Молекулярно-генетический метод гепатит в

Что такое молекулярно-генетическая диагностика

Итак, молекулярно-генетическая диагностика — сравнительно новый метод обследования организма, позволяющий точно и быстро выявить вирусы и инфекции, мутации генов, вызывающих патологию, оценить риски наследственных и иных заболеваний. И это далеко не полный спектр возможностей исследования ДНК.

Важнейшим достоинством молекулярно-генетической диагностики является минимальная степень медицинского вмешательства, поскольку исследование проводят in vitro. Метод успешно применяют даже для диагностики заболеваний у эмбрионов, а также у ослабленных и тяжелобольных пациентов. Самый распространенный материал для исследования — кровь из вены, однако возможно выделение ДНК/РНК из других жидкостей и тканей: слюны, соскоба слизистой рта, выделений из половых органов, околоплодной жидкости, волос, ногтей и т.д.

Молекулярная диагностика — значительный шаг к персонализированной медицине, она позволяет учитывать все особенности конкретного пациента при обследовании и терапии.

Итак, исследование ДНК/РНК используется во многих разделах медицины. Давайте рассмотрим задачи и области, в которых активно применяют молекулярную диагностику:

• Выявление существующих патологий. Например, к молекулярной диагностике прибегают в тех случаях, когда инфекционное или вирусное заболевание не может быть определено обычными методами. Она позволяет обнаружить болезнь даже на ранней стадии, когда внешних проявлений нет.
• Исследование аллергических реакций. Молекулярная диагностика успешно применяется для определения аллергии: в отличие от традиционных методов, она более точна и при этом безопасна для пациента, так как отсутствует непосредственный контакт с аллергеном.
• Индивидуальная оценка рисков развития наследственных заболеваний. Молекулярная диагностика помогает выявить у взрослых и детей опасность в будущем подвергнуться различным патологиям. Нужно отметить, что есть болезни, которые вызваны исключительно мутацией гена (моногенные) и те, которые обусловлены в том числе генетическими особенностями (мультифакторные). Информация о первых позволяет, к примеру, оценить риски передачи наследственных заболеваний от родителей к ребенку. Знание о предрасположенности к мультифакторной патологии необходимо еще и для профилактики болезней с помощью изменения образа жизни.
• Перинатальная медицина. Как уже было сказано, молекулярная диагностика способна дать информацию о состоянии здоровья и генетических предрасположенностях человека. Это относится и к эмбрионам: анализ ДНК еще не родившегося ребенка позволяет распознать синдромы Дауна, Эдвардса, Патау, Тернера, Клайнфельтера. Также молекулярная диагностика применяется в области вспомогательных репродуктивных технологий: она позволяет установить генетические причины бесплодия и невынашивания беременности.
• Фармакогенетика. Молекулярная диагностика объясняет, почему на некоторых действуют одни препараты, а на других — иные: все дело в генетических особенностях пациентов. Возможность определения эффективности веществ имеет особое значение при лечении тяжелых заболеваний, например, онкологических.
• Спортивная медицина. Настоящие чудеса исследования ДНК и РНК творят и в области оценки спортивных перспектив. Например, родители малышей могут узнать о том, какой вид занятий принесет ребенку наибольшую пользу для здоровья или позволит достичь спортивных результатов.

Итак, обращение к генетическим исследованиям актуально в тех случаях, когда пациент стремится получить сведения о состоянии своего организма. Обычно это необходимо в следующих ситуациях:

Отдельной группой стоит выделить исследования ДНК, которые проводят в связи с планированием или рождением ребенка. Чаще всего родители обращаются в лабораторию, чтобы:

• изучить свою генетическую совместимость, оценить риски наследственных заболеваний потомства;
• исследовать состояние плода, выявить синдромы и опасные патологии;
• диагностировать заболевания (и оценить риски) и аллергические реакции у малыша;
• определить, какие спортивные занятия, какое питание и образ жизни будут наиболее полезны для ребенка, а чего стоит избегать;
• установить отцовство или материнство.

Независимо от выбранного метода молекулярно-генетического исследования, оно будет включать в себя следующие этапы:

• взятие биоматериала. Как уже было сказано, чаще для исследования используют кровь пациента. Полученный материал маркируют и транспортируют в лабораторию;
• выделение ДНК/РНК;
• проведение исследований в соответствии с выбранным методом;
• изучение и интерпретацию результатов;
• выдачу заключения.

Цитогенетический анализ позволяет выявить наследственные заболевания, психические отклонения, врожденные пороки развития. Суть метода — в изучении хромосом с помощью специальных микроматриц, нанесенных на ДНК-чипы. Для этого из образца крови выделяют лимфоциты, которые затем помещают на 48–72 часа в питательную среду и по истечении этого времени исследуют. Назначают такой анализ нечасто, в основном для изучения причин бесплодия и невынашивания беременности, для уточнения диагноза у детей при подозрении на врожденные заболевания. Анализ очень точен, но достаточно трудоемок и длителен (результат можно получить лишь через 20–30 дней после сдачи).

Достоинство и в то же время недостаток метода — в его специфичности: цитогенетика может выявить лишь небольшое количество патологий (например, аутизм), однако делает это практически без погрешностей.

Полимеразная цепная реакция — метод, изобретенный в 1983 году, по сей день самый популярный и фундаментальный в молекулярной диагностике. Характеризуется высочайшей точностью и чувствительностью, а также скоростью проведения исследования. Молекулярная диагностика ДНК/РНК методом ПЦР позволяет выявить такие патологии, как ВИЧ, вирусные гепатиты, инфекции, передающиеся половым путем, туберкулез, боррелиоз, энцефалит и многие другие.

Для анализа выбирают участок ДНК и многократно дублируют его в лаборатории с помощью специальных веществ. Для диагностики подходит большой перечень биоматериалов: кровь, слюна, моча, выделения из половых органов, плевральная и спинномозговая жидкость, ткани плаценты и т.д.

В данном молекулярном методе объектом исследования становятся уникальные нуклеотидные соединения отдельно взятой хромосомы или ее участок. Для этого используются меченые флуоресцентными маркерами короткие ДНК-последовательности (зонды), которые позволяют выявить фрагменты с атипичными генами. Биоматериал для анализа может быть любой: кровь, костный мозг, плацента, ткани эмбриона, биопсия и т.д. Важно, чтобы образец был доставлен в лабораторию сразу после его изъятия.

Метод особенно активно используют в онкологии (например, для наблюдения за остаточными злокачественными клетками после химиотерапии), а также в пренатальной диагностике (для определения риска развития у плода врожденных пороков), гематологии. FISH-метод очень чувствителен и точен для выявления поврежденных фрагментов ДНК (погрешность около 0,5%), при этом достаточно быстр: результат придется ждать не более 72-х часов. Однако у него есть и недостатки: FISH еще более специфичен, чем микроматричный цитогенетический анализ, и может служить лишь для подтверждения или опровержения предполагаемого диагноза.

Этот метод похож на предыдущий — здесь так же используются меченные флуоресцентом последовательности ДНК. Однако эти зонды сначала выделяют из проб, полученных от пациента, и затем сравнивают с образцами, нанесенными на микрочипы. ДНК-микрочип представляет собой основание (стеклянное, пластиковое, гелевое), на которое может быть нанесено до нескольких тысяч микротестов длиной от 25 до 1000 нуклеотидов. Полученные после очистки биоматериала пробы (зонды) совмещают с микротестами на чипе и наблюдают за реакцией маркёров. Результаты исследования готовы через 4–6 дней после забора материала.

Для анализа используется любой биоматериал, из которого можно получить образец ДНК/РНК. Используют такой метод в онкологии и кардиологии (в том числе для изучения генетической предрасположенности), он точен и чувствителен, однако в России его применяют редко — в этом его главный минус.

Итак, молекулярная диагностика — неинвазивный и точный метод обследования организма с широким спектром применения в разных областях медицины. Если на Западе исследования ДНК/РНК уже распространены повсеместно, то в России подобную услугу предлагают далеко не все клиники.

Се­год­ня ме­ди­ци­на по­зво­ля­ет уже во вре­мя пла­ни­ро­ва­ния бе­ре­мен­нос­ти узнать о воз­мож­ных рис­ках для бу­ду­ще­го ма­лы­ша, по­это­му не по­жа­лей­те вре­ме­ни и средств — прой­ди­те ге­не­ти­чес­кое ис­сле­до­ва­ние еще до за­ча­тия ре­бен­ка или, если бе­ре­мен­ность ста­ла для вас сюр­п­ри­зом, во вре­мя вы­на­ши­ва­ния. Так вы смо­же­те из­бе­жать мно­жест­ва про­блем для се­бя и для ма­лы­ша в бу­ду­щем.

Молекулярно-генетические методы (методы ДНК –диагностики) – это большая и разнообразная группа методов, предназначенная для выявления вариаций в структуре исследуемого участка ДНК. ДНК- методы используются в следующих направлениях:

1. Для диагностики моногенных и мультифакториальных наследственных болезней.

2. Для пренатальной диагностики моногенных болезней или пола плода (в случаях Х – сцепленного наследования).

3. В судебной медицине для идентификации личности (геномная дактилоскопия) и установления родства.

4. Для диагностики инфекционных заболеваний.

5. Для диагностики онкологических заболеваний.

В 1993 году таких заболеваний было 130, в 1994 году – 600, сейчас еще больше. Сейчас возможна диагностика любого наследственного заболевания, ген которого картирован и доступен прямой или косвенной диагностике.

Молекулярно-генетические методы можно разделить на прямые и косвенные.

Прямая диагностика проводится в тех случаях, когда строение гена уже изучено. Она включает секвенирование ДНК, регистрацию изменения электрофоретической подвижности мутантных молекул ДНК, трансляцию белкового продукта in vitro и др. Косвенное выявление мутацийприменяется в тех случаях, когда строение гена не известно и вместе с тем имеется информация о других структурах, находящихся рядом с геном – определение полиморфизма длин рестрикционных фрагментов и др.

Рассмотрим некоторые из них.

Секвенирование ДНК - это наиболее точный метод, так как позволяет определить строение гена и выявить любую мутацию. Методики секвенирования весьма трудоемки, требуют значительных затрат материалов и времени, в связи с чем не нашли широкого применения в клинической генетике, а применяются главным образом для расшифровки генома человека.

Несколько позже широкое развитие получили различные способы изучения последовательностей ДНК с помощью олигонуклеотидных зондов - искусственно синтезированных коротких цепей нуклеотидов, меченных радиоактивными метками. При определенных условиях указанные зонды могут специфически связываться (гибридизоваться) с комплементарными последовательностями в анализируемой ДНК, свидетельствуя тем самым о присутствии искомого фрагмента.

Выделение ДНК для исследования указанными методами представляет собой достаточно трудоемкую процедуру. Во-первых, ДНК в клетках содержится в относительно небольших количествах по сравнению с другими веществами, поэтому для получения очищенных препаратов требуются сложные и дорогие методы. Во-вторых, молекулы ДНК, особенно эукариот, имеют значительную длину и представляют собой весьма хрупкую цепь, которая при различных биохимических манипуляциях оказывается так или иначе поврежденной.

Для выделения ДНК полученный биологический материал обрабатывают протеолитическими ферментами, чтобы удалить все белки. ДНК адсорбируют на пористых носителях или экстрагируют органическими растворителями, после чего следует многократное очищение. При этом получают всю ДНК клеток (геномную ДНК).

Исследователя обычно интересует только определенный, специфический участок ДНК, который трудно идентифицируется среди множества других, в том числе нетранскрибируемых ДНК-последовательностей. Эта задача решалась с помощью трудоемкого подхода - путем клонирования фрагментов ДНК (т.е.размножения) в различных организмах (т.н. векторах), чаще всего в фагах (вирусах бактерий) или во внехромосомных наследственных единицах - плазмидах. При этом интересующий фрагмент молекулы ДНК какого-либо организма вначале встраивался в геном фага либо в кольцевую ДНК плазмиды при помощи специальных ферментов - рестриктаз, нуклеаз, полимераз и лигаз, после чего происходило заражение бактерий фагом (трансдукция) или внесение плазмидной ДНК в цитоплазму микроорганизма (трансформация). Размножение бактерий тем самым вело к накоплению достаточно больших количеств интересующих исследователя фрагментов ДНК.

Однако процедуры молекулярного клонирования весьма трудоемки, требуют работы с радиоактивными веществами, высокой степени очистки ДНК, поэтому они практически не вышли за рамки крупных специализированных лабораторий, хотя необходимость исследования ДНК на уровне нуклеотидных последовательностей давно стала потребностью практического здравоохранения.

Указанные трудности были преодолены с открытием в 1983 г. К.Б.Мюллисом (США) метода полимеразной цепной реакции (ПЦР), который нашел широкое применение в самых различных областях практической медицины.

Сайт СТУДОПЕДИЯ проводит ОПРОС! Прими участие :) - нам важно ваше мнение.

Лабораторная диагностика гепатита В проводится только серо­логическими и молекулярно-генетическим методами. Исследуемым материалом является сыворотка крови. Для выявления антигенов ВГВ и специфических антител применяются ИФА, РИА, РНГА, РОНГА, реакция преципитации в геле (РПГ), встречный иммуноэлектрофорез.

Серологическая диагностика. В организме больных к каждому из вирусных антигенов на разных стадиях заболевания образуются спе­цифические антитела, поэтому основой серодиагностики являются зна­ния о динамике появления и исчезновения основных маркеров ВГБ.

HBsAg является основным маркером заболевания, он появляет­ся в крови в инкубационном периоде (через 4-6 недель после зараже­ния задолго до появления клинических симптомов), постоянно обнаруживается в безжелтушном и желтушном периодах. К концу пер­вого месяца желтушного периода при остром течении болезни он ис­чезает из сыворотки крови и при последующей сероконверсии это указывает на выздоровление. В то же время длительное присутствие его после заболевания указывает на развитие хронического гепатита или свидетельствует о бессимптомном вирусоносительстве.

Антитела к HBsAgначинают циркулировать через 3-4 месяца после исчезновения из крови HBs-Ag. Они указывают на выздоровле­ние после острого гепатита и появлении протективного иммунитета и сохраняются всю жизнь.

HBeAgпоявляется после HBsAg, максимальная концентрация определяется в конце инкубационного периода и в преджелтушном периоде. С появлением желтухи его количество резко уменьшается и через 2-3 недели от начала заболевания он исчезает. Присутствие HBeAg указывает на активную репродукции вируса и, следовательно, высокую инфекционность крови. Если антиген длительно циркулиру­ет в крови, это указывает на формирование затяжной или хронической формы гепатита.

Антитела к HBeAgпоявляются после спустя 1-2 недели после исчезновения из крови соответствующего антигена и указывают на доброкачественное течение заболевания. У переболевших циркулиру­ют от 2 до 5 лет.

HBeAgнаходится только в ядрах инфицированных гепатоцитов, в свободной крови, как правило, не появляется, его обнаруживают с помощью МИФ.

Антитела к HBeAgциркулируют в крови в желтушный период и в начале реконвалесценции. При уменьшении активности репродукции вируса снижается титр антител, их полное исчезновение указывает на клиническое выздоровление. Особенно показательным и надежным маркером активно-текущего гепатита В является наличие в крови анти-HBcAg IgM.

Антитела к HBeAg класса IgG выявляются как при остром, так и при хроническом гепатите, сохраняются в течение всей и указывают на ранее перенесенный гепатит В (ретроспективная диагностика) или на имеющуюся инфекцию.

Таким образом, основными серологическими маркерами острого гепатита В являются: HBsAg, HBeAg и анти-HBcAg IgM

Молекулярно-генетический метод. Метод применяется как для диагностики заболевания, так и для оценки эффективности противо­вирусной терапии. В сыворотке крови больных можно обнаружить ДНК ВГВ в острый период заболевания и при хроническом гепатите при помощи ПЦР, реже методом молекулярной гибридизации. Количест­венный метод ПЦР применяют для определения уровня вирусемии.

7. Особенности вирусологического метода диагностики (культивирование, индикация, идентификация вируса)

ВГВ с трудом культивируется в клеточных культу­рах. Единственным животным, восприимчивым к вирусу, являются обезьяны шимпанзе. С этим связана сложность изучения жизненно­го цикла ВГВ.

8. Противовирусный иммунитет

У лиц, перенесших гепатит В с полным выздоровлением, формируется достаточно стойкий спе­цифический иммунитет гуморального и клеточного характера. Пере­крестный иммунитет к другим видам вирусного гепатита отсутствует.

Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет

Молекулярно-генетические исследования в эпидемиологии вирусных гепатитов: достижения и перспективы

Вирусные гепатиты являются широко распространёнными инфекционными болезнями и остаются значимой проблемой здравоохранения во всем мире. Развитие молекулярно-генетических методов исследования позволило значительно расширить представления о биологии возбудителей этих инфекций. В статье описаны современные взгляды на генетическую классификацию вирусов гепатитов А и В, приводятся данные о распространенности их генотипов и субтипов в мире и в России. На примере возбудителей этих инфекций раскрываются возможности и перспективы использования молекулярно-генетических подходов для изучения характеристик эпидемического процесса вирусных гепатитов.

С развитием молекулярно-генетических методов и появлением возможности определять генетические характеристики возбудителей инфекционных болезней было положено начало новому направлению эпидемиологических исследований. Использование молекулярно-генетических методов позволяет идентифицировать возбудителя инфекции, более эффективно устанавливать связь между случаями инфицирования, определять факторы передачи возбудителя, проводить мониторинг географического распространения генетических вариантов возбудителя, выявлять генетические маркеры факторов вирулентности и идентифицировать факторы риска.

Вирусные гепатиты до настоящего времени остаются значимой проблемой здравоохранения как в России, так и в мире. По оценкам ВОЗ, в мире ежегодно регистрируется около 1,5 млн случаев гепатита А [1], а общее число заболевших может составлять десятки миллионов в год [2]. Число больных хроническими формами гепатита В в мире оценивается в 240 млн человек и около 600 тыс. человек в год умирают от острых форм инфекции и исходов хронического гепатита В [3]. В России в течение последних лет наблюдается неуклонное снижение заболеваемости гепатитом А, однако в 2012 г. ее показатель оставался достаточно высоким – 5,5 на 100 тыс. населения. Заболеваемость хроническими формами инфекции, вызванной вирусом гепатита В (ВГВ), в 2012 г. составляла 33,7 случаев на 100 тыс. населения и в 23,7 раза превышала заболеваемость острым гепатитом В. В настоящей статье на примере гепатитов А и В раскрываются современные возможности и перспективы использования молекулярно-генетических подходов к изучению эпидемического процесса вирусных гепатитов.

На основе гомологии нуклеотидных последовательностей региона VP1/2A генома вируса гепатита А (ВГА) было выделено 6 его генотипов (I–VI) [4]. Генотипы I и II были изолированы только от больных людей, генотипы IV–VI – только от обезьян, генотип III был выявлен как у человека, так и у приматов. Каждый из генотипов I, II и III подразделяется на 2 субтипа – A и B. Наиболее распространенными в мире является субтипы IA и IIIA.

Особенности циркуляции генетических вариантов ВГА на различных территориях изучались в ряде работ. В исследовании, положившем начало генетической классификации ВГА, было показано, что в пределах субтипа IА существует филогенетическое родство изолятов, циркулирующих в одном географическом регионе. Были выявлены кластеры изолятов из Японии и Китая, с территории бывшего СССР и Таиланда [4]. О.V. Nainan и соавт. [5] проанализировали более 3500 изолятов ВГА из США и других стран мира и доказали наличие географической кластеризации штаммов ВГА.

Нами были изучены генетические характеристики 1071 изолята ВГА из 30 регионов РФ, входящих в состав всех восьми федеральных округов (ФО), а также ряда стран СНГ. В результате исследования было установлено, что большинство (73%) изолятов ВГА из РФ относятся к субтипу IA, а оставшиеся 27% принадлежат субтипу IIIA. Случаи гепатита А, вызванные субтипом IB, в РФ единичны и, за редким исключением, являются завозными [6].

Во всех ФО доминирующим субтипом ВГА является субтип IA, доля которого составляет от 62% (Дальневосточный ФО) до 94% (Уральский ФО). В ряде регионов значительное место среди выявленных изолятов ВГА занимает субтип IIIA. Так, более четверти всех случаев гепатита А было вызвано данным субтипом вируса в Центральном (30%) и Дальневосточном ФО (38%) (рис. 1, см. на вклейке). Наибольшая доля (62%) субтипа IIIA была выявлена в Республике Саха.

В странах Средней Азии (Таджикистан, Кыр­гызстан) доминирующим является субтип IIIA ВГА, который составляет более 70% всех случаев. В Украине доминирующим субтипом ВГА является субтип IA, доля которого превышает 85%.

При филогенетическом анализе изолятов ВГА субтипа IA из России и стран СНГ было выявлено, что большинство из них статистически достоверно группируются в 2 отдельных кластера, отличных от средиземноморского, американских и азиатско-тихоокеанских. Выявленные особенности кластеризации штаммов ВГА субтипа IА, циркулирующего в РФ, странах СНГ и других странах мира, доказывают возможность использования филогенетического анализа для подтверждения фактов завозных случаев гепатита А из стран дальнего зарубежья.

В пределах крупных географических кластеров филогенетически родственных штаммов ВГА субтипа IA часто можно выделить подкластеры штаммов, циркулирующих на отдельных ограниченных территориях. Так, для юга Таиланда было показано существование характерных для данной территории штаммов ВГА, выявленных на протяжении 4 лет наблюдения [7]. Изоляты ВГА, циркулирующие на территории центрального и южного районов Туниса на протяжении 2001–2004 гг., формируют на филогенетическом дереве соответствующие кластеры родственных штаммов [8].

Интересные данные были получены по филогеографии ВГА в Южной Америке. В работе M. Costa-Mattioli и соавт. [9] было показано, что изоляты ВГА IA, циркулирующие на территории Аргентины, Уругвая и Чили, обладают высокой генетической вариабельностью, и кластеризация штаммов на дереве по географическому признаку не обнаруживается. В последующем детальном исследовании ВГА в Аргентине было показано, что штаммы из этой страны образуют 2 статистически значимых кластера, при этом географически штаммы перемешаны – на одной территории встречаются штаммы из обоих кластеров [10]. Интересно, что штаммы только одного из этих кластеров группируются с референс-штаммами из Италии, Туниса и США.

Иная картина наблюдается с разнообразием штаммов ВГА на территории Амазонии (Бразилия), где инфицирование гепатитом А происходит, в основном, в детском возрасте, а заболеваемость взрослого населения исключительно низка. В работе V.S. De Paula и соавт. [11] было установлено, что большинство штаммов ВГА, циркулирующих на территории Амазонии, группируется в отдельный кластер и имеет филогенетическое сходство со штаммами, циркулирующими на других территориях Бразилии.

Многолетняя циркуляция штаммов ВГА на одной территории также была показана для развитых стран – Италии [12], Японии [13] и США [5]. Штаммы, циркулирующие на территории США, группируются на дереве в 3 различных кластера. Один из этих кластеров включает штаммы, циркулирующие на территории соседней Мексики. При этом на территории США штаммы из этой группы преимущественно встречались у выезжавших в Мексику либо у контактировавших с приезжими из этой страны и вызывали пищевые вспышки, связанные с употреблением зеленого лука, импортируемого из Мексики [14].

Детальный анализ филогенетических взаимоотношений штаммов субтипа IA, выявленных в РФ и странах СНГ, показал, что можно выделить ряд статистически достоверных кластеров, соответствующих отдельным географическим регионам. Единый кластер формируют изоляты ВГА, выявлявшиеся у больных гепатитом А, из регионов Европейской части РФ. Два кластера соответствуют изолятам ВГА, выявленным на территории Южного и Северо-Кавказского ФО и в Украине. Большинство изолятов IA субтипа, выявленных в Таджикистане и Кыргызстане, группируются также в два кластера. Отдельную ветвь на филогенетическом дереве формируют изоляты, циркулирующие в Республике Тыва. Изоляты ВГА субтипа IA, выявленные в Сахалинской области и Хабаровском крае, также формируют отдельный кластер. Таким образом, анализ позволил выявить 7 кластеров ВГА субтипа IA, характерных для регионов России и стран СНГ: кластер Европейской части РФ, 2 южных кластера, 2 среднеазиатских кластера, тувинский кластер и дальневосточный кластер (рис. 2, см. на вклейке).

Необходимо отметить, что штаммы кластера Европейской части РФ являются наиболее распространенными на территории РФ и вызывают большинство вспышек гепатита А. Штаммы тувинского кластера субтипа IA были обнаружены только в данном регионе, что, вероятно, связано с особенностями его географического и социально-экономического положения. Штаммы, формирующие дальневосточный кластер, филогенетически близки к средиземноморским штаммам, выявлявшимся в Тунисе, Италии и Испании. Анализ генетического разнообразия штаммов ВГА в Сахалинской области и Хабаровском крае на протяжении 2006–2007 гг. показал, что генетические варианты, формирующие дальневосточный кластер, циркулируют на данной территории на протяжении длительного времени и не являются генетически идентичными. Это свидетельствует о длительной эволюции описанных штаммов ВГА на данной территории, и случаи гепатита А, ими вызванные, не могут считаться завозными. Филогенетический анализ штаммов III генотипа ВГА выявил наличие трех кластеров для штаммов субтипа IIIA, один из которых (основной кластер) содержал абсолютное большинство российских штаммов и штаммов стран СНГ. Абсолютное большинство штаммов из стран Средней Азии, выявленных в данной работе, образовывали единый кластер. Штаммы субтипа IIIA, обнаруженные на территории Республики Саха (Якутия), образовывали целую группу кластеров, филогенетически отличных от среднеазиатских. Отдельным кластером, достоверно отличающимся от других, были представлены штаммы, выявленные в Кемеровской области [15].

Таким образом, филогенетический анализ штаммов ВГА субтипов IA и IIIA, циркулирующих в РФ, Украине, Таджикистане и Кыргызстане, позволил выявить ряд географических кластеров, характерных для стран Средней Азии и отдельных регионов РФ. Это демонстрирует возможность использования данного подхода при эпидемиологической диагностике не только для установления факта завоза случаев гепатита А из стран дальнего зарубежья, но и для выявления завозных случаев заболевания из отдельных регионов РФ и стран СНГ.

ВГА является одним из самых стабильных РНК-содержащих вирусов. Скорость его генетической эволюции составляет 9,76 x 10-4 нуклеотидных замен на сайт в год [16]. Скорость эволюции в синонимичных позициях кодона составляет 1,3–4,0 x 10-3, что на порядок ниже, чем оценки для других членов семейства Picornaviridae [16, 17].

Следствием относительно небольшой скорости эволюции вируса является генетическая однородность вирусной популяции, выявляемой у пациентов во время вспышек гепатита А. Изоляты, выделенные во время вспышек и охарактеризованные по наиболее вариабельным фрагментам генома, обычно относятся к одному штамму (генетически идентичны у всех пациентов по маркерным последовательностям генома) [18]. Во время вспышек с установленным источником инфицирования изоляты ВГА, выделенные от пациентов, идентичны между собой и идентичны изолятам, выделенным из источника [19, 20]. Описаны случаи вспышек с продолжительным подъемом заболеваемости, при которых выявлялись несколько генетически различных штаммов в пределах одного населенного пункта или района и в группах риска [21–23]. Также выявление нескольких штаммов ВГА было описано во время массовых пищевых вспышек, источником которых были морепродукты [24].

За период с 2005 по 2010 г. нами было проанализировано 20 вспышек гепатита А, имевших место в 7 ФО. В 5 (25%) ведущим был установлен водный путь, в 4 (20%) – пищевой путь и в 9 (45%) – контактно-бытовой путь передачи возбудителя. 2 (10%) вспышки имели смешанный характер, при них отмечались как контактно-бытовой, так и водный пути передачи. 15 (75%) вспышек были вызваны субтипом IA ВГА, тогда как остальные 5 – субтипом IIIA. При филогенетическом анализе была выявлена значительная генетическая гетерогенность как среди изолятов субтипа IA, так и среди изолятов субтипа IIIA. Анализ штаммов ВГА, циркулировавших в пределах каждой из изученных вспышек, позволил в ряде случаев установить не только характер вспышки (завоз или распространение локального штамма), но также выдвинуть гипотезы о механизме ее развития и доказать единство фактора передачи возбудителя, подтвердить или опровергнуть связь как отдельных случаев заболевания, так и отдельных вспышек между собой [25]. Анализ молекулярно-генетических характеристик штаммов ВГА, циркулирующих во время вспышки, дает ценную дополнительную информацию для установления источника возбудителя инфекции, путей и факторов передачи, а также временных и пространственных границ очага.

В 70-х годах прошлого века в ряде исследований, выполненных с использованием моноклональных антител, было выделено 9 различных субтипов (серотипов) HBsAg (ayw1, ayw2, ayw3, ayw4, ayr, adw2, adw4, adrq-, adrq+) [26]. Определение субтипа HBsAg пытались применить для изучения географической распространенности вариантов вируса гепатита В (ВГВ), однако дальнейшие исследования показали, что субтипы HBsAg не отражают истинного генетического разнообразия вируса [27]. К 1988 г. были секвенированы полные нуклеотидные последовательности 18 изолятов ВГВ различных субтипов, что послужило основой для разработки первой генетической классификации. H. Okamoto и соавт. [28] первоначально разделили имеющиеся изоляты ВГВ на 4 генетических группы, обозначенные A, B, C, D. Две новые группы, обозначенные Е и F, были выделены на основе анализа вариабельности в S-гене подтипов ayw4 и ayd4 [29]. Позднее были описаны еще 2 генотипа – G и H [30]. В последние несколько лет в литературе появились сообщения об обнаружении в азиатском регионе новых генетических вариантов ВГВ – I и J [31, 32].

Генотипы A, B, C, D и F сегодня принято разделять на ряд субгенотипов, которые обозначают арабскими цифрами. Для генотипа А известно 3 субгенотипа – А1, А2, А3. Для генотипа В точно установлено существование шести субгенотипов, для генотипов С и D – пяти субгенотипов и для генотипа F – четырех субгенотипов [33, 34]. Возможно, субгенотипическая классификация генотипов ВГВ будет дополняться, так как имеются сообщения о выделении ранее неизвестных генетических вариантов вируса.

Генотип А встречается во всех регионах земного шара, однако превалирует в Северной Америке, Западной Европе и Центральной Африке. Генотипы В и С встречаются в Юго-Восточной Азии. Генотип D является вторым по распространенности генотипом и доминирует в странах Средиземноморья, Индии, Восточной Европе и Северной Америке [35]. Генотип Е превалирует в Западной Африке; генотип F – в Южной и Центральной Америке, на Аляске; генотип G – в Центральной и Северной Америке, а также в Европе [36–39]. Генотип Н был обнаружен в Центральной Америке, Мексике и США [40]. Генотипы I и J были выявлены в Лаосе и Японии соответственно [31, 41]. Однако набирающие силу с каждым годом миграционные процессы приводят к постепенному стиранию четких границ географической распространенности тех или иных генотипов. В крупномасштабном исследовании, охватившем 17 гепатологических центров в США, были зарегистрированы 7 генотипов ВГВ: А (33%), В (21%), С (34%), D (9%), E (1%), F (1%) и G (1%). Кроме того, была выявлена достоверная зависимость между расовой принадлежностью и генотипом ВГВ. Так, генотип А был выявлен у белых и афроамериканцев, в то время как генотипы В и С превалировали среди азиатов. У американцев, родившихся в США, Европе, на Дальнем Востоке и в Юго-Восточной Азии, с наибольшей частотой выявлялись генотипы А, D, С, В соответственно [42].

Нами были изучены генетические характеристики 4328 изолятов ВГВ из 36 регионов РФ, входящих в состав всех восьми ФО, и из ряда стран СНГ. Результаты исследования показали, что в РФ большинство изолятов ВГВ (85%) относится к генотипу D, вторым по частоте (10,7%) является генотип А, 3,2% изолятов принадлежит генотипу С и в 1,1% случаев выявляются другие генотипы, сочетанные генотипы и рекомбинантные штаммы вируса [15, 43]. Во всех ФО доминирующим генотипом ВГВ был D, доля которого варьировала от 70 до 97,9%. В отдель­ных субъектах РФ [Республика Саха (Якутия), Кабардино-Балкарская Республика] значительную долю составлял генотип А (от 40 до 50%), а в Чукотском АО была существенно больше доля генотипа С (24,3%). Выявленные особенности могут быть следствием как географических характеристик территории, так и этнических различий, определяющих условия относительной изоляции популяции, проживающей на данной территории. В Армении, Украине и Кыргызстане доминирующим также был генотип D, который составлял более 80% случаев. Вторым по частоте встречаемости был генотип А (рис 3., см. на вклейке).

При анализе возрастных особенностей распределения генотипов ВГВ в РФ было выявлено, что наибольшая доля (17,7%) больных с генотипом А наблюдалась в возрастной группе 21–30 лет, несколько меньшая – в возрастных группах 15–20 и 31–40 лет (14,5 и 9,3% соответственно). Наименьшая доля больных с генотипом А ВГВ была в возрастных группах 0–14, 41–50 лет и 51 год и старше (4,4, 7,2 и 3,2% соответственно). Выявленные отличия распределения генотипов ВГВ в различных возрастных группах были статистически достоверны (критерий Краскела–Уоллиса; p 0