Биофизические и биохимические свойства вирусов

Открытие вирусов Д.И.Ивановским в 1892г. положило начало развитию науки вирусологии. Более быстрому ее развитию способствовали: изобретение электронного микроскопа, разработка метода культивирования микроорганизмов в культурах клеток.

Слово “вирус” в переводе с латинского- яд (животного происхождения). Этот термин применяют для обозначения уникальных представителей живой природы, не имеющих клеточного (эукариотического или прокариотического) строения и обладающих облигатным внутриклеточным паразитизмом, т.е. которые не могут жить без клетки.

В настоящее время вирусология- бурно развивающаяся наука, что связано с рядом причин:

- ведущей ролью вирусов в инфекционной патологии человека (примеры- вирус гриппа, ВИЧ- вирус иммунодефицита человека, цитомегаловирус и другие герпесвирусы) на фоне практически полного отсутствия средств специфической химиотерапии;

- использованием вирусов для решения многих фундаментальных вопросов биологии и генетики.

Основные свойства вирусов (и плазмид), по которым они отличаются от остального живого мира.

1.Ультрамикроскопические размеры (измеряются в нанометрах). Крупные вирусы (вирус оспы) могут достигать размеров 300 нм, мелкие- от 20 до 40 нм. 1мм=1000мкм, 1мкм=1000нм.

2.Вирусы содержат нуклеиновую кислоту только одного типа- или ДНК (ДНК- вирусы) или РНК (РНК- вирусы). У всех остальных организмов геном представлен ДНК, в них содержится как ДНК, так и РНК.

3.Вирусы не способны к росту и бинарному делению.

4.Вирусы размножаются путем воспроизводства себя в инфицированной клетке хозяина за счет собственной геномной нуклеиновой кислоты.

5.У вирусов нет собственных систем мобилизации энергии и белок- синтензирующих систем, в связи с чем вирусы являются абсолютными внутриклеточными паразитами.

6.Средой обитания вирусов являются живые клетки- бактерии (это вирусы бактерий или бактериофаги), клетки растений, животных и человека.

Все вирусы существуют в двух качественно разных формах: внеклеточной- вирион и внутриклеточной- вирус. Таксономия этих представителей микромира основана на характеристике вирионов- конечной фазы развития вирусов.

Строение (морфология) вирусов.

1.Геном вирусов образуют нуклеиновые кислоты, представленные одноцепочечными молекулами РНК (у большинства РНК- вирусов) или двухцепочечными молекулами ДНК (у большинства ДНК- вирусов).

2.Капсид - белковая оболочка, в которую упакована геномная нуклеиновая кислота. Капсид состоит из идентичных белковых субъединиц- капсомеров. Существуют два способа упаковки капсомеров в капсид- спиральный (спиральные вирусы) и кубический (сферические вирусы).

При спиральной симметрии белковые субъединицы располагаются по спирали, а между ними, также по спирали, уложена геномная нуклеиновая кислота (нитевидные вирусы). При кубическом типе симметрии вирионы могут быть в виде многогранников, чаще всего- двадцатигранники - икосаэдры.

3.Просто устроенные вирусы имеют только нуклеокапсид, т.е. комплекс генома с капсидом и называются “голыми”.

4. У других вирусов поверх капсида есть дополнительная мембраноподобная оболочка, приобретаемая вирусом в момент выхода из клетки хозяина- суперкапсид. Такие вирусы называют “одетыми”.

Кроме вирусов, имеются еще более просто устроенные формы способных передаваться агентов - плазмиды, вироиды и прионы.

Основные этапы взаимодействия вируса с клеткой хозяина.

1.Адсорбция- пусковой механизм, связанный со взаимодействием специфических рецепторов вируса и хозяина (у вируса гриппа- гемагглютинин, у вируса иммунодефицита человека- гликопротеин gp 120).

2.Проникновение- путем слияния суперкапсида с мембраной клетки или путем эндоцитоза (пиноцитоза).

3.Освобождение нуклеиновых кислот- “раздевание” нуклеокапсида и активация нуклеиновой кислоты.

4.Синтез нуклеиновых кислот и вирусных белков, т.е. подчинение систем клетки хозяина и их работа на воспроизводство вируса.

5.Сборка вирионов- ассоциация реплицированных копий вирусной нуклеиновой кислоты с капсидным белком.

6.Выход вирусных частиц из клетки, приобретения суперкапсида оболочечными вирусами.

Исходы взаимодействия вирусов с клеткой хозяина.

1.Абортивный процесс- когда клетки освобождаются от вируса:

- при инфицировании дефектным вирусом, для репликации которого нужен вирус- помощник, самостоятельная репликация этих вирусов невозможна ( так называемые вирусоиды). Например, вирус дельта (D) гепатита может реплицироваться только при наличии вируса гепатита B, его Hbs - антигена, аденоассоциированный вирус- в присутствии аденовируса);

- при инфицировании вирусом генетически нечувствительных к нему клеток;

- при заражении чувствительных клеток вирусом в неразрешающих условиях.

2.Продуктивный процесс- репликация (продукция) вирусов:

- гибель (лизис) клеток (цитопатический эффект)- результат интенсивного размножения и формирования большого количества вирусных частиц - характерный результат продуктивного процесса, вызванного вирусами с высокой цитопатогенностью. Цитопатический эффект действия на клеточные культуры для многих вирусов носит достаточно узнаваемый специфический характер;

- стабильное взаимодействие, не приводящее к гибели клетки (персистирующие и латентные инфекции) - так называемая вирусная трансформация клетки.

3.Интегративный процесс- интеграция вирусного генома с геномом клетки хозяина. Это особый вариант продуктивного процесса по типу стабильного взаимодействия. Вирус реплицируется вместе с геномом клетки хозяина и может длительно находиться в латентном состоянии. Встраиваться в ДНК- геном хозяина могут только ДНК- вирусы (принцип “ДНК- в ДНК”). Единственные РНК- вирусы, способные интегрироваться в геном клетки хозяина- ретровирусы, имеют для этого специальный механизм. Особенность их репродукции- синтез ДНК провируса на основе геномной РНК с помощью фермента обратной транскриптазы с последующим встраиванием ДНК в геном хозяина.

Основные методы культивирования вирусов.

1.В организме лабораторных животных.

2.В куриных эмбрионах.

3.В клеточных культурах - основной метод.

Типы клеточных культур.

1.Первичные (трипсинизированные) культуры- фибробласты эмбриона курицы (ФЭК), человека (ФЭЧ), клетки почки различных животных и т.д. Первичные культуры получают из клеток различных тканей чаще путем их размельчения и трипсинизации, используют однократно, т.е. постоянно необходимо иметь соответствующие органы или ткани.

2.Линии диплоидных клеток пригодны к повторному диспергированию и росту, как правило не более 20 пассажей (теряют исходные свойства).

3.Перевиваемые линии (гетероплоидные культуры), способны к многократному диспергированию и перевиванию, т.е. к многократным пассажам, наиболее удобны в вирусологической работе- например, линии опухолевых клеток Hela, Hep и др.

Специальные питательные среды для культур клеток.

Используются разнообразные синтетические вирусологические питательные среды сложного состава, включающие большой набор различных факторов роста- среда 199, Игла, раствор Хэнкса, гидролизат лактальбумина. В среды добавляют стабилизаторы рН (Hepes), различные в видовом отношении сыворотки крови (наиболее эффективной считают эмбриональную телячью сыворотку), L-цистеин и L-глютамин.

В зависимости от функционального использования среды могут быть ростовые (с большим содержанием сыворотки крови) - их используют для выращивания клеточных культур до внесения вирусных проб, и поддерживающие (с меньшим содержанием сыворотки или ее отсутствием)- для содержания инфицированных вирусом клеточных культур.

Выявляемые проявления вирусной инфекции клеточных культур.

2.Выявление телец включений.

3. Выявление вирусов методом флюоресцирующих антител (МФА), электронной микроскопией, авторадиографией.

4.Цветная проба. Обычный цвет используемых культуральных сред, содержащих в качестве индикатора рН феноловый красный, при оптимальных для клеток условиях культивирования (рН около 7,2)- красный. Размножение клеток меняет рН и соответственно- цвет среды с красного на желтый за счет смещения рН в кислую сторону. При размножении в клеточных культурах вирусов происходит лизис клеток, изменения рН и цвета среды не происходит.

5.Выявление гемагглютинина вирусов- гемадсорбция, гемагглютинация.

6.Метод бляшек (бляшкообразования). В результате цитолитического действия многих вирусов на клеточные культуры образуются зоны массовой гибели клеток. Выявляют бляшки- вирусные “ клеточно- негативные” колонии.

Название семейства вирусов заканчивается на “viridae”, рода- “virus”, для вида обычно используют специальные названия, например - вирус краснухи, вирус иммунодефицита человека- ВИЧ, вирус парагриппа человека типа 1 и т.д.

Вирусы бактерий (бактериофаги).

Естественной средой обитания фагов является бактериальная клетка, поэтому фаги распространены повсеместно (например, в сточных водах). Фагам присущи биологические особенности, свойственные и другим вирусам.

Наиболее морфологически распространенный тип фагов характеризуется наличием головки- икосаэдра, отростка (хвоста) со спиральной симметрией (часто имеет полый стержень и сократительный чехол), шипов и отростков (нитей), т.е. внешне несколько напоминают сперматозоид.

Взаимодействие фагов с клеткой (бактерией) строго специфично, т.е. бактериофаги способны инфицировать только определенные виды и фаготипы бактерий.

Основные этапы взаимодействия фагов и бактерий.

1.Адсорбция (взаимодействие специфических рецепторов).

2.Внедрение вирусной ДНК (инъекция фага) осуществляется за счет лизирования веществами типа лизоцима участка клеточной стенки, сокращения чехла, вталкивания стержня хвоста через цитоплазматическую мембрану в клетку, впрыскивание ДНК в цитоплазму.

4.Выход дочерних популяций.

Основные свойства фагов.

Различают вирулентные фаги, способные вызвать продуктивную форму процесса, и умеренные фаги, вызывающие редуктивную фаговую инфекцию (редукцию фага). В последнем случае геном фага в клетке не не реплицируется, а внедряется (интегрируется) в хромосому клетки хозяина (ДНК в ДНК), фаг превращается в профаг. Этот процесс получил название лизогении. Если в результате внедрения фага в хромосому бактериальной клетки она приобретает новые наследуемые признаки, такую форму изменчивости бактерий называют лизогенной (фаговой) конверсией. Бактериальную клетку, несущую в своем геноме профаг, называют лизогенной, поскольку профаг при нарушении синтеза особого белка- репрессора может перейти в литический цикл развития, вызвать продуктивную инфекцию с лизисом бактерии.

Умеренные фаги имеют важное значение в обмене генетическим материалом между бактериями- в трансдукции (одна из форм генетического обмена). Например, способностью вырабатывать экзотоксин обладают только возбудитель дифтерии, в хромосому которого интегрирован умеренный профаг, несущий оперон tox, отвечающий за синтез дифтерийного экзотоксина. Умеренный фаг tox вызывает лизогенную конверсию нетоксигенной дифтерийной палочки в токсигенную.

По спектру действия на бактерии фаги разделяют на :

- поливалентные (лизируют близкородственные бактерии, например сальмонеллы);

- моновалентные (лизируют бактерии одного вида);

- типоспецифические (лизируют только определенные фаговары возбудителя).

На плотных средах фаги обнаруживают чаще с помощью спот (spot) - теста (образование негативного пятна при росте колоний) или методом агаровых слоев (титрования по Грациа).

Практическое использование бактериофагов.

1.Для идентификации (определение фаготипа).

2.Для фагопрофилактики (купирование вспышек).

3.Для фаготерапии (лечение дисбактериозов).

4.Для оценки санитарного состояния окружающей среды и эпидемиологического анализа.

Биофизические свойства вирусов изучают для того, чтобы получить информацию о размере, форме, молекулярной массе и структуре вирусных частиц. Во многих случаях с вирусными частицами можно работать как с простыми макромолекулами, у которых периодически повторяются элементы поверхностной структуры. Биофизические свойства характеризуются многими показателями – седиментацией, плотностью, вязкостью вирусных суспензий, диффузионными свойствами. Все эти характеристики относятся и к субвирусным компонентам.

Биофизические свойства вирусов характеризуются многими показателями— седиментацией, плотностью, вязкостью вирусных суспензий, диффузионными свойствами. Седиментационные свойства вирусов и субвирусных компонентов измеряют с помощью центрифугирования в аналитических и препаративных ультрацентрифугах. Коэфиициент седиментации выражают в единицах Сведберга в переводе на стандартные условия – при температуре 20 о С S_{20w .} Коэффициенты седиментации вирионов зависят от многих факторов: от их размера и массы, плотности, формы. Для определения плотности вирионов и субвирусных структур применяют равновесное центрифугирование в градиентах плотности. Для вирионов и вирусных нуклеопротеидов обычно используют градиенты плотности сахарозы и хлорида цезия. Плотность вирионов и субвирусных структур зависит прежде всего о тих состава. Она увеличивается с увеличением процента содержания нуклеиновых кислот и уменьшается при повышении содержания белков и липидов

3. Использование модельных систем

При проведении биофизических исследований используют модельные системы.

Ситема меньших размеров.

Структурное разрешение любого метода ухудшается с ростом размеров молекулы. Гораздо легче исследовать небольшую часть системы с очень большим разрешением, а потом использовать эти результаты для того, чтобы судить о ее структуре в целой системе. Так спектроскопические методы успешно используются для исследования структуры достаточно малых молекул, у которых спектральный вклад каждой группы может быть определен и измерен по отдельности. Поскольку спектры молекул большего размера получают путем усреднения по многим звеньям, детальная их интерпретация затруднительна. Если же свойства отдельных звеньев в заданном окружении и в заданной конформации известна из модельных исследований, то иногда удается установить установить соответствие спектра полимерной системы определенным гипотезам относительно ее структуры.

Наблюдение за частью системы.

Работа с частью системы, физически отделенной от системы в целом, таит в себе опасность получение неверных результатов, поскольку эта часть необязательно может вести себя также, как в интктной системе. Поэтому разрабатывают такие подходы, позволяющие наблюдать за этой частью системы, но в составе интактной системы. Для этого используются зонды или метки. Иногда макромолекула сама содержит такой зонд, например ион переходного металла в функциональном центре. Исследователь может ввести зонд в заданную структуру путем его ковалентного присоединения или нековалентного связывания. Важно, чтобы введение зонда не привело к нарушению структуры системы. В практике современной вирусологии часто используют введение изотопной метки в сочетании с электрофорезом и хроматографией при исследовании таких процесов, как сборка вириона, транспорт и локализация вируса в клетке.

Сравнение между собой почти идентичных систем.

В биофизических исследованиях при изучении функции системы используют мутантные белки или нуклеиновые кислоты. При этом подходе в одной или нескольких аминокислот или нуклеотидах макромолекулы производят замены, которые приводят к изменению ее функции. В вирусологических исследованиях при изучении внутриклеточных событий в ходе вирусной инфекции часто используют условно-летальные мутанты. Наибольшую информацию можно получить, используя мутантов, которые размножаются в клетках данного хозяина только в определенном диапазоне температур (температурочувстительные мутанты: чувствительные к теплу, холоду). Такая чувствительность объясняется тем, что в результате мутации определенный белок вследствие аминокислотных замен сохраняет свою активность лишь при определенных (пермиссивных) температурах. Такие мутации сказываются на процессах синтеза нуклеиновых кислот, ранних и поздних белков, а также на ходе вирусного морфогенеза. В пермиссивных условиях мутантный вирус способен к размножению. Остановка размножения на определенном этапе при непермиссивных условиях обычно указывает на ту стадию процесса, для которой требуется продукт мутантного гена. Это позволяет выяснить, какие именно гены ответственны за тот или иной этап процесса.

Процесс экстракции вирусов из растений, методы их очистки и концентрирования. Методы изучения биофизических свойств вирусов, определения типа, содержания и размера нуклеиновой кислоты вирусных частиц, числа и молекулярной массы индивидуальных белков.

Рубрика	Биология и естествознание
Вид	курсовая работа
Язык	русский
Дата добавления	30.08.2009
Размер файла	437,0 K

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Очистка, биофизическая и биохимическая характеристика вирусов

Для характеристики вирусов в первую очередь важны их биохимические и биофизические свойства. Чтобы исследовать эти свойства, вирусы необходимо очистить. Разные вирусы требуют специфических методов очистки. В этой работе рассмотрены методы изучения только простейших вирусов, состоящих из белковой оболочки и геномной нуклеиновой кислоты.

1. Очистка вирусов растений

В идеале для наращивания вируса следует использовать растение, в котором вирус дает системную инфекцию, а для определения инфекционное™ на разных стадиях очистки -- растение, на котором образуются локальные поражения. При выборе системного хозяина необходимо принимать во внимание выход вируса, легкость его экстракции, легкость культивирования растения и возможность контаминации другими вирусами. Растение, на котором образуются локальные поражения, следует использовать для определения периода максимального накопления вируса в основном хозяине и для контроля количества вируса на разных стадиях очистки.

В большинстве случаев, однако, невозможно выполнить многие из этих требований. Часто не удается найти подходящее растение, на котором образуются локальные поражения. В этих случаях для контроля количества вируса можно использовать метод дот-блот гибридизации.

1.2 Экстракция вирусов из растений

Чтобы экстрагировать вирусные частицы из растения, необходимо разрушить клеточные стенки и высвободить содержимое клеток. Обычно экстракцию проводят в буферном растворе и в присутствии соединений, предотвращающих повреждение вирусных частиц высвобождающимися ферментами. Кроме того, действие ферментов замедляется, если экстракцию проводят на холоду. Если отсутствуют специальные указания, все стадии очистки следует проводить при 0--5°С.

Наиболее распространенное приспособление для разрушения растительных клеток -- это гомогенизатор с вращающимися ножами, которые приводятся в движение сверху или снизу. В продаже имеются различные типы гомогенизаторов, и выбор конкретной модели должен определяться эффективностью разрушения растительных тканей, которая зависит от скорости вращения ножей, размера лезвий, угла между ними и формы сосуда. Эффективность разрушения растительных клеток можно повысить путем их предварительного замораживания, хотя в некоторых случаях это приводит к снижению выхода вируса.

Использование гомогенизаторов неудобно, если ткани растения-хозяина очень богаты волокнами или частицы выделяемого вируса длинные и гибкие; в последнем случае при гомотенизации они могут разрушаться \3]. Этих трудностей легко избежать, используя соковыжималку или ступку с пестиком. При очистке вирусов, размножающихся только в сосудистых тканях, например лютео-вирусов, обнаруживаемых во флоэме, ткань листьев необходимо сначала разрушить целлюлазами и пектиназами.

Выбор экстрагирующего буферного раствора может оказать решающее влияние на эффективность очистки вируса. Вирусы с удлиненными частицами, склонные к агрегации или к адсорбции на клеточном дебрисе, лучше всего экстрагировать щелочными буферами с умеренной лонной силой; однако частицы некоторых палочковидных вирусов в щелочной среде повреждаются. Для экстракции многих изометрических вирусов удобны кислые буферные растворы с рН около 5; дополнительное преимущество подобных растворов -- осаждение многих клеточных белков при кислой реакции среды. Некоторые изометрические вирусы, например вирус мозаики огурцов и вирус кольцевой пятнистости табака, при рН около 5 выпадают в осадок, и поэтому для их выделения следует использовать растворы с рН, близким к нейтральному. С другой стороны, некоторые вирусы, например бромовирусы, при рН 7 набухают, и РНК становится доступной для нуклеаз; в этом случае лучше использовать кислые растворы.

1.3 Осветление экстрактов

Для очистки вирусных частиц их следует отделить от других компонентов цитоплазмы. В число последних входят органеллы, мембраны, рибосомы и белки, в первую очередь рибулозобис-фосфаткарбоксилаза и фитоферритин. В табл. 1.1 приведены способы обработки, позволяющие эффективно удалять различные контаминанты. При разработке новой методики очистки какого-либо вируса анализируется возможность применения каждого способа грубой очистки путем определения вируса методом локальных поражений или дот-блот гибридизации. Для удаления выпавших в осадок контаминантов или разделения фаз при экстракции органическими растворителями обычно применяют низкоскоростное центрифугирование при 10 000 g в течение 10 мин.

Таблица 1.1. Удаление основных контаминантов при очистке вирусов растений

Фитоферритин Мембраны и органеллы

10 мМ Na2 ЭДТА, 0,5М NaCl, 8%-ный бутанол, хлороформ, нагревание, бентонит 8%-ный бутанол, бутанол/хлороформ, рН 4,9, нагревание, бентонит

10 мМ Na2 ЭДТА, рН 4,9, 8%-иый бутанол, бутанол/хлороформ, нагревание, бентонит Органические растворители, неионные детергенты

1.4 Концентрирование вирусов

Концентрирование обычно осуществляют с помощью поли-этиленгликоля или путем высокоскоростного центрифугирования. Типичные условия осаждения ПЭГ следующие: для палочковидных вирусов используют 2,5% ПЭГ и 0,1 М NaCl, а для изометрических вирусов-- 10% ПЭГ в присутствии 0,1 М NaCl; для эффективного осаждения необходимо поддерживать достаточно высокую концентрацию соли. Обычно ПЭГ и соль добавляют к раствору, содержащему вирус, растворяют их в течение часа при постоянном перемешивании и затем собирают осадок вируса центрифугированием при 10 000 g в течение 10 мин. Высокоскоростное центрифугирование большинства типичных изометрических вирусов проводят при 70000 g в течение 3 ч, а большинства палочковидных вирусов --при 50000 g в течение 2 ч.

1.5 Дальнейшая очистка

Осветленный и концентрированный вирус еще недостаточно чист для большинства биохимических и биофизических исследований. Дополнительной очистки достигают зональным или равновесным центрифугированием. Теоретические и практические аспекты центрифугирования детально изложены в другом руководстве. Для вирусов растений можно использовать следующие методы дополнительной очистки.

1.5.1. Зональное вирусов применяют 10--40%-ные сахарозные градиенты. Их можно приготовить одним из следующих способов:

1. С помощью устройства для приготовления градиентов, в котором соответствующим образом смешиваются исходные 10%-ный и 40%-ный растворы сахарозы.

2. Путем наслаивания друг на друга 10, 20, 30 и 40%-ного растворов сахарозы в количествах, приведенных в табл. 1.2, с последующей диффузией при 4 °С в течение ночи.

3. Путем замораживания 25%-ного раствора сахарозы в центрифужных пробирках и медленного оттаивания. Раствор, содержащий вирус, осторожно наслаивают на поверхность градиента. В большие пробирки не следует вносить больше 5 мг вируса, а в маленькие пробирки -- больше 1 мг. Центрифугирование проводят в роторах со свободно подвешенными стаканами; рекомендуемые режимы центрифугирования указаны в табл. 1.2.

Зоны вируса можно увидеть при освещении сверху и отобрать через верх пробирки шприцем с иглой, изогнутой под прямым углом недалеко от конца, прокалывая пробирку сбоку или фракционированием через дно пробирки. В последнем случае для контроля скорости вытекания раствора рекомендуется простое приспособление, показанное на рис. 1.1. Возможно использование и более сложных приспособлений, например прибора для фракционирования градиентов фирмы Isco, в котором раствор вытесняется снизу вверх и проходит через спектрофотометрическую кювету для регистрации оптической плотности. Простейшее правило, которым следует пользоваться при извлечении зоны вируса из градиента, состоит в том, что вирус не должен проходить через те участки пробирки, в которых концентрируются примеси, т.е. если, например, РБФК находится выше зоны вируса, не следует вытеснять градиент снизу вверх или отбирать зону вируса шприцем через верх пробирки. Сахарозу можно удалить диализом против подходящего буферного раствора или осаждением вируса ПЭГ.

Таблица 1.2. Зональное центрифугирование в градиентах концентрации сахарозы

А. Для получения близких к линейным градиентов методом диффузии при1-веденные объемы растворов сахарозы наслаивают один на другой и оставляют на ночь при 4 С для диффузии.

Если мы говорим о том, что живой организм должен содержать генетический материал, то вирус — живой организм. Если мы говорим, что живой организм это то, что способно к размножению, то возникают споры, к чему относить вирусы: сам по себе вирус размножаться не может, всегда нужен носитель.

Впервые вирусы были обнаружены русским физиологом растений и микробиологом Дмитрием Ивановским в конце XIX века. Он исследовал табачную мозаику, болезнь листьев табака, и пытался классифицировать все организмы, которые способны вызывать заболевания растений и в частности заболевания табака. Среди тех организмов, которые он обнаружил, были и грибковой природы и бактериальной, а также некая субстанция, которая проходит через бактериальный фильтр: она меньше бактерии, она фильтруется. Субстанция не может сама расти в культуре, но при этом она действительно инфицирует листья, вызывает заболевания, другие известные на тот момент организмы подобных заболеваний не вызывают. Эти образования были названы фильтрующимися бактериями, позже появилось понятие вирус, от латинского яд — яд неизвестной природы, но который достаточно патогенен.

Размышления о том, что же такое вирусы идут до сих пор, потому что есть несколько гипотез, откуда взялись хитрые паразиты, которые не могут сами размножаться, им всегда нужен носитель. Они производят себе подобных, но цель непонятна: это не живая система, которая потребляет питательные вещества, пытается встроиться в среду обитания. У вируса ничего нет: это очень редуцированная, очень простая система. Разберем несколько гипотез о том, откуда вирусы появились, и что это такое.

Первая — редукционная гипотеза. Вирусы — это либо древние бактерии, либо доклеточные протоорганизмы, которые такие образом существовали, жили в древние времена. Вторая — это какой-то элемент эволюции, либо протоклетки, либо бактерии, которые очень упростили свой арсенал органелл, оставив минимально необходимое количество. Третья гипотеза — это некий, очень хитрый механизм общения между древними организмами, который сохранился до сих пор.

Существует гипотеза, что переход от изначальной РНКовой жизни к ДНКовой произошел благодаря вирусам, потому что в них были захвачены первые молекулы ДНК, а ДНК более стабильно, чем РНК, стабильно к температурам и к разным агрессивным воздействиям, и поэтому лучше генетическую информацию кодировать именно в ДНК чем в РНК. Возможно, именно вирусы первыми начали переносить появившиеся молекулы ДНК, за счет чего распространили их среди тех организмов, которые в то время существовали.

Ещё одна гипотеза заключается в том, что есть вирусы, которые инфицируют клетку, достраивают свой генетический материал к ДНК этой клетки, фактически, они меняют организм. Это очень смелая идея предполагают, что вирусы — двигатели эволюции, они не просто сообщали, что условия плохие, они позволяли изменять следующие организмы, для того чтобы они могли выжить в этих условиях.

Если говорить на языке структурной биологии, вирусы можно разделить на оболочечные и безоболочечные. Безоболочечные вирусы — это те, у которых вокруг их генома есть только белковый каркас, который защищает, как скорлупа. Оболочечные вирусы вокруг белкового каркаса имеют липидную мембрану, которую они взяли у инфицированной клетки, когда из нее выходили, забрали кусок ее плазматической мембраны — внешней оболочки.

В клетке процессы слияния сферических частиц с мембранами и процессы выброса подобных частиц достаточно сложные и требуют очень много белковых молекул, которые должны в определенном порядке собраться, активироваться, потребить энергию для этого, но вирус не может затрачивать энергию: у него нет АТФ, нет комплекса для синтеза энергетических молекул. Соответственно все должно быть очень просто и эффективно: вирусы, в отличие от клетки, имеют один, два, три белка, которые ответственны за их проникновение внутрь клетки.

Механизмы проникновения могут быть разные. Вирусы могут связываться с наружной мембраной клетки и сразу запускать процесс слияния: поверхностные белки атакуют клеточную мембрану, впиваются в нее и сводят клеточную и вирусную мембрану, для того чтобы образовать некое отверстие, куда может выйти генетический материал. Генетический материал тоже имеет минимальный набор белков, который отвечает за то, чтобы транспортировать материал к ядру, а дальше запускаются процессы либо достройки ДНК, либо, если это РНКовые вирусы, обратная транскрипция. Сначала строится молекула ДНК, потом она достраивается, и клетка начинает нарабатывать новые вирусы. Делает она это эффективно: если вирус заразил клетку, клетка практически полностью переключается только на производство вирусов, в этом заключается эволюционный плюс всех вирусов.

Второй механизм проникновения — вирусы используют систему питания клетки. Существует процесс эндоцитоза, когда на клетку что-то попало, и она пытается условно это съесть: ее наружная мембрана начинает изгибаться, захватывает некие крупные частицы, которые на нее сели. После этого часть мембраны с неким содержимым идет в клеточные эндосомы, аналоги человеческого желудка. В них содержатся ферменты, которые должны все разделить, переварить и использовать для дальнейшей успешной жизни клетки. Вирус на этом механизме отчасти и паразитирует.

Чтобы ферменты не портили жизнь клетки, когда все хорошо и ничего постороннего клетка не скушала, они должны быть неактивны, поэтому их надо запускать в нужный момент. Это происходит за счет понижения PH среды: внутри эндосомы PH падает, а вирусы подстраиваются под этот механизм и атакуют мембрану при понижении PH, то есть при повышении кислотности. Вирусы атаковали мембрану, произошел процесс слияния, и вышел генетический материал. Для этого вирусные белки должны сделать некий конформационный переход: впиваться в мембрану-мишень после того, как изменилась кислотность среды.

Белки, которые формируют каркас вируса, очень интересны, потому что они многофункциональны, их обычно называют матриксными. Они должны сохранять структуру вируса: когда грипп путешествует из Гонконга в Москву, он не должен разрушиться. После того как он попал в клетку, чтобы генетический материал вышел, этот каркас должен разрушиться, чтобы геном мог свободно выйти — при взаимодействии либо с компонентами клеточной цитоплазмы, либо за счет понижения PH среды. Еще одна их функция заключается в том, что, когда мы хотим продуцировать новые вирусы внутри клетки, эти белки опять должны собраться, причем в строго определенном месте, провзаимодействовать со всеми остальными компонентами и запустить производство дочернего вируса. На мой взгляд, это одна из самых интересных сторон жизни вируса, самоорганизация его каркаса.

Главное, матриксные белки не взаимодействуют с антителами иммунной системы: они всегда внутри вируса или клетки, на них нет антител. Если мы делаем вакцины, они действуют на поверхностные белки, а эти — внутри, и они практически не мутируют. Поиск препаратов, которые воздействовали бы на этот каркас, — интересная и перспективная задача, потому что существуют быстро мутирующие вирусы, например вирус иммунодефицита человека (ВИЧ). Поверхностные белки быстро мутируют, а матриксные — нет, им это и не нужно, потому что их никто не атакует. С точки зрения структуры вирусов процесс самоорганизации — один из ключевых моментов в понимании того, как вирусы функционируют и как с ними бороться. Мы знаем, что эволюционно вирусы, может, были нужны, полезны и хороши. Но сейчас, к сожалению, мы с ними должны бороться.