Цыбалова людмила марковна грипп
Какие вирусы пожалуют в нашу страну теперь и чего от них ждать? Будет ли новая эпидемия гриппа, и если да, то можно ли уберечься от ее последствий?
Со всеми этими вопросами мы решили обратиться к заместителю директора НИИ гриппа Минздравсоцразвития России Людмиле Марковне Цыбаловой.
Эпидемии быть?
Людмила Цыбалова: – Вирус гриппа обладает большой изменчивостью, поэтому делать прогнозы по его поводу можно с некоторой долей условности. Но тем не менее можем успокоить читателей: в предстоящем эпидемическом сезоне заболеваемость гриппом и ОРВИ ожидается средней интенсивности. Такие выводы нам, в частности, позволяет сделать анализ уже закончившегося в странах Южного полушария эпидемического сезона, который носил весьма умеренный характер. Как мы ожидаем, в нынешнем сезоне на территории России будут циркулировать вирусы гриппа A (H3N2 и того самого пандемического, H1N1), а также вирусы гриппа В (преимущественно Викторианской разновидности). Но поскольку пресловутый вирус H1N1 уже знаком нашей иммунной системе, в этом сезоне его разрушительная сила значительно ослабеет. Мы ожидаем, что он будет по уровню заболеваемости, выраженности клинической картины носить обычный для гриппа последних лет характер. Впрочем, это не значит, что к гриппу теперь можно относиться легкомысленно. Не следует забывать, что это опасное заболевание, чреватое серьезными осложнениями.
Л. Ц.: – В настоящее время происходит характерный сезонный рост заболеваемости ОРВИ в ряде субъктов Российской Федерации. Вирусы гриппа, в том числе вирусы пандемического гриппа, на данный момент не выделены.
Прививки безопасны
Л. Ц.: – В состав сезонной вакцины вошли рекомендованные ВОЗ три штамма вирусов гриппа – A (H1N1), A (H3N2) и вирус гриппа В. Именно эти штаммы были выделены в прошедшем эпидемическом сезоне в странах Северного и Южного полушарий. Как известно, прививка стимулирует образование в организме человека антител против вируса гриппа, благодаря чему эта мера способна снижать частоту заболеваемости гриппом в среднем в два раза. У привитых людей, даже если они заболеют, болезнь протекает легче и не приводит к развитию осложнений.
Л. Ц.: – Восприимчивость людей к вирусам гриппа абсолютна. Наиболее высокие показатели заболеваемости в эпидемические подъемы приходятся на детей и молодежь. Вакцинация является наиболее эффективной мерой борьбы с этим заболеванием для всех групп граждан, но прежде всего она необходима людям, входящим в группы риска развития заболевания (дети и молодые люди, а также работники здравоохранения, образования и сферы услуг) и развития осложнений (лица с соматическими заболеваниями, хроническими инфекциями, а также в возрасте старше 60–65 лет). В 2010 году эти контингенты риска смогут пройти вакцинацию бесплатно (за счет федерального бюджета). На эти цели государство в нынешнем году потратило свыше 1 млрд руб. Все остальные могут сделать прививку в частном порядке, обратившись в специализированные клиники.
Чем лечиться
Л. Ц.: – Для гриппа характерно очень быстрое развитие клинических симптомов. Температура тела достигает максимальных значений (39–40 °C) уже в первые 24–36 часов. Появляется головная боль, которая локализуется преимущественно в лобно-височной области, человеку становится больно даже двигать глазами, у него возникает светобоязнь, боль в мышцах и суставах, нередко бывает тошнота или рвота, может снижаться артериальное давление. Сухой болезненный кашель и заложенность носа появляются, как правило, уже через несколько часов от начала болезни. Типичным для гриппа является развитие трахеита, сопровождающееся болезненным сухим кашлем. Поражение нервной системы при гриппе связано с токсическим действием вируса, вызывающим функциональные расстройства, вплоть до серозного менингита и менингоэнцефалита. Поражение нервной системы чаще развивается на 3–5‑й день заболевания: у пострадавшего могут появиться сильная головная боль, рвота, судороги, изменение сознания.
Л. Ц.: – Основной стратегией при лечении гриппа является ранняя противовирусная терапия: чем раньше будет начат прием соответствующих препаратов, тем меньше будет риск развития тяжелых осложнений, которые при гриппе могут присоединяться уже в первые сутки болезни. Противовирусные препараты оказывают максимальный эффект при приеме их в течение первых 48 часов от начала заболевания. Также при гриппе важно пить как можно больше жидкости.
Жаропонижающие средства следует применять только при очень высокой температуре. Не нужно стремиться снижать температуру ниже 38,5 градусов, ведь она является своего рода защитной реакцией организма, возникающей на воздействие вируса. Однако хотелось бы напомнить, что самолечение гриппа возможно только в самые первые часы заболевания, до прихода врача. Анализ всех смертельных исходов этого заболевания показал, что к трагическому финалу приводило либо позднее обращение к врачу, либо запоздалая госпитализация. Легкомысленного отношения к себе грипп не прощает.
Цыбалова Людмила Марковна
Доктор медицинских наук
Область научных интересов: эпидемиология и профилактика гриппа и других острых респираторных инфекций; разработка противогриппозных вакцин, основанных на консервативных вирусных белках и обладающих широким спектром действия
ФГБУ "НИИ гриппа" Минздрава России
- Подробнее об авторе
- Книги автора
Основные достижения
Разработан единый донор аттенуации и высокой репродуктивности - штамм вируса гриппа А/ Гонконг /1/68/3 5/162. Реассортанты штамма-донора и эпидемических вирусов перспективны для получения , как живых , так и инактивированных вакцин против гриппа . Исследован вирусный геном , картированы гены , определяющие свойства высокой репродуктивности и аттенуации ; универсальный донор внутренних генов для реассортантов и реассортантные штаммы А/СПб/ГК/09 (H1N1) и A/HK/ Astana /6:2/2010 ( H5N1 ), полученные на его основе . Патент РФ № 2511431 (13) 10.04.2014.
Цыбалова Л.М., Горев Н.Е., Репко И.А., Потапчук М.В., Сергеева М.В., Киселев О.И. Штамм вируса гриппа А/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2).
Цыбалова Л.М., Горев Н.Е., Потапчук М.В.,Репко И.А., Коротков А.В., Сергеева М.В., Комиссаров А.Б., Писарева М.М., Кузнецов В.В., Грудинин М.П., Киселев О.И. Характеристика холодоадаптированного штамма вируса гриппа А/Гонконг/1 /68/162/35 как потенциального донора аттенуации и высокой репродуктивности // Вопросы вирусологии. 2012. № 6. С. 13-17.
Показано формирование клеток памяти (CD4+, CD8+) после иммунизации , что наряду с высокой специфической активностью подтверждает перспективность дальнейшей разработки сконструированных белков как кандидатных вакцинных препаратов .
Степанова Л.А., Ковалева А.А., Потапчук М.В., Короткое А.В., Куприянов В.В., Блохина Е.А., Котляров Р.Ю., Цыбалова Л.М. Иммуногенные свойства рекомбинантных белков, включающих эктодомен М2 белка вируса гриппа А // Вопросы вирусологии. 2013. Т. 58. № 3. С. 21-25.
Исследованы иммуногенные и защитные свойства двух вариантов кандидатных вакцинных препаратов , содержащих эктодомен белка М2 вируса гриппа , полученных в растительных системах . Показана высокая специфическая активность М2е-содержащего препарата на основе генома вируса табачной мозаики .
Проведен скрининг по безопасности , иммуногенности и протективности ряда рекомбинантных белков , содержащих консервативный пептид вируса гриппа М2е и белки : коровый вируса гепатита В(НВс) или флагеллин . Определены наиболее активные рекомбинантные белки , оптимальное число копий М2е, место их инсерции в белки-носители НВс или флагеллин , способ введения экспериментальным животным , подобран адьювант .
Изучены особенности формирования системных и местных антител на каждый вариант рекомбинантного белка, длительность сохранения титров антител,
сроки элиминации вирусов гриппа из организма иммунизированных животных.
Под руководством Л.М. Цыбаловой защищено 2 кандидатские диссертации.
Основные публикации, монографии:
Цыбалова Л.М., Киселев О.И. Универсальные вакцины против гриппа . Разработки , перспективы использования // Вопросы вирусологии . 2012. Т. 57. № 1. С. 9-14. Импакт фактор - 0,87.
Цыбалова Л.М., Горев Н.Е., Потапчук М.В., Репко И.А., Короткое А.В., Сергеева М.В., Комиссаров А.Б., Писарева М.М., Кузнецов В.В., Грудинин М.П., Киселев О.И. Характеристика холодоадаптированного штамма вируса гриппа А/ Гонконг /1/68/162/35 как потенциального донора аттенуации и высокой репродуктивности // Вопросы вирусологии . 2012. № 6. С. 13-17. Импакт фактор - 0,87.
Цыбалова Л.М., Карпова Л.С., Комиссаров А.Б., Еропкин М.Ю., Грудинин М.П., Киселев О.И. Эпидемия гриппа A/ H1N1v 2009 года в России // Вестник РАМН . 2011. № 7. С. 30 -36. Импакт фактор 0,421.
3. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств (иммунобиологические лекарственные препараты). Часть вторая. Москва: Гриф и Кб, 2012. Глава 21. Доклинические исследования инактивированных гриппозных вакцин (Составители: Л.М. Цыбалова, Л.А.Степанова, М.В. Потапчук, И.В. Репко, Н.И. Лонская. С. 409-429)
Имеет 5 патентов в вирусологии.
Участие в программах и проектах
Награды
Почетные грамоты Российской Академии наук (2004 г.),
Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (2012 г.).
Котляров Роман Юрьевич – научный сотрудник, кандидат биологических наук.
Равин Николай Викторович – заместитель директора по научной работе, доктор биологических наук.
Цыбалова Людмила Марковна – заместитель директора по научной работе, заведующая отделом вакцинологии, доктор медицинских наук.
1. Huleatt, J.W. Potent immunogenicity and efficacy of a universal influenza vaccine candidate comprising a recombinant fusion protein linking influenza M2e to the TLR5 ligand flagellin / J.W. Huleatt [et al.] / Vaccine. – 2008. – Vol. 26. – P. 201–214.
2. Schotsaert, M. Universal M2 ectodomain-based influenza A vaccines: preclinical and clinical developments / M. Schotsaert [et al.] / Expert. Rev. Vaccines. – 2009. – Vol. 8. – P. 499–508.
3. Kim, M-C. Virus-like Particles Containing Multiple M2 Extracellular Domains Confer Improved Cross-protection Against Various Subtypes of Influenza Virus / M-C. Kim [et al.] / Molecular Therapy. – 2013. – Vol. 21. – P. 485–492.
4. Stepanova, L.A. Protection against multiple influenza A virus strains induced by candidate recombinant vaccine based on heterologous M2e peptides linked to flagellin / L.A. Stepanova [et al.] / PLoS One. – 2015. – Vol. 10. – e0119520.
5. Tsybalova, L.M. Development of a candidate influenza vaccine based on virus-like particles displaying influenza M2e peptide into the immunodominant region of hepatitis B core antigen: Broad protective efficacy of particles carrying four copies of M2e / L.M. Tsybalova [et al.] / Vaccine. – 2015. – Vol. 33. – P. 3398–3406.
6. Taylor, D.N. Induction of a potent immune response in the elderly using the TLR-5 agonist, flagellin, with a recombinant hemagglutinin influenza-flagellin fusion vaccine (VAX125, STF2.HA1 SI) / D.N. Taylor [et al.] / Vaccine. – 2011. – Vol. 29. – P. 4897–4902.
7. Turley, C.B. Safety and immunogenicity of a recombinant M2e-flagellin influenza vaccine (STF2.4xM2e) in healthy adults / C.B. Turley [et al.] / Vaccine. – 2011. – Vol. 29. – P. 5145–5152.
8. Wang, T.T. Broadly protective monoclonal antibodies against H3 influenza viruses following sequential immunization with different hemagglutinins / T.T. Wang [et al.] / PloS Pathog. – 2010. – Vol. 6. – P. e1000796.
9. Ekiert, D.C. A highly conserved neutralizing epitope on group 2 influenza A viruses / D.C. Ekiert [et al.] / Science. – 2011. – Vol. 333. – P. 843–850.
10. Wrammert, J. Broadly cross-reactive antibodies dominate the human B cell response against 2009 pandemic H1N1 influenza virus infection. / J. Wrammert [et al.] / J. Exp. Med. – 2011. – Vol. 208. – P. 181–193.
11. Wang, T.T. Vaccination with a synthetic peptide from the influenza virus hemagglutinin provides protection against distinct viral subtypes / T.T. Wang [et al.] / Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. – 2010. – Vol. 107. – P. 18979–18984.
12. Bommakanti, G. Design of an HA2-based Escherichia coli expressed influenza immunogen that protects mice from pathogenic challenge / G. Bommakanti [et al.] / Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. – 2010. – Vol. 107. – P. 13701–1376.
13. Ameghi, A. Protective immunity against homologous and heterologous influenza virus lethal challenge by immunization with new recombinant chimeric HA2-M2e fusion protein in balb/c mice / A. Ameghi [et al.] / Viral. Immunol. – 2016. – Vol. 29. – P. 228–234.
14. Stepanova, L.A. A Fusion Protein Based on the Second Subunit of Hemagglutinin of Influenza A/H2N2 Viruses Provides Cross Immunity / L.F. Stepanova [et al.] / Acta Naturae. – 2016. – Vol. 8. – P. 116–126.
15. Gong, X. Conserved stem fragment from H3 influenza hemagglutinin elicits cross-clade neutralizing antibodies through stalk-targeted blocking of conformational change during membrane fusion / X. Gong [et al.] / Immunol. Lett. – 2016. – Vol. 172. – P. 11–20.
16. Jegerlehner, A. Influenza A vaccine based on the extracellular domain of M2: weak protection mediated via antibodydependent NK cell activity / A. Jegerlehner [et al.] / J. Immunol. – 2004. – Vol. 172. – P. 5598–5605.
17. Feng, J. Influenza A virus infection engenders a poor antibody response against the ectodomain of matrix protein 2 / J. Feng [et al.] / Virol. J. – 2006. – Vol. 3. – P.102.
18. Khanna, M. Protective immunity based on the conserved hemagglutinin stalk domain and its prospects for universal influenza vaccine Development / M. Khanna [et al.] / BioMed. Res. Int. – 2014. – 2014:546274.
19. Honko, A.N. Flagellin is an effective adjuvant for immunization against lethal respiratory challenge with Yersinia pestis / A.N. Honko [et al.] / Infect. Immun. – 2006. – Vol. 74. – P. 1113–1120.
20. Bates, J.T. Mucosal adjuvant activity of flagellin in aged mice / J.T.Bates [et al.] / Mech. Ageing Dev. – 2008. – Vol. 129. – P. 271–281.
21. Liu, G. Flagellin-HA vaccines protect ferrets and mice against H5N1 highly pathogenic avian influenza virus (HPAIV) infections / G. Liu [et al.] / Vaccine. – 2012. – Vol. 30. – P. 6833–6838.
22. Katoh, K. MAFFT: a novel method for rapid multiple sequence alignment based on fast Fourier transform/ K. Katon [et al.] / Nucleic Acids Res. – 2002. – Vol. 30. – P. 3059–3066.
23. Okonechnikov, K. Unipro UGENE: a unified bioinformatics toolkit / K. Okonechnikov [et al.] / Bioinformatics. – 2012. – Vol. 28. – P. 1166–1167.
24. Lee, Y.N. Mechanisms of cross-protection by influenza virus M2-based vaccines / Y.N. Lee [et al.] / Immune Netw. – 2015. – Vol. 15. – P. 213–221.
25. Swain, S.L. Expanding roles for CD4+ T cells in immunity to viruses / S.L. Swain, K.K. McKinstry, T.M. Strutt / Nat. Rev. Immunol. – 2012. – Vol. 12. – P. 136–148.
26. McKinstry, K.K. Memory CD4+ T cells protect against influenza through multiple synergizing mechanism / K.K. McKinstry [et al.] / J. Clin. Invest. – 2012. – Vol. 122. – P. 2847–2856.
27. Eliasson, D.G. M2e-tetramer-specific memory CD4 T cells are broadly protective against influenza infection / D.G. Eliasson [et al.] / Mucosal Immunol. – 2017. – doi: 10.1038/ mi.2017.14.
28. Sridhar, S. Cellular immune correlates of protection against symptomatic pandemic influenza / S. Sridhar [et al.] / Nat. Med. – 2013. – Vol. 19. – P. 1305–1312.
29. Zhou, L. Sudden increase in human infection with avian influenza A(H7N9) virus in China, Semptember- December 2016 / L. Zhou [et al.] / Western Pac. Surveill Response J. – 2017. – Vol. 8. – P. 1–9.
- Обратные ссылки не определены.
Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.
НИИ гриппа РАМН
197376, Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, 15/17
Телефон (орг.): (812)2346200
Факс (орг.): (812)2346200
Email (орг.): office@influenza.spb.ru
доктор биологических наук, профессор, академик РАМН
Киселев Олег Иванович
Заместитель директора по научной работе
Цыбалова Людмила Марковна
Кандидат медицинских наук
Лобова Тамара Геннадьевна
Научно-исследовательская деятельность НИИ гриппа включает решение фундаментальных и прикладных задач в области вирусологии, эпидемиологии и инфекционной патологии, направленных на сохранение и укрепление здоровья человека, развитие здравоохранения и медицинской науки.
Основные направления научных исследований:
Усовершенствование эпидемиологического и этиологического мониторинга гриппа и других ОРЗ на территории России. Расширение сотрудничества с ВОЗ.
Молекулярно-генетический и филогенетический анализ вирусов гриппа, циркулирующих на территории России. Прогнозирование направления изменчивости вирусов гриппа и других вирусных агентов.
Генетическая паспортизация и выявление генетических детерминант патогенности существующих и вновь возникающих вирусов. Разработка методов индикации и уточнение таксономии новых вирусов.
Изучение молекулярных механизмов патогенеза вирусных инфекций и морфологии вирусов.
Создание нового поколения диагностических препаратов на основе нанотехнологий. Разработка и внедрение в практику здравоохранения препаратов для диагностики вирусных инфекций, характеристики цитокинового статуса и других факторов иммунитета при вирусных инфекциях.
Создание олигонуклеотидных и белковых микрочипов, тест-систем, препаратов быстрой диагностики.
Разработка подходов к созданию противогриппозных вакцин нового поколения. Использование нанотехнологий с целью получения эффективных и современных средств защиты населения от гриппа и других опасных инфекций.
Поиск и направленный синтез новых противовирусных препаратов синтетического и природного происхождения. Комплексное изучение вирусингибирующего действия.
Экспериментальное и клиническое изучение безвредности, иммуногенных свойств и эффективности препаратов для профилактики вирусных инфекций.
Изучение патогенеза и усовершенствование схем лечения тяжелых и осложненных форм гриппа и других ОРЗ у взрослых и детей.
Развитие системы биобанков. Пополнение коллекций вирусов гриппа и ОРЗ, клеточных культур, гибридом для получения моноклональных антител. Создание электронных и печатных каталогов.
Важнейшей частью научной деятельности института являются исследования, направленные на совершенствование и модернизацию системы эпидемиологического и этиологического мониторинга гриппа и других ОРЗ на территории России, что расширяет возможности контроля ежегодных эпидемий и повышение готовности к пандемии.
Институт гриппа внес большой вклад в теорию эпидемического процесса при гриппе и других ОРЗ, выявив особенности развития этого процесса в межпандемический период на территории России: снижение ежегодно регистрируемой заболеваемости гриппом, сдвиг заболеваемости на детские контингенты, учащение эпидемий смешанной этиологии. Показано влияние демографических и экологических факторов на интенсивность эпидемий. Исследована связь эпидемий гриппа с показателями смертности от соматических заболеваний.
В Институте проводится молекулярно-генетический анализ и прогнозируется направление изменчивости вирусов гриппа, циркулирующих на территории страны. Выполнены работы по секвенированию полноразмерных геномов изолятов вирусов гриппа, в том числе А(Н5N1), результаты депонированы в Международную базу данных (Gene Bank).
При изучении молекулярных механизмов патогенеза показана роль белков вируса гриппа НА и NA,PB1-F2 в усилении фибринолитической и антикоагулянтной активности плазмы крови и повышении активности тканевого активатора плазминогена человека.
Впервые в России методом обратной генетики получены рекомбинантные штаммы вируса гриппа, экспрессирующие микобактериальный протективный антиген ESAT-6 для лечения и профилактики туберкулеза. Изобретение защищено патентом №2318872.
Использование векторной системы на основе рекомбинантного вируса гриппа, экспрессирующего ESAT-6 антиген, является перспективным направлением в создании нового поколения специфических противотуберкулезных вакцин.
По ряду показателей защитный эффект вакцины превышает действие стандартной вакцины БЦЖ. Препарат перспективен для вакцинации детей и лиц с иммуносупрессией. Закончены доклинические исследования эффективности полученных векторов для профилактики и терапии туберкулеза.
Векторы на основе вирусов гриппа позволяют создавать вакцины против других инфекций и злокачественных новообразований.
Институт является ведущим в стране по разработке и серийному выпуску препаратов для диагностики гриппа, ОРЗ и других опасных инфекций. Препараты и наборы поставляются по всей территории Российской Федерации и в страны СНГ.
Разработан ряд средств специфической детекции геномных последовательностей, антигенов и антител к актуальным вирусам, включая вирусы птичьего гриппа. Методом клеточной инженерии получены гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела к биологически значимым детерминантам респираторных вирусов для быстрой дифференциальной диагностики гриппа и других ОРЗ, биочипов и систем оптико-иммунного анализа. Ведется работа над созданием набора для количественного определения цитокинов в биологических жидкостях и тканях на основе технологии как ДНК, так и белковых микрочипов.
Создан целый ряд иммунодиагностических препаратов. Разработаны и выпущены опытные серии диагностикумов и флуоресцирующих антител для экспресс-диагностики гриппа птиц А(Н5N1), усовершенствованы серологические методы индикации антител к этому вирусу.
Институт имеет лицензию № 169879 от 5 декабря 2005 года на право осуществления образовательной деятельности по программам после-вузовского профессионального образования.
В настоящее время в структуру института входит 6 отделов, в которых работает 138 научных сотрудников, в том числе: 1 чл.-корр.РАМН, 16 докторов наук., из них 7 профессоров, и 53 кандидата наук.
Владельцы патента RU 2702834:
Изобретение относится к области медицинской биотехнологии и предназначено для получения моно- или поливалентных инактивированных (ИГВ) и живых (ЖГВ) гриппозных вакцин в целях иммунизации населения против потенциально пандемических вирусов гриппа А подтипа H5N8. Полученный вакцинный штамм относится к семейству Orthomyxoviridae, род Influenza virus А.
Вирусы гриппа, циркулирующие среди животных, создают угрозу здоровью человека в случае непосредственного инфицирования различными подтипами вируса птичьего или свиного происхождения и еще большую - при реассортации с вирусами человека.
Потенциально пандемическим подтипом вируса гриппа птиц является A/H5N8. Выделяют 2 группы вируса гриппа подтипа A/H5N8 - a (Buan-like) и b (Gochang-like) [Lee D.H. et al., 2017]. Вирус гриппа подтипа A/H5N8 впервые был обнаружен в 2013 году в Китае, затем в 2014 в Южной Корее и Северо-Восточной Сибири. На данный момент, благодаря сезонной миграции птиц, вирусы группы А распространились по всей Евразии и Северной Америке и обозначаются icA (от intercontinental - межконтинентальный). При этом они вызвали большую смертность у разных видов диких и домашних птиц [Kapczynski D.R. et al., 2017; Kleyheeg E. et al., 2017].
Вирус подтипа A/H5N8 признан высоко патогенным [Woo С. et al., 2017]. В настоящий момент случаев заражения людей данным вирусом не выявлено [Hui D. S. С., Lee N., Chan Р. K. S., 2017]. Однако данный вирус является птичьим, для которых доказана способность пересечь межвидовой барьер и инфицировать млекопитающих [Leymarie О. et al., 2017]. Так, для родственного вируса подтипа A/H5N6, относящегося к тому же клайду, зарегистрированы случаи инфицирования и смерти у человека [Grund С. et al., 2018]. У штаммов вируса гриппа подтипа A/H5N8 выделенных на территории России были обнаружены мутации, отвечающие за вирулентность, изменение хозяйской специфичности и за адаптацию вирусов для передачи от человека к человеку [Марченко В.Ю. и др., 2017].
Пути миграции многих видов перелетных птиц пересекаются в районе озера Увс-Нуур, находящегося на Российско-Монгольской границе. Оно является постоянной средой обитания для 46 видов водоплавающих птиц и местом остановки 215 видов птиц, мигрирующих на юг из Сибири. Во время широкого распространения высоко патогенных вирусов гриппа подтипа A/H5N1 в 2006 и 2009 г., эти вирусы были обнаружены у диких водоплавающих птиц на озере Увс-Нуур, поэтому эта зона представляет собой значимое место для отслеживания выскопатогенных вирусов птиц. В июне 2016 года в данном районе было выделено и охарактеризовано 3 штамма, относящихся к группе b вирусов гриппа подтипа A/H5N8 клайда 2.3.4.4: A/common tern/Uvs-Nuur Lake/26/2016, A/great crested grebe/Uvs-Nuur Lake/341/2016 и A/gray heron/Uvs-Nuur Lake/20/2016 [Lee D.H. et al., 2017].
Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, было получение реассортанта на основе вируса гриппа A/H5N8 и донора генов внутренних белков А/Гонконг/1/68/162/35(Н3Н2) методом классической генетической реассортации, для производства инактивированных и живых гриппозных вакцин.
Получение штамма вируса гриппа RA-54 (A/UNL/HK/2:6/2017 (H5N8))
Штамм вируса гриппа RA-54 (A/UNL/HK/2:6/2017 (H5N8)) был получен методом классической генетической реассортации штамма-донора А/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2) и потенциально пандемического вируса A/Common tern/Uvs-Nuur Lake/26/2016 (H5N8). При получении штамма было проведено 7 пассажей в 10-12 дневных развивающихся куриных эмбрионах. Селективными факторами для отбора необходимых клонов являлись пониженная температура (26°С) и присутствие гипериммунной сыворотки к штамму А/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2).
Штамм представляет собой реассортант с формулой генома 2:6. Состав генома: 2 гена (НА и NA) от вируса дикого типа и 6 генов внутренних и неструктурных белков (РВ2, РВ1, PA, NP, М и NS) от вируса-донора А/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2).
Подтверждение состава генома было выполнено с использованием рестрикционного анализа ДНК-копий сегментов РНК, полученных с помощью обратно-транскриптазной полимеразно-цепной реакции (ОТ-ПЦР). Полученные с помощью ОТ-ПЦР ДНК-копии сегментов РВ2, РВ1, PA, NP, NS и М вирусов А/Гонконг/1/68/162/35 и A/Common tern/Uvs-Nuur Lake/26/2016 (обозначены на фиг. 1 как НК и UNL) обрабатывали эндонуклеазами рестрикции Acc36I, MhlI, BsmBl, Acc36I, Bse3D1 и Bse3D1 соответственно. Принадлежность NA и НА определяли методом ОТ-ПЦР с типоспецифичными праймерами к различным субтипам. Анализ ДНК-копий сегментов РНК (фиг. 1) показал, что реассортант RA-54 имеет состав генома 2:6.
Антигенное соответствие гемагглютинина родительскому штамму дикого типа у реассортанта RA-54 было подтверждено в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) (табл. 1).
Показано, что вакцинный кандидат RA-54 антигенно идентичен родительскому штамму дикого типа.
Полногеномное секвенирование показало наличие у реассортанта RA-54 нескольких нуклеотидных и аминокислотных замен, по сравнению с родительскими штаммами (табл. 2-4). Нуклеотидные последовательности сегментов реассортанта RA-54 опубликованы в базе данных GISAID под номером EPI_ISL_321098.
Примечание: Жирным шрифтом выделены мутации, приводящие к замене аминокислоты
Характеристика полученного штамма
Пример 1. Репродуктивные свойства штамма A/UNL/HK/2:6/2017 (H5N8) (RA-54).
Штамм вируса гриппа RA-54 тестировали на инфекционную активность путем заражения развивающихся куриных эмбрионов 10-дневного возраста в соответствии с Методическими указаниями 3.3.2.1758-03 "Методы определения показателей качества иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики гриппа". Готовили десятикратные падающие разведения вируссодержащей аллантоисной жидкости. Каждым разведением начиная с 10 -4 до 10 -10 заражали по 3 куриных эмбриона. Инкубировали 48 часов при температуре 32°С. Наличие вируса определяли в РГА, инфекционную активность вируса рассчитывали по методу Рида и Менча.
Штамм вируса гриппа A/UNL/HK/2:6/2017 (H5N8) показал высокую репродуктивную активность в РКЭ. Гемагглютинирующая активность реассортанта составила RA-54 16-64 ГАЕ/50 мкл с 0,5% взвесью куриных эритроцитов. Инфекционная активность в РКЭ составила - 7,75 lgЭИД50/0,2 мл.
Пример 2. Вакцинный штамм RA-54 обладает свойствами температурной чувствительности и холодоадаптированности.
Донор А/Гонконг/1/68/162/35 является универсальным, то есть обладает как высокой репродуктивностью, так и маркерами аттенуации - имеет температурочувствительный (ts) и холодоадаптированный (са) фенотип. Реассортанты на основе донора А/Гонконг/1/68/162/35, также наследуют ts-, са - фенотип.
Полученный реассортант наследовал от штамма-донора А/Гонконг/1/68/162/35 ts-, са- фенотип - способность хорошо репродуцироваться при пониженной температуре и почти полную потерю способности к репродукции при повышенной температуре (табл. 5).
RCT (Reproductive capacity at different temperatures) - репродуктивная способность при различных температурах
ts - температурочувствительный фенотип (RCT39 более 5 lgЭИД50/0,2 мл)
са - холодоадаптированный фенотип (RСТ26 не более 3 lgЭИД50/0,2 мл)
Стабильность реассортанта проверяли 5-кратным пассированием при температуре 32°С в системе РКЭ. Степень температурочувствительности и холодоадаптированности, а также уровень репродукции реассортантного штамма не изменялись. Таким образом, реассортантный штамм удовлетворяет требованиям температурочувствительности и холодовой адаптации, предъявляемым к вакцинным штаммам для ЖГВ, и требованиям высокой репродуктивности для ИГВ.
Пример 3. Заявляемый вакцинный штамм RA-54 безопасен для мышей.
Тестирование штамма вируса гриппа RA-54 на специфическую безопасность проводили на линейных белых мышах Balb/c, самках, массой 18-20 г (16 шт.). В исследованиях использовали здоровых животных, на которых ранее не проводили какие-либо испытания. Испытания проводили в соответствии с методическими указаниями МУК 4.1/4.2.588-96.
Мышей инфицировали интраназально в дозе 6,5 lgЭИД50 на мышь, в объеме 50 мкл. В течение периода наблюдения (14 суток) все животные остались живы и ни у одного из них не были выявлены видимые признаки заболевания. На 3-и и 6-е сутки после заражения у трех мышей проводили забор органов (легкие, носовые ходы и мозг) с целью индикации антигена и его накопления. Репродукцию вируса определяли по показателям титрования суспензии органов в культуре клеток MDCK. Результаты приведены в табл. 6.
У мышей, инфицированных штаммом дикого типа, наблюдается репродукция вируса в носовых ходах и легких на 3-и сутки. К 6-м суткам вирус показывает высокий уровень репродукции во всех рассматриваемых органах мышей. У мышей, инфицированных реассортантным штаммом, наблюдалось наличие вируса только в носовых ходах на 3-и и 6-е сутки. В легких и мозге вирус не реплицируется, что подтверждает его аттенуированный фенотип. Полученные данные доказывают специфическую безопасность реассортантного штамма RA-54.
Пример 4. Вакцинный штамм RA-54 является иммуногенным для мышей.
На основе реассортантных штаммов были подготовлены кандидатные вакцинные препараты живой и инактивированной гриппозных вакцин (ЖГВ и ИГВ соответственно). Для получения ЖГВ накопленный вирусный материал реассортантного вируса разводили фосфатно-солевым буфером (ФСБ) до концентрации 6,5 lgЭИД50/50 мкл. ЖГВ вводили интраназально, в объеме 50 мкл. Для получения ИГВ вирусный материал инактивировали 0,02% формалином, затем очищали и концентрировали методом изопикнического центрифугирования в градиенте плотности сахарозы. Содержание гемагглютинина в вакцинном препарате оценивали методом электрофореза в полиакриламидном геле с последующей денситометрией. Доза ИГВ (250 мкл) содержала 10 мкг НА. В качестве адъюванта в одной из групп использовали полиоксидоний (ПО)- 200 мкг на дозу. ИГВ вводили внутримышечно (в верхнюю треть бедра задних конечностей).
Препараты ЖГВ и ИГВ использовали для иммунизации мышей и исследования иммуногенности. Иммунизация была проведена двукратно с двухнедельным интервалом. Данные по содержанию антигемагглютинирующих антител к вирусам гриппа в сыворотках крови мышей, иммунизированных препаратами ЖГВ и ИГВ RA-54, демонстрируют достоверное (р Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой Influenzavirus А, подтип H9N2, штамм А/HK/HK/6:2/2016 (H9N2), депонированный в Государственную коллекцию вирусов ФГБУ «ФНИЦЭМ им.
Читайте также:
