Диагностика вирусных инфекций растений
Метод индикаторный растений
Метод индикаторных растений — является очень распространенным методом диагностики вирусных и вироидных болезней и идентификации их возбудителей. В основу метода индикаторных растений положено использование растений-индикаторов, которые, в большинстве случаев дают четкие и специфичные симптомы, характерные для определённого вида патогена. Травянистые растения-индикаторы заражают механической инокуляцией соком, в результате заражение может проявляться в виде местных некрозов, изменением окраски и угнетением роста.
Для вируса аспермии томата в качестве индикатора используют молодые растения табака (Nicotiana glutinosa), для диагностики Х-вируса картофеля — амарант шаровидный (Gomphrena globosa). Для выявления заражённости томата вироидом веретеновидности клубней картофеля в качестве индикаторов используют скополию (Scopolia sinensis) или чувствительные сорта томата. В ряде случаев для заражения можно использовать отдельные изолированные листья растений-индикаторов. Соконепереносимые вирусы прививают на индикаторные растения различными методами. В редких случаях, чтобы для передачи вируса
используют насекомых-преносчиков и растение-паразит повилику.
Метод основан на реакции преципитации (образование осадка) между специфичными антителами и белками (антигенами) возбудителя заболевания. Метод серологической диагностики неприменим для идентификации вироидов из-за отсутствия белкового компонента, а также для ряда соконепереносимых вирусов со слабыми иммуногенными свойствами. Для идентификации вирусов в растении могут использоваться следующие модификации серологической диагностики:
1) Иммуноферментный анализ (ИФА) – наиболее высокочувствительный метод, который позволяет получать количественные оценки. В его основе лежит специфическое распознавание поверхностных антигенов вируса антителами, в присутствии ферментов. Данный метод широко используется на практике для идентификации вирусов сельскохозяйственных культур, подходит для серийных анализов.
2) Капельный метод. Проводится следующим образом. На предметном стекле каплю сока растения смешивают с каплей антисыворотки. Через пару минут проводят оценку реакции под микроскопом при малом увеличении в темном поле или даже визуально, без микроскопа.
3) Метод двойной диффузии – проводится в агаровом геле, для определения сферических и других мелких вирусов. Проводится по такой методике, в одни лунки, которые вырезаны в слое агаровой среды, добавляют антисыворотку, а в другие – очищенный сок растения. В геле вирусные частицы и антитела дифундируют друг другу на встречу, и в месте встречи образуют отчетливые линии преципитации в случае их комплиментарной специфичности.
4) Метод радиальной иммунодиффузии. При использовании данного метода антисыворотку добавляют непосредственно в агаровую среду, при этом лунки заполняют соком растений. Реакция является положительной, если вокруг лунок образуются преципитаны в форме колец.
5) Метод адсорбции. Метод основан на том, что перед реакцией с антигеном антитела связывают каким-либо инертным материалом с крупными частицами, например, латексом. При реакции с антигеном происходит хорошо заметная агглютинация всего комплекса.
Метод электронной микроскопии
На ультратонких срезах пораженных тканей растений, при помощи электронных микроскопов можно определить строение, форму и даже размеры вирусов или вироидов. Электронный микроскоп нередко используют в сочетании с серологическими методами (иммуноэлектронная микроскопия), при этом можно обнаруживать вирусные частицы с наслоившимися антителами. Метод электронной микроскопии используется крайне редко из-за высокой стоимости оборудования и реактивов, сложности выделения вирусов и вироидов, окисления срезов растений и ряда других факторов.
В настоящее время понятие иммунитет растений формулируется как проявляемая им невосприимчивость к болезням в случае непосредственного контакта их (растений) с возбудителями, способными вызвать данную болезнь при существовании необходимых для заражения условий.
Наряду с полной невосприимчивостью (иммунитетом) различают также очень сходные между собой понятия – устойчивость или резистентностьи выносливость или толерантность.
Устойчивыми (резистентными) считают те растения (виды, сорта), которые поражаются болезнью, но в очень слабой степени.
Выносливостью (толерантностью)называют способность больных растений не снижать свою продуктивность (количество и качество урожая или снижать ее настолько незначительно, что практически это не ощущается)
Восприимчивость (поражаемость) – неспособность растений противостоять заражению и распространению патогена в его тканях, т.е. способность заражаться при контакте с достаточным количеством инфекционного начала при соответствующих внешних условиях.
У растений имеются все перечисленные типы проявления иммунитета.
Иммунитет (невосприимчивость) растений к болезням может быть врожденными передаваться по наследству. Такой иммунитет называется естественным.
Врожденный иммунитет может быть активный и пассивный.
Активным иммунитетом называют свойство растений активно противостоять возбудителю. Сюда относят антитоксические реакции растений, образование защитных некрозов (участков отмершей ткани вокруг паразита
Пассивный иммунитет - это свойство растений препятствовать развитию паразита независимо от наличия инфекции. Он связан с анатомо-морфологическими, физико-химическими, физиолого-биохимическими и другими особенностями растений (наличие воскового налета, толщина кутикулы, химический состав растений, осматическое давление, реакция клеточного сока, наличие физиологически активных веществ, эфирных масел, фитонцидов и т.д.). Однако такое деление иммунитета на категории условно.
Наряду с естественным иммунитетом растениям может быть свойственен приобретенный (искусственный) иммунитет - свойство растений не поражаться тем или иным возбудителем, приобретенное растением в процессе онтогенеза.
Приобретенный иммунитет может быть инфекционный, если возникает у растения в результате выздоровления от болезни.
Неинфекционный приобретенный иммунитет может быть создан с помощью специальных приемов под влиянием обработки растений или семян иммунизирующими средствами. Этот тип иммунитета имеет большое значение в практике защиты с.х. растений от болезней.
Повышение устойчивости растений к болезням с помощью искусственных приемов называют иммунизацией, которая может быть химической и биологической.
Химическая иммунизациязаключается в использовании различных химических веществ, способных повышать устойчивость растений к болезням. В качестве химических иммунизаторов используют удобрения, микроэлементы, антиметаболиты. Приобретенный неинфекционный иммунитет может быть создан путем использования удобрений. Так, увеличение дозы калийных удобрений повышает лёжкость корнеплодов в период хранения.
Биологическая иммунизациязаключается в использовании в качестве иммунизаторов других живых организмов или продуктов их жизнедеятельности (антибиотиков, ослабленных или убитых культур фитопатогенных организмов и т.д.).
Устойчивость растений может быть достигнута обработкой их вакцинами – ослабленными культурами патогенов или экстрактами из них.
37.Болезни растений, вызываемые мучнисторосяными грибами. Источники инфекции.
Порядок Настоящие мучнисторосяные, или Эризифальные (Erysiphales). Мучнисторосяные грибы — высокоспециализированные облигатные паразиты высших растений, вызывающие болезнь, называемую мучнистой росой.
Мицелий белый или серый, позднее часто темнеющий, многоклеточный, с одним или несколькими ядрами, поверхностный, прикрепляющийся к субстрату с помощью аппрессорий, от которых отрастают гифы, проникающие с помощью гаусторий в ткани растения. У грибов из рода филлактиния (Phyllactinia) мицелий полуэндофитный. Основная его масса развивается на поверхности субстрата и одновременно отдельные ветви проникают через устьица в ткани листа. У грибов из рода левейллула (Leveillula) вначале образуется исключительно эндофитный мицелий, глубоко проникающий внутрь тканей питающего растения и распространяющийся по межклетникам. Впоследствии такой эндофитный мицелий выходит через устьица на поверхность субстрата, где развивается обильное конидиальное спороношение.
В конце вегетации на тех же растениях у мучнисторосяных в результате полового процесса развиваются шаровидные, белые, потом коричневые клейстотеции с различными наружными выростами или придатками. Придатки удерживают на мицелии незрелые плодовые тела, а после созревания способствуют их соединению в рыхлые комки, легко переносимые ветром. Мучнисторосяные грибы классифицируютсяпо форме придатков, а также по числу сумок в клейстотециях. Сумки бывают по одной или в виде пучков, шаро- или эллипсовидные, без выводного отверстия и ггарафиз, с 2 — 8 аскоспорами. За счет повышения осмотического давления клейстотеций разрывается, сумки растрескиваются и споры выбрасываются из них на некоторое расстояние. Таким образом, в жизненном цикле этих грибов имеются две стадии — конидиальная (бесполая, или анаморфная) и половая (сумчатая, или телеоморфная).
Мучнисторосяные грибы распространены повсеместно. Они зарегистрированы более чем на 10000 видах растений-хозяев.
В основе диагностики вирусного заболевания лежат в первую очередь внешние симптомы. Внешними признаками при определении вирусного заболевания можно ограничиться в тех случаях, когда они очень четки и характерны только для данного вида заболевания.
Пример такой конвергенции — хлороз плодовых деревьев или ягодных культур. Он может быть инфекционным, вызванным вирусами, и физиологическим, связанным с недостаточным поступлением в растение азота, железа, серы и т. д. Мозаичная расцветка листьев на огурце может быть следствием и вирусного поражения и дефицита марганца.
Применяют следующие методы диагностики вирусных заболеваний и вызывающих их вирусов:
1) установление инфекционного заболевания;
2) метод растений-индикаторов;
3) серологический метод;
4) электронная микроскопия;
5) метод включений;
6) метод люминесцентного анализа;
7) анатомический метод;
8) химический метод.
Основными из них являются первые четыре метода.
Для всех вирусов, которые удается передать соком на травянистые индикаторы, очень важный показатель при диагностике - определение физических свойств вируса по установлению трех констант:
1) температура инактивации вируса (предельно высокая температура, при которой вирус инактивируется invitroв течение 10 мин);
2) границы разведения (степень предельного разведения сока больного растения, при которой еще сохраняется его инфекционность);
3) длительность сохранения инфекционного сока.
Установление инфекционности заболевания. Все вирусные заболевания заразные, инфекционные. В зависимости от вида вируса как причины заболевания и его свойств (стойкости вируса, способов его распространения в естественных условиях и т. д.) для установления инфекционности применяют следующие способы заражения.
Инокуляциясокомбольногорастения. Этот метод пригоден для передачи на здоровые растения только тех вирусов, которые относятся к группе мозаик и могут распространяться механическим путем.
Передачавируснойинфекциипрививками. Больной привой прививают на здоровый подвой, или наоборот.
Передачавирусовс помощьюнасекомых-переносчиков.Для передачи вирусов используют виды насекомых, специфичные для данного вида вируса. Насекомых (заведомо свободных от вируса особей) выдерживают в течение определенного времени на больных растениях, а затем переносят на здоровые. Всю работу проводят в условиях строгой изоляции растений от заражения извне.
Пересадкарастений. В некоторых случаях для подтверждения или опровержения вирусной природы заболевания прибегают к пересадке растения на новое место. Так поступают, например, при определении характера хлороза малины. Если причиной хлороза были плохие почвенные условия, то у растений, пересаженных на заведомо благоприятную почву, восстанавливается через определенное время (иногда уже через 3—4 недели) нормальный зеленый вид. При вирусном хлорозе растения от такой пересадки не выздоравливают.
Методрастений-индикаторов основан на использовании растений, дающих очень четкую реакцию, строго специфичную только по отношению к определенному виду вируса. Так, для вируса табачной мозаики хорошим индикаторным растением является Nicotianaglutinosa.
Серологический метод основан на том, что вирусы, как и бактерии, грибы, а также белки животных и растений введены в кровь теплокровного животного (кролика, барана, лошади), способны вызывать накопление в плазме крови животного специфических видоизмененных белков, получивших название антител (вещества, вводимые в организм животного и вызывающие в нем образование антител, называют антигенами). Выделенные из крови животного и соответствующим образом очищенные антитела являются строго специфичными, т. е. обладают способностью реагировать (давать положительную реакцию) только с тем антигеном, который был введен в тело животного и по отношению, к которому получена антивирусная сыворотка.
Реакция между антигеном и специфическими антителами, содержащимися в сыворотке, носит название серологической реакции (отсюда и название метода — серологический).
В практике широко применяется капельный серологический метод, разработанный М. С. Луниным и Н. Н. Поповой (1937 г.).
Метод электронной микроскопии основан на изучение формы, строения и размеры вирусных частиц.
Метод включений. Развитие большинства вирусов в клетке сопровождается образованием в ней специфических внутриклеточных отложений, или, как их называют, вирусных включений. В одних случаях это скопления (кристаллы, паракристаллы и т. п.) самих вирусных частиц, в других — образования, состоящие из элементарных частиц вируса и аморфного вещества клетки. Каждому виду вируса свойственна своя форма вирусных включений.
Внутриклеточные вирусные включения образуются в большинстве случаев в клетках волосков или эпидермиса листьев и могут быть обнаружены в обычный биологический микроскоп.
Контрольные вопросы
1. Симптомы вирусных заболеваний.
2. Характеристика передачи вирусной инфекции прививками.
3 . На чем основан серологический метод.
4 . На чем основан метод электронной микроскопии.
Литература
1.Фитопатология: Учебник/ М.И. Дементьева. - М.: Колос, 1977. - 366 с. - (Учебник. и учеб. пособия для высших с.-х. учебных заведений).
2.Яковлева Н.П. Фитопатология программированное обучение.Изд.2-е,допол.: Учеб.для студентов высших учебных заведений., М.: Колос,1992. – 382с.
3.Попкова К.В. Общая фитопатология.- М.: 2005.
Лекция №11. Возбудители болезней растений.
1. МИКОПЛАЗМЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2. ЦВЕТКОВЫЕ РАСТЕНИЯ
МИКОПЛАЗМЫ (ФИТОПЛАЗМЫ)
Фитоплазмы — специфическая группа фитопатогенных организмов, занимающих промежуточное положение между бактериями и вирусами. Клетки круглые, но некоторые имеют удлиненную или гантелеобразную форму. Диаметр клеток — 0,1 — 1 мкм.
Фитоплазмы не имеют настоящей клеточной стенки, и поэтому не имеют постоянной формы, окружены трехслойной элементарной мембраной, чем и отличаются от бактерий.
По сравнению с вирусами для них характерны клеточное строение и способность размножаться на искусственных питательных средах. На плотных средах они образуют мелкие специфические колонии. В отличие от вирусных частиц, в клетках фитоплазм присутствуют два типа нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) и рибосомы, по размерам близкие к рибосомам бактерий. Фитоплазмы, в отличие от бактерий, устойчивы к пенициллину, но по сравнению с вирусами чувствительны к тетрациклину.
По существующей классификации фитоплазмы объединены в класс Mollicutes. На основании пищевых потребностей выделены 2 порядка: Mycoplasmatales - представители которого нуждаются в холестерине, Acholeplasmatales, для которых он не является необходимым. Наиболее известными заболеваниями, вызываемыми возбудителями этой группы, являются стабборн цитрусовых (Citrusstubborn), карликовость кукурузы (Cornstunt) и кокосовой пальмы (Cocosstunt). Среди наиболее вредоносных заболеваний, вызываемых фитоплазмами из порядка Acholeplasmatales, можно отметить столбур томатов, курчавую мелколистность шелковицы, филлодию клевера. Эти микроорганизмы способны проникать в ткани растений непосредственно через корневую систему и вызывать специфические изменения морфогенеза
Последнее изменение этой страницы: 2016-04-06; Нарушение авторского права страницы
Визуальная диагностика — наиболее простой метод. Хотя в ряде случаев и удается достоверно установить вирусную природу заболевания по его внешним признакам (например, кольцевые или линейные хлоротичные узоры на молодых листьях), их идентификация затруднена частым бессимптомным характером развития болезней. Так, большинство промышленных сортов земляники являются скрытыми носителями вирусной инфекции. С другой стороны, вирусные симптомы сходны с симптомами неинфекционных болезней, вызванных недостатком (избытком) макро- и микроэлементов (азота, магния, железа, меди, хлора). Действие гербицидов, регуляторов роста на растения при неправильном применении также может быть сходно по симптоматике с вирусными болезнями. Поэтому визуальная диагностика требует дополнительных методов исследований.
При диагностике вирусных заболеваний требуется установить инфекционность заболевания. Для этого вирус нужно передать на здоровое растение. Чтобы определить вирусы, распространяющиеся контактно-механическим способом, проводят инокуляцию соком больного растения. Для этого растительный материал растирают в ступке, из растертой массы отжимают сок, фильтруют и осторожно втирают в лист молодого здорового растения. Через определенное время (5—20 дней) наблюдают за развитием симптомов. Универсальный метод передачи вирусной инфекции — прививка, когда больной привой (черешок листа, верхушка побега) прививают на здоровый подвой. Редко для передачи вирусов используют насекомых-пере- носчиков и растение-паразит — повилику.
Метод индикаторных растений — широко распространенный метод диагностики вирусных болезней и идентификации вирусов. Он основан на использовании тест-растений (индикаторных растений), дающих четкие, часто строго специфичные по отношению к определенному виду вируса симптомы. Заражение травянистых растений- индикаторов осуществляют механической инокуляцией соком. Симптомы проявляются в виде местных некрозов, реже системной реакцией (изменением окраски, угнетением роста). Для вируса аспермии томата в качестве индикатора можно использовать молодые растения табака (Nicotiana glutinosa), для диагностики Х-вируса картофеля — амарант шаровидный (Gomphrena globosa). В редких случаях для заражения используют отдельные изолированные листья растений- индикаторов. Соконепереносимые вирусы переносят на индикаторные растения методом прививки. Так, для диагностики вирусов земляники используют прививку черешком листа на индикаторные клоны земляники лесной (Fragaria vesca).
Несмотря на то, что это довольно длительный, экономически затратный и трудоемкий метод идентификации вируса (нужны теплицы, семена многих растений и др.), конечный результат (характер симптомов) является довольно точным и является одним из основополагающих критериев отличия вирусов друг от друга по биологическим свойствам.
Серологический метод широко распространен при диагностике вирусов. Если теплокровному животному, например кролику, ввести в кровь очищенный препарат растительного вируса, иммунный аппарат животного в ответ на введение чужеродного белка (антигена) начнет вырабатывать специфичные к этому белку антитела, связывающие его. С помощью специальных методик эти антитела можно выделить из сыворотки и использовать для определения вирусов непосредственно в соке растения. Разработаны методы, которые позволяют вырабатывать антитела из культуры in vitro клеток животного. В результате реакции между антителом и антигеном образуется осадок (преципитат, или серум), различимый визуально или с помощью микроскопа. В основе связи антиген—антитело лежит принцип ключа и замка, т.е. она очень специфична. Каждое определение необходимо проводить в присутствии соответствующего контроля.
Разработано несколько модификаций метода.
Метод электронной микроскопии дает возможность быстро получить информацию о наличии вирусных частиц в растении. С помощью электронных микроскопов в ультратонких срезах пораженных частей растений можно установить форму, строение и даже размеры вирусов. Трансмиссионный электронный микроскоп используют для серийных анализов вирусной инфекции в соке им- муноэлектронной микроскопией, при которой можно обнаруживать вирусные частицы с наслоившимися антителами.
Метод гель-электрофореза основан на электрофоретическом разделении предварительно очищенных нуклеиновых кислот вируса (вироида) или его белкового компонента в полиакриламидном (агарозном) геле при силе тока 3 и 6 мА с последующим окрашиванием красителем зон соответственно нуклеиновых кислот или белков. При сравнении высоты полученных окрашенных линий с высотой стандартных, или маркерных, зон определяют массу (соответственно и размеры) вирусных структур.
Молекулярно-генетические методы основаны на знании строения молекулы РНК вируса или вироида. Отличаются высокой надежностью, чувствительностью, быстротой, пригодны для серийной диагностики. К недостаткам относятся высокая стоимость реактивов и оборудования для проведения методов, а также необходимость предварительного изучения генетических кодов патогенов.
Метод ДНК-зондов — другая модификация молекулярно-биологического метода, также основана на принципе комплементарности видоспецифичных последовательностей нуклеиновых кислот. Синтезируют специфические к РНК вируса или вироида зонды, которые представляют собой комплементарные цепи ДНК (кДНК), полученные с помощью обратной транскриптазы вируса миелобластоза птиц, затем их метят радиоактивным фосфором (Р 32), вводят в бактерии
К методу пересадки растений на другой участок прибегают для подтверждения или опровержения вирусной природы заболевания. Например, для определения причин хлороза растений их можно пересадить на заведомо благоприятную почву. Если заболевание неинфекционное, то через некоторое время у растений восстановится типичная зеленая окраска. При вирусном заболевании хлороз сохранится.
Метод включений. Развитие некоторых вирусов в клетках растения сопровождается образованием в них скопления вирусных частиц (включений, или кристаллов Ивановского), которые обнаруживаются с помощью обычного светового микроскопа. Каждому виду вируса свойственна своя форма вирусных включений, образующихся обычно в клетках волосков или эпидермиса листьев. Например, для вируса табачной мозаики характерны игловидные и гексагональные кристаллы; для Х-вируса картофеля и вируса мозаики пшеницы типично образование сферических аморфных тел.
Для выявления зеленой крапчатой мозаики огурца, скручивания листьев картофеля и некоторых других болезней применяют химические аналитические методы диагностики в пораженных тканях растений.
Визуальная диагностика. Хотя в ряде случаев и удается достоверно установить вирусную природу заболевания по внешним признакам (например, кольцевые или линейные хлоротичные узоры на молодых листьях), их идентификация затруднена в связи с бессимптомным (латентным) характером развития болезней. Симптоматика зависит от состояния организма, агрессивности штамма патогена, внешних условий и продолжительности пребывания вируса в клетках хозяина. Например, симптомы заболевания отчетливо выражены у растений, росших на ярком свету и при умеренной температуре, при высокой температуре и недостаточном освещении симптоматика заболевания может быть совсем не выражена.
Посветление жилок самых молодых листьев нередко является одним из первых признаков системной вирусной инфекции. Жилки становятся желтыми и полупрозрачными. Листья, образующиеся позже, могут быть мозаичными, крапчатыми или совсем желтыми (хлоротичными).
Инкубационный период заболевания зависит от вида вируса, растения хозяина и условий среды, но, в любом случае, он составляет несколько дней или недель.
Если первые симптомы вироза заметны на рассаде, то источник инфекции находился либо в семенах, либо заражение произошло при посредстве переносчика. Если зараженные растения расположены в культуре совершенно случайно или же только в рядках, посаженных из одной партии, то это говорит о том, что, скорее всего, был заражен посадочный материал. Если на отдельных участках поля обнаруживаются заболевшие растения, причем появление зараженных участков связано с почвенными различиями, имеются все основания предполагать распространение вирусов через почву.
Хотелось бы отметить также, что существуют симптомы, напоминающие поражения вирусами, но вызванные другими причинами. Сходные симптомы поражения имеют фитоплазмы и некоторые бактерии. Точечные некрозы, вызванные поражениями растений тлями и клещами, также нередко путают с вирозами, например, большая картофельная тля вызывает скручивание, деформацию и местный хлороз листьев огурца. К появлению симптомов, сходных с вирусной инфекцией, часто приводят обычные нарушения минерального питания (например, связанные с дефицитом железа). Различные деформации органов могут вызывать гербициды гормональной природы.
Таким образом, точная идентификация по внешним признакам поражения вирусами невозможна, однозначный ответ может быть получен только с использованием инструментальных методов (иммуноферментный анализ, PCR-анализ и т.д.).
Метод индикаторных растений является широко распространенным методом диагностики вирусных болезней и идентификации вирусов. Он основан на использовании тест-растений (индикаторных), дающих четкие, часто строго специфичные по отношению к определенному виду вируса, симптомы. Заражение травянистых растений-индикаторов осуществляют механической инокуляцией соком. Заражение проявляется в виде местных некрозов, реже системной реакцией (изменением окраски, угнетением роста). Для вируса аспермии томата в качестве индикатора можно использовать молодые растения табака (Nicotiana glutinosa), для диагностики Х-вируса картофеля – амарант шаровидный (Gomphrena globosa). В ряде случаев для заражения можно использовать отдельные изолированные листья растений-индикаторов. Соконепереносимые вирусы переносят на индикаторные растения методом прививки, так для диагностики вирусов земляники используют прививку черешком листа на индикаторные клоны земляники лесной (Fragaria vesca). Редко для передачи вирусов используют насекомых–переносчиков и растение-паразит повилику.
Серологическая диагностика. Если теплокровному животному ввести в кровь очищенный препарат растительного вируса, иммунный аппарат животного в ответ на введение чужеродного белка (антигена) начнет вырабатывать специфические к нему антитела, связывающие антиген. В результате реакции образуется осадок (преципитат, или серум), различимый визуально или с помощью микроскопа.
Практическое значение для идентификации вирусов в растении имеют следующие модификации:
1. Капельный метод, при котором на предметном стекле каплю антисыворотки смешивают с каплей сока растения, и через несколько минут оценивают реакцию под микроскопом при малом увеличении в тёмном поле или даже визуально без микроскопа.
2. Для определения сферических и других мелких вирусов используют метод двойной диффузии в агаровом геле. При этом в одни лунки, вырезанные в слое агаровой среды, добавляют антисыворотку, а в другие очищенный сок растения. Антитела и вирусные частицы диффундируют в геле навстречу друг другу и образуют в месте встречи отчетливые линии преципитации.
3. При использовании метода радиальной иммунодиффузии антисыворотку добавляют непосредственно в агаровую среду, а лунки заполняют соком, в случае положительной реакции вокруг лунок образуются преципитаты в форме колец.
4. Метод адсорбции основан на том, что перед реакцией с антигеном антитела связывают каким-либо инертным материалом с крупными частицами, например, латексом. При реакции с антигеном происходит хорошо заметная агглютинация всего комплекса.
5. Наиболее высокочувствительной, позволяющей получать количественные оценки модификацией является иммуноферментный анализ (ИФА), основанный на связывании антител определёнными метками — ферментами. В лунки микроплаты из полимерных материалов добавляют антисыворотку и очищенный сок, содержащий антитела, между ними происходит первая иммунная реакция. Затем на фиксированный комплекс антиген-антитело наносят раствор антител, связанных ферментом (фосфатаза или пероксидаза), при этом меченные ферментом антитела наслаиваются на детерминанты молекул антигена, и происходит вторая иммунная реакция. После добавления соответствующего ферментного субстрата происходит ферментная реакция по каталитическому расщеплению субстрата, что обнаруживается с помощью фотометра по цветной реакции.
Метод электронной микроскопии. С помощью электронных микроскопов в ультратонких срезах поражённых частей растений можно установить форму, строение и даже размеры вирусов. Трансмиссионный электронный микроскоп используют для серийных анализов вирусной инфекции в соке иммуноэлекгронной микроскопией, при которой можно обнаруживать вирусные частицы с наслоившимися антителами.
Метод гель-электрофореза. Этот метод основан на электрофоретическом разделении предварительно очищенных нуклеиновых кислот вируса (вироида) или его белкового компонента в геле при силе тока 3 и 6 мА с окрашиванием зон соответственно нуклеиновых кислот или белков. При сравнении полученных окрашенных линий с высотой стандартных маркерных зон определяют массу (соответственно и размеры) вирусных структур.
Метод ДНК-зондов основан на принципе комплементарности нуклеиновых кислот. Синтезируют зонды, которые узнают определённые нуклеотидные последовательности РНК вируса. В зависимости от выбора зондов можно дифференцировать группы, виды и даже штаммы вирусов.
Молекулярно-биологический метод основан на знании строения молекулы РНК вируса. Наиболее распространённым тестом является амплификация (умножение) видоспецифичных последовательностей РНК в ходе полимеразной цепной реакции (PCR). При этом отдельные фрагменты РНК, специфичные только для одного вида или группы родственных вирусов, многократно с помощью ферментов размножают, при этом их количество превышает исходное число копий выбранного фрагмента РНК в миллионы раз. Далее их обнаруживают методом электрофореза в геле или методом иммунофлуоресценции.
Частные методы исследований. Метод включений. Развитие некоторых вирусов в клетках растения сопровождается образованием в ней скопления вирусных частиц (включений, кристаллов Ивановского), которые обнаруживаются с помощью обычного светового микро скопа. Каждому виду вируса свойственна своя форма вирусных включений, образующихся обычно в клетках волосков или эпидермиса листьев. Например, для вируса табачной мозаики характерны игловидные и гексагональные кристаллы; для Х-вируса картофеля типично образование сферических аморфных тел.
Для выявления зелёной крапчатой мозаики огурца, скручивания листьев картофеля и некоторых других применяют химические аналитические методы диагностики.
Дата добавления: 2016-01-09 ; просмотров: 1631 ; ЗАКАЗАТЬ НАПИСАНИЕ РАБОТЫ
Читайте также:
