Тест-системы для диагностики вирусного гепатита а

Для выявления специфических (вирусных) нуклеиновых кислот и их фрагментов в сыворотке крови больных гепатитами, разработана (К. Миллис с соавт., 1985-1987) и широко применяется полимеразная цепная реакция (ПЦР). С высокой степенью разрешения она позволяет определить HBV-ДНК, HCV-PHK, а также генотипы HCV В последнее время с помощью ПЦР выявляют HGV-PHK и TTV-ДНК. Этот набор реакций позволяет осуществлять не только диагностику различных типов вирусного гепатита, но и использовать их для контроля проводимого противовирусного лечения (слежение за динамикой вирусемии).

Используется широкий арсенал методов серологической диагностики вирусных гепатитов1, позволяющий выделять вирусоспецифические антигены в различных биологических материалах, полученных от больных (кровь, фекалии, слюна, сперма, влагалищный секрет, материнское молоко; пунктаты печени; ткань печени и других органов, полученных посмертно, а также методы определения у больных антител различных классов).

Гепатит А. Среди разработанных и апробированных методов специфической диагностики в настоящее время подавляющее распространение получил иммуноферментный анализ (ИФА), позволяющий выявлять как вирусоспецифические антигены в материалах от больных (фекалии), так и антител различных классов IgM и IgG в сыворотке крови. Наиболее информативным является тест определения анти-ВГА класса IgM, поскольку эти антитела синтезируются у всех больных уже в инкубационном периоде вслед за репродукцией вируса. Определение анти-ВГА класса IgG имеет значение в эпидемиологических исследованиях при изучении иммуноструктуры населения, титровании иммуноглобулинов и т.д.

Что касается определения самого возбудителя или его фрагментов в настоящее время, при необходимости, трудоемкий метод иммунной электронной микроскопии может быть заменен ИФА, а также методом молекулярной гибридизации, позволяющим выявлять вирусную РНК в биологических объектах. Тест-системы для диагностики ГА выпускаются многими фирмами из различных стран мира, включая Россию.

Гепатит В характеризуется наличием вируса и(или) его антигенов как в ткани печени, так и циркуляцией их в крови в определенных временных взаимоотношениях с соответствующими антителами. Антигены HBSAg, HBCAg, HBEAg; антитела: анти-HBS, анти-НВС, анти-НВЕ. Для выявления самого вируса может быть использован метод иммунной электронной микроскопии, однако в последнее время он вытеснен молекулярно-биологическими методами, позволяющими определить вирусоспецифическую ДНК в минимальных количествах, отражающих имеющуюся репродукцию вируса - молекулярная гибридизация нуклеиновых кислот (дот-гибридизация, спот-гибридизация, полимеразная цепная реакция).

Определение ДНК гепатита В важно не столько для установления этиологии заболевания, сколько для оценки эффективности противовирусной терапии. Поверхностный антиген ВГВ (HBSAg) является основным маркером инфекции. Он выявляется у больных уже в инкубационном периоде за много недель до появления биохимических сдвигов в крови и исчезает в период реконвалесценции с сероконверсией на анти-HBS при благополучном исходе инфекции и сохраняется при ее хронизации. Аналогичная картина наблюдается и с HBEAg-свидетелем активной репродукции вируса и высокой инфекционности сыворотки. Другим информативным маркером инфекции являются анти-HBCAgM, которые присутствуют в высоких титрах в остром периоде и более низких - при хроническом гепатите. Для определения указанных маркеров в настоящее время, в подавляющем большинстве случаев, применяется ИФА с использованием коммерческих диагностикумов.

Что касается HBsAg, то используется реакция обратной пассивной гемагглютинации (РОПГА), однако ее чувствительность значительно ниже ИФА (20-50 нг/мл и 0,5-3,0 нг/мл соответственно). В связи с этим РОПГА может быть применена при анализе сывороток крови больных, у которых концентрация HBsAg высокая и не рекомендуется в службе крови при выявлении возможных носителей HBsAg в низкой концентрации. При диагностике ГВ необходимо учитывать, что определение маркеров иногда не позволяет адекватно оценить активность и направленность патологического процесса у больных, что может быть связано с индивидуальными особенностями макроорганизма.

Диагностика гепатита А основана на эпидемиологических, клинических и лабораторных данных. Лабораторная диагностика основана на выявлении маркеров репликации вируса — антител IgM и IgG к антигенам возбудителя и проведение генетического анализа — обнаружение в сыворотке крови вирусной РНК. Ограниченное значение имеет методика выявления антигенов вируса, что связано с тем, что пик их образования приходится на период инкубации и самый ранний желтушный период. Культуральное исследование для диагностики гепатита А используется редко. На многослойных культурах клеток вирусы не растут. Предпочтение отдается лейкоцитарным или органным культурам.

Рис. 1. Желтуха у больного.

Клинические данные, указывающие на гепатит А

При диагностике заболевания следует учитывать тот факт, что наиболее часто заболевание регистрируется у детей от 5 до 14 лет. У детей в возрасте до 5-и лет в 80% болезнь протекает бессимптомно в безжелтушной форме. У детей старшего возраста и взрослых желтушная форма заболевания регистрируется в 70% случаев.

На наличие у больного гепатита А указывают следующие клинические данные:

Контакт с больным гепатитом А, употребление воды из непроверенных источников, немытых овощей и фруктов и др., посещение стран Азии, Африки и Латинской Америки в среднем за 14 — 28 дней до заболевания. Амплитуда колебания инкубационного периода находится в пределах 7 — 50 дней.
Острое начало заболевания с гипертермией, интоксикационным, диспептическим и астеновегетативным синдромами.
При желтушной форме заболевания преджелтушный период короткий.
Улучшение самочувствия больного с появлением желтухи.
Значительное повышение (в 5 — 40 раз) уровня аминотрансфераз (АЛТ и АСТ) в сыворотке крови и тимоловой пробы.

Для диагностики гепатита А используется, в основном, сыворотка крови и фекальные массы.

Рис. 2. Потемнение мочи и обесцвечивание кала — опорные признаки болезни.

Диагностика заболевания с помощью серологических исследований

Идентифицировать гепатит в острой фазе можно только путем выявления в сыворотке крови специфических антител IgM и IgG. Данные маркеры заболевания выявляются с помощью серологических реакций ИФА (иммуноферментный анализ) и РИА (радиоиммунный анализ). Оба метода диагностики высокоспецифичны и высокочувствительны. При постановке РИА используются специфические IgG меченные радионуклидом 125И, при постановке ИФА — ферментом пероксидазой. С помощью реакции иммуннофллюоросценции можно исследовать биоптаты печени. Серологические методы диагностики используются также с целью эпидемиологического обследования контактных лиц.

IgМ начинают вырабатываться в организме больного уже с конца инкубационного периода и присутствуют в крови в течение 3 — 6 месяцев после перенесенного заболевания.
IgG начинают вырабатываться на 2 — 3 неделе заболевания и в последующем присутствуют в сыворотке крови пациента в течение всей жизни.

В разных регионах удельный вес здоровых лиц, имеющих антитела IgG в сыворотке крови к вирусу гепатита А, составляет от 30 до 60%.

Рис. 3. Антитела вырабатываются клетками иммунной системы больного в ответ на антигены вируса гепатита. Чем выше иммунный ответ, тем больше концентрация антител в сыворотке крови.

Определение антител к вирусу гепатита А класса IgМ является основным тестом специфической диагностики гепатита А. Их присутствие в сыворотке крови говорит об острой фазе или недавно перенесенном заболевании.

Антитела класса IgA накапливаются в слизистых оболочках кишечника, верхних дыхательных и мочеполовых путей, они содержаться в слюне, слезной жидкости, молозиве и молоке и первыми защищают организм от чужеродных микроорганизмов. В сыворотке крови появление антител IgA происходит параллельно с появлением антител IgМ, но исчезают IgA из крови значительно быстрее. Антитела IgA определяются в фекалиях.

Рис. 4. Специфические антитела IgM и IgG выявляются с помощью серологических реакций ИФА (иммуноферментный анализ) и РИА (радиоиммунный анализ).

Анализ кала на гепатит А

Антигены вируса гепатита А можно выявить в экстрактах фекалий больного, для чего используются иммуноэлектронная микроскопия, иммуноферментный и радиоиммунный анализы. Наличие вирусов в каловых массах больного является 100% подтверждением диагноза, но их отсутствие не исключает наличие гепатита А.

Диагностика заболевания с помощью ПЦР

РНК вируса (генетический материал) выявляют в сыворотке крови больного, фекальных экстрактах, пищевых продуктах и воде (водоемы, стоки и др.) с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Чувствительность данного метода диагностики составляет не менее 80 вирусных частиц в 5 мкл, специфичность — 98%. РНК вируса выявляются с 3-й недели заболевания и еще около 20-и дней после появления первых симптомов заболевания. РНК вируса в фекалиях выявляются с 3-й недели заболевания и еще около 3-х месяцев после появления первых симптомов заболевания.

Рис. 5. РНК вирусов определяются методом проведения ПЦР.

Выделение вирусов у лабораторных животных

Выделить вирусы гепатита А можно при заражении восприимчивых животных (обезьян мармозеток, шимпанзе или павианов), что производится только в высокоспециализированных лабораториях. Материал, полученный от зараженных животных, подвергается исследованию на обнаружение самих возбудителей и его антигенов вышеописанными способами.

Рис. 6. Выделить вирусы гепатита А можно при заражении восприимчивых животных (обезьян мармозет, шимпанзе или павианов), что производится только в высокоспециализированных лабораториях.

Клинические и биохимические анализы

Клинические анализы при диагностике гепатита А, имеющие диагностическое значение:

Лейкопения или нормоцитоз.
Относительный лимфоцитоз.
Замедление СОЭ.

Биохимические анализы при диагностике заболевания, имеющие диагностическое значение:

Непродолжительное (в течение 1 — 2 недель) повышение активности аминотрансфераз АЛТ и АСТ в 5 — 40 раз. Их нормализация регистрируется к 21 дню заболевания.
Повышение уровня билирубина непродолжительное (1 — 2 недели), умеренное. Полная нормализация отмечается на 3-й неделе заболевания.
Значительное повышение тимоловой пробы в первые 10 дней желтушного периода.
Повышение уровня щелочной фосфатазы.
В случае развития на фоне основного заболевания панкреатита отмечается повышение уровня амилазы в моче и крови.
В случае развития основного заболевания на фоне алкогольной интоксикации в крови регистрируются высокие показатели у-ГТ (гамма-глютамилтрансферазы).

Рис. 7. У детей в возрасте до 5-и лет болезнь в желтушной форме протекает в 20% случаев. В 80% — бессимптомно в безжелтушной форме.

Дифференциальная диагностика

Дифференциальную диагностику гепатита А следует проводить со следующими заболеваниями:

Вирусные гепатиты С, В и Е.
При безжелтушной форме в ранний, дожелтушный периоды, зачастую гепатит А протекает под маской ОРЗ или пищевой токсикоинфекции.
Рак большого сосочка 12-и перстной кишки.
Хронический гепатит и цирроз печени.
С желтухой могут протекать инфекционный мононуклеоз, токсоплазмоз, лептоспироз, псевдотуберкулез, цитомегаловирусная инфекция.

Комплексный анализ крови, направленный на первичную диагностику основных форм вирусных гепатитов.

Вирусные гепатиты А, В, С; первичная диагностика.

Hepatitis A, В, С Virus; primary diagnostics.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Как правильно подготовиться к исследованию?

Исключить из рациона жирную пищу в течение 24 часов до исследования.
Исключить физическое и эмоциональное перенапряжение в течение 30 минут до исследования.
Не курить в течение 30 минут до исследования.

Общая информация об исследовании

Вирусные гепатиты представляют собой заболевания, вызванные вирусами и приводящие к повреждению тканей печени. К данным вирусам относятся вирусы гепатита А, гепатита В и гепатита С. Анализ крови на гепатит позволяет определить заболевание и его возбудителя.

Гепатит А – это острая форма гепатита, вызванная вирусом гепатита А (ВГА, HAV) при употреблении загрязненных вирусом пищи или воды, а также при контакте с больным человеком. В отличие от других вирусных гепатитов, гепатит А не переходит в хроническую форму течения. При проникновении вируса в организм человека в результате стимуляции иммунной системы происходит выработка антител – иммуноглобулинов класса IgM. Они обычно появляются в первые 2-3 недели с момента инфицирования и сохраняются от 2 до 6 месяцев. Поэтому в ранней лабораторной диагностике данной формы гепатита рекомендовано выявление анти-HAV IgM антител в крови в целях диагностики при подозрении на вирусный гепатит А, при симптомах острого гепатита, в частности в детском возрасте, а также для диагностики бессимптомного течения гепатита А.

Вирус гепатита С (ВГС, HCV) – это РНК-содержащий вирус семейства Flaviviridae, поражающий печень и приводящий к развитию хронического гепатита С, цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциноме. Основной путь передачи инфекции – через кровь (при переливании элементов крови и плазмы, пересадке донорских органов, через нестерильные шприцы, иглы, при гемодиализе). Реже возможна передача вируса при половом контакте и от матери ребенку во время родов. Острый ВГС часто протекает бессимптомно, только в 15-20 % случаев инфицирования появляются симптомы гепатита, тогда как в 70-85 % случаев заболевание переходит в хроническую форму. Специфические антитела направлены к следующим составляющим компонентам вируса: ядру (нуклеокапсидному белку – core), оболочке (нуклеопротеинам Е1-Е2) и фрагментам генома вируса (неструктурным белкам NS). В сыворотке крови больных могут обнаруживаться иммуноглобулины классов IgM в случае острого течения инфекции и IgG в случае латентного течения, реактивации заболевания и при хронической форме ВГС.

Вирус гепатита В (ВГВ, HBV) широко распространен в современной популяции и является частой причиной развития острого и хронического гепатита, а также смертности от данного заболевания. Инфицирование происходит через кровь и другие биологические жидкости, а также от матери к ребенку во время родов и кормления. Основным скрининговым маркером данного гепатита является поверхностный антиген вируса гепатита В (HВsAg). Он обнаруживается в сыворотке крови больных при острой инфекции и в активной фазе хронической инфекции. Также рекомендовано определение данного показателя при профилактическом осмотре в группах риска по заражению данным вирусом, у доноров компонентов крови, в случае подозрения на бессимптомное течение заболевания и в целях контроля формирования иммунитета после вакцинации против гепатита В.

Для чего используется исследование?

Для первичной диагностики в случае подозрения на наличие инфицирования вирусным гепатитом, при наличии симптомов или при бессимптомном течении.
Для диагностики острого вирусного гепатита А, а также для диагностики его бессимптомного течения.
Для диагностики острого или хронического вирусного гепатита С, для выявления ранее перенесенного ВГС.
Для диагностики острого или хронического вирусного гепатита В, для скрининга инфекции при отсутствии симптомов болезни, для выявления инфицирования и для контроля иммунитета после вакцинации.

Когда назначается исследование?

При скрининговой диагностике вирусных гепатитов А, В, С.
При симптомах острого гепатита, а также в случае бессимптомного течения заболевания.
В группах лиц с повышенным риском инфицирования вирусными гепатитами В и С: работники здравоохранения, дети от инфицированных родителей, люди, не прошедшие вакцинацию против ВГВ, лица с иммунодефицитными состояниями; беременные.
При сдаче донорской крови и ее компонентов, а также перед переливанием крови.

Что означают результаты?

Причины повышения и понижения индивидуальны для каждого исследуемого показателя в представленном комплексе.

Они могут свидетельствовать о наличии острой вирусной инфекции, активной фазе хронической формы инфекции, а также о бессимптомном носительстве вируса.

Что может влиять на результат?

Ложноположительные результаты на ВГА – наличие аутоиммунных заболеваний; ВГС – наличие аутоиммунных заболеваний, в частности присутствие в крови ревматоидного фактора.

7 Anti-HAV, IgM
8 Anti-HCV, антитела
10 HCV, генотипирование (типы 1a, 1b, 2, 3a, 4), РНК [реал-тайм ПЦР]
10 HCV, РНК количественно [реал-тайм ПЦР]
115 Вирус гепатита С (тест-системы Hoffman-La-Roche)
10 Антитела к структурным и неструктурным белкам вируса гепатита С
23 HBsAg
7 Anti-HBc, IgM
7 Anti-HBc, антитела
7 Anti-HBs, антитела
6 Аланинаминотрансфераза (АЛТ)
9 Аспартатаминотрансфераза (АСТ)
8 Гамма-глютамилтранспептидаза (гамма-ГТ)
14 Фосфатаза щелочная общая
27 Билирубин общий
9 Билирубин прямой
30 Билирубин непрямой

Кто назначает исследование?

Инфекционист, гастроэнтеролог, гепатолог, эпидемиолог, врач общей практики, терапевт, акушер-гинеколог, уролог, хирург, педиатр.

Литература

Fauci, Braunwald, Kasper, Hauser, Longo, Jameson, Loscalzo Harrison’s principles of internal medicine, 17th edition, 2009.
Revie D, Salahuddin SZ. Human cell types important for hepatitis C virus replication in vivo and in vitro: old assertions and current evidence. Virol J. 2011 Jul 11;8:346.
Gerlich WH. Medical virology of hepatitis B: how it began and where we are now / Virol J. 2013 Jul 20;10:239.
Schüttler CG, Thomas C, Discher T, Friese G, Lohmeyer J, Schuster R, Schaefer S, Gerlich WH Variable ratio of hepatitis C virus RNA to viral core antigen in patient sera / J Clin Microbiol. 2004May;42(5):1977-81.

Что такое гепатит А?

Вирус гепатита А поражает ткань печени

Гепатит А (болезнь Боткина) — это остро протекающая вирусная инфекция, поражающая печень. В отличие от вирусных гепатитов В и С, это заболевание почти никогда не переходит в хроническую форму и не рецидивирует, после выздоровления организм переболевшего человека оказывается защищен от повторной инфекции.

Гепатит А передается при бытовых контактах с больным, а также при употреблении загрязненных продуктов питания и воды. Вирус имеет высокую устойчивость, поэтому во многих случаях даже мытье овощей и фруктов с мылом, их легкая термическая обработка не спасают от инфицирования, воду для полного устранения опасных вирусных частиц необходимо кипятить не менее 10 минут, в некипяченой воде вирусы сохраняются месяцами.

Такая высокая устойчивость приводит к тому, что в странах с высокой инфицированностью населения и плохими санитарно-бытовыми условиями большинство людей переболевают гепатитом А еще в раннем детском возрасте. К таким странам относятся Китай, Индия, Таиланд, Монголия, все страны Африки и Южной Америки, Мексика, а также любимые туристические направления — Турция, Египет, Израиль. Болезнь, полученная в детском возрасте (до 6-10 лет) переносится достаточно легко, у младших детей в 80-90% случаев не наблюдается симптомов поражения печени, однако взрослые практически всегда болеют среднетяжелой и тяжелой формой гепатита А.

Кто входит в группу риска по заболеванию?

В группе риска — лица с патологией печени

Наибольшую опасность гепатит А несет для следующих групп населения:

Не привитые от гепатита А подростки и взрослые, выезжающие в страны с высокой распространенностью инфекции среди местных жителей;
Лица пожилого возраста (старше 60 лет);
Люди, страдающие другими вирусными гепатитами (В, С), особенно в хронической форме;
Пациенты с неинфекционными болезнями печени и желчного пузыря (цирроз, жировая дистрофия печени, желчнокаменная болезнь);
Дети и взрослые, страдающие иммунным дефицитом по любой причине (наследственный дефицит выработки В- или Т-лимфоцитов, инфицированность ВИЧ, злоупотребление алкоголем, прием глюкокортикоидов);
Онкологические больные.

Показания к проведению анализа

Боль в правом подреберье — показание для анализа

Главными показаниями к проведению анализа является возможный недавний контакт с больным человеком, а также имеющиеся симптомы болезни печени, возникшие внезапно на фоне относительного здоровья:

Пожелтение или потемнение кожи, белков глаз;
Тяжесть и ноющие боли в животе, особенно справа под ребрами;
Рвота, диарея и другие симптомы несварения, продолжающиеся более 1-2 суток;
Изменение нормального цвета мочи на темный;
Изменение цвета каловых масс на светлый;
Стойкое отсутствие аппетита;
Изменение во вкусовых ощущениях, неприятный привкус во рту;
Повышенная температура тела, ломота в мышцах и суставах.

Подготовка к исследованию на гепатит А

Накануне теста стоит ограничить жирную пищу

Чаще всего для выявления инфицированности гепатитом А исследуют кровь, для экспресс-диагностики — кал пациента. Перед сдачей крови необходимо воздержаться от употребления жирных продуктов, стоит исключить и переедание накануне. Кровь сдается натощак утром, в случаях, когда результат нужно получить срочно, допустимо сдать кровь после голодания в течении 4-5 часов. Кал для диагностики инфекции собирают утром в стерильную емкость, за 1-2 суток до сдачи нужно отказаться от алкоголя.

Методы специфической диагностики гепатита А

Кровь пациента может исследоваться несколькими методами

Методы диагностики вирусного гепатита А подразделяются на группы в зависимости от того, что именно позволяют обнаружить в биологическом материале от пациента: генетический материал самой инфекционной частицы или специфические защитные белки иммунной системы человека, направленные против вируса. Оба варианта имеют свои недостатки и преимущества, поэтому выбор метода лучше всего доверить своему лечащему врачу.

Исследованию по этой методике подвергается сыворотка крови пациента, анализ длится 1-2 суток. Существует несколько вариантов ИФА-метода:

Обнаружение Ig M — ранних иммуноглобулинов (защитных белков) против вирусного гепатита A;
Обнаружение Ig G — иммуноглобулинов, обеспечивающих надежную защиту от вируса после прививки или перенесенного заболевания. В случае острой болезни их появление свидетельствует о том, что человек начал выздоравливать.
Поиск Ig total (или суммарных антител к вирусу гепатита А) — наиболее общий тест, позволяющий определить, встречался ли организм пациента с вирусом гепатита А.

Главным достоинством метода является то, что врач с его помощью может оценить защитные силы организма пациента, а также стадию болезни: при выздоровлении нарастает количество Ig G и снижаются титры Ig M. Также ИФА-анализ используется для определения иммунитета к вирусу после прививки.

Выявление возбудителя возможно с помощью ПЦР-метода

ПЦР-анализ позволяет обнаружить непосредственно сами вирусные частицы в крови или фекалиях пациента, потому основным преимуществом его является высокая диагностическая надежность. ИФА-анализ может давать ложноотрицательные результаты на ранних стадиях инфицирования из-за того, что организм не успевает быстро выработать специфические защитные белки (иммуноглобулины), при этом ПЦР метод помогает обнаружить инфекцию в первые же дни. Точность ПЦР-анализа не зависит и от иммунного статуса пациента, потому он чаще всего показан лицам с ослабленным иммунитетом и людям пожилого возраста.

Экспресс-тест на гепатит А проводят при помощи специальных тест-полосок, пропитанных индикаторным веществом. Это исследование позволяет выявить инфекцию очень быстро (в течении 1-2 часов может быть получен результат из лаборатории), кроме того, плюсом является его безболезненность, так как исследованию подвергаются фекалии.

Биохимический анализ при гепатите А

Биохимический анализ крови при гепатите А важен из-за того, что позволяет быстро оценить степень поражения клеток печени, а также динамику выздоровления. Чем тяжелее состояние пациента, тем сильнее будут изменены показатели биохимического анализа, при этом улучшение результатов — надежный критерий эффективности поддерживающей терапии.

К главным показателям, по которым оценивают состояние печени при вирусной инфекции, относятся:

АлАТ — вещество, в больших количествах содержащееся в клетках печени (гепатоцитах), при их массовом повреждении обнаруживается в крови.
Билирубин общий — повышение данного показателя встречается при многих видах поражения печени, в том числе неинфекционной природы. В случае вирусного гепатит А анализ позволяет оценивать, насколько сильно нарушено функционирование органа.
Билирубин прямой — повышение уровня характерно для гепатитов различной природы, при гепатите А повышение прямого билирубина связано с пожелтением кожных покровов и изменением окраски мочи и кала.
Щелочная фосфатаза — фермент, активность которого повышается при закупорке внутрипеченочных протоков. При диагностике состояния печени у пациентов с вирусным гепатитом А показатель позволяет оценить, затронута ли болезнью функция нормального отведения желчи.

Общий анализ крови при гепатите А

Важно сдавать и общий анализ крови

Регулярный общий анализ крови показан при любом инфекционном процессе для отслеживания динамики борьбы организма с патогеном (вирусом или бактерией). В случае вирусного гепатита А наиболее информативным оказывается уровень повышения лейкоцитов: чем он выше, тем активнее организм борется с вирусом, но также тем больше содержание живых вирусных частиц в крови и печени пациента. При выздоровлении уровень лейкоцитов может оставаться повышенным в течении 1-2 недель, но уже с первых дней улучшения будет наблюдаться его постепенное снижение.

Расшифровка результатов

Изменения в общем анализе крови не являются специфическим критерием для диагностики вирусного гепатита, но при лечении этот анализ повторяют наиболее часто, ведь он косвенно свидетельствует о стадии болезни и активности иммунного ответа пациента на вирус.

Биохимический анализ крови используется в диагностике состояния печени при любых формах гепатита, чем сильнее отклонения показателей от нормы, тем сильнее нарушены функции печени и большее количество клеток повреждено.

При установлении диагноза вирусного гепатита А наиболее важны специфические методы диагностики, в то время как при лечении на первый план выходят биохимический и общий анализ крови для контроля за состоянием пациента.

Использование: медицина, вирусология, прикладная иммунология, для диагностики вируса гепатита А. Сущность изобретения: проводят иммуноферментный анализ на твердом носителе с использованием пероксидазного коньюгата и магносорбентов, сенсибилизированных антигепатитным (А) иммуноглобулином. Пероксидазный коньюгат конструируют на основе иммуноглобулинов к вирусу гепатита А.

Изобретение относится к медицинской вирусологии, в частности к прикладной иммунологии.

Известен иммуноферментный метод обнаружения в нарастающем титре I₉М-анти-ВГА (антител к вирусу гепатита А) в продромальном периоде заболевания и начальной фазе периода разгара (Е.П.Шувалова. Инфекционные болезни. М. 1990,с.154).

Недостатком данного способа является то, что он направлен на выявление антител и не позволяет выявить возбудителя заболевания вирус гепатита А или его антигены.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является иммуноферментный способ определения антигенов аренавирусных инфекций, который основан на принципе меченых антител. В качестве метки используют фермент, например пероксидазу хрена. Результат теста учитывают по степени специфического связывания меченых антител с фиксированным на твердом носителе антигеном. Степень связывания меченых антител определяют по ферментной активности - разрушению ферментного субстрата, дающего окрашенный продукт (Методические рекомендации по применению твердофазных иммуносорбентных методов (энзиммеченного и радиоиммунологического анализа) для лабораторной диагностики аренавирусных инфекций, крымской геморрагической лихорадки и геморрагической лихорадки с почечным синдромом. М. 1982,с. 21 ).

Недостатком данного способа является отсутствие возможности выявить наличие вируса при его дискретном поступлении и малой концентрации, селективно концентрировать вирусы непосредственно из выделений больных или других загрязненных проб и сократить время проведения иммуноферментного анализа (ИФА) с 4 до 1 ч.

Обнаружение патогенных микроорганизмов в объектах внешней среды связано с большими трудностями. Одним из наиболее специфичных методов концентрации микроорганизмов является применение магносорбентов. Эти препараты и приспособления хорошо зарекомендовали себя при выявлении возбудителя холеры из различных объектов внешней среды. Однако до настоящего времени не разработаны эффективные способы определения вируса инфекционного гепатита А из объектов внешней среды. Применение магнитных сорбентов и других приспособлений поможет разработать эффективные способы мониторинга окружающей среды на наличие возбудителя вирусного гепатита А. Использование гранулированных магнитных сорбентов в качестве твердой фазы при осуществлении иммуноферментного анализа для выявления возбудителя вирусного гепатита А из объектов внешней среды позволит повысить чувствительность анализа, существенно снизить трудоемкость и время проведения анализа, улучшить качественные характеристики определений.

Таким образом, ни использование в качестве твердого носителя магносорбентов, которые сенсибилизированы антигепатитными (А) иммуноглобулинами, ни использование иммунопероксидазного конъюгата на основе иммуноглобулинов к вирусу гепатита А, ни выявление вируса гепатита А иммуноферментным методом с применением магноиммуносорбентов в вирусологии на существующем уровне исследований нам не известны. Исходя из этого можно сделать вывод о том, что изобретение соответствует критерию изобретательского уровня.

Сущность изобретения заключается в том, что выявление вируса гепатита А осуществляют путем проведения ИФА на твердом носителе с использованием пероксидазного конъюгата.

Отличительные признаки заявляемого объекта: иммунологическую реакцию на твердом носителе осуществляют с использованием магносорбентов, которые сенсибилизированы антигепатитными (А) иммуноглобулинами их помещают в исследуемую среду; конструирование же иммунопероксидазного конъюгата проводят на основе иммуноглобулинов к вирусу гепатита А.

Когда поступление вируса дискретное, и малая концентрация не позволяет выявить его известными способами, то возникающая потребность селективно концентрировать вирус достигается при помощи совокупности признаков, включенных в формулу изобретения.

Тест-систему диагностическую осуществляют следующим образом.

1. Получают сыворотки от людей, больных вирусным гепатитом А, с высокими титрами специфических антител.

2. Получение специфических антигепатитных (А) иммуноглобулинов.

Иммуноглобулины выделяют, используя метод двойного высаливания сернокислым аммонием. Добавляют к сыворотке равный объем дистиллированной воды, затем навеску сернокислого аммония до 40%-ного насыщения раствора добавляют медленно при перемешивании раствора на магнитной мешалке в течение 30 мин. Затем оставляют при 4 o С на 18 ч для стабилизации белка и формирования осадка. Центрифугируют в течение 30 мин при 6000 об/мин. Супернатант удаляют, а осадок ресуспендируют в дистиллированной воде до двойного объема исходной сыворотки. Вносят в раствор навеску сернокислого аммония до 40%-ного насыщения, инкубируют 30 мин на магнитной мешалке при комнатной температуре, а затем 18 ч при 4 o С. Центрифугируют вышеуказанным способом, супернатант удаляют, а осадок ресуспендируют в дистиллированной воде до первоначального объема взятой в работу сыворотки.

Полученный раствор иммуноглобулино диализуют против водопроводной, а затем дистиллированной воды до исчезновения ионов NH + ₄,, что проверяют с помощью реактива Несслера.

Определяют количество белка спектрофотометрическим способом и активность иммуноглобулинов в ТИМФ. Содержание белка при выделении иммуноглобулинов таким способом составляет 25-30 мг/мл, а активность в ТИМФ 1:600000-1: 800000.

Полученные иммуноглобулины используют для получения иммунопероксидазного конъюгата и гепатитного (А) магноиммуносорбента.

3. Получение иммунопероксидазного гепатитного (А) конъюгата.

Иммуноглобулины гепатитные (А), меченные пероксидазой хрена, получают методом перйодатного окисления пероксидазы хрена.

Для конъюгации иммуноглобулина с ферментом используют пероксидазу хрена тип VI, RZ-3,0 НПО "Биохимреактив" ВНИИ прикладной биохимии (г. Олайне), которую в количестве 5 мг растворяют в 1 мл свежеприготовленного раствора 0,3 М двууглекислого натрия.

4. Получение гепатитного (А) магноиммуносорбента.

Магноиммуносорбент (МИС) получают путем ковалентной сшивки иммуноглобулина к вирусу гепатита А на поверхности гранул.

Магносорбент отмывают от консерванта дистиллированной водой /3-4 раза в течение 1 мин/. 1 г магносорбента заливают 10 мл 8%-ного раствора глутаральдегида, инкубируют в течение 18 ч при комнатной температуре (20-22) o С со встряхиванием. Затем отмывают от глутаральдегида десятью объемами дистиллированной воды и 3-4 объемами 0,1 М фосфатно-солевого буфера (ФСБ) рН 7,6. Активированный магносорбент конъюгируют с 10 мл антигепатитных иммуноглобулинов в ФСБ рН 7,6 с концентрацией белка 500-600 мкг/мл. Конъюгацию проводят в течение 18 ч при комнатной температуре со встряхиванием. Магноиммуносорбент отмывают тремя объемами 0,1 М ФСБ рН 7,6. Заливают 10 мл 1%-ного раствора бычьего сывороточного альбумина (БСА), шуттелируют в течение 3 ч при комнатной температуре. Отмывают тремя объемами 0,1 ФСБ рН 7,6, добавляют мертиолат натрия до конечной концентрации 1:10000 и хранят препарат при 4 o С. Срок годности препарата 6 мес (срок наблюдения).

5. Проведение анализа, направленного на выявление вируса гепатита А.

Твердофазный иммуноферментный метод с применением магноиммуносорбета (МИС).

Для проведения иммуноферментного анализа, направленного на выявление вируса гепатита А или его антигенов, микропланшет заполняют реагентами в соответствии со следующей схемой реакции: в лунки первого ряда помещают навески по 5 мг МИС (или 50 мкл 10%-ной взвеси) и отмывающий раствор - фосфатно-солевой буфер (ФСБ) рН 7,2 по 200 мкл; в лунки второго ряда - анализируемые пробы по 100 мкл, содержащие антигены, кроме последней лунки ряда, которую используют в качестве контроля и заполняют 100 мкл ФСБ; в лунки третьего ряда по 200 мкл ФСБ для промывания; в лунки четвертого ряда по 100 мкл рабочего разведения иммунопероксидазного конъюгата; в лунки пятого, шестого и седьмого рядов по 200 мкл ФСБ для промывания; в лунки восьмого ряда по 100 мкл субстрат-индикаторного раствора (0,1 М лимонная кислота с 0,2 М Na₂HPO₄ рН 5,0 в присутствии 0,006%-ной перекиси водорода и ортофенилендиамина в концентрации 0,4 мг/мл).

Подготовленный планшет устанавливают в рамку устройства для проведения ИВФ с использованием МИС и проводят операции в следующей последовательности: отмывание МИС от консерванта в лунках первого ряда 30 с с перемешиванием; перенос с помощью металлической гребенки МИС в лунки второго ряда. Инкубирование с пробами 20 мин с перемешиванием пятикратно по 30 с; перенос МИС в лунки третьего ряда. Промывание с перемешиванием 30 с; перенос МИС в лунки четвертого ряда. Инкубирование с иммунопероксидазным конъюгатом 20 мин с перемешиванием пятикратно по 30 с; перенос МИС в лунки пятого, шестого и седьмого рядов с перемешиванием в каждом ряду по 30 с для промывания; перенос МИС в лунки восьмого ряда для реагирования с субстрат-индикаторным раствором, инкубирование 3-5 мин с перемешиванием 30 с.

После развития цветной реакции МИС удаляют из лунок восьмого ряда. Реакцию останавливают внесением в лунки по 100 мл 2 М серной кислоты. Результат реакции оценивают визуально по сравнению с контролем. Положительными считают пробы, окрашивание которых превышает аналогичный показатель контроля на 70-80% Анализ длится 45-50 мин.

Обнаружение вируса гепатита А или его антигенов в объектах внешней среды.

Для обнаружения вируса гепатита А или его антигенов в водопроводной сети, канализационных стоках или открытых водоемах использовали магнитные ловушки, в которые помещали гепатитный (А) магноиммуносорбент (МИС) и оставляли на сутки на объекте исследования: канализационные стоки инфекционной больницы г. Ставрополя, водопроводная сеть, очистные сооружения в г. Ессентуки, канализационный сток курортной зоны в г. Пятигорске и другие объекты. За это время происходила селективная концентрация вируса гепатита А или его антигенов на поверхности гепатитных МИС. Затем ловушки снимали, МИС отмывали несколько раз в физиологическом растворе и далее проводили иммуноферментный анализ с использованием магноиммуносорбентов. Этот вариант анализа исключает момент соединения пробы с МИС на микропланшете, так как этот процесс происходит во время нахождения магноиммуносорбента на магнитной ловушке. Сам анализ длится 25-30 мин.

В результате проведенных исследований было установлено, что с использованием предлагаемой тест-системы вирус гепатита А был выявлен в канализационных стоках инфекционной больницы г. Ставрополя, в сточных водах курортной зоны г. Пятигорска, канализационном коллекторе инфекционной больницы г. Ессентуки и других объектах.

Диагностическая тест-система для выявления вируса гепатита А путем проведения иммуноферментного анализа на твердом носителе с использованием пероксидазного коньюгата, отличающаяся тем, что иммунологическую реакцию на твердом носителе осуществляют с использованием магносорбентов, которые сенсибилизируют антигепатитными (А) иммуноглобулинами и помещают их в исследуемую среду, а конструирование иммунопероксидазного коньюгата проводят на основе иммуноглобулинов к вирусу гепатита А.

Читайте также: