Низкопатогенный грипп птиц вызванный вирусом подтипа н9

Грипп птиц — (Grippus avium; высокопатогенный грипп птиц, классическая чума птиц, грипп кур А, экссудативный тиф, голландская чума кур) — высококонтагиозное, остро протекающее вирусное, поражающее сельскохозяйственных, синантропных и диких птиц заболевание с поражением респираторного и желудочно-кишечного трактов.

Грипп птиц способен протекать в форме эпизоотий, вызывая массовый охват поголовья и имея широкое распространение-район, область, страна.

Историческая справка. Заболевание впервые было описано в Италии в 1880г. Перрончито, который отдифференцировал его от холеры птиц и назвал экссудативным тифом кур. Наиболее сильная эпизоотия произошла в 1925г. на севере страны, во время которой погибло 200 000 кур. В дальнейшем заболевание распространилось на Австрию, Германию, Швецию, Чехословакию и Румынию. Болезнь встречалась в странах Азии, Южной и Северной Америки, Африки. В Россию впервые грипп был занесен в 1902г. Вирусная природа вируса была установлена итальянским ученым Гентании в 1902г.

Экономический ущерб от гриппа птиц чрезвычайно велик и связан с массовой гибелью заболевшей птицы, затратами при проведение жестких карантинных и ветеринарно-санитарных мероприятий, включая уничтожение больной птицы. К примеру панзоотия птичьего гриппа в мире в 2005году нанесла материальный ущерб, который оценивается в 4млр. евро.

Возбудитель болезни – РНК-содержащий вирус относится к семейству ортомиксовирусов, который подразделяется на три серологических типа: А,В и С. Вирусы типа А вызывают заболевание у животных и человека. Величина вирусных частиц 80-120нµ. Вирусы гриппа на основании типирования по основным антигенам (поверхностным белкам) -гемагглютинину (Н) и нейраминидазе (N) классифицируются соответственно на 15 и 7 субтипов. Все они имеют определенное родство, но у разных видов животных заболевания вызывают различные серотипы. Для птиц наиболее патогенны вирусы подтипов Н5 и Н7, имеющие молекулярно-биологические характеристики высокопатогенных вирусов. Наибольшую озабоченность вызывает вирус Н5N1 в связи с его возможной опасностью для человека.
В организме птиц вирус индуцирует выработку вируснейтрализующих и комплементсвязывающих антител.

Устойчивость вируса во внешней среде варьируется в зависимости от серотипа. Вирус чувствителен к эфиру, хлороформу, нагреванию и кислой среде (рН 3,0). При температуре 55°С он инактивируется в течение одного часа, при 60° С за 10минут, при 65-70°С- за 2-5 мин. При глубоком замораживании (температура -70°С) в мясе вирус остается вирулентными свыше 300дней. Высушивание субстрата, содержащего вирус, консервирует его.

Обычные дезинфектанты: хлорная известь, гидрооксид натрия, фенол, соляная кислота, карболовая кислота и другие быстро инактивируют вирус.

Эпизоотология. Грипп регистрируется у многих видов домашних и диких птиц. Патогенность вируса не ограничивается только тем видом птиц, от которого он выделен. Вирус подтипа Аj выделен от кур, индеек, голубей, уток, гусей являясь при этом патогенным для кроликов, мышей, морских свинок и человека, у которого в случае возникновения осложнений возникает атипичная пневмония.
Среди диких и домашних птиц могут одновременно циркулировать несколько антигенных разновидностей вируса, свойственным человеку, птицам и домашним животным. Стрессовые реакции, возникающие у птиц во время их длительных перелетов и изменяющиеся климатические условия, приводят к обострению инфекции.

В хозяйствах промышленного типа в появлении заболевания определенную роль играет занос возбудителя инфекции с кормами, оборудованием, инвентарем при этом особую опасность представляет не продезинфицированная мясная и яичная тара.

Первые случаи заболевания, как правило, регистрируются у цыплят и взрослой ослабленной птицы на фоне их неполноценного кормления, транспортных перевозок, переуплотненной посадки. Пассажи вируса через ослабленный организм кур повышают его вирулентность и способствуют последующему заболеванию птицы, которая содержится в нормальных условиях.

Вся восприимчивая птица в хозяйстве, обычно переболевает гриппом в течение 30-40 дней. Это объясняется высокой контагиозностью вируса и высокой концентрацией птицы в птичниках.

Источником возбудителя инфекции служит переболевшая птица (в течение 2мес.). Вирус гриппа вызывает заболевание птиц при респираторном, пероральном, интраперитонеальном, подкожном и внутримышечном заражении. В промышленных предприятиях при клеточной системе содержания птицы основное значение в распространение возбудителя имеет аэрогенный путь, а также алиментарный (передача с питьевой водой). Из организма больной птицы вирус выделяется с экскрементами, секретом, пометом, инкубационным яйцом. В разносе вируса гриппа внутри птицеводческого хозяйства могут принимать участие грызуны, кошки и особенно свободно живущая дикая птица, проникающая в птичники или гнездящаяся в них.

Наличие кур-вирусносителей поддерживает эпизоотический очаг в хозяйстве при воспроизводстве новой популяции восприимчивой птицы, которая во время выращивания заболевает и поддерживает стационарное неблагополучие. Заболеваемость птицы варьирует от 80 до 100%, смертность от 10 до 90% в зависимости от вирулентности вируса и условий содержания птицы. В неблагополучных хозяйствах грипп у цыплят и кур часто осложняется возбудителями респираторного микоплазмоза, инфекционного ларинготрахеита, колисептицемией. Взрослая птица в течение 2-х месяцев после переболевания на 40-60% теряет свою яичную продуктивность. Птица после переболевания гриппом частично или полностью теряет иммунитет против болезни Ньюкасла, инфекционного ларинготрахеита, бронхита, оспы.

Патогенез. В зависимости от вирулентности, тропизма вируса, естественной резистентности птицы развивается генерализованная или респираторная форма болезни.

В результате попадания вируса на слизистые оболочки дыхательных путей он начинает активно размножаться и проникает в кровеносную систему. Все это происходит в течение 4-12 часов. Вирус в большом количестве содержится в сыворотке крови, а также в эритроцитах. В развитии болезни принято различать четыре фазы: активного размножения вируса и накопление его в паренхиматозных органах, вирусемия — вирус в эту фазу можно обнаружить в крови, затем начинается процесс синтезирования антител, что свидетельствует о прекращении дальнейшей репродукции вируса. Последняя стадия сопровождается активным образованием антител и формированием у птицы иммунитета.

Исходя из того, что вирус в процессе своей жизнедеятельности выделяет токсические продукты, у птицы в стадии вирусемии происходит интоксикация и гибель птицы. Это обычно происходит при остром течении болезни.

Все высоковирулентные штаммы вируса независимо от принадлежности к тому или иному подтипу вызывают у птицы генерализованную форму инфекции. При гриппе птиц, вызванном подтипом А происходит гипоплазия лимфоидных органов, лимфоцитопения и подавление защитных механизмов, что способствует вирусемии и репликации вируса в клетках различных органов и тканей. Вследствие нарушения порозности стенок кровеносных сосудов и нарушения гемодинамики у больной птицы отмечаются явления геморрагического диатеза.

Клиническая картина. Инкубационный период составляет 3-5 дней. Грипп может протекать остро, подостро и хронически.
При остром течении — птица отказывается от корма (анорексия), оперение становится взъерошенным, глаза закрытые, голова опущена, куры теряют яйценоскость. Видимые слизистые оболочки гиперемированы и отечны, у отдельной больной птицы из слегка приоткрытого клюва вытекает тягучий слизистый экссудат, носовые отверстия заклеены воспалительным экссудатом.

У некоторых больных кур отмечается отечность лицевой части сережек вследствие застойных явлений и интоксикации организма. Гребень и сережки имеют темно-фиолетовый цвет. Дыхание становится учащенным и хриплым, температура тела поднимается до 44°С, а перед падежом падает до 30°С. Если заболевание у кур вызвано высокопатогенными вирусами гриппа, то как правило 100% кур погибает.

Подострое и хроническое течение гриппа длится от 10 до 25 дней; при этом исход болезни находится в зависимости от резистентности заболевшей птицы. Смертность достигает 5-20%. При данной форме гриппа у больной птицы наряду с респираторными симптомами возникает диарея, помет становится жидким, окрашенным в коричнево-зеленый цвет. Кроме вышеуказанных признаков у больной птицы отмечается атаксия, судороги, некрозы, манежные движения, в предагональную стадию тоникоклонические судороги мышц шеи и крыльев.

В случаях заражения низкопатогенными штаммами возможны случаи хронического течения болезни без выраженных клинических признаков.

Патологоанатомические изменения. В зависимости от течения болезни патологоанатомические изменения варьируют в широких границах. Наиболее типичным для гриппа признаком является картина геморрагического диатеза, сопровождающаяся подкожными отеками в области глотки, гортани, шеи, груди, ног в которых содержится желатинозный экссудат. Данные отеки у птиц возникают в результате нарушения функции органов кровообращения. Отмечаются как массовые, так и единичные кровоизлияния под кожу, в мышцы, в паренхиматозные органы и слизистые оболочки; у кур-несушек – кровоизлияния в яичник и яйцевод.
Постоянными патологоанатомическими признаками гриппы являются гастроэнтерит, бронхит, перикардит, перитонит, аэросакулит, отек легких, застойные явления во внутренних органах.

Особенно характерны для гриппа патологоанатомические изменения в головном мозге: геморрагический менингит, диффузные кровоизлияния, очаги отека в размягчении мозгового вещества.

При гистологическом исследование птиц павших на 3-4-й день болезни, наряду со стазом и геморрагиями находим дегенеративные изменения нейронов и множественные ареактивные некробиотические очажки в сером и белом веществе головного мозга.

Диагноз. На основании эпизоотических особенностей течения болезни, характерных острых клинических признаков респираторной болезни и патологоанатомических изменений можно поставить предположительный диагноз. Для постановки окончательного диагноза необходимо провести комплекс лабораторных вирусологических исследований.

В лабораторию направляют патологический материал (печень, легкие, головной мозг и др.) от птиц павших в острую стадию болезни. Патматериал должен быть свежим, допускается его замораживание до -60°С с целью консервации вируса или сохранение в 50%-ном растворе глицерина. Для серологических исследований от кур берут парные сыворотки крови в различные периоды болезни.

В лаборатории для выделения вируса применяют методы заражения куриных эмбрионов, для идентификации выделенного вируса — РГА, РТГА и РСК. Биологическая проба ставится на цыплятах 60-120-дневного возраста.
Для ретроспективной диагностики используют РТГА, РДП, ИФА и ПЦР.

Диагноз на грипп птиц считают подтвержденным, если:

• выделен и идентифицирован высокопатогенный вирус;
• выделен и идентифицирован любой вирус подтипов Н5 или Н7;
• установлено наличие рибонуклеиновой кислоты (РНК), специфичной для высокопатогенного вируса любого подтипа или РНК вирусов подтипов Н5 или Н7, любого уровня патогенности в пробах патологического материала;
• обнаружены антитела к гемагглютининам подтипов Н5 и Н7, когда достоверно известно, что они не связаны с вакцинацией.

Дифференциальный диагноз. Генерализованную септицемическую форму гриппа дифференцируем от болезни Ньюкасла. Респираторную форму -от инфекционного бронхита, микоплазмоза, ларинготртахеита и других респираторных заболеваний птиц.

Грипп птиц, в отличие от ньюкасловской болезни, поражает все виды птиц в любом возрасте и вызывает выраженные отеки, катарально-геморрагический энтерит. Для респираторной формы гриппа характерно преимущественное поражение верхних дыхательных путей, заболевают все виды птицы, а при инфекционном бронхите — только птица отряда куриных. Для респираторного микоплазмоза кур и инфекционного синусита индеек характерны хроническое течение болезни, отсутствие острых воспалительных процессов и развитие фибринозно-дифтеритического аэросакулита.

Иммунитет и специфическая профилактика. Переболевшая птица приобретает нестерильный иммунитет, который продолжается до 6месяцев. Для профилактики высокопатогенного гриппа птиц в России применяются инактивированные вакцины как самые эпизоотологически безопасные. Для специфической профилактики применяют инактивированную гидроокисьалюминиевую гидроксиламиновую эмбрионвакцину типа А, жидкую и сухую инактивированные вакцины против гриппа птиц. Вакцины вводят внутримышечно, инактивированные –двукратно с интервалом в 14дней. С профилактической целью в угрожаемых хозяйствах прививают только клинически здоровую птицу (кур, уток, индеек). Через 14-21 день после вакцинации птица приобретает напряженный иммунитет длительностью до 6 месяцев.

Для профилактики гриппа необходимо обеспечить до отлета перелетной водоплавающей птицы исключительно подворное содержание птицы в ЛПХ граждан, где при выгульном содержании не исключен контакт с дикой водоплавающей птицей.

Вакцинация птиц, содержащихся в ЛПХ, проживающих в населенных пунктах, вблизи которых расположены гнездопригодные водоемы для диких водоплавающих и околоводных птиц.

Проведение мероприятий по созданию неблагоприятных гнездовых условий для водоплавающих птиц на водоемах вблизи населенных пунктов.
Задачей этих мер является отпугивание птиц от мест гнездования. С этой целью могут применяться технические помехи — установка звуковых и световых ограждений и устройств, укрытие локальных мест гнездования сетями, выкашивание, а также отстрел водоплавающих, околоводных и синантропных птиц на гнездопригодных водоемах.

Срок проведения мероприятий- с момента прилета птиц до завершения периода гнездования (апрель—июнь), а также с момента начала отлета до его завершения (сентябрь—ноябрь).

В случае появления в птицеводческих хозяйствах (на фермах) заболевания птиц гриппом, вызванным высокопатогенными вирусами, утверждают специальную комиссию по борьбе с птичьим гриппом, которая вводит жесткий санитарный режим работы хозяйства; разрабатывает комплекс мер, направленных на ликвидацию и недопущение распространения болезни, которая включает уничтожение переносчиков (перелетной и водоплавающей птицы); решается вопрос о проведении вакцинации в угрожаемых пунктах и зонах; устанавливает сроки санации и комплектования таких хозяйств птицей, исходя из конкретных условий хозяйства; решает вопросы возможной защиты людей от заражения и их вакцинацию против гриппа человека.

Карантин в неблагополучном пункте может быть отменен не ранее 21 суток со дня уничтожения (утилизации) всего восприимчивого поголовья или убоя и переработки условно здоровых птиц, находившихся в неблагополучном пункте и проведения заключительной дезинфекции.
Карантин в организации в которой проводили убой птицы, подозреваемой в заражении гриппом птиц или перерабатывали и хранили продукты и сырье от такой птицы отменяют не ранее 21 суток после окончания переработки мяса птицы и проведения заключительной дезинфекции помещений организации, ее территории, инвентаря, производственного оборудования.

После отмены карантина в течение 3 месяцев для всех владельцев птиц следует ограничивать вывоз инкубационного яйца и живой птицы всех видов и возрастов в другие хозяйства.

Вакцинацию птицепоголовья против гриппа птиц после отмены карантина следует проводить на территории неблагополучного пункта на протяжении того периода времени, пока результатами лабораторного мониторинга не будет подтверждено отсутствие циркуляции вируса среди вакцинированного поголовья.

Мероприятия по защите персонала.

Всем лицам, занятым в проведении специальных мероприятий по ликвидации заболевания птиц гриппом, рекомендуется проходить ежедневный медицинский осмотр.

Для работы с больными птицами специалисты должны быть обеспечены спецодеждой (халатами или комбинезонами, полотенцами, шапочками), сменной обувью, резиновыми перчатками, респираторами, мылом и другими средствами индивидуальной защиты, а также необходимыми инструментами и посудой. По окончанию работы одежду и обувь обеззараживают или уничтожают. После клинического обследования животных или отбора проб патматериала необходимо умыться и вымыть руки с мылом.

Для личной дезинфекции работников, инструментария и посуды используют средства и методы, предписанные для обеззараживания различных объектов, зараженных патогенными микроорганизмами.

К работе с больными птицами не следует допускать лиц, перенесших тяжелые заболевания, имеющих болезни дыхательной системы, лиц в возрасте 65 лет и не достигших 18-летнего возраста, беременных женщин.

Мы сообщаем о серологических доказательствах инфекции низкопатогенного гриппа птиц (LPAI) H9N2 в популяции, зараженной домашней птицей, и населения в целом. Серологическое обследование населения, охваченного профессиональной деятельностью, и население в целом было проведено с использованием анализа ингибирования гемагглютинином (HI) в Шанхае, Китай, с января 2008 года по декабрь 2010 года. Доказательства более высоких антител против H9 были обнаружены в собранных образцах сыворотки от работников птицеводства. В течение этого периода было выделено 239 вирусов птичьего гриппа H9N2 (AIV) из 9297 трахеальных и клоачных парных образцов, собранных у домашней птицы на рынках живой птицы. Кроме того, было выделено в общей сложности 733 вируса гриппа из 1569 назальных и горловых тампонов, собранных у пациентов с гриппоподобными симптомами в дозорной больнице, которые включают H3N2, H1N1, пандемию H1N1 и B, но вирус H9N2 не был обнаружен. Эти данные подчеркивают необходимость долгосрочного наблюдения за вирусами птичьего гриппа у профессиональных работников, зараженных домашней птицей.

Исследование показывает, что профессиональное воздействие на домашнюю птицу увеличивает риск заражения вирусом птичьего гриппа H9N2 с низкой патогенностью.

Вирус гриппа птиц Avia H9N2 циркулировал в течение 3 лет на рынках птицы в Шанхае до появления нового H7N9 в 2013 году.

Долгосрочное сохранение генов вируса птичьего гриппа на рынках живой птицы представляет собой серьезный риск возникновения на рабочем месте населения, подверженного риску заражения домашней птицей, а также среди населения в целом.

Вирусы гриппа A были отнесены к 18 подтипам гемагглютинина (HA) и 11 нейраминидазы (NA) (Tong et al., 2013). Вирусы птичьего гриппа (AIV) играют ключевую роль в возникновении пандемических штаммов. В феврале 2013 года в Китае появился новый вирус птичьего гриппа H7N9, который, как было установлено, заражает людей (Gao et al., 2013). По состоянию на 25 октября 2013 года новый подассортантный подтип гриппа A / H7N9 птичьего гриппа заразил 137 человек в Китае, включая 45 смертей, все гены вируса H7N9 в Китае были птичьего происхождения, причем шесть внутренних генов из подтипа AIV H9N2 (Gao et al., 2013; Всемирная организация здравоохранения, 2013 г.). Между тем, данные секвенирования генома показали, что вирус H1N1 1918 года, вероятно, был птичьим вирусом с мутациями, адаптированными к его хозяину млекопитающих (Taubenberger et al., 2005). С другой стороны, пандемические штаммы 1957 H2N2 и 1968 H3N2 были созданы как вирусы вируса гриппа птиц-человека, которые приобрели связывающие с вирусом человека рецептор-связывающие свойства (Kawaoka et al., 1989). Кроме того, было показано, что вирус пандемического вируса гриппа H1N1 в 2009 году содержит консенсусные остатки птиц в положениях 627 (E) и 701 (D) полимеразы PB2, что свидетельствует о недавнем приобретении вируса птичьего гриппа (Jagger et al., 2010).

Водные виды птиц являются естественными хозяевами вирусов гриппа А, а барьер хозяина ограничивает межвидовую передачу (Subbarao and Katz, 2000; Perdue and Swayne, 2005). Тем не менее, AIV могут иногда передаваться млекопитающим, включая людей. Однако есть опасения, что мутации и / или повторный набор вирусов птиц и человека / свиней могут привести к потенциальной инфекции гриппа человека или даже к новому пандемическому штамму. Вирусы птичьего гриппа Серотипы H4, H5 и H9 передаются свиньям в Канаде и на юго-востоке Китая (Karasin et al., 2000; Peiris et al., 2001; Ninomiya et al., 2002). Высокопатогенные вирусы птичьего гриппа (HPAI) H5N1, H7N7 и H7N3 также вызывают заболевания человека (Chan, 2002; Fouchier et al., 2004; Tweed et al., 2004; Wang et al., 2006).

Вирус вируса птичьего гриппа с низкой патогенностью (LPAI) H9N2, впервые обнаруженный у индейки в Соединенных Штатах в 1966 году (Dong et al., 2011), обычно вызывает только легкую болезнь у домашней птицы, такую ​​как цыплята, утки, индюки и перепела ( Alexander, 2000; Lu et al., 2001; Matrosovich et al., 2001; Miller et al., 2010). В материковом Китае вирус птичьего вируса H9N2 был впервые изолирован от провинции Гуандун в 1994 году. Впоследствии он распространился и стал наиболее распространенным подтипом вирусов гриппа у домашней птицы (Wu et al., 2008; Sun et al., 2010).

Сообщалось о передаче вируса H9N2, пересекающего видовой барьер для млекопитающих. Например, AIV H9N2 был выделен из свиней на юге Китая в 1998 году (Peiris et al., 1999b, Li et al., 2005). Через год два ребенка в Гонконге были подтверждены вирусами птичьего гриппа H9N2 с помощью носоглоточных аспиратов (третий ребенок был зарегистрирован в 2003 году) (Peiris et al., 1999a; Guo et al., 2000; Wan et al., 2008; Ge и др., 2009; Jia et al., 2009). В период с 1998 по 1999 год в Китае было зарегистрировано 10 человеческих вирусных инфекций H9N2 (Khuntirat et al., 2011).

Серологические исследования убедительно свидетельствуют о вирусных инфекциях H9 у людей. В 2006 году 1,7% образцов сыворотки от фермеров в Синьцзяне (северо-западный Китай) были положительными по H9 (Jia et al., 2009). Другое серологическое наблюдение показало, что в Гуанчжоу с 2007 по 2008 год распространенность антител против H9 среди всех участников была намного выше, чем антитела против H5 (Wang et al., 2009). Все эти данные указывают на существование бессимптомных инфекций AIV H9N2 среди людей, хотя сероположительность H9N2 еще не была связана с каким-либо клиническим заболеванием.

Чтобы лучше понять потенциал распространения LPAI H9N2 среди людей и домашней птицы в Шанхае, мы исследовали серологическое H9N2-специфическое антитело, ингибирующее гемагглютинин HI (HI) у профессиональных рабочих, зараженных домашней птицей, и общее население в Шанхае. Мы также исследовали распространенность вируса птичьего гриппа H9N2 у живой птицы с мокрых рынков в Шанхае и положительный уровень изоляции вируса гриппа среди пациентов с гриппоподобными заболеваниями (ILI).

После утверждения одобрения организационного совета в период с января 2008 года по сентябрь 2010 года в Шанхае, Китай, было набрано в общей сложности 2570 участников, и они были выбраны с удобством при использовании процесса информированного согласия. Население состояло из 840 работников, работающих с домашними птицами, которые определялись как работники кормовой птицы, порчи, продавцы и перевозчики. Эти рабочие регулярно подвергались воздействию цыплят, уток, гусей, голубей и, как ожидается, имели самый высокий уровень заражения птицами, зараженными птичьим гриппом. 840 профессиональных работников, работающих на домашней птице, работали на 35 влажных рынках в районе Пудун и 102 мокрых рынках в районе Путуо в Шанхае. Не было никаких критериев исключения, кроме тех людей, которые не хотели участвовать в этом исследовании. Все работники птицеводства не сообщили о серьезной истории заболеваний дыхательных путей и не были вакцинированы против птичьего гриппа. Общее население (1730 контрольных субъектов) состояло из участников медицинского осмотра и детей-амбулаторных пациентов, у которых не было профессионального контакта с домашней птицей из трех районов (Путуо, Пудун и Минханг) в Шанхае. После получения информированного согласия стандартный вопросник проводился обученным персоналом для субъектов. Информация, собранная в ходе обследования, включала демографические характеристики (возраст и пол) и профессиональное облучение (кормовая домашняя птица, убойная птица, птица и транспортная птица) субъектов исследования. Каждый участник разрешал сбор образцов сыворотки. Было собрано в общей сложности 2570 образцов сыворотки человека, из которых 840 были произведены работниками, работающими на домашней птице, и 1730 были собраны из общей популяции в качестве контроля.

Мы определили гриппоподобные болезни (ILI) как внезапное начало лихорадки (температура ≥ 38 ° C) и кашель или боль в горле при отсутствии другого диагноза. Для мониторинга активности вируса гриппа часовые больницы в Шанхае должны были собирать 5-15 носоглоточных или горловых тампонов еженедельно у амбулаторных больных ILI, у которых была температура (температура тела ≥ 38 ° C) не более 3 дней. В период с января 2008 года по декабрь 2010 года было зарегистрировано в общей сложности 1569 амбулаторных больных, страдающих гриппом (ILI), независимо от возраста от дозорной больницы (центральной больницы Минханга) в районе Минханг, Шанхай.

В Шанхае есть три оптовых розничных рынка домашней птицы, большинство живых птиц, продаваемых на розничных мокрых рынках в Шанхае, были приобретены на этих оптовых рынках. Мы выбрали два из трех оптовых рынков для тестирования домашней птицы для AIVs: Sanguantang Poultry and Egg Market в районе Путуо и Шанхайского оптового рынка сельскохозяйственной продукции в районе Пудун. В общей сложности 9297 трахеальных и клоачных парных мазков были случайными, собранными из живой птицы на двух рынках, которые мы выбрали в период с января 2008 года по август 2010 года.

Все эксперименты проводились в лабораторных условиях BSL-2 в соответствии с институциональным регулированием.

Клетки Madin-Darby canine почки (MDCK) (ATCC, CCL34) выращивали в минимальной основной среде (Lifetechnologies / Gibco, Chicago, IL, USA), дополненной 5% фетальной бычьей сывороткой (FBS), 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина (Lifetechnologies / Gibco, Чикаго, Иллинойс, США).

С января 2008 года по декабрь 2010 года в общей сложности было собрано 1569 образцов мазков горла, собранных из амбулаторных пациентов с гриппоподобными заболеваниями (ILI), и их помещали в пробирки вирусной транспортной среды и отправляли в лабораторию в течение 48 часов в холодильном контейнере при 2-8 ° C затем хранят при -80 ° C. Пробирки с горлом следует вымыть и удалить. Супернатант пропускали через 0,22 мкм фильтры (Millipore, MA, USA) для уменьшения бактериальных загрязнений, затем инкубировали в монослое MDCK-клетки в 24-луночных планшетах в среде, содержащей трипсин и проходы три раза. В тот же период в аллантоической полости 10-дневных эмбриональных куриных яиц выращивали 9297 трахеальных и клоачных парных образцов мазка.

Вирусные РНК экстрагировали из супернатанта клеточной культуры или аллантоида с использованием реагента TRIizol® LS (Такара, Далянь, Китай), как было предложено изготовителем. Анализ цепной реакции обратной транскриптазы (RT-PCR) проводили с использованием набора амплификации rTaq PCR (Takara, Dalian, China). Гены гемагглютинина (HA) AIV H9N2 и других вирусов, включая вирусы сезонного гриппа человека (H1N1, H3N2, H1N1pdm09 или B), амплифицировали специфическими праймерами с помощью RT-PCR. Все амплифицированные продукты визуализировали после электрофореза на окрашенном этидиум бромидом 1,5% агарозном геле.

Мы секвенировали и анализировали гены HA из семи вирусов H9N2, выделенных в 2008 году. Затем HA амплифицировали с использованием пар прямого и обратного праймеров, сконструированных следующим образом: H9seqF1: 5′-TCGGCTACCAATCAAC-3 ‘; H9seqR1: 5’-CGAGCAGTTCCCAAAT-3 ‘; H9seqF2: 5’-GAAGAATCCTGAAGACT-3 ‘; H9seqR2: 5’-GAATAAGAAGGCAGCAA-3 ‘. Секвенирование ДНК проводилось корпорацией Life Tecnologies / Invitrogen Corporation, Шанхай, Китай. Редактирование и выравнивание нуклеотидных последовательностей и филогенетический анализ выполняли с использованием программы MEGA, а нерукованное филогенетическое дерево было создано методом соседнего соседа. Значения Bootstrap вычислялись из 1000 повторов. Аминокислотные остатки были пронумерованы в соответствии с последовательностями HA H3 (Nobusawa et al., 1991) с номером регистрации GenBank: V01087.

Образцы сыворотки, собранные у 2570 участников, хранились в холодильной таре при температуре 2-8 ° C сразу после сбора и доставлялись в лабораторию в конце каждого рабочего дня для хранения при -20 ° C до использования.

Образцы сыворотки испытывали на титры антител против вирусов птичьего гриппа H9 с помощью анализа ингибирования гемагглютинации (HI) согласно руководству Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) для лабораторной диагностики и вирусологического надзора за гриппом (Всемирная организация здравоохранения, 2011 г.). Чтобы исключить перекрестную реакцию антитела против вируса гриппа человека H1, мы также обнаружили титры антител против H1 человека. Стандартный антиген H9 и H1 был получен из Харбинского института ветеринарных исследований Китайской академии сельскохозяйственных наук.

Перед анализом одну часть сыворотки смешивали с тремя частями фермента, разрушающего рецептор (RDE) (Denka Seiken, Tokyo, Japan). Смеси инкубировали в течение ночи на водяной бане при 37 ° С для удаления неспецифических ГА. Фермент инактивировали 45-минутной инкубацией при 56 ° С с последующим добавлением 1/5 части куриных эритроцитов и одной части физиологического раствора (0,85% NaCl). После очередной 30-минутной инкубации 37 ° С образцы центрифугировали при 2000 г в течение 5 мин. Супернатант переносили в новую пробирку с окончательным разбавлением 1/5. Анализы HI проводили на 96-луночных планшетах с V-образным вырезом с 0,7% красными кровяными клетками курицы (эритроциты). Положительные и отрицательные контрольные сыворотки были включены с тестируемыми сыворотками. Тит HI выражали как ответное из самого высокого разведения сыворотки, которое полностью ингибировало гемагглютинацию четырех единиц HA вируса. Как сообщалось ранее, титры HI 40 были сопоставлены с 50% -ным снижением риска заражения или заболевания вирусами сезонного гриппа в популяции человека, а титры HI от 40 или более указывают на воздействие вируса или вакцины (de Jong et al. ., 2003; Killian et al., 2013). Поскольку значения отсечения HI-анализов серологического наблюдения H9 у людей в опубликованных исследованиях часто различаются (Kayali et al., 2010; Coman et al., 2013; Huang et al., 2013; Zhou et al., 2014), чтобы улучшить понять субклиническую инфекцию H9N2, мы приняли HI-титр антител ≥ 1: 40 образцов сыворотки как положительный.

Мы провели анализ микронейтрализации (MN) для обнаружения функциональных антител с тремя изолятами вируса гриппа H9N2. Все анализы MN проводили с клетками MDCK в соответствии со стандартными протоколами ВОЗ (Всемирная организация здравоохранения, 2011 г.) с величиной отсечения MN 1: 20 (Miller et al., 2010; Rizzo et al., 2010). Вирусы вируса гриппа H9N2, отобранные для тестирования, выращены следующим образом: A / Chicken / Shanghai / 0734/2007, A / Chicken / Shanghai / 0817/2008 и A / Chicken / Shanghai / 0867/2008.

Логистическая регрессия использовалась для скрининга факторов риска, связанных с положительными анти-H9 HI титрами ≥ 1: 40. Для контроля возможных взаимодействий между факторами для оценки отношения шансов (OR) и 95% доверительного интервала использовалась многопараметрическая логистическая регрессия (95% CI) для факторов, связанных с положительными анти-H9 HI титрами. Мы провели скрининг ряда возможных факторов риска, в том числе оккупации, возрасту, полу и человеческому типу гриппа H1N1 ≥ 1: 40. Независимые переменные в исходной модели включали оккупацию, возраст, пол и человеческий грипп H1N1 титр ≥ 1: 40. Все независимые переменные оставались в окончательной модели после выполнения процедуры обратной обработки. В логистическом регрессионном анализе оценки максимального правдоподобия для коэффициентов шансов (OR) и 95% доверительных интервалов (CI) были рассчитаны с использованием теста хил-квадрат Вальда. Согласование между анализами HI и MN рассчитывали по каппа-тесту. Все значения Р были двумя хвостами; Значения P 100%.

Титры антител к ингибированию гемагглютинации (HI) против вируса птичьего гриппа H9 профессионального облучения домашней птицы и общего населения в Шанхае

Отношение шансов для положительного титрования антител против ингибирования гемагглютинации (HI) против вируса птичьего гриппа H9N2 с использованием логистической регрессии

ИЛИ, отношение шансов; CI, доверительный интервал.

Титр ≥ 1: 40 считался положительным; все потенциальные факторы были включены в окончательную модель.