Метод определения напряженности при ящуре
Текст ГОСТ 25384-82 Животные сельскохозяйственные. Методы лабораторной диагностики ящура
ЖИВОТНЫЕ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫЕ
МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ЯЩУРА
ГОСТ 25384-82 (СТ СЭВ 2597-80)
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ПО СТАНДАРТАМ
РАЗРАБОТАН Министерством сельского хозяйства СССР ИСПОЛНИТЕЛЬ
ВНЕСЕН Министерством сельского хозяйства СССР
Член Коллегии А. Д. Третьяков
УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 11 августа 1982 г. № 3155
УДИ 636:576.8.07:006.354 Группа С79
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР
ЖИВОТНЫЕ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫЕ Методы лабораторной диагностики ящура
Domestic animals. Methods of laboratory diagnostics of foot-and-mouth disease
Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 11 августа 1982 г. № 3155 срок действия установлен
с 01.01.83 до 01.01.88
Несоблюдение стандарта преследуется по закону
Настоящий стандарт распространяется на крупный и мелкий рогатый скот, свинейг верблюдов, а также на все виды диких парнокопытных и мозоленогих животных, восприимчивых к ящуру, и устанавливает методы лабораторной диагностики ящура.
Стандарт предназначается для научно-исследовательских учреждений, республиканских и областных (краевых) ветеринарных лабораторий.
Стандарт полностью соответствует СТ СЭВ 2597—80.
1. МЕТОДЫ ОТБОРА ПРОБ
1.1. Для проведения диагностических исследований на ящур отбирают стенки и содержимое афт (лимфа) на слизистой оболочке языка (у крупного рогатого скота), на пятачке (у свиньи), на коже венчика и межпальцевой щели (у крупного и мелкого рогатого скота, свиней, верблюдов и др.). При отсутствии афт отбирают пробы крови в момент температурной реакции у животных, а из трупов молодняка всех видов животных — лимфатические узлы головы и заглоточного кольца, поджелудочную железу и мышцу сердца.
Для проведения ретроспективных диагностических исследований на ящур отбирают пищеводно-глоточную слизь. Отбор пищеводно-глоточной слизи производят в любое время после предполагаемого заболевания животных.
1.2. Для проведения диагностики серологическим методом отбирают не менее 5 г стенок или содержимого афт. Масса проб остальных материалов, предназначенных для выделения вируса ящура и его последующей идентификации, должна быть не менее 10 г.
При невозможности получения указанных количеств проб допускается отбирать максимально возможное количество патологического материала для проведения последующей расплодки вируса в культурах клеток.
1.3. Пробы патологического материала без признаков разложения помещают во флаконы с завинчивающимися или притертыми пробками и замораживают, а при отсутствии условий замораживания— заливают консервирующей жидкостью. Для консервирования стенок и содержимого афт используют консервирующую жидкость, состоящую из равных объемов нейтрального глицерина и забуференного 0,15 М раствора хлористого натрия или среды для культивирования клеток (без сыворотки). Пробы остального патологического материала консервируют растворами антибиотиков с широким спектром действия или глицерин-фос-фатным буфером.
1.4. Флаконы с пробами снабжают этикеткой с указанием вида животных, наименования патологического материала и его количества, консерванта, времени отбора и адреса отправителя. Флаконы с пробами помещают в небьющийся контейнер со льдом или хладоносителем и доставляют на исследование в возможно короткий срок, но не позднее 48 ч с момента отбора. Если пробы могут быть доставлены в течение 6—12 ч с момента отбора, замораживание и консервация проб не обязательны.
1.5. Поступившие на исследование стенки афт освобождают от консервирующей жидкости отмыванием в 2—3 сменах стерильного 0,15 М раствора хлористого натрия или среды для культивирования клеток, взвешивают, измельчают сначала ножницами, а затем в ступке с песком или с помощью гомогенизатора и смешивают в соотношении 1:1 или 1:2 с 0,15 М раствором хлористого натрия. Полученные 50 или 33% суспензии выдерживают в течение 20 мин при температуре 4°С, а затем очищают 20% (по объему) хлороформа или флюорокарбона в течение 5—7 мин и осветляют центрифугированием с частотой вращения 3000 об/мин в течение 15 мин.
1.6. Содержимое афт (лимфа) разбавляют равным количеством 0,15 М раствора хлористого натрия и подвергают очистке и осветлению в соответствии с п. 1.5.
1.7. Пробы лимфоузлов, мышцы сердца, поджелудочной железы и свернувшейся крови сначала обрабатывают в соответствии с п. 1.5, а затем разбавляют средой для культивирования клеток.
Полученные суспензии при невозможности немедленно использовать для постановки биопробы замораживают и хранят при температуре минус 20°С.
1.8. Суспензии, полученные в соответствии с пп. 1.5 и 1.6, делят на три неравные части. Меньшую из них (около 1 см 3 ), предназначенную для вирусологических исследований (постановки биопробы), консервируют антибиотиками и хранят при температуре минус 20°С. Другую часть (2—3 см 3 ), предназначенную для исследования в РСК, прогревают при температуре 56°С в течение 40 мин, а оставшуюся (1,5—2 см 3 )—хранят без прогревания. Перед постановкой РСК обе эти пробы центрифугируют в течение 20 мин с частотой вращения 3500—4000 об/мин.
2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Серологический метод
Сущность метода заключается в обнаружении специфического антигена того или иного типа и варианта вируса ящура непосредственно в материале, полученном от животных с клиническими признаками заболевания, с помощью реакции связывания комплемента (РСК).
2.1.1. Ап п а р а ту р а, материалы и реактивы
2.1.1.1. Для проведения исследования применяют: центрифугу настольную с угловым ротором и частотой вращения до 5000 об/мин;
центрифугу рефрижераторную; холодильник с температурой минус 20°С; холодильник с температурой от 0 до 8°С; гомогенизатор;
баню водяную или термостат;
шкаф сушильный с регулируемой температурой в диапазоне от 100 до 200°С;
электрофотоколориметр или спектрофотометр; пробирки стеклянные по ГОСТ 10515—75; пластинки (панели) для микросерологических реакций типа Такачи;
наборы разбавителей и капельниц для микросерологических реакций типа Такачи;
пипетки вместимостью до 10 см 3 с ценой деления 0,01 и 0,1 см 3 по ГОСТ 20292—74;
колбы мерные вместимостью 50, 100 и 200 см 3 по ГОСТ 1770—74;
комплемент морской свинки с титром не более 2,8% по ГОСТ 16446—78;
гемолизин кроличий к эритроцитам барана с титром 1 :8000 по ГОСТ 16446—78;
эритроциты барана в виде дефибринированной крови, смешанной с равным объемом консерванта;
сыворотки морских свинок семи типов и актуальных для стран—членов СЭВ вариантов вируса ящура с титром в РСК не ниже 1 :20;
антигены ящурные эталонные семи типов и актуальных для стран—членов СЭВ вариантов вируса с титром в РСК не ниже 1 :4;
сыворотки и антигены для лабораторной диагностики везикулярных заболеваний свиней;
кислоту борную дважды перекристаллизованную;
глюкозу по ГОСТ 975—75; натрий хлористый по ГОСТ 4233—77; магний хлористый по ГОСТ 4209—77, х. ч.; кальций хлористый по ГОСТ 4460—77, х. ч.; среду питательную для культивирования клеток с 0,5% гидролизата лактальбумина (pH 7,4—7,6);
хлороформ по ГОСТ 20015—74 или флюорокарбон-113; консервант для эритроцитов; приготовленный следующим образом: последовательно растворяют в 100 см 3 дистиллированной воды 6 г глюкозы, 4,5 г борной кислоты, дважды перекристалли-зованной, и 0,85 г хлористого натрия. Полученный раствор стерилизуют кипячением в течение 3 дней по 30 мин;
раствор буферный веронал-мединаловый концентрированный, приготовленный следующим образом: растворяют в 1000 см 3 кипящей дистиллированной воды 83 г хлористого натрия, 18,4 г веронала, 1,15 г хлористого магния и 0,22 г хлористого кальция. Раствор охлаждают, затем растворяют 0,22 г мединала, стерилизуют автоклавированием и хранят при температуре 4°С. Рабочий раствор готовят непосредственно перед постановкой РСК разбавлением концентрированного раствора четырьмя объемами дистиллированной воды.
2.1.2. Подготовка к исследованию
2.1.2.1. Суспензии стенок и содержимого афт, полученные в соответствии с пп. 1.5, 1.6 и 1.8, разводят с 1:2 до 1:32 0,15 М раствором хлористого натрия, вероналовым буфером или средой для культивирования клеток и разливают в серологические пробирки по 0,1 см 3 или в лунки панелей для микросерологических реакций по 0,025 см 3 . Число пробирок (лунок), заполняемых каждым разведением исследуемой суспензии, должно быть равно числу штаммоспецифических сывороток и контролей на антикомпле-ментарность и гемолитические свойства.
2.1.2.2. Для приготовления гемолитической системы эритроциты барана трехкратно отмывают от консерванта 0,15 М раствором
хлористого натрия, каждый раз осаждая их центрифугированием с частотой вращения 600 об/мин в течение 5—7 мин и готовят рабочую суспензию смешиванием 2 см 3 осадка с 98 см 3 разбавителя. К полученной суспензии эритроцитов при постоянном перемешивании приливают постепенно равный объем гемолизина, разведенного 0,15 М раствором хлористого натрия с таким расчетом, чтобы его конечное разведение было в 4 раза концентрированнее предельного гемолитического титра, указанного на этикетке. Затем суспензию выдерживают в течение 15—20 мин в водяной бане при температуре 37°С или при комнатной температуре.
При постановке РСК на панелях для микрореакций концентрацию эритроцитов в гемсистеме увеличивают в 2 раза.
2.1.2.3. Для приготовления рабочего разведения комплемента содержимое нескольких ампул с сухим препаратом растворяют в первоначальном объеме дистиллированной воды, определяют предельный титр, обусловливающий гемолиз 50 % ! эритроцитов гемсистемы, приготовленной согласно п. 2.1.2.2, и разводят 0,15 М раствором хлористого натрия или вероналовым буфером из расчета 5 СН50 в 0,1 см 3 (если РСК ставят в пробирках) или в 0,025 см 3 (при постановке РСК на панелях для микрореакций).
2.1.2.4. Рабочие разведения типоспецифических ящурных сывороток готовят на 0,15 М растворе хлористого натрия или веро-наловом буфере из расчета получения раствора в 2 раза более концентрированного, чем их предельный титр, т. е. они должны содержать 2 сывороточных единицы (СЕ). Вариантноспецифические сыворотки разводят до предельного титра. Вместо типоспецифических сывороток могут быть использованы вариантноспецифические в предельном, двух- и четырехкратном титрах (1, 2 и 4 СЕ).
2.1.2.5. Рабочие разведения эталонных (контрольных) ящурных антигенов готовят на 0,15 М растворе хлористого натрия или веро-наловом буфере. Они должны быть в 2 раза концентрированнее, чем их предельный титр, т. е. должны содержать 2 антигенных единицы (АЕ).
2.1.2.6. Рабочие разведения сывороток и антигенов для лабораторной диагностики везикулярных заболеваний сельскохозяйственных животных готовят по пп. 2.1.2.4 и 2.1.2.5.
2.1.3. Проведение исследования
2.1.3.1. В пробирки (лунки), заполненные в соответствии с п. 2.1.2.1, вносят равные объемы штаммоспецифических сывороток, взятых в рабочем титре, и рабочего разведения комплемента, содержащие 5 СН50. В контролях исследуемого патологического материала на антикомплементарность заменяют сыворотки равным объемом разбавителя, а в контроле на гемолитические свойства — разбавителем заменяют и комплемент. Все полученные смеси тщательно встряхивают и помещают в водяную баню или тер
мостат при 37°С на 30 мин, после чего к ним добавляют суспензию эритроцитов, сенсибилизированных гемолизином, в объеме 0,2 см 3 (пробирки) или 0,05 см 3 (лунки), энергично встряхивают и выдерживают при 37°С в течение 20 мин.
Пробирки или панели извлекают из термостата или водяной бани и осаждают эритроциты центрифугированием в течение 5 мин с частотой вращения 600 об/мин или отстаиванием в течение 2—3 ч при комнатной температуре.
При исследовании недоброкачественных афтозных материалов, а также при исследовании сердечной мышцы объем исследуемых суспензий увеличивают в 4 раза при сохранении объема и концентрации остальных компонентов реакции в обычных пределах.
Для повышения чувствительности РСК применяют реакцию длительного связывания комплемента (РДСК), при которой первая фаза протекает при 4°С в течение 16—20 ч.
2.1.4. Обр аботка результатов
Оценку результатов проводят визуально.
Реакцию считают положительной, если в ряду пробирок (лунок) с какой-либо штаммоспецифической сывороткой отмечается задержка гемолиза не менее 50% эритроцитов при полном гемолизе в параллельных рядах с другими штаммоспецифическими сыворотками и в контроле с пробами патологического материала на антикомплементарность. Возбудитель относится к тому варианту вирусов ящура, с сывороткой которого титр исследуемой суспензии окажется выше.
Отрицательная реакция не исключает ящура или иного сходного с ним заболевания, поскольку концентрация вирусоспецифического антигена в исследуемом материале может оказаться слишком низкой для обнаружения в РСК.
2.2. Методы выявления вируса
Сущность методов заключается в выявлении биологического действия вируса на восприимчивые и чувствительные биологические системы и его последующей идентификации серологическим методом.
2.2.1. Аппаратура, материалы и растворы
2.2.1.1. Для проведения исследования применяют:
термостат с температурой нагрева 37°С;
пипетки вместимостью до 10 см 3 с ценой деления 0,01 см 3 по ГОСТ 20292—74;
культуры монослойные первичных клеток почки свиней (СП), телят, взрослого крупного рогатого скота (ВП) и ягнят (ПЯ) и перевиваемых линий ВНК-21 и IB-RS-2 в пробирках и флаконах вместимостью 50, 100, 500 и 1000 см 3 ;
среду питательную для культивирования клеток с 0,5% гидролизата лактабумина (pH 7,4—7,6);
среду питательную Игла для культивирования клеток перевиваемых линий;
раствор Хенкса солевой, pH 7,2—7,4.
2.2.2. Подготовка к исследованию
2.2.2.1. Суспензии стенок и содержимого афт, полученные в соответствии с пп. 1.5, 1.6 и 1.8, и оказавшиеся неактивными в РСК, а также суспензии лимфатических узлов, сердечной мышцы, поджелудочной железы, свернувшейся крови и пищеводноглоточную слизь, полученные в соответствии с пп. 1.7 и 1.9, используют для заражения монослойных культур первичнотрипсинизирован-ных клеток (СП, ВП, ПЯ, щитовидной железы крупного рогатого скота), перевиваемых линий (ВНК-21 и IB-RS-2), десять мышат 3—6-дневного возраста и пять морских свинок. Допускается заражение двух голов крупного рогатого скота в 18-месячном возрасте и четырех поросят 3-месячного возраста, не содержащих в крови специфических антител.
2.2.3. П р о в едение исследования
2.2.3.1. Проведение биопробы на культурах клеток
Отбирают пробирки (флаконы) с хорошо сформированным
монослоем без признаков старения и неспецифической дегенерации. На каждую пробу исследуемого материала берут по 10 пробирок или по 2—3 флакона с перечисленными клеточными культурами. Непосредственно перед инокуляцией культуры дважды отмывают от ростовой питательной среды раствором Хенкса. Затем в пробирочные культуры вносят по 0,1—0,2 см 3 , а во флаконы от 0,5 до 10 см 3 (в зависимости от площади монослоя) исследуемых суспензий. Инокулированные культуры выдерживают в термостате при температуре 37°С в течение 60 мин, затем освобождают от исследуемой суспензии и заливают поддерживающей питательной средой. Одновременно ставят контроль на цитотоксичность раствора Хенкса. Инокулированные контрольные культуры помещают в термостат при температуре 37°С и в течение 7 дней проводят микроскопию для выявления дегенерации клеток. В случае обнаружения дегенерации только в инокулированных культурах проводят дополнительный пассаж культуральной суспензии, полученной после однократного промораживания культур с дегенерацией монослоя при температуре минус 20°С. Полученную при этом суспензию осветляют центрифугированием в течение 15 мин с частотой вращения 3000 об/мин и затем заражают исходные культуры в том же порядке, который предусмотрен для исследуемых суспензий проб патологического материала.
Специфичность дегенерации клеток проверяют в РСК.
2.2.3.2. Постановка биопробы на животных
Биопробу ставят на морских свинках, мышатах 3—6-суточного возраста и естественно-восприимчивых к ящуру животных.
Используют клинически здоровых особей, в анамнезе которых полностью исключены предварительные контакты с вирусом ящура. Мышатам исследуемую суспензию инокулируют подкожно в дозе 0,1 см 3 , морским свинкам — в кожу подушечек обеих задних конечностей методом тунелирования в дозе 0,2—0,5 см 3 . Крупному рогатому скоту материал вводят в толщу эпителия языка и в мякиши всех конечностей в дозе 2—3 см 3 . За инокулированными животными наблюдают в течение 7 дней. В случае гибели подопытных мышат проводят дополнительный пассаж материала, приготовленного из тушек павших мышат, и исследование в РСК в соответствии с п. 2.1.
При появлении у остальных видов животных везикулярных поражений кожи в местах инокуляции исследуемого материала отбирают пробы содержимого афт в соответствии с п. 1.2, готовят из них суспензии в соответствии с пп. 1.5 и 1.6 и исследуют в РСК в соответствии с п. 2.1.
2.2.4. О б р а б о т к а результатов
2.2.4.1. Пробу исследуемого патологического материала считают отрицательной, если во втором и последующем пассажах не будет отмечено дегенерации клеток и падежа белых мышат, а при исследовании полученных из них суспензий в РСК не будет обнаружен антиген вируса ящура.
Ящур - острое вирусное заболевание из группы антропозоонозов (инфекционных болезней животных, которыми болеет также и человек), характеризующееся интоксикацией и везикулезно-эрозивным (пузырьково-язвенным) поражением слизистых оболочек ротовой и носовой полостей, а также кожи межпальцевых складок и околоногтевого ложа, а у животных- межкопытной щели.
Ящур довольно широко распространен среди животных. В ряде стран заболевание носит характер эпизоотии (эпидемий среди животных), повторяющихся через определенные промежутки времени. Наиболее подвержены инфекции молодые парнокопытные сельскохозяйственные животные (крупный рогатый скот, свиньи, козы, овцы, олени). От неё могут страдать также лошади, верблюды, собаки, кошки и грызуны. У животных, перенесших заболевание, и некоторых птиц установлено вирусоносительство, проявляющееся выделением возбудителя с испражнениями. ящур патологический инфекционный
Инфекционный процесс у парнокопытных характеризуется тяжелым течением с вирусемией, афтозными высыпаниями и изъязвлениями в области слизистых оболочекполости рта, языка, носоглотки, носа, губ, на коже в межкопытных щелях, на вымени, иногда около рогов. Общая продолжительность болезни у животных - от 10 до 15 дней, продолжительность инкубационного периода - 2-- 4 дня. При злокачественном течении ящура, особенно у коров, более чем у 50 % заболевших животных наступает смертельный исход в течение 2--3 суток.
Взятие патологического материала.
Основной путь инфицирования людей - через сырое молоко больных животных и продукты его переработки, реже через мясо. У лиц, непосредственно контактирующих с больными животными, возможна прямая передача инфекции (при доении, уходе, лечении, убое), воздушно-капельный путь заражения (при дыхании, кашле животных), а также через предметы, загрязненные их выделениями. Описаны случаи внутрилабораторного инфицирования.
Отбор материала для прижизненной диагностике. В зависимости от вида инфекции у клинически больных животных берут соответствующий, специфический для данной болезни материал, соблюдая меры личной безопасности.
Моча чаще всего служит объектом исследования при подозрении на лептоспироз. У коров и свиноматок мочу можно брать непосредственно из мочевого пузыря с помощью катетера или собирать при естественном мочеиспускании в чистые пробирки, банки. Легче всего мочу получать после утреннего подъема животных, а у свиней - в любое время дня после 1 . 2-часового лежания.
Кал берут из прямой кишки в стерильную посуду, которую закрывают плотной крышкой. При обнаружении на стенке прямой кишки слизи, утолщений или других патологических изменений дополнительно делают соскобы; их помещают в отдельную посуду.
Выделения из верхних дыхательных путей и ротовой полости собирают в посуду при естественном истечении или поступают так:
Крылья носа и переднюю часть носовых ходов обмывают водой, после чего выделения собирают стерильными тампонами из глубоких частей носа. Тампоны помещают в стерильные пробирки, содержащие по 0,5 мл стерильного физиологического раствора.
Материал из язв и ран получают методом соскоба на границе пораженной и здоровой тканей.
Отбор материала для посмертной диагностики. Патологический материал необходимо взять как можно раньше: не позднее 12ч после гибели животного зимой и 6 ч - в теплое время года, законсервировать или отправить в свежем виде. Аутолизированный пат-материал для выделения возбудителя непригоден.
Для вирусологического исследования материалом могут служить:
Кровь или ее сыворотка, смывы из носоглотки и другие жидкости организма, стенки и содержимое афт, папулы (узелки), везикулы (серозные пузырьки), пустулы (гнойные пузырьки), кусочки головного мозга, печени, легких, селезенки или кусочки других органов и тканей, в которых вирус предполагаемого заболевания содержится в наибольшем количестве.
Для гистологического исследования патматериал берут только от свежих трупов. В лабораторию отправляют кусочки площадью 3. 4 см 2, толщиной не более 1 см, при этом следят, чтобы в них вошли пораженные и граничащие с ними неизмененные участки ткани.
Трупы мелких животных, части трупов крупных животных и отдельные органы в свежем виде направляют для исследования в лабораторию только нарочным. Посылаемый материал тщательно упаковывают в плотный деревянный или металлический ящик, чтобы предупредить рассеивание возбудителя по пути следования.
Консервирование патологического материала. Полученные пробы отправляют в лабораторию в свежем виде; если невозможно отправить в течение ближайших 24. 30 ч, то их фиксируют в консерванте.
Для вирусологического исследования материал консервируют 50% - м глицерином на стерильном физиологическом растворе Наилучший и простой метод сохранения биологических свойств вирусов в патматериале - охлаждение. Надежно закрытые (флаконы заворачивают в вату или упаковочную бумагу и плотно укладывают в термос, заполненный на 1/3 снегом или льдом. При этом в термосе в течение 12. 24 ч удерживается температура 2 6 "С, при которой вирусы сохраняются практически без изменений.
Выделение вируса. Эффективность выделения вируса из патологического материала повышается при использовании методов очистки и концентрирования вируссодержащих суспензий. Благодаря удобству выполнения, экономичности, а главное, возможности быстрого получения результатов, позволяющих одновременно определить типовую и вариантную принадлежность эпизоотического вируса, чаще всего применяют РСК или РДСК. Однако, когда доставленное количество вирусного материала недостаточно для исследования или РСК дает отрицательный результат или неспецифическую задержку гемолиза, то ставят биопробу на КРС (не менее 2 голов) в возрасте 18 мес, вводя 0,1 мл суспензии полученного материала в несколько точек слизистой оболочки языка и мякишей конечностей; общий объем испытуемого материала 2-3 мл. Появление афт на месте введения материала с последующим подтверждением в РСК свидетельствует о наличии ВЯ. Однако метод дорог и связан с опасностью выноса вируса за пределы учреждения. Поэтому в диагностической практике он применяется очень редко. Чаще для биопробы используют мышат-сосунков 4-6-дн возраста, морских свинок массой не менее 500 г и первичную культуру клеток почек телят, поросят, ягнят, щитовидной железы КРС и перевиваемые клетки - ВНК-21, IB-RS-2. Биопроба на мышах удобна и экономична. ИД 50 испытуемого штамма на мышатах-сосунах и крупном рогатом скоте одинаковы. Мышата-сосуны более чувствительны к вирусу ящура, чем морские свинки. Однако необходимо иметь в виду, что оценка результатов титрования на мышатах-сосунках нередко затруднительна.
Морские свинки легко заражаются при интрадермальном введении вируссодержащего материала в плантарную поверхность задних лапок методом тунелирования в дозе 0,2-0,5 мл. Заражают не менее 5 голов. Первичные поражения обычно появляются через 2-5 дн (по мере созревания). Вторичные поражения - везикулы в ротовой полости - обычно развиваются при заражении штаммами, адаптированными к морским свинкам.
Для выделения вируса чаще всего используют культуру первично-трипсинизированных клеток почек свиней или телят. Наблюдение за инфицированными культурами клеток ведут 7 дн, микроскопируя их ежедневно. Специфическая дегенерация клеток при подтверждении её специфичности в РСК свидетельствует о наличии ВЯ в испытуемом материале.
Индикация и идентификация вируса
В качестве экспресс-метода в настоящее время широко применяется ПЦР. Эго быстрый и чувствительный метод обнаружения ВЯ в тканях путем энзиматической амплификации РНК гена полимеразы.
РСК по 100%-ному гемолизу. Применяется для определения типов и подтипов (вариантов) ВЯ, вызвавших заболевание животных, а также для проверки производственных штаммов ВЯ при изготовлении вакцин и лабораторных штаммов в научно- исследовательской работе.
Антигенное родство (R) более 70% свидетельствует о том, что штаммы по антигенным свойствам идентичны друг другу и относятся к одному и тому же варианту, от 10 до 70% - к различным вариантам (подтипам) и менее 10%- к различным типам.
РСК по 50%-ному гемолизу. Успешно применяют в работе научно-исследовательских лабораторий и учреждений биологической промышленности. Разработан способ изучения иммунного статуса вакцинированных против ящура животных в РСК. Он позволяет специалистам на уровне областных ветлабораторий проводить мониторинг за иммунным состоянием стад в простой и достоверной реакции.
РПГА. Это простой, ускоренный, чувствительный метод идентификации ВЯ. По чувствительности реакция превосходит общепринятый метод типировання ВЯ в РСК в 8-16 раз. Сущность её заключается в том, что нагруженные АТ эритроциты агглютинируются при контакте с ящурным АГ гомологичного типа.
Определение типа ВЯ методом перекрестного иммунитета. Испытание перекрестного иммунитета на КРС с целью определения типовой принадлежности полевого штамма ВЯ проводится лишь в том случае, если по лабораторным тестам обнаруживается новый тип ВЯ, ранее не встречавшийся в стране. Определение типа ВЯ методом перекрестного иммунитета возможно и на морских свинках.
Штаммы считают идентичными, если вакцина предохраняет животных от развития генерализованного процесса при заражении используемыми штаммами. В случае иммунологического отличия штаммов вакцинированные животные, инфицированные гетерологичным штаммом, заболевают генерализованной формой ящура.
При определении в культуре леток типа ВЯ его относят к тому типу, сыворотка против которого предотвращает ЦПД. Разработан вариант универсальный эритроиммуноадсорбции (УЭИА), позволяющий определять АГ ВЯ в более высоких титрах, чем в РСК и РПГА.
ИФА. Высокоэффективен для выявления как 146S-, так и 12Б-компонентов ВЯ. Этот метод в 500 раз чувствительнее РСК при исследовании проб афтозного эпителия. Установлена высокая степень специфичности и чувствительности ELISA для идентификации и ти- пирования ВЯ всех 7 серотипов в эпителиальных тканях. Установлена высокая чувствительность сэндвич-варианта ИФА (на основе щелочной фосфатазы), который по эффективности превосходит в 207-219 раз, а с хромогенными субстратами - в 4-64 раза.
ИФА может быть пригодной в системе лабораторной диагностики ящура при исследовании диагностических штаммов. Для выявления АТ к ВЯ в ИФА можно использовать пробы крови, высушенной на фильтровальной бумаге. Первоначальный объем гепаринизиро- ванной крови равен 7,65 мкл.
Серодиагностика и ретроспективная диагностика
Ретроспективная диагностика с целью определения типа и варианта ВЯ, вызвавшего в прошлом заболевание животных, основана на идентификации АТ в РПСК, РДП и РРИД, НРИФ, реакции серозащиты на мышатах и PH в культуре клеток.
Для достоверного выявления АТ и определения их типовой специфичности пробы сыворотки крови должны быть взяты не ранее 7 дн с момента появления у животных признаков везикулярного заболевания или проведения вакцинации. На исследование следует направлять 5-10 проб сыворотки от каждой возрастной группы. На партию проб сыворотки, направляемой для исследования, оформляют сопроводительный документ.
Выявление, идентификация типовой специфичности и количественное определение АТ к ВЯ в РРИД, РПСК, РНСК и НИФ могут проводиться в условиях обычных ветеринарнодиагностических лабораторий и не требует создания более строгого санитарного режима, поскольку проводятся с неинфекционными материалами.
Для обнаружения ингибиторных (неполных) АТ применяют РНСК (или РПСК). Эти АТ отличаются высокой авидностью. Они формируют комплекс АГ-АТ, не адсорбирующий комплемент. Связываясь с АГ быстрее полных АТ, они блокируют его, но не связанный при этом комплемент в присутствии гемолитической сыворотки вызывает лизис эритроцитов. Ингибиторные АТ обнаружены сейчас при многих инфекциях, в том числе при ящуре. Данная реакция применяется для определения типов ВЯ по сывороткам переболевших животных, а также для обнаружения постинфекционных и поствакцинальных АТ.
Типироваиие ВЯ по сывороткам переболевших животных в РДП. В реакции используют: АГ из очищенного и концентрированного лапинизированного В Я типов 0, А, С и др.; сыворотки от переболевших ящуром животных (не пригодны для исследования в РДП сыворотки крови животных, дважды переболевших ВЯ различных типов), типоспецифические сыворотки; агаровая среда.
Постановка реакции: в центральные лунки 7-ми 6-угольных систем на агаровых пластинках помещают соответствующие АГ типов 0, А, С и др. В периферические лунки помещают пробы испытуемых и контрольных сывороток. Затем пластинки выдерживают во влажной камере при 37°С. Реакцию учитывают через 16, 24, 48 и 72 ч после постановки. Положительная реакция характеризуется образованием одной или двух четких линий преципитации между лункой с АГ и сывороткой. ВЯ относят к тому типу, с АГ которого испытуемая сыворотка дает положительную реакцию. В случае обнаружения в сыворотках пре- ципитирующих АТ к 2 и более типам вирус относят к тому типу, с АГ которого испытуемые сыворотки дают наибольший процент положительных реакций.
РРИД. Сущность её заключается в формировании зоны специфической преципитации вирусных антигенов антителами, включенными в состав агарового геля. Реакция является типоспецифичной, позволяет провести исследования по типированию и количественному определению постинфекционных и поствакцинальных АТ.
Компоненты реакции: 1) антигены эталонные 7 типов ВЯ и других везикулярных болезней (ВБС 0-72 и Т-75, ВЭС А-48 и С-72, ВС Индиана и Нью-Джерси); 2) сыворотки эталонные 7 типов ВЯ и других везикулярных болезней (ВБС 0-72 и Т-75, ВЭС А-48 и С-72, ВС Индиана и Нью-Джерси); 3) агар белый или импортный фирм "Серва" или "Дифко", азид натрия или кислота карболовая, вода дистиллированная, БФР с pH 7,2-7,4. АТ, обнаруженные в испытуемой пробе сыворотки, относят к тому серотипу, с АГ которого они дали положительную реакцию. Их предельным титром считают максимальное разведение испытуемой сыворотки, с которым наблюдается положительная реакция. Титры сыворотки, полученные от вакцинированных животных, зависят от активности использованной вакцины, кратности и сроков ее применения и физиологических характеристик животного (возраст, вид). У 1- кратно вакцинированного против ящура взрослого КРС обычно титры через 30-90 дн после введения вакцины находятся в диапазоне 1:20-1:80, а после 2-кратной иммунизации в эти же сроки титр возрастает до 1:80-1:160. Титр у молодняка, как правило, в 2-3 раза ниже, чем у взрослых животных. У свиней и овец титры ниже, чем у КРС. После переболевания животных титры значительно выше, чем после вакцинации, и обычно превышают 1:160.
Встречный ИЭФ. Может быть с успехом использован для серотипирования ВЯ. Чувствительность его такая же, как и РДП, но учет результатов производится через 1,5 ч, тогда как реакция иммунодиффузии требует не менее 24 ч.
НИФ. При ящуре позволяет проводить дифференциацию АТ переболевших животных от вакцинированных. В справочнике "Диагностика вирусных болезней животных", 1992 г. приводится подробная методика постановки данной реакции при яшуре. Выявление в НИФ специфического свечения свидетельствует о наличии в испытуемой сыворотке постинфекци- онных антител, т.е. о переболевании животного ящуром.
С помощью РНГ А определяют напряженность поствакцин ального иммунитета у КРС. Установлена корреляция результатов, полученных при РПГА и PH. С помощью монАТ в PH или ELISA определяют не нейтрализуемые варианты ВЯ. В зависимости от чувствительности к монАТ все варианты ВЯ разделены на 3 группы. Варианты 1-й группы имели мутации преимущественно в области 140-160 VP1; варианты 2-й и 3-й групп мутируют в области 204 VP1 и 70, 139, 195 VP3 соответственно. Определены две большие АГ зоны вируса: чувствительная и нечувствительная к трипсину (VP1 140-160 и VP3 соответственно).
Реакция серозащиты на мышатах-сосунах. Используется для определения типа ВЯ по сывороткам животных-реконвалесцентов. Для постановки реакции используют эталонные (адаптированные к организму 4-7-дн мышат-сосунов) штаммы ВЯ различных типов. Штаммы должны быть типоспецифическими и иметь титр на мышатах-сосунах не ниже 7 lg в 1 г.
ВЯ, вызвавший заболевание животных, относят к тому типу, при заражении которым привитые сывороткой мышата остались живы. Необходимым условием достоверной оценки реакции серозащиты является обязательная гибель контрольных мышат, которым введен вирус, в то время как контрольные мышата, которым вводили только испытуемую сыворотку, должны выжить.
PH в культуре клеток. Для постановки PH необходимо иметь 24 пробирки культур клеток. Отсутствие ЦПД в пробирках, в которые внесена смесь вируса с сывороткой, при четко выраженном ЦПД в контрольных пробирках, указывает на наличие в исследуемой сыворотке АТ против данного типа ВЯ. Специфичность ЦПД можно установить путем исследования в РСК культуральной жидкости, полученной из пробирок с выраженным ЦПД.
Дифференциальная диагностика. При дифференциальной диагностике ящура необходимо исключить ВС, ВБС, ВЭС, катаральную лихорадку овец. Для дифференциальной диагностики в лабораториях используют диагностические наборы, выпускаемые биологической промышленностью, для ящура и ВБС.
Иногда в материале от людей, подозреваемых в заболевании яшуром, выделяли возбудителя энтеровирусной инфекции человека - вирус Коксаки серотипа В. Вирус вызывал видимое ЦПД в перевиваемых культурах клеток в течение 24 ч, имея икосаэдрическую форму, размером 20-30 нм и вызывал гибель мышат при интрацеребральном заражении.
Читайте также:
