Белки вируса клещевого энцефалита

Синонимы: весенне-летний, таежный, русский, дальневосточный; Encephalitis ocarina.

Клещевой энцефалит — природно-очаговая трансмиссивная (передающаяся клещами) вирусная инфекция, характеризующаяся преимущественным поражением центральной нервной системы. Заболевание отличается полиморфизмом клинических проявлений и тяжестью течения (от легких стертых форм до тяжелых прогредиентных).

Первое клиническое описание болезни дали в 1936—1940 гг. отечественные ученые А. Г. Панов, А. Н. Шаповал, М. Б. Кроль, И. С. Глазунов. Возбудитель клещевого энцефалита — фильтрующийся вирус — был также открыт отечественными учеными Л.А.Зильбером, Е.Н.Левковичем, А. К. Шубладзе, М. П. Чумаковым, В. Д. Соловьевым, А. Д. Шеболдаевой в 1937 г.

В настоящее время клещевой энцефалит регистрируется в Сибири, на Дальнем Востоке, на Урале, в Беларуси, а также в центральных областях России.

Этиология. Вирус клещевого энцефалита (КЭ) относится к семейству Flaviviridae, роду Flavivirus (от лат. flavus - желтый). Выделяют три разновидности возбудителя — дальневосточный подвид, центрально-европейский подвид и возбудитель двухволнового менингоэнцефалита. Вирионы вируса клещевого энцефалита имеют сферическую форму с диаметром 40—50 им. Внутренним компонентом является нуклеокапсид. Он окружен наружной липопротеидной оболочкой, в которую погружены шипы, состоящие из гликопротеида, обладающего гемагглютинирующими свойствами. Нуклеокапсид содержит однонитчатую РНК. Вирус длительное время сохраняется при низких температурах (оптимальный режим минус 60°С и ниже), хорошо переносит лиофилизацию, в высушенном состоянии сохраняется много лет, но быстро инактивируется при комнатной температуре. Кипячение инактивирует его через 2 мин, а в горячем молоке при 60°С вирус погибает через 20 мин. Инактивирующим действием обладают также формалин, фенол, спирт и другие дезинфицирующие вещества, ультрафиолетовое излучение.

Эпидемиология. Клещевой энцефалит относится к группе природно-очаговых болезней человека. Основным резервуаром и переносчиком вируса в природе являются иксодовые клещи — Ixodes persulcatus, Ixodes ricinus с трансовариальной передачей. Дополнительным резервуаром вируса являются грызуны (заяц, еж, бурундук, полевая мышь), птицы (дрозд, щегол, чечетка, зяблик), хищники (волк). Для заболевания характерна строгая весенне-летняя сезонность заболевания. Динамика заболеваемости находится в тесной связи с видовым составом клещей и наибольшей их активностью. Чаще болеют лица в возрасте 20—40 лет. Основным путем инфицирования человека является трансмиссивная передача через укусы клещей. Возможна также передача инфекции алиментарным путем при употреблении в пищу сырого молока коз и коров, а также при раздавливании клеща в момент его удаления с тела человека и, наконец, воздушно-капельным путем при нарушении условий работы в лабораториях. При алиментарном заражении обращает на себя внимание наличие семейно-групповых случаев болезни.

Патогенез. Инфекционный процесс развивается вследствие внедрения нейротропного вируса и взаимодействия его с организмом человека. Эти взаимоотношения определяются путем внедрения, свойствами и дозой возбудителя, а также резистентностью и реактивностью макроорганизма. Вирус клещевого энцефалита проникает в организм человека в естественных условиях через кожу при присасывании клеща или через сырое молоко домашних животных.

После присасывания клеща вирус распространяется гематогенно и быстро проникает в мозг, фиксируясь здесь клетками. Параллельно с накоплением вируса развиваются воспалительные изменения сосудов и оболочек мозга. Соответствие места укуса клеща последующей локализации сегментарных расстройств указывает на возможность лимфогенного пути проникновения вируса в центральную нервную систему (ЦНС). В отдельных случаях преобладает тот или иной путь, что отражается в клинических особенностях клещевого энцефалита. Возникновение менингеальных и менингоэнцефалических синдромов соответствует гематогенному, а полиомиелитических и радикулоневритических — лимфогенному пути распространения вируса. Инвазия нервной системы возможна также и невральным путем посредством центростремительного распространения вируса через обонятельный тракт. Редкость поражения нижних конечностей при клещевом энцефалите не соответствует частоте присасывания клещей в кожных областях, иннервируемых поясничными и крестцовыми сегментами спинного мозга, что указывает на известную тропность вируса к клеткам шейных сегментов и их аналогов в бульбарных отделах продолговатого мозга.

Вирусемия при клещевом энцефалите имеет двухволновый характер: кратковременная первичная вирусемия, а затем повторная (в конце инкубационного периода), совпадающая по времени с размножением вируса во внутренних органах и появлением его в ЦНС.

Возможно длительное вирусоносительство, которое может быть различным по своим проявлениям и последствиям: латентная инфекция (вирус интегрирован с клеткой или существует в дефектной форме), персистентная инфекция (вирус репродуцируется, но не вызывает клинических проявлений), хроническая инфекция (вирус репродуцируется и вызывает клинические проявления с рецидивирующим, прогрессирующим или регрессирующим течением), медленная инфекция (вирус репродуцируется после длительного инкубационного периода, вызывает клинические проявления с неуклонным прогрессированием, приводящим к смерти).

Симптомы и течение. Выделяют следующие клинические формы болезни:

Независимо от клинической формы у больных наблюдаются общие инфекционные проявления болезни, характеризующиеся лихорадкой и другими признаками синдрома общей инфекционной интоксикации. Инкубационный период клещевого энцефалита длится в среднем 7—14 сут с колебаниями от одних суток до 30 дней. У ряда больных началу заболевания предшествует продромальный период, длящийся 1—2 дня и проявляющийся слабостью, недомоганием, разбитостью; иногда отмечаются легкие боли в области мышц шеи и плечевого пояса, боли в поясничной области в виде ломоты и чувства онемения, головная боль.

Лабораторным подтверждением диагноза служит нарастание титра антител, выявляемое с помощью РСК, РТГА, РПГА, РДНА и реакции нейтрализации. Диагностическим является нарастание титра антител в 4 раза.

Перспективным методом является выделение вируса на культуре ткани. Вирус и его антигены обнаруживаются в первые 7 дней болезни. В последнее время апробирован и хорошо зарекомендовал себя иммуноферментный метод (ИФА) диагностики клещевого энцефалита. С помощью ИФА выявляют антитела к вирусу клещевого энцефалита раньше и в более высоких разведениях сывороток, чем в РТГА и РСК, а также чаще определяют изменение напряженности специфического иммунитета, необходимое для подтверждения клинического диагноза.

Лечение больных клещевым энцефалитом проводят по общим принципам независимо от проводимых ранее профилактических прививок или применения с профилактической целью специфического гамма-глобулина.

Профилактика и мероприятия в очаге. Уничтожение и предотвращение укусов клещей. В течение первых суток после присасывания клеща — экстренная профилактика: донорский иммуноглобулин (титр 1:80 и выше) внутримышечно в дозе 1,5 мл детям до 12 лет, 2 мл — от 12 до 16 лет, 3 мл — лицам в возрасте 16 лет и старше. Для специфической профилактики применяют инактивированную культуральную сорбированную жидкую вакцину.

4. Молекулярная биология вируса клещевого энцефалита

4.1. Морфология и структурно-функциональные характеристики флавивирусов

Возбудитель острого и хронического клещевого энцефалита - ВКЭ - как и вирионы всех флавивирусов, имеет сферическую форму диаметром до 50-60 нм, покрытую гликопротеиновой оболочкой. Внутри внешней оболочки размещается вирусный капсид - геномный нуклеопротеиновый комплекс, покрытый коровым белком диаметром около 30 нм. В своем составе вирусная частица содержит 68% белка, 8% РНК, 17% липидов и 9% углеводов.

Неионные детергенты, такие, как тритон-Х, солюбилизируют оболочку вируса, удаляя все белки оболочки; дезоксихолат натрия снимает только бислойную мембрану внешней оболочки, оставляя коровый белок ассоциированным с нуклеокапсидом вируса. Обработка протеазами выявляет, что якорная часть гликопротеина оболочки вируса утоплена в липидном бислое. Оболочка флавивирусов защищает геном вируса от внутриклеточных протеаз, а раздетый нуклеокапсид деградируется рибонклеазами. Во внешней среде в составе мозговой суспензии на физиологическом растворе полностью собранная частица ВКЭ сохраняет жизнеспособность при комнатной температуре до 10 дней. Вирус устойчив в кислой среде, в частности, в составе желудочного сока; вирус в крови или его суспензия в белковом растворе инактивируются при 56°С в течение 30 мин. Кипячение убивает вирус в течение 2-3 мин. В глубоко замороженном виде или лиофилизированном состоянии в вакууме вирус сохраняет жизнеспособность многие годы. Благодаря бислойной липидной природе оболочки вирус чувствителен к эфиру, растворам лизола, спиртам.

Геном флавивирусов в составе нуклеокапсида представлен одной молекулой однонитчатой РНК положительной полярности общей длиной около 11 тыс. нуклеотидов, которые кодируют полипептидную цепь длиной 3,4-3,6 тыс. аминокислотных остатков (а.о.). Вирусная РНК cодержит 7-метилгуанозиновый кэп на 5’-конце. Геномная РНК служит в качестве мРНК для внутриклеточного синтеза вирусных белков. Для сборки зрелого флавивируса синтезируются 3 вирусных структурных белка: капсидный белок С, мембранный белок М и поверхностный белок Е. Незрелые внутриклеточные вирусные частицы содержат гликозилированный белок-предшественник рreM. Кроме того, в геноме флавивирусов закодированы неструктурные белки NS1-NS5, вирусная РНК-полимераза, которые обнаружены в инфицированной клетке и участвуют в репликации вируса. В геноме все белки закодированы последовательно в виде одной открытой рамки считывания. Индивидуальные белки вируса образуются в результате ко- или посттрансляционного расщепления единого вирусного полипротеина-предшественника протеазами вирусного или клеточного происхождения.

В репликативном цикле геномная РНК является инициатором инфекционного процесса и служит матрицей для создания дочерних копий.

4.2. Организация генома ВКЭ и экспрессия структурных и неструктурных вирусных белков

Нуклеотидная последовательность всего генома ВКЭ и полная аминокислотная последовательность полипротеина вируса расшифрованы Плетневым с соавторами [19]. На рис. 2 представлена линейная генетическая карта вируса с указанием кодируемых генов всех структурных и неструктурных белков и концевых нетранслируемых областей генома ВКЭ штамма Софьин. Этот штамм вируса выделен от больного на Дальнем Востоке еще в 1937 г., прошел несколько десятков пассажей на лабораторных животных и пермиссивных клетках. Широко известен как прототипный штамм регионального дальневосточного генетического субтипа или антигенного серотипа ВКЭ.

Немного позже были расшифрованы полная нуклеотидная последовательность генома ВКЭ западного штамма Neudoerfl (Найдорф) [25], дальневосточного штамма 205 [30] и другого вируса из антигенного комплекса ВКЭ - вируса Повассан [73].

Длина одноцепочечной РНК генома ВКЭ штамма Софьин составляет 10477 нуклеотидов. Последовательность нуклеотидов содержит единственную открытую рамку считывания белка (поз. 127-10363), кодирующую 3412 а.о. полипротеина. С 5’-конца генома 126 нуклеотидов предшествуют инициирующему транскрипцию кодону AUG; затем следует открытая рамка считывания полипротеина-предшественника всех структурных и неструктурных белков вируса длиной 10236 нуклеотидов. В другом конце полинуклеотидной последовательности геномной РНК представлены UAA-стоп кодон и 112 нуклеотидов её 3’-нетранслируемой области.

Первым с N-концевой части полипротеина ВКЭ находится нуклеокапсидный кор-белок С, состоящий из 111 а.о. Молекулярная масса белка С равна 12108 Da. При сборке вируса он вместе с геномной РНК образуют центральную структурную компоненту нуклеокапсида. Коровый белок обогащен остатками основных аминокислот: доля остатков аргинина и лизина, по-видимому, необходимых для нейтрализации зарядов на РНК при ее упаковке в нуклеокапсид, составляет 21,4%. Следующим от N-конца фрагментом полипротеина, выщепляемым протеазами, является гликопротеин preM-полипептид длиной 168 а.о. PreM является только предшественником в синтезе вирионного белка М, его нет в составе зрелого вириона в крови, не удается обнаружить его и в зараженных вирусом клетках. Мембранный белок М, содержащийся в составе оболочки зрелого вируса, представлен 75 остатками аминокислот, имеет молекулярную массу 8209 Da. В С-концевой части белка находятся два гидрофобных участка, разделенных остатком аргинина. Подобные последовательности имеются в белках М всех представителей флавивирусов. По-видимому, они обеспечивают этим белкам трансмембранную локализацию и важны для посттрансляционной модификации.

Расщепление полипротеинов флавивирусов протеиназой со специфичностью к последовательности Val-X-Ala, расположенной на расстоянии (-3)-(-1) от места гидролиза, обеспечивает формирование N-концов белков NS2A и NS4B. По мнению авторов [19], кроме такого типа протеолиза полипротеинов флавивирусов формирование N-концевых последовательностей белков NS3, NS4A и NS5 осуществляет, по-видимому, вирусспецифическая протеиназа по последовательности, обогащенной остатками основных аминокислот, которым предшествуют протяженные гидрофобные участки полипротеинов. Функцию вирусспецифической протеиназы могут, вероятно, выполнять белки preM или NS1, так как в их составе присутствуют последовательности Cys-Trp, часто встречающиеся в активных центрах тиоловых протеиназ. Учет этих двух типов гидролиза полипротеинов флавивирусов приводит к локализации семи неструктурных белковых продуктов (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B и NS5), наблюдаемых в инфицированных флавивирусами клетках, в том числе и при репликации ВКЭ.

Низкомолекулярные белки NS2A, NS2B, NS4A и NS4B с М 24873, 14531, 16063 и 27585 Da, соответственно, - это гидрофобные белки с протяженными участками остатков незаряженных аминокислот. Функции этих молекул в развитии вируса в клетках только выясняются. Более высокомолекулярные белки NS1, NS3 и NS5 легко обнаруживаются в инфицированных флавивирусами клетках, в сыворотке крови или спинномозговой жидкости больных клещевым энцефалитом.

Нестуктурный белок NS1 (M 39162 Da) является гликопротеином и обладает иммуногенными свойствами. Комплекс белка NS1 с гликопротеином Е отсутствует в зараженных клетках, несмотря на накопление индивидуальных составляющих его субъединиц, только секретируется в сыворотку крови [76]. Внеклеточная локализация комплекса на поздних стадиях инфекции исключает его участие в созревании вирионов и создает оптимальные условия для индукции синтеза вирусспецифических антител. Эти антитела способны вызвать комплемент-зависимый лизис инфицированных вирусом клеток. С другой стороны, фрагменты белка NS1 экспонируются на поверхности инфицированных ВКЭ клеток и индуцируют эффекторные CTL клеточного иммунитета. Предварительная иммунизация животных белком NS1 ВКЭ, вирусов лихорадки Денге и желтой лихорадки приводит к защите животных от высоких доз заражения этими вирусами. Однако, в сыворотке крови животных, иммунизированных NS1 ВКЭ, не обнаруживают вируснейтрализующих антител. Известно, что мутации в NS1 влияют на вирулентность флавивирусов. Предполагается, что NS1 также воздействует на ранние процессы репликации. В инфицированной клетке этот белок обнаруживается в димерной форме, либо во фракции белка с М 49000 Da. Последняя, по-видимому, представляет собой слитую форму NS1-NS2A, которая за счет гидрофобности цепи NS2A приобретает способность удерживаться на клеточных мембранах.

Второй крупный неструктурный белок NS3 (68949 Da), возможно, обладает протеазной, геликазной и рибо-НTФ-азной активностями. В составе третьего крупного неструктурного белка NS5 (102639 Da) всех флавивирусов присутствует последовательность, характерная для РНК-зависимых РНК-полимераз вирусов животных и растений: Gly-Asp-Asp. Белки NS3 и NS5, по-видимому, необходимы для репликации вирусной РНК, так как в зараженных клетках они находятся в околоядерной области в составе комплекса с репликативной формой вирусного генома. Ассоциация комплекса с мембранами эндоплазматического ретикулума хозяйских клеток исключает возможность контактов с системой иммунитета и обеспечивает репродукцию ВКЭ в организме. Изменение соотношения составляющих субъединиц комплекса может вызывать переключение синтеза РНК с цепей отрицательной полярности на цепи положительной полярности [76].

Разумеется, из всех белков ВКЭ более полно изучен структурный белок Е.

4.3. Структура и функции белка Е

Белок Е - главный, биологически наиболее значимый компонент внешней поверхности оболочки вириона. Он играет ключевую роль в процессах сборки вирусной частицы, в связывании вируса с клеточной поверхностью и последующем слиянии вирусной и клеточной мембран - определяет тропизм вируса. При сборке вириона нуклеокапсид вирусной частицы диаметром 26-30 нм, состоящий из вирусной РНК и внутривирусного нуклеокапсидного белка С, заключается в липидный бислой, происходящий из плазматической мембраны клетки-хозяина и вирусных поверхностных белков preМ и Е. Таким образом, гликопротеин Е и белок preМ (после созревания и выхода вируса из клетки - белок М) включены в состав липопротеиновой оболочки вируса, однако, пространственно выступают на поверхности собранной вирусной частицы.

При обработке очищенного вирусного препарата трипсином или детергентами белок Е ВКЭ легко отщепляется от поверхности вириона в растворимом состоянии. Сохраняющаяся при этом интактная структура белковой глобулы была изучена рентгеноструктурным анализом [72]. На рис. 3 представлена схема пространственной конфигурации полипротеинов димера поверхностного белка Е ВКЭ. Из полученных данных следует, что на поверхности вируса белок Е представляет собой отдельную объемную единицу, состоящую из комплекса двух молекул (димера) вирусного белка Е. При этом каждая молекула белка Е в димере представляет собой продолговатое образование, состоящее из трех структурных клубков-доменов (I-III), собранное определенным образом из единой полипептидной цепочки. Объемный каркас каждой молекулы в виде трех структурных доменов белка Е жестко фиксируется шестью дисульфидными мостиками, образованными 12 цистеиновыми остатками в полипептидной цепи белковой молекулы. Абсолютная консервативность цистеиновых остатков в составе белка Е и высокая гомологичность профиля гидрофильности полипептида этого белка для всех флавивирусов предполагают одинаковую пространственную структуру поверхностного белка Е флавивирусов. Надмолекулярная димерная структура поверхностного белка вируса дополнительно поддерживается межмолекулярным взаимодействием двух объемно протяженных молекул, стянутых вместе по принципу голова-хвост или валетом. В результате получается объемная симметричная структура димера с общими размерами длиной 150Е, шириной 55Е и толщиной 30Е, где боковые поверхности в основном формируются I и II парными доменами, а торцевые поверхности - доменами III и частично I двух, образующих белковый димер, молекул. Плоская структура димера располагается параллельно с поверхностью липидной бислойной мембраны вириона, и в результате, как считается, белок Е образует на поверхности вируса объемно-решетчатую сеть толщиной 30Е.

Результаты рентгеноструктурного анализа подтверждаются данными визуализации вирионов флавивирусов методом электронной микроскопии. Выступающие на поверхности вириона свободные участки димера белка Е, состоящие из двух димерообразующих парных доменов I, II и дистальных доменов III, связывают нейтрализующие вирус иммунопротективные антитела. Не удивительно, что мутации, расположенные на поверхности димера, как будет рассмотрено ниже, могут иметь серьезные последствия в патогенезе инфекции.

С использованием набора моноклональных антител (МКА) изучены иммунохимические свойства и проведено картирование антигенных детерминант на димере белка Е. На рис. 3 показаны топологические связи, серологическая специфичность и функции отдельных эпитопов, представляемых различными клонами МКА против белка Е штамма Найдорф западного серотипа ВКЭ [15].

На основании метода конкурентного связывания МКА были определены три неперекрывающиеся антигенные домена А, В и С, каждый из которых состоит из нескольких эпитопов А1-А5, В1-В5 и С1-С6, которые проявляют различные функции и серологическую специфичность. Более того, МКА выявили три изолированных эпитопа вне антигенных доменов i1-i3. Домен А содержит не только перекрестно реагирующие между различными флавивирусами эпитопы А1 и А2, но также специфические к субтипам ВКЭ эпитопы А3 и А4. Большинство эпитопов антигенного домена В специфичны к вирусам комплекса клещевого энцефалита, тогда как домен С преимущественно содержит специфические к вирусным субтипам эпитопы. Вируснейтрализующую активность проявили МКА, соответствующие эпитопам А3, А4, А5, В1, В2, В4, В5, С1 и i2. Примечательно, что эпитопы внутри каждого антигенного домена показывали одинаковые структурные свойства: чувствительность к денатурации при низких рН, протеолизу и восстановлению дисульфидной связи. Это, несомненно, подтверждает, что антигенные домены соответствуют хорошо известным стуктурным доменам белка Е.

Семь из вышеназванных эпитопов, в которых точечные мутации замещения аминокислотных остатков ведут к потере нейтрализации вируса соответствующими МКА (escape mutations), сосредоточены в двух больших не перекрывающихся участках, антигенных доменах С и А, соответствующих пространственным доменам I и II белка Е. Антигенные домены разобщены не только пространственно, но и отличаются по их чувствительности к конформационным изменениям и фрагментации. Оба антигенно реактивных участка вовлекаются в реакции нейтрализации вируса, но домен А содержит так называемые конформационные антигены, тогда как домен В - антигены, резистентные к конформационным изменениям и денатурации. Антигенный домен В, соответствующий структурному домену III белка Е, представляет собой достаточно автономное образование. Он может быть отщеплен от остальной части белковой молекулы трипсиновой обработкой нативного вириона или синтезирован отдельно, как генно-инженерный продукт, экспрессией рекомбинантной ДНК. Однако, в обоих случаях ведущая к нейтрализации вируса иммунохимическая активность антигенного домена В реализуется только при сохранности дисульфидного мостика внутри соответствующего структурного домена III белка Е. Как предполагается авторами, не исключено, что представленные отдельные эпитопы МКА составляют только части центров связывания нейтрализующих антител, составленных из фрагментов различных субъединиц белка на нативной структуре поверхности вириона. Хотя отсутствует специальное подтверждение, но часть центров нейтрализации вируса на белке Е, возможно, потеряна при получении солюбилизированного димера.

Локализация антигенных доменов на полипептидной карте белка Е показала, что структурный домен I образован N-концевыми 50 а.о. полипептида вместе с фрагментом 125-200 а.о., содержащим сайт гликозилирования белка Е, и другим фрагментом 250-300 а.о. Внутренние фрагменты полипептида 50-125 и 200-250 а.о. образуют домен II белка Е. Следующие около 100 (301-395) а.о. полипептида белка Е составляют структурный домен III. Последние 50 а.о. с самого С-конца полипептида составляют якорную цепочку белка Е в бислойной липидной мембране вириона.

Аннотация научной статьи по биологическим наукам, автор научной работы — Хаснатинов Максим Анатольевич, Хавликова С., Таплин Э., Казимирова М., Гунавардане Н.

Похожие темы научных работ по биологическим наукам , автор научной работы — Хаснатинов Максим Анатольевич, Хавликова С., Таплин Э., Казимирова М., Гунавардане Н.

THE ROLE OF THE STRUCTURAL PROTEINS IN THE NON-VIRAEMIC TRANSMISSION OF TICK-BORNE ENCEPHALITIS VIRUS

М.А. Хаснатинов 2, С. Хавликова 5, Э. Таплин 3, М. Казимирова 4, Н. Гунавардане М. Словак 4, Б. Клемпа 5, И.М. Джоунс М. Лабуда 5, Э.А. Гоулд 6, Т.С. Грицун 1

роль Структурных белков вируса клещевого энцефалита в осуществлении невиремической трансмиссии вируса между

1 Школа биологических наук, Редингский Университет (Рединг, Великобритания) 2 Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека (Иркутск) 3 Школа естественных наук, Уорикский университет (Ковентри, Великобритания)

4 Институт Зоологии (Братислава, Словакия) 5 Институт вирусологии (Братислава, Словакия) 6 Кафедра вирусологии политехнического университета (Марсель, Франция)

Ключевые слова: вирус клещевого энцефалита, трансмиссия, рекомбинантный вирус

THE role of THE structural pRoTEiNs iN THE NoN-viRAEMiC TRANsMissioN

of TiCK-BoRNE encephalitis viRus

M.A. Khasnatinov 2, Sabina Havlikova 5, Andrew Tuplin 3, Maria Kazimirova 4, Niluka Goonavardane Mirco Slovak 4, Boris Klempa 5, Ian M. Jones ', Milan Labuda 5, Ernest A. Gould 6, Tamara S. Gritsun 1

1 School of Biological Sciences, University of Reading, UK 2 Scientific Center of Family Health and Human Reproduction Problems SB RAMS, Irkutsk

3 School of Life Sciences, University of Warwick, Coventry, UK Institute of Zoology, Bratislava, Slovakia 5 Institute of Virology, Bratislava, Slovakia 6 Unit des Virus Emergents, Marseille, France

Клещевой энцефалит (КЭ) — это инфекционное заболевание, распространенное в лесной и лесостепной зоне Северной Евразии. Возбудитель КЭ — вирус, который передается человеку при укусе иксодовых клещей. Ежегодно в мире происходит порядка 10000 новых случаев заболеваний КЭ [5]. ВКЭ относится к семейству Flaviviridae род Flavivirus и в настоящее время выделяют 3 субтипа вируса — Дальневосточный, Сибирский

и Западноевропейский. Основным переносчиком первых двух субтипов является таежный клещ Ixodes persulcatus, который распространен в лесной и лесостепной зоне Азии и Восточной Европы, вплоть до Прибалтики. Основной переносчик вирусов Европейского субтипа — клещ Ixodes ricinus, обитающий в лесах Западной и Восточной Европы до Урала [6]. Геном вируса состоит из одной одноцепочечной молекулы РНК длиной

-11000 нуклеотидных оснований (н.о.). Одна открытая рамка считывания кодирует полипротеин, который расщепляется клеточными сигналазами и вирусной протеазой NS3 на 3 структурных и 7 неструктурных белков. На поверхности вириона расположены 2 структурных белка — мембранный (М) и оболочечный (Е), которые вместе с липидной мембраной образуют оболочку вириона [9]. В природе ВКЭ существует в процессе непрерывной передачи (трансмиссии) от зараженных клещей к незараженным. Существует 3 основных вида трансмиссии: невиремическая, при которой вирус передается незараженным клещам во время совместного питания в непосредственной близости с зараженным клещом [7], виремическая, при которой вирус передается клещу с кровью больного животного [1]и трансовариальная, при которой вирус передается от зараженной самки потомству [2]

Недавно было обнаружено, что эффективность невиремической трансмиссии ВКЭ Сибирского субтипа между клещами I. ricinus чрезвычайно низкая — при совместном питании с зараженными самками заражались только от 0 до 5 % нимф, в то время как для ВКЭ Западноевропейского субтипа этот показатель составлял 60 — 100 % (T.S. Gritsun и M. Labuda, неопубл.). В настоящей работе мы попытались определить, какие вирусные белки определяют эффективность невиремической трансмиссии. Для этого мы сконструировали ряд рекомбинантных вирусов, содержащих разные комбинации генов ВКЭ Сибирского и Западноевропейского субтипов, и сравнили их биологические свойства со свойствами соответсвующих типовых штаммов обоих субтипов.

материалы и методы

Для культивации ВКЭ, титрования инфекционного вируса с помощью бляшкообразующих единиц, восстановления рекомбинантных вирусов и оценки эффективности репродукции вирусов в клетках млекопитающих использовали культуру клеток эмбриона свиньи СПЭВ. Все эксперименты проводили с использованием среды RPMI1640 с добавлением 2 — 5 % сыворотки крови эмбрионов коров и антибиотиков.

Концентрацию инфекционного вируса, а также морфологию бляшек определяли с помощью титрования бляшкообразующих единиц (БОЕ\мл) согласно Gould и Clegg, 1985 [3]. Эффективность репликации ВКЭ в культуре клеток млекопитающих оценивали по скорости накопления инфекционного вируса в течение первых 48 часов после

заражения. Монослой клеток заражали из расчета 1 БОЕ на клетку, адсорбировали вирус в течение 1 часа при комнатной температуре, тщательно промывали монослой и заливали среду поддержки. Через 4, 8, 12, 16, 20, 24 и 48 часов отбирали аликвоты надклеточной среды и определяли титр инфекционного вируса.

Клещи I. ricinus были выведены в лабораторной колонии Института Зоологии Академии наук Словакии (Братислава). Эффективность невиремиче-ской трансмиссии для каждого вируса определяли следующим образом. Группу из 10 голодных самок клещей заражали инъекцией 500БОЕ исследуемого вируса на одного клеща. Зараженных клещей инкубировали при 24 ± 4 °C и влажности 85 — 90 % в течение 14 дней. Далее зараженных самок попарно прокармливали на мышах Balb/C одновременно с 15 неинфицированными нимфами I. ricinus, которые были прикреплены в непосредственной близости от самок-доноров. Открепившихся нимф и самок использовали для определения в них концентрации инфекционного вируса. Эффективность трансмиссии определяли как долю зараженных нимф. Эффективность репликации оценивали по средней концентрации инфекционного вируса в единичном зараженном клеще.

Все биологические эксперименты проводили как минимум в 3 независимых повторах. Для оценки вариабельности результатов рассчитывали стандартную ошибку средних значений.

результаты и обсуждение

При оценке эффективности репродукции рекомбинантных ВКЭ и типовых штаммов в клетках млекопитающих выяснилось, что все они способны достигать высоких титров в культуре клеток СПЭВ. Динамика репродукции вирусов оказалась практически идентичной и к 32 часу после момента заражения титры вирусов достоверно не отличались друг от друга (рис. 1).

Во взрослых клещах I. ricinus все вирусы размножались со сходной эффективностью и достигали титров 3,65 — 5,71 1од10БОЕ/мл. Интересно, что типовые штаммы размножались с практически одинаковой эффективностью — 4,56 1од10БОЕ/мл для

Рис. 1. Динамика репродукции рекомбинантных вирусов в культуре клеток млекопитающих (СПЭВ).

Vs Vs | НуprL | VS | Hvpr 1' i'M-L ] VS | Hvpr-S Ir | Hypr

Vs Vs[lKprhJ VS [11> pr PrM-F) VS[1 Ivpr-Slr] ll\pr

Рис. 2. А - репродукция рекомбинантных и исходных вирусов в нимфах I. ricinus; б - эффективность невире-мической трансмиссии рекомбинантных и исходных вирусов от самок к нимфам I. ricinus.

Vs[ns], что согласуется с высокой эффективностью репродукции этого вируса в нимфах (рис. 2Б).

Данная работа выполнена при поддержке грантов BBSRC BBS/B/00697, The Sixth EU Framework grant (VIZIER EU Contract LSHG-CT-2004-511960) и грантом MRC ID 87652. Данный проект вдохновлен идеями покойного проф. Milan Labuda, который сформулировал концепцию невиремической трансмиссии ВКЭ.

2. Danielova V., Holubova J. Transovarial transmission rates of tick-borne encephalitis virus in Ixodes ricinus ticks. In: Dusbabek F,Bukva V, eds. Modern acarology. Vol 2, Prague, Czech Republic: SPB Academic Publishing; 1991. - С. 7-10.

3. Gould E.A., Clegg J.C.S. Growth, titration and purification of togaviruses. // In: B. W. J. Mahy (ed.), Virology: A Practical Approach. — IRL Press, 1985. — P. 43 — 48.

4. Gritsun TS, Gould EA Development and analysis of a tick-borne encephalitis virus infectious clone using a novel and rapid strategy // J. Virol. Methods. — Vol. 76. — P. 109—120.

5. Kunz C., Heinz F.X. Tick-borne encephalitis. — Vaccine, 2003. — Vol. 21. — P. 1—2.

6. Lindquist L., Vapalahti O. Tick-borne encephalitis // Lancet. — 2008. — Vol. 371. — P. 1861 — 1871.

7. Non-viraemic transmission of tick-borne encephalitis virus: a mechanism for arbovirus survival in nature / M. Labuda [et al.] // Experientia. — 1993. — Vol. 49. — P. 802 — 805.

8. Nucleotide and deduced amino acid sequence of the envelope gene of the Vasilchenko strain of TBE virus; comparison with other flaviviruses / T.S. Gritsun [et al.] // Virus Res 27. — 1993. — P. 201 —209.

9. Rice C. Flaviviridae: the viruses and their rep- Virology. — Lippincot-Raven Publishers, Philadelphia lication // In: Fields, B., Knipe, M.D. (Eds.), Fields and New York, 1996.

Сведения об авторах

HavlikovaS. - Institute of Virology, Bratislava

Tuplin A. - лектор School of Life Sciences, University of Warwick

KazimirovaM. - научный сотрудник Institute of Zoology, Slovakia

GoonavardaneN. - научный сотрудник School of Biological Sceinces, University of Reading, UK

SlovakM. - научный сотрудник Institute of Zoology, Slovakia

KlempaB. - руководитель группы экологии вирусов Institute of Virology, Bratislava

JonesI.M. - глава департамента School of Biological Sceinces, University of Reading, UK

LabudaM. - профессор Institute of Virology, Bratislava