Пцр диагностика вирусов картофеля

Вирусные заболевания картофеля представляют значительную опасность для сохранности посевных качеств и урожайности. Вирусы - это неклеточные организмы, которые могут воспроизводиться только внутри живых клеток, используя генетический материал хозяина для собственного размножения. Будучи мельчайшим из всех живых организмов, вирус состоит из нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), заключённой в белковую оболочку. Поскольку вне клетки хозяина вирус не проявляет признаков живого организма и слишком мелок для световых микроскопов, диагностика картофеля для клонального размножения и анализ качества посадочного материала картофеля осуществляется лабораторными молекулярными методами: иммуноферментным анализом (ИФА) или полимеразной цепной реакцией (ПЦР).

Вирусы вызывают ряд общих симптомов на наземной части поражённого растения. Это, как правило, общее угнетение растения, скручивание, морщинистость или пятнистость (мозаичность) листьев. Симптомы могут быть типичными для какого-то определённого вируса, но, в большей степени, разные вирусы могут вызвать схожие симптомы. Более того, различные сорта картофеля могут по-разному реагировать на заражение одним и тем же вирусом. В некоторых случаях, вирусные инфекции протекают бессимптомно.

Несмотря на то, что вирусы редко убивают картофельное растение, они могут оказывать существенное негативное влияние на развитие растений, урожайность и качество клубней и являются основной причиной дегенерации (вырождения) картофеля. Поскольку картофель размножают вегетативно и возбудители болезней картофеля могут переходить в дочерние клубни, доля заражённых вирусами растений увеличивается по мере размножения посевного материала. Диагностика вирусов картофеля проводится для того, чтобы выяснить, заражен посевной материал или нет.

Производство и сертификация семенного картофеля требуют полного отсутствия вирусов в исходном материале и, по возможности, поддержания безвирусного статуса растений при их размножении. Введение картофеля в стерильную культуру с использованием апикальной меристемы в сочетании с термической обработкой позволяет получить безвирусный материал. Как правило, в развитых хозяйствах исходный материал культивируемых сортов поддерживается в стерильной культуре клональным размножением и новые партии семенного картофеля получают из этих тщательно контролируемых и свободных от вирусов и бактериальных патогенов фондов. Иммуноферментный анализ на вирусы картофеля обычно используется для контроля заболеваний в большинстве диагностических лабораторий.

На настоящий момент, известно более 50 видов вирусов картофеля, большинство из которых, либо не вызывают серьёзных проблем, либо имеют очень узкий ареал распространения. В России согласно ГОСТ Р 53136-2008 семенной материал высоких репродукций должен быть свободен от 5 вирусов: Y-, X-, S-, M-вирусов картофеля и вируса скручиваемости листьев картофеля.

Вирус Y (PVY) является одним из тяжелейших вирусов картофеля по степени воздействия на снижение урожайности. В зависимости от условий, сорта и присутствия других вирусов в поражённом растении потери могут достигать 70 %. Симптомы первичного заражения вирусом весьма разнообразны и определяются не только сортом картофеля и условиями культивирования, но и штаммом вируса. Как правило, это черно-коричневые угловатые некрозы листьев, пятнистость, пожелтение, пониклость или опадение листьев и преждевременное отмирание растений. Симптомы вторичного заражения выражаются в карликовости растения и пятнистости и морщинистости листьев. Симптомы заражения вирусом Y картофеля могут проявляться как на всём растении, так и на нескольких листьях или отдельных побегах.

Наряду с Y вирусом, вирус скручиваемости листьев картофеля (PLRV) один из самых тяжелых вирусов. Потери урожая при высоком уровне заражения могут достигать 50%. Симптомы, характерные для первичного и вторичного заражения различны. При первичном заражении, происходящем в текущем сезоне, как правило, повреждаются верхние листья – они скручиваются внутрь, бледнеют и, иногда, несколько краснеют. Вторичная инфекция, развивающаяся из заражённых клубней, протекает с гораздо более тяжёлыми симптомами – повреждение листьев начинается снизу и распространяется по всему растению. Листья скручиваются, бледнеют, краснеют и усыхают. Повреждённые растения формируют нормальные по форме, но более мелкие клубни. Развивается некроз флоэмы, который в клубнях носит название сетевой некроз.

Следующими по значимости являются вирусы Х (PVX) и А (PVA). Они проявляют схожие симптомы, выражающиеся в мозаичности листьев. Оба вируса встречаются везде, где выращивают картофель. Незначительные уровни инфекции практически не отражаются на урожайности, тогда как массовое поражение может приводить к потере урожайности на 20-40%. Однако, в развитых странах контроль за распространением этих вирусов позволил значительно снизить их влияние на выращивание картофеля.

Вирусы S и М, как правило, не проявляют симптомов и не оказывают серьёзного влияния на урожайность поражённых растений. Однако, эти вирусы усиливают негативные эффекты, вызванные другими вирусами в случае совместного заражения растений.

Вирусные болезни картофеля не поддаются лечению. Они передаются с насекомыми, в первую очередь, тлями и при механическом контакте с инфицированными растениями. Таким образом, профилактика и борьба с вирусными заболеваниями сводится к использованию здорового посадочного материала. Необходимы своевременный анализ качества семенного материала картофеля, контроль за появлением и распространением вирусов и своевременное удаление заболевших растений, уничтожение насекомых, аккуратность при проведении полевых работ и работ, связанных с хранением, обработкой и транспортировкой клубней.

Помимо вирусных существуют также инфекционные заболевания картофеля - вы можете ознакомиться с ними в соответствующем разделе.

Вирусы вызывают одни из самых экономически значимых заболеваний картофеля и являются основной причиной снижения категорий семенного картофеля. Вирусы поражают как семенной, так и товарный картофель, вызывая потери в урожайности и снижение качества продукции. Заражённые растения не поддаются лечению.

В Российской Федерации семенной картофель традиционно исследуют на наличие 6 вирусов:

Вирус переносится тлёй, а также при механическом повреждении растений. Вирус вызывает существенное снижение урожайности ряда сортов картофеля. Симптомы заболевания и степень потерь урожая находятся в прямой зависимости от штамма вируса, устойчивости сорта и продолжительности воздействия вируса на растение.

Вирус переносится тлёй. Поражение приводит к серьёзным повреждениям растений, выражающимся в скручивании листьев и некрозах ткани, и значительному снижению урожайности.

Заражение картофеля этими вирусами может протекать бессимптомно и не приводить к заметному снижению урожайности, однако, совместное заражение растений с тяжёлыми вирусами (PVY, PLRV) приводит к существенному усилению проявления симптомов заболеваний и увеличению потерь урожайности.

Диагностика вирусов картофеля

Испытательная лаборатория ООО Независимая диагностическая лаборатория оказывает услуги по диагностике семенного картофеля на наличие вирусов с учётом требований соответствующего ГОСТ.

Уровень заражения семенного картофеля вирусами, а также методы отбора проб и определения качества семенного картофеля регламентируются ГОСТ 33996-2016 “Картофель семенной. Технические условия и методы определения качества”:

• наличие растений с проявлением симптомов тяжелых форм мозаики (YBK) и скручивания листьев картофеля (ВСЛК) в исходном материале не допускается (пункт 5.1.2; таблица 1)
• в оригинальном, элитном и репродукционном семенном картофеле допускается наличие растений с проявлением симптомов тяжелых форм мозаики (YBK) и скручивания листьев картофеля (ВСЛК) (в процентах по счёту) не более 0.4, 1 и 2%, соответственно (пункт 5.1.2; таблица 1)
• по результатам лабораторного тестирования в исходном материале наличие вирусов не допускается (пункт 5.1.11; таблица 2)
• по результатам лабораторного тестирования допускается наличие вирусов в семенном картофеле категорий ПП-1 и ССЭ (в процентах по счёту) не более 5% (YВК – не более 0.5%) и 10% (YВК – не более 1%), соответственно (пункт 5.1.11; таблица 2)
• для партий суперэлитного, элитного и репродукционного семенного картофеля лабораторное тестирование проводится по заявке производителя или поставщика семенного картофеля. Предельно допустимые нормы ограничения вирусной инфекции по результатам лабораторного тестирования клубневых проб могут устанавливаться в договорах (контрактах) на поставку семенного картофеля по договоренности сторон. Для партий категории ЭС предельный уровень ограничения YВК по результатам лабораторного тестирования не должен превышать 10%
• для проведения лабораторного тестирования на заражённость вирусной инфекцией отбирают 200 клубней для оригинального семенного картофеля и 100 клубней для элитного семенного картофеля (пункт 6.3.1; таблица 6)
• полимеразная цепная реакция (ПЦР) и иммуноферментный анализ (ИФА) являются методами лабораторного тестирования исходного материала, оригинального и элитного семенного картофеля (пункты 5.1.11, 7.3.1, 7.3.2).

Диагностика вирусов картофеля подразумевает определение процента клубней, инфицированных вирусами, относительно общего количества клубней. В Независимой диагностической лаборатории применяются два основных метода диагностики – иммуноферментный анализ (ИФА) и полимеразная цепная реакция (ПЦР) в режиме реального времени с зондами Taqman, совмещённая с реакцией обратной транскрипции.

Для проведения ИФА в лаборатории используются антитела и конъюгаты антител производства компании Bioreba AG (Райнах, Швейцария; ISO 9001 и ISO 17025) и SASA (Science and Advice for Scottish Agriculture; Эдинбург, Шотландия; ISO 9001). Все процедуры выполняются в строгом соответствии с рекомендациями производителя антител.

Аннотация научной статьи по ветеринарным наукам, автор научной работы — Рязанцев Д.Ю., Дробязина П.Е., Завриев С.К.

Похожие темы научных работ по ветеринарным наукам , автор научной работы — Рязанцев Д.Ю., Дробязина П.Е., Завриев С.К.

PCR-based diagnostics of the Andean potato viruses

ПЦР-диагностика андийских вирусов картофеля

П.Е. ДРОБЯЗИНА, С.К. ЗАВРИЕВ

Андийский (Южноамериканский) регион является центром происхождения как картофеля, так и его болезней. Здесь наблюдается наибольшее разнообразие патогенов картофеля, среди которых выделяют четыре вируса, внесенных в Перечень карантинных объектов РФ (Список отсутствующих на ее территории ). В их числе - андийский латентный вирус картофеля (АЛВК) и андийский вирус крапчатости картофеля (АВКК).

На дикорастущих видах картофеля, пораженных АЛВК, отмечают довольно четкие симптомы как при первичной,так и вторичной инфекциях, тогда как на культурном картофеле при первичной инфекции заболевание чаще протекает бессимптомно, иногда может наблюдаться мозаичность или сетчатое по-светление жилок, а при вторичной инфекции развивается мозаика, нередко с некротической крапчатостью, скручиванием и некрозом верхушки листьев. АЛВК переносится неперсистентным способом блошками из рода Epitrix, контактным путем от зараженных клубней, а также настоящими семенами [4].

Андийская крапчатость картофеля при первичной инфекции проявляется в виде слабой мозаичной окраски листьев, а при вторичной - в их ярко выраженной крапчатости. Иногда наблюдается деформация листьев, некротические поражения участков тканей, общее угнетение растения. Восприимчивые сорта могут реагировать первоначальным системным верху-

шечным некрозом, деформацией листьев и задержкой роста [2]. Вирус переносится насекомыми из родов 01аЬгоИаа и ЕрйгЫ, а также при контакте с зараженными клубнями и растениями.

В случае обоих вирусов симптомы инфекции в большей степени проявляются в прохладную погоду.

География ввоза в Россию семенного и продовольственного картофеля ежегодно расширяется. Картофель из зон распространения андийских вирусов (Гондурас, Чили, Никарагуа, Боливия, Колумбия, Эквадор, Перу и Бразилия)ввозится и как важный источник генов хозяйственно ценных признаков (содержание микроэлементов и важнейших антиоксидантов, например, витамина С, полифенолов, каротино-идов). Интенсивный международный обмен селекционным материалом и гермоплазмой в виде клубней, корневых черенков создает

риск заноса андийских вирусов. Опасность для нашей страны представляет не только зараженный андийскими вирусами семенной, но и продовольственный картофель, который может попасть с прилавков рынков и магазинов в качестве посадочного материала на приусадебные участки. Поэтому все клубни, предназначенные для посадки или прямого потребления, должны проходить досмотр и лабораторную экспертизу на наличие карантинных объектов, в том числе андийских вирусов.

Для реализации карантинных мер защиты от проникновения на территорию России АЛВК и АВКК необходимы быстрые, высокотехнологичные методы лабораторной экспресс-диагностики подкарантинной продукции.

Применявшиеся ранее методы диагностики этих вирусов имеют ряд ограничений. Метод растений-индикаторов [1] требует высокой квалификации персонала и значительных затрат времени, серологические методы детекции [3, 5] - дорогостоящих высококачественных антител, к тому же чувствительность обоих методов невысокая и ни один из них не может обеспечить контроль за постоянно растущими объемами ввозимой продукции. Альтернативой могут стать молекулярные методы детекции АЛВК и АВКК, например, на основе метода полимераз-ной цепной реакции (ПЦР). Они позволяют быстро, с высокой чувствительностью и специфичностью определять наличие анализируемого вируса даже при его низком содержании в образцах и при латентной инфекции.

ПЦР основана на способности фермента ДНК-полиме-разы проводить удвоение молекулы ДНК, начиная с двухцепочечного участка (затравки). В процессе ПЦР на первом этапе при температуре 94 °С происходит раз-

деление двойной спирали ДНК (денатурация), затем температуру понижают до 55-70 °С, при которой с одноцепочечной ДНК могут взаимодействовать специальные оли-гонуклеотиды - праймеры (так называемый отжиг праймеров), которые и обеспечивают затравку для ДНК-полимеразы. Правильность подбора праймеров определяет специфичность и чувствительность ПЦР. За этапами денатурации и отжига идет этап собственно полимеризации ДНК (при 60-72 °С). Эти три этапа (денатурация, отжиг и полимеризация) повторяются 2550 раз (циклов) путем последовательного выдерживания определенных температур в термоцикле-ре. За каждый цикл количество фрагмента ДНК, ограниченного праймерами, удваивается, и после прохождения ПЦР его можно обна-

увеличению уровня флуоресценции в пробирке.

Схема анализа образцов растительного материала на наличие АЛВК

Для диагностики вирусных болезней применяются макро- и микроскопические, биологические, физические, химические, индикаторный и серологический методы. Наиболее распространены визуальный и серологический методы.

Визуальный метод – определение заболевания по внешним признакам (хлороз, деформации, чрезмерное ветвление, язвы, некрозы, мозаики) непосредственно в поле (скручивание листьев, полосчатая мозаика,бактериоз стеблей, бурая бактериальная гниль, аукуба – мозаика, морщинистая мозаика, столбур). Этот метод часто не дает надежных результатов при определении вирусов Х,S,M,A, вызывающих слабозаметные симптомы или находящихся в латентном состоянии.

Эффективность визуального метода оценки выше, если учитывать комплекс основных и второстепенных признаков в динамике. Например, слабые признаки обыкновенной мозаики лучше заметны на молодых растениях до цветения, затем они ослабевают или исчезают; закручивание листьев сильно проявляется во время бутонизации, позднее исчезает; признаки полосчатой мозаики проявляются после цветения и усиливаются с возрастом растений.

Наиболее типичные проявления вирусной инфекции на картофеле - мозаики, деформации, хлорозы, некрозы, желтая мозаика.

При тяжелых формах вирусных болезней отмечаются следующие признаки.

Для морщинистой мозаики (вирус У, часто – вместе с вирусами Х,S и А) характерны мозаичность и морщинистость листьев, торможение роста жилок долей в длину, края листьев загибаются книзу, на листьях – некрозы, нижние листья засыхают.

При полосчатой мозаике (чаще вирус У) обнаруживаются темные штрихи (некрозы) и пятна на нижней стороне листа, а также на черешках листьев и стеблях.

При закручивании листьев (вирус М) проявляются мозаичность, искривления и волнистость верхних листьев, края их долей загнуты вверх или доли слегка сложены вдоль средней жилки. Признаки болезни хорошо различаются только на молодых растениях.

Складчатая мозаика (вирус А) характеризуется разнообразными деформациями долей листа, часто сопровождающимися мозаичностью.

К группе желтух относится скручивание листьев (вирус L): нижние листья скручиваются в трубочки, становятся жесткими и шуршат, что особенно заметно во время цветения.

Крапчатость и обыкновенная мозаика (вирусы Х и S) проявляются на листьях в виде размытых светлых пятен различной величины, иногда наблюдается слабая деформация листьев.

Для выявления поражения картофельного растения вирусом скручивания листьев применим гистохимический анализ (выявляются патологические изменения в структуре клеток и тканей, биохимическом составе растений). Во флоэме стебля отмечается отмирание клеток (некроз), а в ситовидных трубках клубней – накопление полисахарида каллозы, выявляемое по окрашиванию тканей фуксином и резорцином.

Серологический метод – выявление скрытой инфекции с помощью диагностических сывороток. Основан на антигенных свойствах вирусов: при смешивании диагностических сывороток с соком проверяемых растений, листьев, клубней, ростков, вытяжек из них, семян в случае их зараженности одним или несколькими вирусами наблюдается хлопьевидный осадок. Метод широко применяется в первичном семеноводстве и селекции картофеля. Дает возможность выявить растения, зараженные латентными формами вирусов Х,S, М,У,А и скручивания листьев. Оптимальные сроки анализа для вирусов Х и М – во время бутонизации, вируса У – через 20-25 суток после всходов, вируса S – во время цветения. Серологическую оценку рекомендуется проводить не менее 2х раз. Для этого у полевых растений отбирают концевые доли 3-х полностью развитых листьев (верхнего, среднего и нижнего) и выдерживают при t 3-5 0 С не менее 2 ч, а при анализе растений, полученных из глазков в теплице, берут 2-3 листа целиком с верхней частью стебля. Для получения более достоверных серологических реакций следует: химические обработки посевов, подлежащих проверке, прекращать за 2-3 недели до начала анализов; проверять только молодые растения; отбирать листья с разных ярусов; брать сок из свежесорванных листьев; между отжатием сока и смешиванием его с сывороткой не допускать перерыва более 30 мин; анализы проводить при t 18…22 0 C; смешанные капли выдерживать не менее 20 мин.

Разновидность этого метода – иммуноферментный анализ ,основанный на использовании сывороток, глобулины которых соединены с ферментом (Элиза – тест). Вначале материал проверяют с помощью капельного серологического, индикаторного и других методов и только после этого для окончательной проверки используют данный метод.

Сущность иммуноферментного анализа заключается в следующем: на стадии выделения иммуноглобулинов добавляют небольшое количество фермента пероксидазы или кислой фосфатазы, что позволяет резко повысить чувствительность метода благодаря цветной реакции. При этом дается не только качественная характеристика , но и количественная. В настоящее время освоены методы получения конъюгата (иммуноглобулины, меченые указанными выше ферментами) для выявления вирусов Х,У, S, М.

Среди модификаций ИФА предпочтение отдается Сэндвич – методу. Им можно одновременно определить растения на зараженность Х,S, М,У, F,L – вирусами.

Оборудование для ИФА: автоматические пипетки от 50 до 200 мкл, полистироловые пластины с 96 лунками; фотометр, холодильник на -20 0 С, термостат на +37 0 С, сушильный шкаф, диагностические наборы на вирусы, которые заказывают в НИИКХ. Анализ проводят при t 18…25 0 С. Весь процесс определения длится 1,5 дня и состоит из следующих этапов:

1. Нанесение антител. Специфические антитела разбавляют в буфере и наливают по 100 мкл (0,1 мл) в лунки платы, накрывают крышкой и инкубируют в течение ночи при + 4 0 или 2 часа при + 37 0 С в термостате.

Промывка. Раствор удаляют из платы. Для этого нужно резко перевернуть плату и вытряхнуть содержимое. Промывают лунки 3 раза промывочным буфером. Избыточную влагу удаляют из лунок фильтровальной бумагой.

2. Нанесение анализируемых образцов. Буфером экстрагируют сок из растения картофеля и наливают по 0,1 мл суспензии исследуемого материала, а также контрольные растворы в лунки платы. Закрывают плату крышкой и инкубируют в течение ночи при + 4 0 С или 1 ч при + 37 0 С.

В качестве отрицательного контроля используют сок листьев или ростков заведомо здоровых растений и клубней или вносят в лунку вместо него буфер для проб и коньюгата в объеме не больше 0,1 мл ( во избежание появления неспецифической реакции).

При взятии проб необходима тщательная промывка проточной водой инструментов и посуды с последующей дезинфекцией.

3. Нанесение коньюгата. Наливают в лунки по 0,1 мл рабочего раствора коньюгата (специфическое антитело, меченое ферментом), накрывают плату крышкой, инкубируют 1 ч при +37 0 С. Промывку проводят аналогично п.1.

4. Проведение ферментативной реакции. Наливают по 0,1 мл субстрата и инкубируют при комнатной t 0 в течение 30…40 мин для окрашивания.

Оценка результатов. Наличие или отсутствие вируса может быть определено визуально или спектрофотометрически. При визуальной оценке, дающей информацию типа “да” “или нет”, интенсивность окраски в лунках с анализируемыми пробами сравнивают с интенсивностью окраски в лунках с отрицательным контролем. Результаты анализа можно фиксировать условными обозначениями: - - вирус отсутствует; + - материал заражен; ++- материал сильно заражен.

Антитела, нанесенные на планшет и высушенные на воздухе, рекомендуется хранить при – 20 0 С. В этих условиях они в течение нескольких месяцев не теряют способности взаимодействовать с вирусом.

Контроль пробирочных растений методом Элиза – теста (ИФА) осуществляют при черенковании растений.

Метод электронной микроскропии. Объект, приготовленный для просмотра на электронном микроскопе, должен быть монтирован на очень тонких (толщиной 20 нм) пленках формваровых или коллодиевых.

Для получения пленки готовый коллодий дополнительно высушивают в вакууме и растворяют в амилацетате (1-1,5 % раствор).

На сетки (диски 3 мм с отверстиями, изготовленные из меди) наносят плёнку.

Для нанесения объекта на сетку с пленкой готовят предметное стекло с наклеенной тонкой полоской пластыря посередине, по обе стороны которого по краям слегка прикрепляют по 10 сеток с пленкой.

Край исследуемого листа отрезают лезвием и место среза погружают на 1-2 сек. в каплю дистиллированной воды, помещенную на сетку с пленкой. Каждый новый срез делают чистым лезвием. После высыхания и напыления препарат готов для просмотра.

Контрастирование напылением производят в вакуумной установке. Для достоверности готовят по два препарата исследуемого объекта и просматривают по 10 полей каждого препарата. Для напыления применяют металлы. Препараты просматривают при увеличении в 40-60 тыс. раз.

Метод индексации. Для выявления вирусных болезней в зимний период применяют метод индексации, т.е. определение зараженности клубней вирусами по их частям (индексам). Он основан на способности некоторых вирусов давать внешнее проявление заболевания за короткое время в условиях повышенной температуры. Для чего в зимний период после естественного начала прорастания клубней или искусственного прерывания периода покоя путем обработки стимуляторами в верхушечной части клубня вырезают глазок (индекс) вместе с мякотью диаметром до 1,5 см. Индексы высаживают в горшочки с торфокрошкой и выращивают из них растения в условиях теплиц. При этом номер каждого глазка (индекса) такой, как у клона, из которого взят клубень для проведения анализа.

При высоте растений 18-20 см растения тщательно осматривают на выявление внешних признаков заболеваний. Все больные растения бракуют и записывают в журнал их номера. Внешне здоровые проверяют на выявление скрытой инфекции серологическим или иммуноферментным методами. При анализе растений, полученных из глазков в теплице, берут целиком 2-3 листа с верхней части стебля. Все растения с положительной реакцией бракуют, а их номера отмечают в журнале. По данным визуальной и серологической оценок растений, выращенных из глазков (индексов), проводят браковку клонов. По результатам оценки бракуют целиком все клоны, номера которых совпадают с номерами выбракованных растений в теплице.

Задания для самостоятельной работы.

1. Ознакомиться с методикой и техникой визуальной диагностики вирусных болезней, учитываемых в семеноводстве картофеля, и получить практические навыки.

2. Ознакомиться с методикой и техникой проведения анализов по диагностике болезней в скрытой форме и получить практические навыки.

3. Получить практические навыки по освоению методов иммуноферментного анализа и метода индексации.

Россия готовится к тотальному тестированию, новые тест-системы позволяют быстро провести масштабную проверку на вирус. К массовому выпуску приступил один из разработчиков нового продукта, два других начинают производство. Олег Гусев, ведущий научный сотрудник Научно-клинического центра прецизионной и регенеративной медицины Казанского федерального университета и института физико-химических исследований RIKEN (Япония) помог РБК Тренды разобраться в том, как устроено тестирование на коронавирус в России и в мире.

Что предлагает ВОЗ

Глава Всемирной организации здравоохранения Тедрос Гебреисус еще в середине марта призвал страны проводить как можно больше тестов на вирус, который вызывает заболевание SARS-CoV-2, даже людям без симптомов. Согласно руководству ВОЗ, анализы на коронавирус COVID-19 должны проводиться методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с обратной транскрипцией. Как говорится в рекомендациях, на сегодня это самый точный и надежный метод диагностики вирусной инфекции. Он позволяет определить даже очень небольшое количество РНК вируса в биологическом материале человека. Это помогает выявить болезнь в инкубационном периоде.

Изобретенный в 1983 году метод и сейчас считается фундаментальным в молекулярной диагностике. Американский ученый, который придумал способ значительного увеличения малых концентраций фрагментов ДНК в биологической пробе, получил за него Нобелевскую премию. Выявление ДНК/РНК методом ПЦР позволяет диагностировать такие заболевания, как ВИЧ, вирусные гепатиты, инфекции, передающиеся половым путем, туберкулез, боррелиоз, энцефалит и многие другие. Метод используют в археологии, криминалистике, генетике.

Как работает ПЦР-тест

Для анализа из физиологических жидкостей извлекают одноцепочечную РНК, моделируют на ее основе двуцепочечную ДНК и многократно дублируют с помощью специального фермента (полимеразы). Увеличение числа копий ДНК называется амплификацией. В результате концентрация определенных фрагментов ДНК/РНК в биологическом образце, изначально минимальная, значительно увеличивается. При исследовании копируется только необходимый для теста участок ДНК. И, конечно, дублирование происходит только в том случае, если искомый участок вирусной ДНК или РНК присутствует в исследуемом биоматериале. В случае с коронавирусом мазок для анализа берут из ротоглотки или носоглотки, поскольку в крови или в кале вирус появляется на более продвинутой стадии болезни.

Тест-система EMG — продукт совместной разработки российских и японских разработчиков, проводившейся с 2016 года, рассказывает Олег Гусев. На данный момент эти тесты включены в систему обязательного медицинского страхования в Японии.

В ближайшее время планируется производить до 2,5 млн. тестов и 1 тыс. портативных лабораторий в неделю. Сами тесты, как и многие реагенты производятся в России. Планируется, что цена на тесты EMG будет в среднем в пять раз меньше, чем на стандартные ПЦР-тесты в Европе.

Российско-японские тесты основаны на методе изотермальной молекулярной диагностики SmartAmp, превосходящем метод ПЦР по скорости работы в восемь раз, а переносная лаборатория позволяет тестировать до 20 пациентов в час, говорит Гусев.

Ключевое отличие теста EMG в том, что многие тесты, которые производятся сейчас, это тесты ИФА (имунноферментный анализ), а не ПЦР. Данные системы определяют антитела, которые организм начинает вырабатывать не ранее, чем через неделю после заражения. Российско-японская разработка позволяет получать результат уже за 30 минут, с точностью, равной почти 100%. Кроме того, тест EMG позволяет определить наличие вируса уже на самых ранних стадиях, в то время как другие системы диагностики короновируса обладают меньшей чувствительностью и не могут выявлять вирус на ранней стадии инфицирования.

Принцип технологии российско-японского теста, по сути, не отличается от классической ПЦР — это наращивание количества целевых фрагментов ДНК и их детекция. Однако в изотермической амплификации, в отличие от классической ПЦР, где необходимы циклы нагрева и охлаждения, все происходит при одной температуре. Это позволяет многократно увеличивать скорость реакции. Метод SmartAmp был изобретен более 15 лет назад (как и LAMP — другая популярная технология изотермальной амплификации, предшествующая SmartAmp). Впервые для инфекционных заболеваний эту технологию применили в 2009 году для быстрого выявления пандемического гриппа (H1N1) в Японии.

Повторные тесты необходимы при любом методе. Отрицательный тест на COVID-19 не гарантирует, что человек не заразится этим вирусом на следующий день. Поэтому, например, в японских лабораториях персонал тестируют каждые несколько дней. Повторный тест нужен и для того, чтобы подтвердить, что человек излечился.

Эта тест-система будет использоваться для диагностики COVID-19 не только в России и Японии. 40 тыс. тестов закупила Австрия, поступили заказы из других стран Европы, Ближнего Востока, и Латинской Америки. Подана заявка в Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов США (FDA) для поставок в эту страну.

На данный момент в России прошли регистрацию еще три теста на коронавирус.

По некоторым данным, в Москве проводится около 700 тестов на коронавирус в сутки. В планах у московских властей увеличить этот показатель до 10 тыс. тестов в сутки, а затем довести его до 25—28 тыс. тестов ежедневно.

Новые разработки за рубежом

Компания Bosch выводит на рынок свой тест на коронавирус, который сначала будет доступен в Германии, а вскоре появится в других странах. В его основе лежит диагностический аппарат Vivalytic, который, по словам изготовителей, станет первым автоматизированным тестом на COVID-19. Тест распознает не только коронавирус, но еще шесть респираторных заболеваний, например, вирусы гриппа А и B. Во время лабораторных испытаний аппарата его точность составила 95%.

Как пишет издание ZME Science, анализ может проводиться прямо в стационаре или медицинском центре — не нужно отправлять образцы в лабораторию и ждать, пока придет ответ. Врачи смогут быстрее идентифицировать и изолировать зараженных, а пациентам не придется пребывать в неизвестности несколько дней. Тест прост в обслуживании и не требует специальной подготовки. Медперсоналу нужно только взять мазок из носа или горла пациента, нанести его на картридж, содержащий реагент, и вставить картридж в анализатор. Каждый аппарат может выполнять до десяти анализов за 24 часа.

Еще более оперативный тест на COVID-19 разработали в Великобритании. Он позволяет выявить COVID-19 всего за 30 минут. Чтобы провести его, достаточно портативного оборудования стоимостью около $120 и набора полосок для мазков из носа и горла по $5 каждая. Одновременно проходить тест могут до шести человек.

FDA в экстренном порядке одобрило сверхбыстрый тест на коронавирус, разработанный калифорнийской компанией Cepheid. С его помощью диагноз можно будет поставить всего за 45 минут. Как отмечает Business Insider, для обработки результатов теста не требуется специальное обучение. Нужен лишь доступ к системе Cepheid GeneXpert — в США их 5 тыс., а по всему миру — 23 тыс.

Начало тотального тестирования людей на COVID-19 во всем мире — хорошая новость как для людей, так и для национальных органов здравоохранения. До сих пор в мире нет четкого представления о том, сколько людей заражены коронавирусом и выявление тех, у кого он уже есть: их госпитализация или отправка на домашний карантин позволит быстрее оценить масштаб угрозы и вовремя принять правильные меры.