадка отмечалась на Черноморском побережье, в Средиземноморье и Индии. В Астраханской области отмечается астраханская риккетсиозная лихорадка, которую считают подвидом марсельской.

Бактерии в организме клеща способны сохраняться долго – 1,5 года. Кусая животных, клещи выделяют бактерии со слюной и с фекалиями.

В чем опасность для человека

Инфекционные заболевания, вызываемые патогенными для человека риккетсиями, носят название риккетсиозы. Чаще всего причиной являются укусы клещей или вшей. У человека риккетсиозы протекают в виде лихорадок различной степени тяжести.

Патогенез (механизм возникновения и развития патологии) различных риккетсиозов по своей сути сходен:

• Возбудитель проникает через кожные покровы и начинает размножаться вблизи места проникновения, вызывая в этом месте воспалительную реакцию.
• Далее поражаются сосуды. Для болезней, вызванных возбудителями риккетсиоза, типично появление кожных высыпаний.
• К опасным и вредным факторам следует отнести поражение сердца и головного мозга.
• У больных, перенесших риккетсиоз, формируется специфический иммунитет, однако некоторые риккетсии (Rickettsia prowazekii) способны спустя много лет спровоцировать повторное заболевание.

Поэтому создание вакцины из инактивированных микробов имеет большое положительное значение для жизни человека.

Наиболее распространенные заболевания, вызываемые риккетсиями

Эпидемический сыпной тиф и болезнь Брила Rickettsia prowazekii Эндемический блошиный сыпной тиф Rickettsia typhi Лихорадка цуцугамуши Rickettsia tsutsugamushi Клещевые пятнистые лихорадки (марсельская) Rickettsia conorii Ку-лихорадка Coxiella burnetii

Тяжело протекает пятнистая лихорадка Скалистых гор, лихорадка цуцугамуши и сыпной тиф. Ку-лихорадка может протекать в латентной форме и не иметь симптомов риккетсиоза вообще.

Микробиологическая диагностика

Лабораторная диагностика различных инфекций, вызванных риккетсиями, основывается на выделении возбудителя. Наиболее эффективны исследования будут в острый период, до начала приема антибиотиков.

Патогенные риккетсии, вызвавшие заболевание, исследуют методами лабораторной диагностики. Используют несколько методов:

• серологические (РНГА, РСК, ИФА и другие);
• культуральные;
• молекулярно-генетические (ПЦР, изучение нуклеотидных последовательностей генов).

В результате исследования образцов в мазке может быть поставлен правильный диагноз, позволяющий исключить наличие других риккетсиозов и назначить правильное лечение.

Возможность изучать столь мелкие бактерии, как риккетсии, возникла только с появлением электронного микроскопа. История изучения этих микроорганизмов только начинается, и микробиологи открывают новые виды и новые свойства.

Образование высшее филологическое. В копирайтинге с 2012 г., также занимаюсь редактированием/размещением статей. Увлечения — психология и кулинария.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Предложен набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для идентификации вируса клещевого энцефалита, вируса лихорадки Западного Нила, боррелий и риккетсий методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени. Изобретение обеспечивает набор праймеров и зондов для мультиплексной идентификации генетического материала четырех инфекционных патогенов, передающихся клещами. 4 ил., 4 табл., 2 пр.

Изобретение относится к набору диагностических праймеров и зондов для одновременного выявления генетического материала вируса клещевого энцефалита, вируса лихорадки Западного Нила, риккетсий и боррелий и может быть использовано в биотехнологии, в частности в генетической инженерии, в медицине для выявления генетического материала вируса клещевого энцефалита, вируса лихорадки Западного Нила, риккетсий и боррелий в образцах клещей, в клинических или секционных пробах с целью постановки диагноза или коррекции лечения, а также для решения научно-исследовательских задач по изучению клещевых инфекций, созданию диагностических, профилактических или лечебных препаратов.

На территории России широко распространены сочетанные очаги клещевых инфекций вирусной, бактериальной, риккетсиозной и протозойной природы. Имеются данные об инфицированности клещей одновременно несколькими патогенами, что ведет к возникновению микст-инфекций. Все это создает новую эпидемиологическую ситуацию, когда без решения вопросов дифференциальной диагностики невозможен успех в борьбе с этой большой группой заболеваний человека.

Клещевые инфекции поражают центральную нервную систему, различные органы и ткани. Неадекватная и запоздалая терапия может привести к развитию хронических заболеваний или инвалидности.

В настоящее время известны коммерческие наборы реагентов (аналоги) для обнаружения генетического материала возбудителей клещевых инфекций в исследуемых образцах:

Данные наборы реагентов обладают достаточной чувствительностью и специфичностью, и с их помощью возможно выявление генетического материала боррелий, вирусов клещевого энцефалита и лихорадки Западного Нила. Однако все указанные наборы имеют в своем составе праймеры и зонды, позволяющие идентифицировать генетический материал инфекционных патогенов, передающихся иксодовыми клещами, только в моноплексном варианте, что требует четырех отдельных постановок ПЦР для идентификации четырех инфекционных патогенов. Использование разработанного набора олигонуклеотидных праймеров и зондов позволяет одновременно в одной реакционной ПЦР-смеси выявлять генетический материал вируса клещевого энцефалита, вируса лихорадки Западного Нила, риккетсий и боррелий, что сокращает время проведения диагностики и делает исследование более полным, поскольку иксодовые клещи могут являться переносчиками одновременно нескольких инфекций.

Известны методы обнаружения генетического материала клещевых инфекций, предложенные в работах:

- [Hanaoka N, Matsutani M, Kawabata H, Yamamoto S, Fujita H, Sakata A, Azuma Y, Ogawa M, Takano A, Watanabe H, Kishimoto T, Shirai M, Kurane I, Ando S. Diagnostic assay for Rickettsia japonica // Emerg Infect Dis. 2009 Dec; 15(12):1994-7], где представлен набор олигонуклеотидов для диагностики риккетсиозов;

- [Yeh JY, Lee JH, Seo HJ, Park JY, Moon JS, Cho IS, Lee JB, Park SY, Song CS, Choi IS. Fast duplex one-step reverse transcriptase PCR for rapid differential detection of West Nile and Japanese encephalitis viruses // J Clin Microbiol. 2010 Nov; 48(11):4010-4], где предлагается набор праймеров для мультиплексной идентификации вируса лихорадки Западного Нила и вируса Японского энцефалита, методом ПЦР с детекцией продуктов амплификации методом гель-электрофореза;

- [Schwaiger M, Cassinotti P. Development of a quantitative real-time RT-PCR assay with internal control for the laboratory detection of tick borne encephalitis virus (TBEV) RNA // J Clin Virol. 2003 Jul; 27(2):136-45], в которой представлен набор олигонуклеотидов для детекции РНК вируса клещевого энцефалита;

- [Courtney JW, Kostelnik LM, Zeidner NS, Massung RF. Multiplex real-time PCR for detection of Anaplasma phagocytophilum and Borrelia burgdorferi // J Clin Microbiol. 2004 Jul; 42(7):3164-8], где представлен метод идентификации клещевых бактериальных инфекций, основанный на мультиплексной ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией результатов в режиме реального времени.

Однако описанные в этих работах методы диагностики клещевых инфекций подразумевают либо моноплексный формат проведения ПЦР, либо применение набора праймеров и зондов для детекции только двух инфекций, либо применение гель-электрофоретической детекции продуктов амплификации, что делает метод более трудоемким и повышает риск контаминации продуктами амплификации ДНК.

Результаты патентного поиска по выявлению генетического материала вируса клещевого энцефалита, вируса лихорадки Западного Нила, риккетсий и боррелий позволили определить несколько зарубежных аналогов, которые все же значительно отличаются от предлагаемого изобретения.

Известна патентная заявка США №20100278866, касающаяся метода ELISA клещевого энцефалита (КЭ), а не ПЦР диагностике, не позволяет проводить экспресс диагностику КЭ на ранних стадиях заболевания и является более затратным по времени постановки реакции и уступает методу ПЦР по чувствительности.

Известна патентная заявка США №20110143358, касается метода сравнения нуклеотидных последовательностей клещевых инфекций масс-спектрометрией и не может быть использована в практической лабораторной диагностике ввиду высокой стоимости.

Известна патентная заявка США №20120171679, касается использования мультиплексных биочипов в составе роботизированного комплекса для экспресс-диагностики инфекционных агентов, в том числе во время биотеррористических актов. Данный комплекс предусматривает использование дорогостоящего оборудования и не может быть доступен при выполнении простых диагностических задач.

Патенты Китая №CN101967513 и №CN101886113 касаются современного метода LAMP-PCR. Однако данный метод не может быть использован в лабораторной диагностике в настоящее время, поскольку предназначен для использования только в полевых условиях, не является количественным, и, кроме того, до настоящего времени ни одна LAMP-PCR тест-система не получила разрешения для использования в клинической лабораторной практике. Кроме того, метод LAMP-PCR является более дорогостоящим по сравнению с традиционным ПЦР и не может быть использован в формате мультиплексного ПЦР.

Изобретения по патенту Испании №ES2264642 и международной заявке №WO2004005479 касаются выявлению возбудителей трансмиссивных инфекций методом ПЦР, но не позволяет проводить выявления вирусов клещевого энцефалита и Западного Нила. Кроме того, данный набор не зарегистрирован и недоступен на территории Российской Федерации. Стоимость диагностических тест-систем, произведенных за рубежом, значительно выше российских, что делает их недоступными в лабораторной практике.

Патент Китая №CN101629215 касается тест-системы для выявления вируса Западного Нила методом ПЦР в формате мультиплекс с инфекционными агентами, передающимися не клещами, а комарами, не являющимися эндемичными на территории России. Кроме того, стоимость диагностических тест-систем, произведенных за рубежом, значительно выше российских, что делает их недоступными в лабораторной практике.

Однако конструкция данного набора реагентов исключает возможность определения генетического материала вируса лихорадки Западного Нила и бактерий семейства Rickettsiae, являющихся возбудителями большой группы трансмиссивных острых лихорадочных заболеваний.

Техническим результатом заявляемого изобретения являлась разработка неизвесного ранее набора олигонуклеотидных праймеров и зондов для мультиплексной идентификации генетического материала четырех инфекционных патогенов, передающихся клещами: вируса клещевого энцефалита, вируса лихорадки Западного Нила, риккетсий и боррелий в образцах клещей, в клинических и секционных образцах и вируссодержащих пробах (культуральная вируссодержащая жидкость и т.д.), методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени.

Указанный технический результат достигается тем, что создан набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченых зондов для идентификации вируса клещевого энцефалита, вируса лихорадки Западного Нила, боррелий и риккетсий методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени, включающий:

- последовательности, видоспецифичные для вируса клещевого энцефалита:

- последовательности, видоспецифичные для вируса лихорадки Западного Нила: