Тест-система иммуноферментная для определения антигенов хантавирусов

Иммуноферментная для определения антигенов хантавирусов

набор из 12 компонентов

Описание

Ÿ планшет для иммунологических реакций, полистироловый или полихлорвиниловый, монолитный;

иммуноглобулин человека класса G (ИГ+), сухой, содержащий антитела к хантавирусу, аморфная масса белого цвета;

иммуноглобулин человека класса G (ИГ-) сухой, не содержащий

антител к хантавирусу, аморфная масса белого цвета;

Ÿ антиген хантавируса (АГ+), сухой, инактивированный, аморфная масса белого или светло-розового цвета;

Ÿ коньюгат, жидкий – иммуноглобулин человека класса G (IgG),

содержащий антитела к хантавирусу, коньюгированный с

пероксидазой хрена, вязкая, прозрачная жидкость;

* Взамен: Инструкции по применению, утвержденной 19 мая 1999 года

Ÿ Альбумин из бычьей сыворотки (БСА), стабилизатор, сухой

кристаллический порошок белого или светло-желтого цвета;

Ÿ Концентрат ( х100) фосфатно-солевого буферного раствора, (ФСБх100) – бесцветная прозрачная жидкость, возможно выпадение

осадка, растворяющегося при температуре от 300 до 400 С в течение

Ÿ Концентрат (х2) цитратно-фосфатного буферного раствора, (ЦФБ),

бесцветная прозрачная жидкость;

Ÿ Твин-20, жидкий;

Ÿ Хромоген – ортофенилендиамин (ОФД), таблетка серо-коричневого цвета;

Ÿ Стоп-реагент – серная кислота, 1 М раствор, бесцветная прозрачная жидкость;

Ÿ Гидроперит сухой, таблетка белого цвета.

Набор рассчитан на исследование 48 анализов, включая анализ

контрольного образца АГ+.

1. Приготовление рабочих растворов и реагентов:

1.1. Рабочий раствор ФСБ. ФСБ (х100) разводят до 1 л дистиллированной водой. Раствор предназначен для растворения ИГ+, ИГ- (10 мл), и является исходным для приготовления раствора для отмывания планшета (ФСБ-Т) и раствора для разведения коньюгата (1% раствор БСА в ФСБ-Т). Хранят при температуре 2-8 0С в течение 3 сут.

1.2. ФСБ-Т – во флакон с 0,5 мл твина-20 добавляют 5,0 мл рабочего раствора ФСБ, и смесь осторожно перемешивают до получения

однородного раствора, не допуская образования обильной пены.

Полученный раствор переносят пипеткой в оставшийся объем (985 мл)

рабочего раствора ФСБ. Раствор предназначен для отмывания

планшета и для приготовления 1%-ного раствора БСА в ФСБ-Т. Хранят

при температуре 2-8 0С в течение 4 сут.

1.3. ФСБ — БСА – к 10 мл раствора ФСБ-Т добавляют содержимое флакона с БСА и, не встряхивая, оставляют при комнатной температуре до полного растворения белка. Раствор предназначен для разведения коньюгата. Готовят перед употреблением.

1.4. ЦФБ – к ЦФБ (х2) добавляют 6,0 мл дистиллированной воды и перемешивают. Раствор предназначен для приготовления раствора хромогена. Готовят перед употреблением.

1.5. Перекись водорода – таблетку гидроперита растворяют в 3 мл дистиллированной воды. Полученный раствор перекиси водорода готовят перед употреблением.

1.6. АГ+ — раствор АГ+ получают добавлением во флакон воды в объеме указанном на этикетке. Готовят непосредственно перед употреблением.

1.7. ИГ+, ИГ — — во флаконы с препаратом добавляют по 5,0 мл приготовленного раствора ФСБ. Растворы предназначены для сорбции планшета.

2. Проведение ИФА.

2.1. Сенсибилизация лунок планшета: планшет располагают согласно рекомендуемой схеме, т. е. вертикально так, чтобы буквы (от Н до А) находились вверху, а нумерация рядов (от 1 до 12) – справа (см. схему). Вносят по 0,1 мл рабочего разведения анти-хантавирусного IgG (ИГ+) человека в нечетные ряды лунок и по 0,1 мл рабочего разведения

нормального IgG человека (ИГ-) – в четные ряды лунок. Планшет накрывают

крышкой и выдерживают в холодильнике при температуре 4 – 8 0С в течение 16-20 ч, или при температуре 37 0С в течение 3 ч.

2.2. Промывание лунок планшета: после инкубации содержимое лунок удаляют и лунки трижды промывают раствором ФСБ-Т, заполняя их до края и сразу же удаляя раствор. Планшет подсушивают постукиванием по 2-3 слоям фильтровальной бумаги до удаления видимых капель.

2.3. Внесение исследуемых образцов: в лунки планшета вносят по 0,05 мл исследуемых образцов суспензий, начиная от буквы Н до А — один образец в две вертикально расположенные лунки – с ИГ+ и ИГ-, а в последнюю пару лунок (А-11 и А-12) вносят по 0,05 мл контрольного антигена хантавируса. Панель накрывают крышкой и выдерживают в холодильнике при температуре 4 – 8 0С в течение 16-20 ч, или при температуре 37 0С в течение 2 ч.

2.4. Промывание лунок планшета: после инкубации содержимое лунок удаляют и лунки 5 раз промывают раствором ФСБ-Т, заполняя их до края (1-й раз сразу же удаляя раствор, а последующие 4 раза, выдерживая с раствором по 5 мин). Планшет подсушивают постукиванием по 2-3 слоям фильтровальной бумаги до удаления видимых капель.

2.5. Приготовление рабочего разведения коньюгата: раствор для разведения коньюгата (1% р-р БСА в ФСБ-Т см. п. 1.3.) в объёме 6,4 мл вносят по флакон, содержащих пероксидазный коньюгат и тщательно перемешивают. Коньюгат в рабочем разведении не хранить, использовать сразу!

2.6. Внесение коньюгата: по 0,05 мл рабочего разведения перокисдазного коньюгата вносят по все лунки планшета. Планшет накрывают крышкой и выдерживают при температуре 37 0С в течение 1 ч.

2.7. Приготовление раствора хромогена: ОФД растворяют при перемешивании в 12 мл ЦФБ в течение 1-2 мин в темном месте. Непосредственно перед внесением в лунки к приготовленному раствору ОФД при перемешивании 0,01 мл раствора перекиси водорода.

2.8. Промывание лунок планшета: после инкубации содержимое лунок 37 0С удаляют и лунки 6 раз промывают раствором ФСБ-Т, заполняя их до края (1-й раз сразу же удаляя раствор, а последующие 5 раз, выдерживая с раствором по 5 мин). Планшет подсушивают постукиванием по 2-3 слоям фильтровальной бумаги до удаления видимых капель.

2.9. Внесение раствора хромогена: приготовленный раствор хромогена немедленно вносят по 100 мкл во все лунки планшета, который затем в условиях полной темноты выдерживают при комнатной температуре в течение 30 – 50 мин.

2.10. Стоп реагент: реакцию останавливают внесением во все лунки план-шета по 50 мкл стоп-реагента. Результат учитывают не позднее 30 мин.

Результат учитывают спектрофотометрически по оптической плотности (ОП) при длине волны 492 нм. Положительной считают пробу в случае, когда ОП лунки с ИГ+ превосходит ОП лунки с ИГ- в 2,1 и более раз.

Ÿ Планшет для иммунологический реакций — 1 шт.

Иммуноглобулин человека класса G, содержащий антитела

к хантавирусу (ИГ+), сухой — 1 флакон (0,1 мл)

Ÿ Антиген Хантавируса (АГ +), сухой, инактивированный 1 флакон (0,1 мл)

Ÿ Коньюгат, жидкий 1 флакон (5 или 20 мкл)

Ÿ Альбумин из бычьей сыворотки, сухой 1 флакон (0,1 г)

Ÿ Концентрат фосфатно-солевого буферного раствора

(ФСБ х100) 1 флакон (10,0 мл)

Ÿ Концентрат (х2) цитратно-фосфатного буферного раствора

(ЦФБ) 1 флакон (6,0 мл)

Ÿ Твин-20, жидкий 1 флакон (0,5 мл)

Ÿ Хромоген (ортофенилендиамин) ОФД — 1 флакон (5,0 мг);

Ÿ Стоп-реагент – серная кислота, раствор 1М — 1 флакон (5,0 мл);

Ÿ Гидроперит, сухой — 1 табл

Ÿ Инструкция по применению — 1 шт.

Тест система с истекшим сроком годности применению не подлежит.

Транспортирование: в соответствии с СП 3.3.2.1248-03 при температуре от 2 до 8 0С. Допускается транспортирование при температуре до 250С в течение не более 2-х сут.

Хранение в соответствии с СП 3.3.2.1248-03 в сухом помещении при температуре от 2 до 8 0С в недоступном для детей месте.

Закон закупки 44-ФЗ

Закон, регулирующий правовые отношения в области государственных закупок.

Расширили список запрещенных иностранных товаров по 44 ФЗ
В каких случаях указывать и подтверждать страну происхождения товара по 44-ФЗ?
Переторжка по 44-ФЗ и 223-ФЗ: особенности, процедура проведения
Оплата по контракту по 44-ФЗ: как получить вовремя
Исключения из правил: что нельзя закупить по 44-ФЗ или 223-ФЗ
Существенные условия контракта по 44-ФЗ: что к ним относится и можно ли их изменять?
Сравниваем 44-ФЗ и 223-ФЗ: таблица для чайников
Чем обычный договор отличается от контракта по 44-ФЗ
Национальный режим при осуществлении закупок по 44-ФЗ и 223-ФЗ: запреты, ограничения, условия допуска
Вопрос: Я продаю компьютеры. Могу ли я участвовать в закупках по 44фз, если у меня нет документов о том, что эта техника - российского происхождения?
Неустойка по 44-ФЗ: разбираемся с особенностями начисления
Что не так с 44-ФЗ, или Почему злится Артемий Лебедев
Что такое госзакупки: полное определение понятия, виды закупок по 44-ФЗ
Независимый регистратор по 44-ФЗ: обзор, функции, цели, плюсы и минусы использования
Предметы роскоши по 44-ФЗ: как их опознать
Как оплатить неустойку по 44-ФЗ
Способы закупок по 44-ФЗ и 223-ФЗ
Что изменилось в закупках в конце мая: обзор Постановлений Правительства
Как проходят закупки у СМП по 223-ФЗ и 44-ФЗ
Идентификационный код закупки (ИКЗ) по 44-ФЗ: определение, формирование, расшифровка и поиск закупок по ИКЗ
Банковское сопровождение контракта по 44-ФЗ: виды, случаи и порядок осуществления

Заказчик

ИНН: 4826045274 / КПП: 482601001

Как заказчики злоупотребляли своими правами
"Зачем потеть и страдать, затачивая техзадание под своего подрядчика?" - подумал как-то заказчик и обратился к компьютерщикам.
Любовь заказчика к ПДФ (pdf)
Контракт исполнен, а оплаты нет - знакомая ситуация?
Может ли заказчик поменять техзадание после публикации закупки?
Как отличить убытки от неустойки
Топ-5 ловушек заказчика в техзадании
ФАС в шоке: новое нарушение госзаказчиков
Ошибки заказчика и обжалование действий заказчика
Положение о закупках по 223-ФЗ: содержание, структура, примеры
Права поставщика, о которых молчат заказчики
Кто такие государственные заказчики
Может ли поставщик увидеть заявки конкурентов?
Заказчик не платит
Заказчик разместил аукцион на ремонтные работы. Сроки выполнения работ - нереальные. Стоит ли участвовать?
Топ-5 ловушек заказчика в документации
Общение с заказчиками
Об исчезновении строительства детского сада.

Информационная лента

При прокрутке вниз Вы можете получить очень полезную информацию, подобранную специально для Вас нашей программой. А также самые интересные и актуальные статьи о тендерах и закупках, которые мы подобрали для Вас на просторах интернета.

Портал отображает информацию о закупках, публикуемых в сети интернет
и находящихся в открытом доступе, и предназначен для юрлиц и индивидуальных предпринимателей,
являющихся участниками размещения государственного и коммерческого заказа. Сайт использует Cookie, которые нужны для авторизации пользователя.
На сайте стоят счетчики Яндекс.Метрика, Google Analytics и LiveInternet,
которые нужны для статистики посещения ресурса.

Биологические и иммунологические свойства

Тест-система обладает способностью выявлять антигены коксиелл Бернета (Ку-антиген) за счет их связывания с поликлональными антителами, сорбированными на поверхности лунок стрипов. Образующийся комплекс антитело-антиген выявляется с помощью пероксидазного коньюгата на основе поликлональных антител по появлению желтого окрашивания на этапе ферментативного превращения субстратного раствора.

Несмотря на то, что входящие в тест-систему контрольные образцы (К+ и К-) инактивированы, с системой следует обращаться как с потенциально инфекционным материалом:

работать в резиновых перчатках;
не пипетировать ртом;
все использованные материалы подвергать обработке дезинфицирующими растворами (6 % раствором перекиси водорода или монохлорамина);
использованные наконечники обрабатывать 20 % раствором этилового спирта.

Назначение

Тест-система предназначена для выявления Ку-антигена в объектах внешней среды, (смывы) и материалах биологического происхождения (органы животных, клещи).

8-луночные стрипы, сорбированные антителами к Ку-антигену - 12 шт.
Позитивный контрольный образец, содержащий антиген коксиелл Бернета, (К+), (красный раствор), 1,2 мл - 1 пр.
Негативный контрольный образец, содержащий гетерологический антиген, (К-), (зеленый раствор), 1,2 мл - 1 пр.
Конъюгат — поликлональные антитела к коксиеллам Бернета, меченные пероксидазой хрена, (Концентрат конъюгата), (синий раствор), 0,2 мл - 1 пр.
Концентрат фосфатно-солевого буферного раствора, содержащий детергент — твин-80, (ФСРТ), (бесцветный раствор), 20,0 мл - 1 фл.
Цитратный буферный раствор с перекисью водорода, (ЦБП), (бесцветный раствор), 10,0 мл - 1 фл.
Раствор для разведения конъюгата, (РРК), (бесцветный раствор), 10,0 мл - 1 фл.
Раствор тетраметилбензидина, (ТМБ), (бесцветный или слегка голубоватый раствор), 2,5 мл - 1 фл.
Раствор серной кислоты, (Стоп реагент), (бесцветный раствор), 5,0 мл - 1 фл.
Полиэтиленовый пакет с молнией - 1 шт.
Инструкция по применению - 1 шт.

Все растворы и реагенты необходимо выдержать перед началом работы при температуре (18 — 25) o С в течение 30 мин. Иммуноферментный анализ (ИФА) рекомендуется проводить с использованием новых, не подвергавшихся обработке наконечников для пипеток.
Растворы каждого компонента тест-системы и каждого исследуемого образца необходимо брать с помощью индивидуального наконечника для пипеток.
В зависимости от числа исследуемых проб отбирают необходимое количество стрипов. Остальные стрипы вынимают из рамки-держателя и хранят в закрытом полиэтиленовом пакете с молнией при температуре (4 — 6) °С.
Материал для исследования. а) Внутренние органы животных, клещей растирают в стерильной фарфоровой ступке и готовят 25 % суспензию в 0,9 % растворе хлорида натрия. Полученную суспензию подвергают трехкратной процедуре замораживания-оттаивания, инактивируют в водяной бане при температуре 100 °С в течение 20 мин. и центрифугируют при 1000 об./мин. в течение 15 мин. Дальнейшее исследование проводят с супернатантом. б) Смывы берут ватным тампоном, смоченным 0,9 % раствором хлорида натрия, с поверхности не менее 200 –– 300 см 2 . Тампон помещают в пробирку, содержащую 2 –– 5 мл 0,9 % раствора хлорида натрия. Перед исследованием тампон тщательно отжимают, содержимое пробирки инактивируют на водяной бане при температуре 100 °С в течение 20 мин.
Раствор ФСРТ. Для получения рабочего раствора содержимое флакона с концентратом ФСРТ доводят до 500 мл дистиллированной водой. Раствор хранят до 4 мес. при температуре (4 — 6) o С.
Раствор конъюгата. Концентрат конъюгата разводят на растворе РРК 1 : 80. Необходимый объем раствора конъюгата определяется числом используемых стрипов (см. пример 1). Хранят до 4 ч при температуре (4 — 6) o С.
Субстратный раствор. Готовят перед проведением ферментативной реакции. Необходимый объем раствора субстрата определяется числом используемых стрипов (см. пример 1). Хранению не подлежит.

Пример № 1. Таблица расхода компонентов тест-системы.

Количество одновременно используемых стрипов	Коньюгат (мкл)	Разводящий буфер для коньюгата (РРК) (мл)	ТМБ (мл)	ЦБП (мл)
1	15	1,2	0,2	0,8
2	30	2,4	0,4	1,6
3	40	3,2	0,6	2,4
4	50	4,0	0,8	3,2
5	60	4,8	1,0	4,0
6	70	5,6	1,2	4,8
7	80	6,4	1,4	5,6
8	90	7,2	1,6	6,4
9	100	8,0	1,8	7,2
10	110	8,8	2,0	8,0
11	120	9,6	2,2	8,8
12	130	10,4	2,4	9,6

При правильном проведении всех стадий анализа содержимое лунок с контролем субстрата и К- должно оставаться БЕСЦВЕТНЫМ или БЛЕДНО-ЖЕЛТЫМ, а содержимое лунок с К+ должно приобрести ЖЕЛТУЮ окраску.

Исследуемый образец оценивается как положительный, если имеются отчетливые различия в интенсивности его окрашивания по сравнению с растворами в лунках с контролем субстрата и К-.

Измерение оптической плотности (ОП) проводится при длине волны 450 нм непосредственно в лунках планшета с помощью вертикального фотометра. В качестве кюветы сравнения служит лунка А1 с контролем субстрата. При правильном проведении анализа среднее значение в лунках с К+ должно быть не менее (0,60 ± 0,10) единиц ОП, а в лунках с К- – не должно превышать (0,15 ± 0,05) единиц ОП.

Оценка результатов производится следующим образом: если отношение (А) среднего значения ОП (ОП_сред) исследуемого образца к ОП_сред К- больше или равно 3 (А ≥ 3), то этот результат следует оценивать как положительный, если отношение ОП_сред исследуемого образца к ОП_сред К- меньше 3 (А o С. Транспортировку осуществлять всеми видами крытого транспорта при температуре не выше 25 о С не более 2 недель.

Срок годности тест-системы — 6 мес. со дня выпуска.

При нарушении условий хранения, транспортировки и схемы постановки ИФА рекламации не принимаются.

Иммуноферментный анализ (ИФА) — метод лабораторной диагностики, позволяющий обнаруживать специфические антитела и антигены при самых разных патологиях.

ИФА — один из самых распространенных и точных методов для выявления инфекций, передающихся половым путем, в частности ВИЧ, ВПЧ, гепатита В.

Для того чтобы результаты анализов были максимально достоверными, необходимо правильно подготовиться к их сдаче.

Спецпредложения, скидки и акции помогут существенно сэкономить на медицинском обследовании.

Контроль качества лабораторных исследований, осуществляемый по международным стандартам, — дополнительная гарантия точности результатов анализов.

Современная диагностика в медицине немыслима без высокочувствительных лабораторных анализов. Прежде для установления причин тех или иных симптомов врачи были вынуждены ориентироваться на косвенные признаки болезни, а также проводить многоступенчатые микроскопические исследования в попытке обнаружить возбудителя инфекции. Сегодня достаточно одного-единственного теста — такого как иммуноферментный анализ — чтобы подтвердить или опровергнуть первоначальный диагноз.

Основные понятия и принцип метода иммуноферментного анализа

Существует несколько разновидностей антител, каждая из которых вступает в действие на определенном этапе иммунного ответа. Так, первыми в ответ на проникновение антигена в организм синтезируются иммуноглобулины класса М (IgM). Содержание этих антител наиболее высоко в первые дни инфекционного процесса.

Следом за ними иммунная система выбрасывает в кровь иммуноглобулины класса G (IgG), которые помогают уничтожать антигены до полной победы над инфекцией, а также продолжают циркулировать по сосудам в дальнейшем, обеспечивая иммунитет к повторному заражению. На этом явлении основана вакцинация: благодаря прививкам, содержащим ослабленные антигены микробов и вирусов, в нашей крови появляется большое количество IgG, которые при контакте с реальной угрозой быстро подавляют инфекцию — до того, как она нанесет вред здоровью.

Как узнать, какие именно антигены или антитела присутствуют в организме человека? Когда врач предполагает, что причиной заболевания является определенная инфекция, или желает измерить концентрацию определенного гормона, он назначает пациенту иммуноферментный анализ.

ИФА бывает качественным и количественным. В первом случае подразумевается однозначный ответ: искомое вещество или найдено, или не найдено в образце. В случае с количественным анализом более сложная цепь реакций дает возможность оценить концентрацию антител в крови человека, что в сравнении с результатами предыдущих тестов даст ответ на вопрос о том, как развивается инфекционный процесс.

Бесспорные преимущества ИФА — высокая чувствительность и специфичность метода. Чувствительность — это возможность распознать искомое вещество, даже если его концентрация в образце невысока. Специфичность же подразумевает безошибочность диагностики: если результат положительный, значит, найдены именно те антитело или антиген, которые предполагались, а не какие-то другие.

Высокая степень технологичности проведения иммуноферментного анализа минимизирует влияние человеческого фактора, что снижает вероятность ошибки. Большинство используемых в современных лабораториях тест-систем и реактивов для ИФА выпускаются в промышленных условиях, что гарантирует точный результат.

В случае диагностики инфекционных заболеваний иммуноферментный анализ не может найти возбудителя и определить его специфичные свойства: он лишь указывает на наличие антител в крови у больного, косвенно свидетельствующих о присутствии чужеродного микроорганизма в теле человека.

ИФА — крайне точный, но не дешевый метод, поэтому обращаться к нему нужно с умом, а интерпретацией результатов должен заниматься квалифицированный врач.

Невозможно охватить полный список показаний к проведению ИФА. Вот наиболее распространенные цели анализа:

Диагностика острых и хронических инфекционных заболеваний:
- IgM и IgG к вирусным гепатитам А, B, C, E, а также антигенов гепатитов В и С;
- IgG к ВИЧ;
- Ig M и IgG к цитомегаловирусной инфекции;
- Ig M и IgG к вирусу Эпштейна-Барр;
- Ig M и IgG к герпетическим инфекциям;
- Ig M и IgG к токсоплазмозу;
- Ig M и IgG к кори, краснухе, сальмонеллезу, дизентерии, клещевому энцефалиту и другим заболеваниям;
- IgG к паразитарным заболеваниям;
- Ig M и IgG к инфекциям, передающимся половым путем;
- IgG к хеликобактерной инфекции.
Общая оценка показателей иммунитета человека и маркёров некоторых аутоиммунных заболеваний.
Выявление онкологических маркёров (фактора некроза опухоли, простатспецифического антигена, раково-эмбрионального антигена и других).
Определение содержания гормонов в сыворотке крови (прогестерона, пролактина, тестостерона, тиреотропного гормона и других).

Основной биоматериал для проведения ИФА — это сыворотка крови: в лаборатории у пациента берут образец крови из вены, из которого в дальнейшем удаляют форменные элементы, затрудняющие проведение анализа. В некоторых других случаях для анализа используется спинномозговая жидкость, околоплодные воды, мазки слизистых оболочек и т.д.

Для того чтобы избежать искажений в результатах, рекомендуется сдавать кровь натощак, а за две недели до исследования (если целью является диагностика хронических, скрыто протекающих инфекционных заболеваний) необходимо отказаться от приема антибиотиков и противовирусных препаратов.

При наличии необходимых реактивов и хорошей организации работы лаборатории результат анализа вы получите в течение 1–2 суток после забора крови. В некоторых случаях, при необходимости получения экстренного ответа, этот срок может быть сокращен до 2–3 часов.

IgM — наличие этого класса иммуноглобулинов говорит об остром инфекционном процессе в организме. Отсутствие IgM может говорить как об отсутствии конкретного возбудителя в организме, так и о переходе инфекции в хроническую стадию.
IgA при отрицательном результате теста на IgM чаще всего свидетельствует о хронической или скрыто протекающей инфекции.
IgM и IgA (совместное присутствие) — два положительных результата говорят о разгаре острой фазы заболевания.
IgG говорит либо о хронизации заболевания либо о выздоровлении и выработке иммунитета к инфекционному агенту.

В зависимости от содержания анализа в бланке могут быть представлены данные в виде таблицы с перечислением всех антител или антигенов с пометками об отрицательной или положительной реакции, либо будет указано количественное значение результата (отрицательный, слабоположительный, положительный или резко положительный). Последний вариант определяет, сколько антител содержится в анализируемом образце.

Еще один количественный показатель — индекс авидности антител, выраженный в процентах. Он указывает, сколько времени прошло от начала инфекционного процесса (чем выше индекс — тем больше).

Сегодня выпускаются тысячи видов тест-систем ИФА, позволяющих обнаруживать специфические антитела и антигены при самых разных патологиях. Поэтому этот анализ используется практически во всех медицинских отраслях. Диагноз, поставленный с помощью ИФА, — это гарантия назначения адекватной терапии и эффективного лечения заболевания.

Информативность ИФА делает этот анализ важным инструментом в работе многих медицинских центров. Но можно ли доверять такую диагностику государственным лабораториям или лучше самим выбрать, где провести такое исследование?

Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) -- вирусный нетрансмиссивный зооноз, широко распространенный в Евразии, а в России занимающий одно из первых мест среди всех природно-очаговых болезней человека. Случаи заболевания ГЛПС регистрируются в 58 из 83 административных регионов Российской Федерации и составляют ежегодно 8--10 тыс. больных в целом по стране.

Отсутствие тенденции к снижению заболеваемости ГЛПС, расширение ареала инфекции, участившиеся случаи вспышек ГЛПС, ассоциированных с новыми, ранее не известными в России хантавирусами, свидетельствует о возрастающей медицинской и социальной значимости проблемы ГЛПС.

Открытию возбудителя ГЛПС предшествовал более чем 40-летний период поисков, успешно завершившийся в конце 70-х гг., когда впервые вирус-возбудитель ГЛПС был выделен в Южной Корее от полевой мыши Apodemus agrarius coreae [1].

Несколько лет после открытия возбудителя ГЛПС единственным лабораторным методом для выявления антигена вируса-возбудителя ГЛПС и антител к нему оставался непрямой метод флюоресцирующих антител (МФА) с использованием препаратов криостатных срезов легочной ткани полевых мышей. Ограниченные возможности этого метода, а также трудности, связанные с использованием криостатных срезов легочной ткани диких грызунов (отлов диких животных, транспортировка и хранение легочных тканей, нестандартность антигенной активности препаратов, спонтанная инфицированность грызунов реовирусами, низкая производительность и др.), существенно тормозили изучение ГЛПС, а также применение специфической диагностики этой инфекции в широкой практике. Это в основном и явилось основанием для разработки и усовершенствования методов лабораторной диагностики ГЛПС, чему посвящена настоящая работа.
В процессе исследований было разработано и усовершенствовано применительно к хантавирусам 23 метода, включая иммунологические, вирусологические и молекулярно-генетические.

• обнаружение и титрование вируса по индикации вирусспецифического антигена в клетках VERO-Е6 с использованием непрямого МФА;
• обнаружение и титрование вируса с использованием феномена фокусобразующих единиц (ФОЕ) [10, 11];
• реакция нейтрализации [10, 11].

Реакция нейтрализации с использованием феномена подавления числа ФОЕ применялась в собственной модификации, предусматривающей добавление комплемента при экспозиции вирус-сывороточной смеси, что стандартизует результаты нейтрализующей активности антител в сыворотках крови с различным сроком хранения. По нашим данным, такая модификация позволяет наиболее достоверно выявлять антигенные взаимоотношения между хантавирусами и, соответственно, обеспечивать надежную информацию к таксономической классификации хантавирусов.

Молекулярно-генетические методы:

• выделение хантавирусной РНК с использованием гнездовой ПЦР с обратной транскрипцией;
• амплификация и секвенирование нуклеотидных последовательностей РНК-сегментов хантавирусного генома [13--15].

При сравнении эффективности применения разработанных нами иммунологических методов принимали во внимание не только их высокую чувствительность и специфичность, но и доступность для широкого применения в условиях практического здравоохранения. Кроме того, учитывали перспективность технологии промышленного изготовления диагностических препаратов. Так, в соответствии с этими критериями оценки эффективности было показано, что по сравнению с ранее применявшимся непрямым МФА (препараты криостатных срезов) возможность широкого практического применения иммуносорбентных методов ИФА и РИА для выявления вирусспецифического антигена у мелких млекопитающих в природных очагах ГЛПС имеет очевидные преимущества, обусловленные высокой производительностью при обследовании большого количества образцов суспензий органов, не нуждающихся в дополнительной очистке от грубых примесей, простотой и объективностью учета результатов опыта. Кроме того, в отличие от непрямого МФА иммуносорбентные методы и РНГА, обладая практически одинаковой чувствительностью и специфичностью, позволяют определять количественное содержание антигена в исследуемых материалах. Вместе с тем следует отметить, что при сравнении возможностей использования ИФА, РИА и РНГА для выявления хантавирусного антигена предпочтение отдано ИФА, поскольку применение РИА требует наличия дорогостоящего оборудования и высокого качества радиоактивных препаратов, а также специальной подготовки персонала, что ограничивает возможности использования этого метода в учреждениях практической сети здравоохранения. Что касается РНГА и РТНГА, то эффективность их широкого практического применения ниже по сравнению с ИФА и РИА, что связано главным образом с необходимостью предварительной обработки исследуемых материалов эритроцитами барана для удаления гетероагглютининов. При оценке эффективности применения двух вариантов непрямого МФА для выявления специфических хантавирусных антител в сыворотках крови больных и переболевших ГЛПС людей из разных регионов России было показано, что частота выявления серопозитивных лиц и среднегеометрические титры антител, выявляемых непрямым МФА с культуральным антигеном хантавируса (92%, титр Σ 8,3 log2), была значительно выше по сравнению с тем же методом, но с применением в качестве антигена препаратов криостатных срезов легочной ткани животных (72%, титр Σ 4,5 log2) [16].

Биотехнологические основы конструирования диагностикумов ГЛПС

Диагностикум геморрагической лихорадки с почечным синдромом культуральный, поливалентный для непрямого метода иммунофлюоресценции.

До разработки технологии изготовления культурального поливалентного диагностикума в том виде, в котором этот препарат был передан для промышленного освоения, пройден длительный и важный этап его конструирования. Этот этап был связан с усовершенствованием и оптимизацией процессов изготовления диагностического препарата, обусловленных как использованием в технологии новых данных, касающихся особенностей гуморального иммунитета при ГЛПС, антигенной вариабельности хантавирусов и их репродукции в культуре клеток, так и чисто практическими проблемами, возникавшими при широком применении диагностикума.

Первоначально культуральный диагностикум готовили на основе прототипного штамма Hantaan 76-118, полученного из Южной Кореи. Однако применение такого диагностикума в европейских очагах ГЛПС оказалось малоэффективным, особенно в ранние сроки болезни, поскольку циркулирующий в этих очагах вирус-возбудитель ГЛПС имеет, как выяснилось позже, антигенные различия с прототипным штаммом. В связи с этим для приготовления культуральных антигенов стали использовать выделенные нами в европейском и дальневосточном регионах России штаммы, относящиеся к хантавирусам Puumala и Hantaan. Вначале готовили и применяли моновалентные антигены (отдельно для каждого хантавируса), а затем комбинированный двухвалентный препарат, с тем чтобы при серологическом исследовании сывороток крови больных ГЛПС не пропустить гетерологичный для данного региона хантавирусный серотип. Диагностикум включал антигенные препараты, изготовленные по авторской технологии из 2 штаммов, представлявших штаммы хантавирусов Puumala и Hantaan, положительные и отрицательные контрольные сыворотки и ФИТЦ-конъюгат IgG против иммуноглобулинов человека. Поскольку антитела, вырабатываемые в ответ на заражение человека вирусами-возбудителями ГЛПС, относящимися к хантавирусам Hantaan, Seoul и Dobrava/Belgrad, при исследовании непрямым МФА перекрестно реагируют с минимальной разницей в титре, включение в состав диагностикума одного из этих вирусов для выявления антител ко всем остальным представлялось оправданным. Однако впоследствии было показано, что в остром периоде болезни титры антител в сыворотках крови больных ГЛПС, ассоциированной с хантавирусами Hantaan, Seoul и Dobrava/Belgrad, в 2--4 раза выше c гомологичным антигеном (в поздних сыворотках эта разница нивелируется). В этой связи для повышения чувствительности препарата при определении антител в ранние сроки болезни диагностикум ГЛПС был усовершенствован: в состав комбинированного двухвалентного антигена были дополнительно включены культуральные антигены, приготовленные на основе штаммов хантавирусов Seoul и Dobrava/Belgrad (рис. 1).

При разработке экспериментальных серий препарата были проведены научные исследования по изучению оптимальных условий размножения хантавирусных штаммов в культуре клаток VERO-Е6 и накопления вирусспецифического антигена; оптимальных условий приготовления антигенных препаратов; параметров полной инактивации инфекционной активности хантавирусов; оптимальных условий постановки непрямого МФА для выявления вирусспецифических флюоресцирующих антигенов хантавирусов и др.

Успешная апробация культурального диагностикума ГЛПС в широкой практике (серологически обследовано более 20 тыс. больных с подозрением на ГЛПС на 17 административных территориях России) и определение реальных потребностей в препарате практического здравоохранения явились обоснованием к технологической разработке промышленного производства этого диагностикума. Была разработана и утверждена соответствующая нормативно-техническая документация по изготовлению, контролю и применению культурального поливалентного диагностикума ГЛПС, проведены комиссионные испытания диагностикума в ГИСК им. Л.А. Тарасевича, а также утверждена фармакопейная статья на диагностический препарат.

В настоящее время диагностикум ГЛПС выпускается в виде набора реагентов, содержащего культуральный антигенный препарат и контрольные сыворотки. Антигенный препарат является основным действующим компонентом комплекта. Он представляют собой равномерно нанесенные на предметное стекло по 0,005 мл высушенные, инактивированные ультрафиолетовым облучением и фиксированные ацетоном суспензии клеток VERO-E6, содержащие специфические антигены, приготовленные на основе штаммов хантавирусов Puumala, Hantaan, Seoul и Dobrava/Belgrad, и клетки, не содержащие хантавирусных антигенов в соотношении 2:1:1:1:1. Визуально на стекле антиген определяется в виде серых пятен диаметром 2--З мм (по 12 или 21 капле на каждом стекле). Помимо антигенных препаратов, набор содержит контрольные иммунные сыворотки: анти-Hantaan, выявляющую антигены хантавирусов Hantaan, Seoul и Dobrava/Belgrad; анти-Puumala, выявляющую антигены хантавируса Puumala; нормальную сыворотку человека, а также ФИТЦ-конъюгат против глобулинов человека.

Несомненным достоинством диагностикума ГЛПС является то, что в антигенном поливалентном препарате имеется весь набор присущих хантавирусу антигенных детерминант, представленных в цитоплазме клеток в составе зрелых вирионов, а также компонентов сборки вирусных частиц: белка нуклеокапсида, гликозилированного белка наружной оболочки и его предшественников, вирусной РНК. Именно поэтому непрямой МФА остается стандартом при сравнении специфичности и чувствительности вновь создаваемых диагностических препаратов для серодиагностики ГЛПС.

Следует отметить, что культуральный диагностикум применяется и для исследования сывороток крови животных на присутствие хантавирусных антител. Для этого необходимо использовать ФИТЦ-конъюгат против глобулинов того вида животных, которому принадлежит исследуемая сыворотка.

Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом занимает ведущее место по заболеваемости среди природно-очаговых инфекций в России. Заболевание протекает как острая инфекция с поражением почек, легких, центральной нервной и гормональной систем, наличием в ряде случаев тяжелых осложнений в остром периоде, приводящих к летальным исходам, и характеризуется длительным сроком восстановления до полного выздоровления. В этой связи проблема ГЛПС представляет серьезную медико-социальную проблему.

Открытие вируса -- одного из возбудителей этого заболевания в 1978 г. (Lee H.W. et al., 1978) стало этапным в изучении этой инфекции, а название вируса -- Хантаан стало родовым для многочисленных впоследствии открытых вирусов, как патогенных, так и не патогенных для человека.

Начало наших исследований по этой проблеме совпало с началом становления хантавирусологии. В первую очередь остро стоял вопрос методической составляющей исследований, поскольку в арсенале экспериментаторов поначалу имелся только метод непрямой иммунофлюоресценции с использованием криостатных срезов легких инфицированных грызунов -- природных носителей вируса. Отсутствовала специфическая диагностика заболевания, соответственно, вопросы этиологии, ареала и нозоареала инфекции, о ее носителях в природе требовали своего решения.

В начале наших исследований наиболее важным был вопрос обеспечения исследований ГЛПС высокоэффективными и стандартными диагностическими препаратами. Это препараты для специфической лабораторной диагностики ГЛПС у больных людей, с одной стороны, и, с другой, для выявления возбудителей этой инфекции во внешней среде, поскольку источником заражения людей служат дикие грызуны.

В связи с этим были определены основные параметры конструирования иммуноглобулиновых диагностических препаратов, что позволило разработать технологическую схему их промышленного производства. Были разработаны и утверждены нормативно-технические документы по изготовлению, контролю и применению иммуноглобулиновой пероксидазной тест-системы для ИФА и культурального поливалентного диагностикума ГЛПС для непрямого МФА.

Экспериментальная разработка лабораторных методов применительно к хантавирусам и промышленное производство диагностических препаратов ГЛПС в значительной мере способствовало успеху, достигнутому в нашей стране и за рубежом в изучении ГЛПС, а также решению ряда задач практического здравоохранения, связанных с этой инфекцией.

Широкое применение разработанных нами методов специфической диагностики применительно к хантавирусам для обследования людей и мелких млекопитающих позволило значительно расширить наше представление о географическом распространении возбудителей ГЛПС и их носителей в природе. Отмечена тесная корреляция при обнаружении инфицированных хантавирусом мелких млекопитающих и серопозитивных к этому вирусу лиц среди населения административных территорий, где проводились параллельные исследования мелких млекопитающих и людей. В последние годы, благодаря серологическому обследованию людей с заболеваниями, сходными по некоторым симптомам с ГЛПС, в ряде районов России, в которых ранее не регистрировалась заболеваемость ГЛПС, были выявлены больные этой инфекцией.

1. Впервые, применительно к хантавирусам, разработан комплекс лабораторных методов исследования материалов от больных ГЛПС и мелких млекопитающих, позволивших существенно повысить эффективность специфической диагностики ГЛПС и получить новые данные, имеющие приоритетное значение в изучении хантавирусных лихорадок в нашей стране и за рубежом.

2. Результаты сравнительной оценки эффективности клинической и специфической лабораторной диагностики ГЛПС позволили установить истинные размеры заболеваемости, расширить представление о диапазоне клинических проявлений инфекции.

3. Получены экспериментальные данные, которые составили основу технологии изготовления иммунобиологических препаратов, предназначенных для специфической лабораторной диагностики ГЛПС.

Читайте также: