Методы культивирования вирусов в клеточных культурах в курином эмбрионе

1. Для культивирования вирусов используют эмбрионы в возрасте от 8 до 12 дней. Для выращивания эмбрионов оплодотворенные яйца помещают в термостат при 38° С, в котором находится посуда с водой для создания влажности. Два раза в день яйца вынимают для проветривания. Периодически яйца просматривают в овоскоп на жизнеспособность. Живые эмбрионы отличаются подвижностью, пульсацией сердца, хорошо контурируемыми сосудами. Перед заражением эмбрион осматривают в овоскоп и намечают границы воздушного мешка, а также расположение зародыша.

2. Для предотвращения инфицирования эмбриона посторонними микробами заражение проводят в асептических условиях с использованием стерильного инструмента (ставят в стаканчик со спиртом) в помещении, облученном бактерицидными лампами. Скорлупу яйца над воздушной камерой обрабатывают 70 % спиртом, обжигают, смазывают 2 % йодом, вторично протирают спиртом и обжигают. Вируссодержащий материал обрабатывают антибиотиками для удаления бактериальной флоры.

3. Существует несколько способов заражения куриного эмбриона. Чаще всего материал вводят в аллантоисную и амниотическую полости, на хорион-аллантоисную оболочку и в желточный мешок.

При заражении в аллантоисную полость в скорлупе над воздушной камерой проделывают небольшое отверстие с помощью ножниц или скальпеля. Туберкулиновым шприцем вводят 0,1-0,2 мл вируссодержащего материала на глубину 2-3 мм ниже границы воздушной камеры. Прокол в скорлупе заливают расплавленным парафином.

При заражении на хорион-аллантоисную оболочку ножницами вскрывается скорлупа над воздушной камерой, пинцетом приподнимается подскорлуповая оболочка и шприцем на оболочку наносят 0,2-0,5 мл вируссодержащего материала при вертикальном положении эмбриона. Отверстие в скорлупе закрывают стерильным покровным стеклом, края которого замазывают парафином.

Заражение в амниотическую полость осуществляется длинной иглой через отверстие в воздушной камере. Иглу вводят в темной комнате под контролем овоскопа. При попадании иглы в полость эмбрион сдвигается. Заражение приводит к непосредственному контакту вируса с тканями эмбриона, поэтому в данном случае вирус размножается не только в полости, но и в тканях зародыша.

При заражении в желточный мешок вируссодержащий материал вводят иглой длиной 3-4 см, которой проделывают отверстие в воздушной камере. Иглу ведут к центру с небольшим отклонением книзу при горизонтальном положении эмбриона. Отверстие в скорлупе запаивают каплей парафина.

После инфицирования эмбрионы помещают в термостат при 37°С.

4. Через 48-72 часа (срок максимального накопления вирусов) производят вскрытие зараженных эмбрионов. Перед вскрытием эмбрионы оставляют на ночь при 4° С. После обработки скорлупы спиртом и 2 % раствором йода ее рассекают ножницами немного выше очерченной карандашом границы воздушной камеры, наклоняя яйцо так, чтобы избежать попадания скорлупы в полость. Скорлупу отбрасывают, осторожно снимают ее оболочку и рассматривают хорион-аллантоисную оболочку. Затем пастеровской пипеткой прокалывают эту оболочку в участке, свободном от сосудов, и отсасывают аллантоисную жидкость. После этого извлекают хорион-аллантоисную оболочку, дважды промывают физиологическим раствором, помещают в чашку Петри и отмечают на черном фоне наличие специфических поражений.

5. О репродукции вируса судят по специфическому характеру поражений на хорион-аллантоисной оболочке, по гибели эмбриона, по РГА – реакции гемагглютинации (склеивание эритроцитов).

Особенно четко очаги поражения на хорион-аллантоисной оболочке появляются в месте заражения в виде геморрагий, белесоватых очагов (вирус кори или гриппа вызывает образование оспин на оболочке).

По РГА устанавливают присутствие вируса в аллантоисной жидкости. РГА основана на способности некоторых вирусов адсорбироваться на поверхности эритроцитов и, изменяя их поверхность, вызывать склеивание. РГА ставят на стекле или в пробирках: готовят двукратное разведение вируссодержащего материала, добавляют 1 % взвесь отмытых куриных эритроцитов и оставляют при комнатной температуре. Результаты учитывают через 30-40 минут после оседания эритроцитов в контрольной пробе, в которую вместо вируссодержащего материала добавляют аллантоисную жидкость незараженного эмбриона. При гемагглютинации образуется зернистый осадок с фестончатыми краями, а в контроле – осадок в виде диска с ровными краями. Наличие гемагглютинации в опытных пробирках при ее отсутствии в контроле указывает на присутствие вируса в исследуемой жидкости.

Культивирование вирусов человека и живот­ных проводят с целью лабораторной диагнос­тики вирусных инфекций, для изучения пато­генеза и иммунитета при вирусных инфекци­ях, а также для получения диагностических и вакцинных препаратов. Вирусы культивируют на трех биологических моделях: в организ­ме лабораторных животных, в развивающихся эмбрионах птиц (чаще на куриных эмбрионах) и культурах клеток (тканей).

Лабораторных животных (взрослых или новорожденных белых мышей, хомяков, кроликов, обезьян и др.) заражают иссле­дуемым вируссодержащим материалом раз­личными способами (подкожно, внутримы­шечно, интраназально, интрацеребрально и т. д.) в зависимости от тропизма вирусов. Использование животных для культивирова­ния вирусов в диагностических целях весьма ограничено из-за видовой невосприимчи­вости животных ко многим вирусам челове­ка, контаминации животных посторонними микробами, а также по экономическим и этическим соображениям.

О репродукции вирусов в организме жи­вотных судят по развитию у них видимых клинических проявлений заболевания, па-томорфологическим изменениям органов и тканей, а также на основании реакции гемаг-глютинации (РГА) с суспензией из органов, содержащих вирусы. РГА основана на способ­ности многих вирусов вызывать склеивание (агглютинацию) эритроцитов человека, птиц и млекопитающих в результате взаимодейс­твия вирусных белков (гемагглютининов) с рецепторами эритроцитов.

Куриные эмбрионы (5—12-дневные) зара­жают путем введения исследуемого матери-

ала в различные полости и ткани зародыша. Таким образом можно культивировать виру­сы гриппа, герпеса, натуральной оспы и др. Достоинствами модели являются: возмож­ность накопления вирусов в больших коли­чествах; отсутствие скрытых вирусных ин­фекций; доступность для любой лаборатории. О репродукции вирусов в куриных эмбрионах свидетельствуют: специфические поражения оболочек и тела эмбриона (оспины, крово­излияния); гибель эмбриона; положительная РГА с вируссодержащей жидкостью, получен­ной из полостей зараженного зародыша.

Методику культивирования вирусов в раз­вивающихся эмбрионах птиц используют при промышленном выращивании вирусов. Однако многие вирусы не размножаются в эм­брионах птиц; почти неограниченные возмож­ности для культивирования вирусов появились после открытия метода культур клеток.

Культуру клеток (тканей) наиболее часто применяют для культивирования вирусов. Метод культур клеток разработан в 50-х годах XX века Дж. Эндерсом и соавт., получивши­ми за это открытие Нобелевскую премию. Клетки, полученные из различных органов итканей человека, животных, птиц и дру­гих биологических объектов, размножают вне организма на искусственных питательных средах в специальной лабораторной посуде. Большое распространение получили культу­рыклеток из эмбриональных и опухолевых (злокачественно перерожденных) тканей, обладающих, по сравнению с нормальными клетками взрослого организма, более актив­ной способностью к росту и размножению.

При выращивании культур клеток необхо­димо выполнение ряда условий:

1) соблюдение правил асептики: 2) исполь­зование лабораторной посуды из нейтрально­го стекла (пробирки, флаконы, матрасы) или специальных реакторов для получения био­технологической продукции; 3) использование сложных по составу питательных сред (среда 199, Игла), содержащих минеральные соли, аминокислоты, витамины, глюкозу, сыворотку крови животных или человека, буферные рас­творы для поддержания стабильного рН; 4) до­бавление антибиотиков к питательной среде для подавления роста посторонних микробов;

5) соблюдение оптимальной температуры (36— 38,5 °С) роста клеток.

В зависимости от техники приготовления различают однослойные, суспензионные и органные культуры клеток:

Однослойные культуры клеток — клетки спо­собны прикрепляться и размножаться на повер­хности химически нейтрального стекла лабора­торной посуды в виде монослоя. Они получили наибольшее применение в вирусологии.

□ Суспензионные культуры клеток — клетки размножаются во всем объеме питательной среды при постоянном ее перемешивании с помощью магнитной мешалки или во враща­ющемся барабане. Их используют для получе­ния большого количества клеток, например, при промышленном получении вирусных вакцин.

□ Органные культуры — цельные кусочки органов и тканей, сохраняющие исходную структуру вне организма (применяются огра­ниченно).

Культуры клеток в процессе их культиви­рования способны проходить десятки гене­раций. По числу жизнеспособных генераций культуры клеток подразделяют на: 1) пер­вичные, или первично-трипсинизированные; 2) перевиваемые, или стабильные; 3) полупе­ревиваемые.

Первичные культуры способны размножать­ся только в первых генерациях, т. е. выдержи­вают не более 5— 10 пассажей после выделения из тканей. В основе получения первичных культур лежит обработка кусочков тканей (эм­бриональных, опухолевых или нормальных) протеолитическими ферментами, например трипсином, который разрушает межклеточ­ные связи в тканях и органах с образованием изолированных клеток.

Перевиваемые, или стабильные, культуры клеток способны размножаться в лаборатор­ных условиях неопределенно длительный срок (десятки лет), т. е. выдерживают мно­гочисленные пассажи. Их получают преиму­щественно из опухолевых или эмбриональ­ных тканей, обладающих большой потенцией роста. Перевиваемые культуры клеток имеют преимущества перед первичными культура­ми. К ним относятся: продолжительность их культивирования, высокая скорость размно-

жения опухолевых и эмбриональных клеток, меньшая трудоемкость, способность культур сохранять свои свойства в замороженном со­стоянии в течение многих лет, возможность использования международных линий культур во многих лабораториях мира. Однако злока­чественный характер клеток и соматические мутации, претерпеваемые нормальными клет­ками в гпоцессе многочисленных генераций, ограничивают использование этого вида куль­тур, в частности невозможно их применение в производстве вирусных вакцин.

Полуперевиваемые культуры клеток имеют ограниченную продолжительность жизни и выдерживают 40—50 пассажей. Их обычно по­лучают из диплоидных клеток эмбриона че­ловека. В процессе пассажей эти культуры сохраняют диплоидный набор хромосом, ха­рактерный для соматических клеток исходной ткани, и не претерпевают злокачественной трансформации. Поэтому полуперевиваемые культуры клеток могут быть использованы как в диагностике, так и в производстве вакцин.

Внедрение в вирусологию метода культур клеток позволило выделить и идентифициро­вать многочисленные ранее неизвестные ви­русы, так как почти к каждому вирусу можно подобрать соответствующие чувствительные клетки, в которых он способен репродуциро­ваться. Метод дал возможность изучать взаи­модействие вирусов с клеткой на молекуляр­ном уровне, получать высококачественные вакцинные и диагностические препараты, проводить вирусологические исследования в стандартных условиях.

ЦПД — патологические изменения морфо­логии клеток, вплоть до их гибели, возника­ющие в результате репродукции вирусов, и наблюдаемые под микроскопом (рис. 3.11). В зависимости от особенностей репродуци­рующихся вирусов ЦПД может отличаться. В одних случаях быстро вакуолизируется ци-

топлазма, разрушаются митохондрии, округ­ляются и гибнут клетки, а в других — фор­мируются гигантские многоядерные клетки (так называемые симпласты) или наблюдает­ся явление клеточной пролиферации, которое в итоге заканчивается деструкцией клеток. Таким образом, характер ЦПД позволяет ис­пользовать этот феномен не только для инди­кации вирусов, но и для их ориентировочной идентификации в культуре клеток.

Некоторые вирусы можно обнаружить и идентифицировать по внутриклеточным вклю-

чениям, которые образуются в ядре или цитоп­лазме зараженных клеток (рис. 3.12). Часто включения представляют собой скопления вирусных частиц или отдельных компонентов вирусов, иногда могут содержать клеточный материал. Выявляют включения с помощью светового или люминесцентного микроско­па после окрашивания зараженных клеток соответственно анилиновыми красителями или флюорохромами. Включения могут отли­чаться по величине (от 0,2 до 25 мкм), форме (округлые или неправильные) и численности (одиночные и множественные). Характерные цитоплазматические включения формируют­ся в клетках, инфицированных вирусом нату­ральной оспы (тельца Гварниери), бешенства (тельца Бабеша—Негри), а внутриядерные включения — при заражении аденовирусами или вирусами герпеса.

В основе реакции гемадсорбции лежит спо­собность культур клеток, инфицированных вирусами, адсорбировать на своей поверхности эритроциты. Целый ряд вирусов (гриппа, па­рагриппа и др.) обладают гемадсорбирующими свойствами, что позволяет использовать реак­цию гемадсорбции для индикации этих виру­сов даже при отсутствии выраженного ЦПД в культуре клеток. Механизмы реакции гемад­сорбции и гемагглютинации сходны. Поэтому для обнаружения репродукции некоторых ви­русов в культуре клеток можно использовать

реакцию гемагглютинации с культуральной жидкостью, т. е. с питательной средой, содер­жащей размножившиеся вирусы.

Дата добавления: 2016-02-04 ; просмотров: 3590 ; ЗАКАЗАТЬ НАПИСАНИЕ РАБОТЫ

ВНИМАНИЕ! САЙТ ЛЕКЦИИ.ОРГ проводит недельный опрос. ПРИМИТЕ УЧАСТИЕ. ВСЕГО 1 МИНУТА.

С тех пор как обнаружили, что вирусы гриппа размножаются в куриных эмбрионах, этот метод стал широко применяться в вирусологии, так как прост в применении и не является дорогим.

Используют 7-9 дневные куриные эмбрионы (полный цикл развития 21 день).

Перед заражением поверхность обрабатывают спиртом, раствором йода, в скорлупе делают отверстие и заражают стерильным шприцем.

Способы заражения: в амниотическую полость, в аллантоисную полость или в желточный мешок. Вирусы размножаются на соответствующих оболочках, накапливаются в полостной жидкости, которую затем и можно собрать для дальнейшего исследования.

Эмбрионы культивируют при 37 град. 3 суток, затем снова обрабатывают скорлупу, вскрывают стерильными инструментами эмбрион и собирают вируссодержащую жидкость. Все работы по заражению и вскрытию производят в боксе.

Культивирование на культурах клеток.

Культуры клеток стали применять в вирусологии в последние десятилетия, это дало возможность культивировать и изучать гораздо более широкий спектр вирусов, так как не все человеческие вирусы возможно выделить на животных или на эмбрионах. Таким образом, современная вирусология пользуется клеточными культурами, которых получено в настоящее время огромное множество.

Разновидности клеточных культур

а) первичные -получают из эмбриональной ткани, путем ее измельчения, обработки трипсином для дезагрегации (разъединения) клеток и дальнейшего культивирования

in vitroв специальной культуральной жидкости.

б) перевиваемые– получают из опухолевой ткани, они отличаются тем, что их можно культивировать неограниченно долго, меняя только культуральную среду и посуду.

В процессе культвирования на стекле получается монослой: то есть один слой клеток.

Теперь можно заразить эти клетки исследуемым материалом с предполагаемым вирусом, либо уже имеющимися вирусами. Посуду с клетками, зараженными и незараженными, культивируют в термостате при 37 градусах.

Процесс накопления вирионов в клеточной культуре длится примерно 48 – 72 часа.

Подбирая подходящие культуры, можно культивировать практически все человеческие вирусы.

Следующая стадия изучения – индикация и идентификация вирусов.

Методы индикации.

Индикация – это обнаружение вирусов непосредственно в исследуемом материале или в культуральной жидкости или в зараженных клетках.

I.Если вирионы находятся в жидкости, то обнаружить их можно с помощью реакции гемагглютинации.

Суть реакции: некоторые виды вирусов способны спонтанно склеивать (то есть вызывать гемагглютинацию) каких – либо эритроцитов. Например, вирионы гриппа склеивают эритроциты кур, некоторые аденовирусы – эритроциты крысы и т.д.

Таким образом, с помощью взвеси эритроцитов в физиологическом растворе можно обнаружить вирусы в вируссодержащей жидкости.

II.Если вирусы размножаются в клеточной культуре, но являются гемагглютинирующими, то можно обнаружить их с помощью реакции гемадсорбции: на культуру наносят взвесь эритроцитов, инкубируют, сливают – если культура заражена, то эритроциты прилипнут прямо к зараженным клеткам – это видно в световой микроскоп.

III.Другие эффекты:

а) вирусы вызывают разрушение монослоя – это называется цитопатогенное действие вируса - ЦПД.

б) вирусы вызывают морфологические изменения клеток: внутриклеточные или внутриядерные включения, образование синцития, симпластов (то есть слияние нескольких клеток в одно образование из-за повреждения клеточных мембран).

Разные варианты ЦПД могут быть характерными для разных вирусов, что дает возможность их дифференцировать.

Таким образом, тем или иным путем можно констатировать наличие размножающихся вирусов либо в культуральной жидкости, либо в культуре клеток.

Бактериофаги - это вирусы бактерий. Основная характеристика: Большинство – ДНК-содержащие. Разнообразны по форме. Каждому виду бактерий соответствует свой бактериофаг (специфичность).

Многие вирусы, поражающие человека и животных, могут в большей или меньшей степени размножаться в курином эмбрионе. Наличие плотной скорлупы защищает эмбрион от попадания микроорганизмов из внешней среды.

Метод культивирования вирусов в куриных эмбрионах используют при лабораторной диагностике вирусных инфекций, а также для изготовления вирусных вакцин и диагностических препаратов. Но этот метод имеет недостатки: 1) невозможно наблюдать в динамике за патологическими изменениями, происходящими в эмбрионе после заражения его вирусом; 2) при вскрытии эмбриона, зараженного вирусом, часто не обнаруживается видимых изменений и приходится выявлять наличие вируса в тканях, в жидкостях эмбриона, пользуясь другими вирусологическими методами (например, реакцией гемагглютинации); 3) метод культивирования в куриных эмбрионах пригоден не для всех вирусов. Несмотря на имеющиеся недостатки метод сравнительно прост, удобен и дешев и широко используется в вирусологических исследованиях. Наибольшее значение он имеет при работе с ортомиксовирусами, герпесвирусами, поксвирусами.

1.3.1. Строение куриного эмбриона

Куриный эмбрион покрыт известковой оболочкой – скорлупой, к которой изнутри примыкает скорлупная оболочка. В тупом конце яйца она раздваивается и заключает в себе воздушное пространство. Под скорлупной оболочкой находится хорионаллантоисная оболочка, в тупом конце яйца она проходит по внутренней стороне скорлупной оболочки, замыкающей воздушное пространство, эта оболочка богата кровеносными сосудами и служит эмбриону органом дыхания. Изнутри к ней прилегает аллантоисная полость, которая является органом выделения и защищает зародыш от высыхания и травм. Аллантоисная полость окружает зародыш, находящийся в полости амниона, которая наполнена околоплодной жидкостью. Через желточный канатик зародыш соединён с желточным мешком – основным источником питательных веществ.

Для успешного культивирования вирусов в организме развивающихся куриных эмбрионов требуется определённый температурный режим (36 0 -38 0 ), влажность (50-70%), а также достаточная вентиляция. Заражают куриные эмбрионы определённого возраста, инкубированные от 6 до 13 дней в зависимости от вида вирусов и метода заражения. Необходимо подготовить: подставку для яйца, пузырьки со спиртом и йодом, пробирку со стерильным парафином, покровные стёкла, пакетики стерильной ваты и марли, завёрнутую в бумагу стерильную посуду, стерильные шприцы, иглы, пинцеты, препаровальные иглы. Инструменты помещают в стаканчик со спиртом, где они находятся в течение всей работы, перед каждой манипуляцией их дополнительно стерилизуют обжиганием в пламени горелки. Руки перед работой тщательно моют, рекомендуется надеть маску из марли.

Для работы отбирают жизнеспособные эмбрионы, просвечивая инкубированные яйца в овоскопе. Жизнеспособный эмбрион подвижен, кровеносные сосуды оболочки заполнены кровью. Отобранные яйца тщательно дезинфицируют на тупом конце (или на боковой стороне яйца): скорлупу протирают спиртом, смазывают йодом, повторно обрабатывают спиртом и обжигают.

1.3.2. Заражение куриного эмбриона на хорионаллантоисную оболочку

Для заражения используют куриные эмбрионы 10-12-дневного возраста. Основные этапы заражения:

1. Яйцо помещают на подставку в вертикальном положении так, чтобы воздушный мешок находился наверху, проводят стерилизацию скорлупы на тупом конце яйца.

2. Над центром воздушного мешка делают прокол скорлупы с помощью препаровальной иглы.

3. в образовавшееся отверстие вводят браншу ножниц и вырезают окно в скорлупе около 1,5 см в диаметре.

4. Через отверстие осторожно надрывают иглой внутренний листок скорлупной оболочки и отслаивают на небольшом участке (0,5-1 см 2 ).

5. Производят заражение хорионаллантоисной оболочки путём нанесения на неё 0,1-0,2 мл вируссодержащего материала с помощью пастеровской пипетки или шприца.

6. Окошко в скорлупе закрывают специальной эластичной плёнкой или стерильным покровным стеклом и прикрепляют расплавленным парафином.

Заражённые эмбрионы помещают в термостат в вертикальном положении и инкубируют в течение 2-3 суток, после чего производят вскрытие по следующим правилам:

1. Яйцо помещают на подставку так, чтобы воздушное пространство было наверху, проводится стерилизация места вскрытия.

2. Стерильными ножницами срезают скорлупу по границе воздушного пространства.

3. Пользуясь пинцетом, снимают скорлупную оболочку по границе. Обнажённую хорионаллантоисную оболочку подрезают вдоль края скорлупы. Через образовавшееся отверстие выливают всё содержимое яйца в чашку или лоток.

4. Оставшуюся внутри скорлупы хорионаллантоисную оболочку осторожно извлекают пинцетом и помещают в стерильную чашку с физиологическим раствором. Здесь её расправляют и изучают изменения, поместив чашку на тёмный фон.

Для получения из хорионаллантоисной оболочки материала, содержащего вирус, её нужно измельчить ножницами и затем растереть в ступке с кварцевым стеклом, добавив солевой раствор. Полученную суспензию центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10-15 минут и надосадочная жидкость используется в качестве вируссодержащего материала.

Рис. 3. Заражение куриных эмбрионов

1.3.3. Заражение в аллантоиную полость

Для заражения берут эмбрионы 10-11-дневного возраста. Основные этапы заражения:

1. Яйцо помещают на подставку тупым концом кверху и проводят стерилизацию скорлупы над воздушным пространством.

2. В центре тупого конца делают прокол скорлупы с помощью препаровальной иглы.

3. В отверстие вводят иглу шприца, содержащего разведение вируса. Иглу продвигают в вертикальном направлении на 2-3 мм ниже уровня воздушного мешка и затем вводят 0,1-0,2 мл материала.

4. Отверстие в скорлупе заделывают с помощью расплавленного стерильного парафина.

Заражённые эмбрионы выдерживают в термостате обычно в течение 2 суток. Перед вскрытием яйца помещают на ночь в холодильник при 4 0 С. Вскрытие производится в следующем порядке:

1. Яйцо устанавливается на подставке так, чтобы воздушный мешок находился наверху, скорлупу над ним стерилизуют.

2. С помощью ножниц скорлупу срезают немного выше границы воздушного пространства.

3. Осторожно удаляют пинцетом скорлупную оболочку, после чего хорионаллантоисную оболочку прокалывают пастеровской пипеткой в том месте, где нет сосудов, и насасывают аллантоисную жидкость.

4. Аллантоисную жидкость переносят в стерильную пробирку, а часть засевают в бульон для проверки на бактериологическую стерильность.

Дата добавления: 2015-04-15 ; просмотров: 10 ; Нарушение авторских прав

Сайт СТУДОПЕДИЯ проводит ОПРОС! Прими участие :) - нам важно ваше мнение.

Вирусы – облигатные внутриклеточные паразиты. Они размножаются в живых клетках и не растут на искусственных питательных средах, поэтому методы культивирования вирусов отличаются от методов культивирования бактерий.

1. На лабораторных животных. Заражают животных (подкожно, внутримышечно, внутрибрюшино), которые чувствительны к определенным вирусам: хорьков - вирусом гриппа, кроликов - вирусом бешенства, обезьян - вирусом полиомиелита. Индикация (обнаружение) вируса проводится по признакам заболевания. Недостаток метода - не все вирусы можно культивировать на животных, например, животные невосприимчивы к вирусам человека.

2. В куриных эмбрионах. Заражают куриный эмбрион (аллонтоисная полость, хорион-аллонтоисная оболочка, амниотическая полость, желточный мешок, сам эмбрион). Куриный эмбрион – очень удобен. Он защищен от попадания других микробов (стерильный), техника работы с ним проста, можно накопить большое количество вирусов. Индикация: а) по специфическим поражениям на хорион-аллантоисной оболочке, по гибели эмбриона, б) по реакции склеивания эритроцитов – реакции гемагглютинации (РГА). Недостатки метода: а)не все вирусы (вирус полиомиелита, вирус ящура) можно вырастить в куриных эмбрионах; б) невозможно обнаружить микроб без вскрытия эмбриона; в) в нем много загрязняющих белков и других соединений.

3. В тканевых культурах. Тканевые культуры или клеточные культуры – клетки, выращенные вне организма на искусственных питательных средах. Для их приготовления используют чаще всего эмбриональные и опухолевые ткани. Метод тканевых культур разработан Дж. Эндерсом в 50-е годы. Большинство вирусов способно размножаться в культурах клеток. Для каждого вируса можно подобрать наиболее чувствительную культуру клеток.

Бывают культуры растущих тканей и переживающих тканей (утративших способность к росту).

Существуют три типа растущих тканевых культур:

а) однослойныетканевые культуры – клетки прикрепляются и растут в виде сплошного монослоя по поверхности стекла лабораторной посуды;

б) культуры суспензированных клеток – клетки растут и размножаются во взвешенном состоянии;

в) органные культуры - кусочки органов животных и человека, выращиваемые вне организма.

Однослойные культуры – основные культуры. Различают: а) первичные – клетки этой культуры делятся один раз, поэтому каждый раз необходимо вновь получать культуру ткани; чаще всего используют эмбриональные ткани и опухолевые ткани взрослого человека;

б) полуперевиваемые – клетки делятся до 50 раз, сохраняя диплоидный набор хромосом; их можно перевивать несколько раз; используют диплоидные клетки человека (фибробласты человеческого эмбриона, диплоидные клетки легких человека);

в) перевиваемые – клетки культуры постоянно делятся в условиях in vitro (вне организма), поэтому их можно перевивать непрерывно; их готовят из линий клеток, которые хорошо размножаются в течение многих лет; чаще всего эти культуры получают из опухолевых клеток. Получено около 200 штаммов таких клеток: штамм L (из культуры мышиных фибробластов), штамм HeLa (из карциномы шейки матки), штамм Hep-3 (из лимфоидной карциномы) и т.д.

Первичные и перевиваемые линии клеточных культур могут быть загрязнены неизвестными вирусами, в том числе онкогенными, это ограничивает их применение, особенно в производстве вакцин.

Все работы с культурами клеток требуют строжайшего соблюдения правил асептики. К культуре клеток добавляют антибиотики против бактериального загрязнения.

Способы обнаружения (индикации) вирусов в тканевой культуре.

Вирусы можно обнаружить следующим образом.

1. По цитопатическому действию (ЦПД). В результате размножения вирусов в клетках происходят морфологические изменения клеток (вакуолизация цитоплазмы, деструкция митохондрий, округление клеток). Часть клеток погибает и отслаивается от стекла. Вместо сплошного монослоя остаются отдельные клеточные островки. ЦПД обнаруживают под микроскопом (´8). По ЦПД можно не только обнаружить, но и идентифицировать вирусы. Например, вирус полиомиелита вызывает мелкозернистую деструкцию клеток; аденовирусы вызывают образование скоплений клеток в виде виноградных гроздьев; вирус кори вызывает образование симпластов – многоядерных клеток.

2. Пообразованию включений. Включения - скопления вирусов в клетках. Они имеют различную форму и размеры. Их окрашивают по Романовскому-Гимзе или флюорохромами и наблюдают под микроскопом.

3. Погемадсорбции. Клетки, зараженные вирусами, могут адсорбировать эритроциты. Вирусы выходят на поверхность клеток и связывают эритроциты. Эритроциты добавляют к культуре и через некоторое время промывают физиологическим раствором. На поверхности клеток под микроскопом видны прилипшие эритроциты в виде разнообразных фигур;.

4. Пореакция гемагглютинации. Гемагглютинация - склеивание эритроцитов под влиянием вирусов. Эритроциты добавляют к культуральной жидкости. Если в ней есть вирусы, то эритроциты склеиваются.

5. По"цветной" реакции. Клетки культуры выращиваются на жидкой среде с индикатором (метиленовым красным). Индикатор изменяет цвет (с красного на желтый) под действием кислых продуктов метаболизма при росте нормальных клеток. Если клетки заражены вирусом, то нормальный метаболизм нарушается, кислые продукты не образуются и индикатор не изменяет цвет. Таким образом, признаком размножения вирусов в клетках культуры является сохранение красного цвета среды.

Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет

Читайте также:

• Как ребенку не заболеть гриппом свиным гриппом
• Айр доктор блокатор от вирусов комаровский
• Вирус коксаки в беларуси
• Бешенство в ярославской области 2020
• Антибактериальные и противовирусные капли для глаз для детей

Читайте также: Антигенная структура вирусов гриппа и ее изменчивость, роль в эпидемическом и пандемическом распространении гриппа. Механизмы естественного и приобретенного иммунитета. Ареалы распространения вирусов. В Германии, Австрии, Японии, в некоторых постсоциалистических и развивающихся странах действуют смешанные модели, вобравшие в себя разные черты англосаксонской и континентальной. Взаимодействие вируса с клеткой. Репродукция (размножение) вирусов. Взаимодействие вирусов с восприимчивой клеткой. Строгий паразитизм и цитотропизм вирусов и факторы, его обуславливающие. Клеточные и вирусспецифические рецепторы. Виды вирусов сознания. Виды компьютерных вирусов и вредоносных программ. Вирусологический — заражение куриных эмбрионов, культур клеток почек зеленых мартышек (Vero) и собак (МДСК) Вирусы, их природа, происхождение. Методы культивирования вирусов. ВОПРОС 91. ОТВЕТСТВЕННОСТЬ ЗА НЕЗАКОННОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ЗАПРЕЩЕННЫХ К ВОЗДЕЛЫВАНИЮ РАСТЕНИЙ, СОДЕРЖАЩИХ НАРКОТИЧЕСКИЕ ВЕЩЕСТВА (СТ.231 УК).