Полиморфизм генов и туберкулез

Группы больных туберкулезом

Больные туберкулезом с деструкцией легочной ткани

Больные туберкулезом без деструкции легочной ткани

Примечание. N - численность генотипов; р - достигнутый уровень значимости

Ассоциация 469+14G/C полиморфизма NRAMP1 гена, возможно, обусловлена функциональной значимостью белкового продукта гена. Белок, NRAMP1 участвует в процессе фагоцитоза и таким образом обеспечивает защиту организма от внутриклеточных микробных агентов. Вероятно, 469+14C аллель снижает функциональную активность NRAMP1, влияя на течение возникшего заболевания и обусловливая развитие деструктивных процессов при вторичном туберкулезе легких. Показано, что у японцев формирование деструкции при туберкулезе также связано с изменчивостью гена NRAMP1, ассоциацию проявил полиморфизм D543N [Abe T. et al., 2003].

При сравнении больных туберкулезом с деструкцией и без таковой со здоровыми, выявлены ассоциации аллеля 274T гена NRAMP1, +3953А2 гена IL1B, 1188С гена IL12B и аллеля А2 VNTR полиморфизма гена IL1RN с распадом ткани легкого (табл. 20). Полиморфные варианты IL1B и IL1RN регулируют эффект IL-1в и таким образом участвуют в моделировании иммунного ответа [Tarlow J.K. et al., 1993]. Обнаружено, что макрофаги больных туберкулезом отличает пониженная способность секретировать ИЛ-1в [Селедцова Г.В. и др., 1991]. Причем при деструктивном процессе наблюдалось более выраженное снижение продукции ИЛ-1, чем при отсутствии некроза легочной ткани [Хонина Н.А. и др., 2000].

Показано, что экспрессия мРНК IL-1в, индуцированная МБТ выше у субьектов IL1В(+3953)А1+ и ниже - у индивидов с IL1В(+3953)А1- гаплотипом. Также известно, что А2 аллель IL1RN приводит к повышению продукции мРНК и секреции белка IL-1RN [Wilkinson R.J. et al., 1999].

Учитывая близкое расположение IL1B и IL1RN на хромосоме 2, предположили, что гены, кодирующие эти белки, наследуются не независимо друг от друга, то есть между локусами имеется неравновесие по сцеплению. С целью подтверждения или опровержения данной гипотезы, между IL1B и IL1RN в выборке больных деструктивным туберкулезом были произведены расчеты неравновесия по сцеплению.

Частота аллеля у больных

Сравнение со здоровыми

Примечание. Обозначения см. табл. 19

Показано наличие неравновесия по сцеплению между генами, причем +3953А1 аллель IL1B и А1 аллельVNTR полиморфизма IL1RN оказались в фазе отталкивания, мера неравновесия для них составила -0,033 (р=0,009). Известно, что неравновесие по сцеплению возникает между неаллельными генами, расположенными на одной хромосоме столь близко, что частота кроссинговера приближается к нулю. Также гаметическое неравновесие может наблюдаться между генами, локализованными на разных хромосомах, что является результатом действия факторов популяционной динамики, например, естественного отбора [Животовский Л.А., 1984].

При сравнении частоты гаплотипа IL1RN*A1A1/IL1B*A1A1 в группах больных туберкулезом и здоровых индивидов найдено, что статистически чаще это сочетание встречается в контрольной выборке (ч 2 =9,10, р=0,003). Причем риск заболеть туберкулезом у носителей этого гаплотипа равен 0,50 (0,31-0,79). Таким образом, у русских жителей г. Томска гаплотип IL1RN*A1A1/IL1B*A1A1 имеет протективный эффект в отношении заболевания туберкулезом.

Для оценки тяжести туберкулезного процесса определяют распространенность патологического образования в пораженном органе. Выборку больных вторичным туберкулезом легких разделили на три группы в зависимости от объема поражения. Первую группу составили 68 больных с ограниченным по протяженности туберкулезным процессом (1-2 сегмента). Во вторую группу вошли 37 пациентов, у которых туберкулез локализовался в пределах одной доли. Третью группу составили 115 больных с распространенной формой заболевания (объем поражения - больше доли).

При сравнении этих групп найдены ассоциации генетических маркеров с распространенностью специфического процесса при туберкулезе (табл. 21). В группе больных ТБ с объемом поражения ткани легкого более доли статистически значимо чаще, чем в выборке пациентов с туберкулезом с поражением легкого менее доли, регистрировали индивидов, обладающих гомозиготным по аллелею 469+14С гена NRAMP1 и гетерозиготным генотипом (р=0,043). Таким образом, можно говорить о вкладе 469+14С аллеля гена NRAMP1 не только в формирование деструкции при туберкулезе, но и в увеличение зоны поражения. Хотя полиморфизм 469+14G/С гена NRAMP1 не проявил связь с туберкулезом, его "мутантный" аллель негативно влиял на течение возникшего заболевания, обусловливая распад ткани легкого и увеличивая объем поражения. Противоположным действием на течение туберкулезного процесса обладал полиморфизм B/b гена VDR. Аллель b этого маркера ассоциирован с ограниченным по распространенности вторичным туберкулезом (р=0,021).

Кроме того, с объемом поражения ткани легкого при вторичном туберкулезе проявили ассоциацию полиморфизмы +3953А1/А2 IL1B, 1188А/С IL12B и полиморфизм VNTR IL1RN. Различалась частота генотипов и аллелей в группе контроля и в группах больных туберкулезом разным по площади поражения ткани легкого (табл. 22).

Конкурирующие интересы: авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.

Задуманные и разработанные эксперименты: MS JK MN TO EV RC. Выполнены эксперименты: MS JK BA ES IP MO TP. Проанализированы данные: MS JK MN TO EV RC. Написал документ: MS JK LJ MN TO EV RC.

Недавние данные свидетельствуют о том, что аутофагия важна для внутриклеточного уничтожения Mycobacterium tuberculosis, а полиморфизмы в гене аутофагии IRGM связаны с восприимчивостью к туберкулезу (ТБ) среди афроамериканцев и с туберкулезом, вызванным генотипами M. tuberculosis в Гане. Мы сравнили 22 полиморфизма из 14 аутофагиальных генов между 1022 индонезийскими больными туберкулезом и 952 сопоставимыми контролями, а также между пациентами, инфицированными различными генотипами M. tuberculosis, как определено сполиготипированием. Те же аутофагиальные полиморфизмы изучались в корреляции с производством ex-vivo TNF, IL-1β, IL-6, IL-8, IFN-γ и IL-17 у здоровых добровольцев. Между ТБ и полиморфизмами не обнаружено никакой ассоциации в генах ATG10, ATG16L2, ATG2B, ATG5, ATG9B, IRGM, LAMP1, LAMP3, P2RX7, WIPI1, MTOR и ATG4C. Обнаружены ассоциации между полиморфизмами в LAMP1 (p = 0,02) и MTOR (p = 0,02) и инфицированием успешного генотипа M. tuberculosis в Пекине. Обследованные полиморфизмы не были связаны с цитокинами, индуцированными M. tuberculosis, за исключением полиморфизма в ATG10, который был связан с продуцированием IL-8 (p = 0,04). Все ассоциации обнаружили утраченное статистическое значение после коррекции для множественного тестирования. Это первое исследование широкого набора полиморфизмов в генах аутофагии не дает четкой связи с ТБ, с инфекцией генотипа вируса M. tuberculosis в Пекине или с производством провоспалительных цитокинов ex-vivo.

Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis), основная причина туберкулеза (ТБ) во всем мире, является внутриклеточным возбудителем, который в первую очередь заражает макрофаги [1], [2]. Этот патоген живет и размножается в фагосоме, происходящей от хозяина, где он сохраняется через вмешательство в биогенез фагосом-лизосом [3], [4]. Недавние исследования показывают, что аутофагия, гомеостатический процесс, связанный с регенерацией питательных веществ и иммунными реакциями, участвует во внутриклеточном убийстве M. tuberculosis
[3], [5], [6] и что физиологическая или фармакологическая индукция этого процесса in vitro (то есть: с АТФ, IFN-γ, витамин D3) способствует слиянию фагосом, содержащих M. tuberculosis с лизосомами, и последующему уничтожению патоген в аутофагических характеристических двухслойных автолизосомах [1], [3], [7]. Кроме того, было показано, что внутриклеточная выживаемость M. tuberculosis зависит от его способности избегать или ингибировать аутофагию [5], [8] и исследование Kumar et al. обнаружили, что гены, которые регулируют внутриклеточное выживание M. tuberculosis, независимо от его генотипа, находятся в самом пути аутофагии или в путях, которые влияют на аутофагию [9].

Восприимчивость к ТБ частично генетически определена, и вариации генов, участвующих в аутофагическом пути, могут влиять на реакцию хозяина на инфекцию M. tuberculosis. Действительно, мыши, дефицитные в аутофагии и связанных с аутофагами генах, оказались более восприимчивыми к инфекции M. tuberculosis
[10], [11] и человеческие мононуклеарные клетки с определенными полиморфизмами в генах, связанных с аутофагами, демонстрировали ослабленную способность контролировать рост M. tuberculosis [12], [13], что свидетельствует о том, что полиморфизмы в аутофагах и связанных с аутофагами генах могут быть связаны с ТБ. Это, по-видимому, имеет место, поскольку различные полиморфизмы в одном аутофагиальном гене IRGM, нисходящем эффекторе IFN-γ, были связаны с усиленной защитой от инфекции M. tuberculosis у афроамериканцев [14] и китайцев [15] и инфицирования специфические генотипы M. tuberculosis в Гане [16]. Кроме того, полиморфизмы в ряде генов, которые влияют на аутофагию, такие как P2RX7, также были связаны с ТБ [17], [18]. Однако, насколько нам известно, помимо ИРГМ, у больных туберкулезом не было обнаружено другого гена автофагического пути. Поэтому мы изучили выбор генов аутофагии в большой когорте пациентов с ТБ и здоровых контролях в Индонезии. Поскольку восприимчивость к ТБ может зависеть от взаимодействия между генотипом хозяина и микобактерий [2], [9], [19], мы также сгруппировали изоляты M. tuberculosis пациентов в штаммы генотипа W-Beijing, на которые приходится одна треть всех M. tuberculosis в Индонезии [20], [21] и не-W-Beijing генотипы. Кроме того, в кавказской когорте, которая была генотипирована для 22 SNP, мы измеряли продукцию цитокинов в мононуклеарных клетках периферической крови (РВМС), стимулированных M. tuberculosis.

Мы ранее завербовали пациентов с туберкулезом, которые были диагностированы в двух амбулаторных клиниках и двух больницах в Джакарте и Бандунге (Индонезия) с января 2001 года по декабрь 2006 года, для серии генетических исследований, посвященных изучению восприимчивости к туберкулезу [19], [22], [23] ,

Диагностика туберкулеза легких (ПТБ) проводилась в соответствии с критериями Всемирной организации здравоохранения путем клинического обследования и рентгенографии грудной клетки с последующим подтверждением с микроскопическим обнаружением кислотно-быстрых бацилл в мазках мокроты, окрашенных Зилем-Нильсеном, и положительной культурой M. tuberculosis на 3% среды Огава. Для анализа генотипа M. tuberculosis микобактериальную ДНК экстрагировали путем приведения 2 петель бактериальной массы из культуры M. tuberculosis в физиологический раствор и последующего нагревания при 95 ° C в течение 5 мин. M. tuberculosis определяли с использованием коммерчески доступного набора Spoligotyping (Isogen Bioscience, Maarssen, The Netherlands), как описано ранее [20]. M. tuberculosis. Печеночный генотип был определен как образец сполиго, демонстрирующий гибридизацию по меньшей мере с 3 из 9 спейсеров 35-43 и отсутствие гибридизации с разделителями 1-34. Сполиготипирование проводилось в больнице Хасана Садыкина, Бандунг, Индонезия. Кроме того, для целей контроля качества, спомотипирование 10% изолятов и всех изолятов, не имеющих гибридизации, также было выполнено в больнице Гельре, Апелдорн, Нидерланды.

Мы исключили из генетических исследований пациентов с подтвержденным диагнозом внелегочного туберкулеза (n = 93), сахарного диабета (уровень глюкозы в крови натощак> 126 мг / дл) (n = 139) и ВИЧ-положительных субъектов (n = 10). Стандартный режим лечения туберкулеза состоял из изониазида, рифампицина, пиразинамида и этамбутола (2HRZE / 4H3R3), который вводился бесплатно всем пациентам в соответствии с национальной программой борьбы с туберкулезом в Индонезии.

В течение вышеупомянутого периода мы также набирали 1000 случайно отобранных возрастных и гендерных сопоставленных, но генетически не связанных контрольных субъектов из тех же самых, в основном бедных и плотно населенных районов, где туберкулез обилен. Все контрольные люди подвергались одному и тому же физическому осмотру, анализу крови и рентгенографии грудной клетки в качестве больных туберкулезом. В исследовании было зарегистрировано в общей сложности 952 контрольных субъекта после исключения лиц с симптомами или нарушениями рентгенографии грудной клетки, что указывает на активный туберкулез или историю туберкулеза.

Структурированная анкета использовалась для пациентов и контрольных субъектов для регистрации клинической информации, возраста, пола, самости и родительской принадлежности, социально-экономического статуса и одновременной истории болезни.

Все набранные лица подписали письменное информированное согласие. Протокол исследования был рассмотрен и одобрен местными экспертными советами медицинского факультета Университета Индонезии, Институтом молекулярной биологии Эйкмана в Джакарте в Индонезии и Медицинским этическим комитетом Арнем-Неймеген в Нидерландах.

Используя базу данных SNBI SNP, мы выбрали SNP в генах аутофагии, ранее ассоциированных с ТБ (P2RX7- rs2393799 [17]), другие заболевания (ATG16L1- rs2241880 [24], [25], ATG5- rs2245214 [26] IRGM rs72553867 [27] rs4958847 [ 28] или с малой частотой аллеля не менее 5% (таблица 1).

данные из dbSNP,

данные HapMap-HCB (ханьцы из Пекина),

данные из пилотной панели низкого охвата CHB + JPT (китайские китайцы из Пекина и японцы из Токио), N.D. = нет данных, N.A. = нет известной ассоциации.

Образцы крови были получены путем венопункции. Геномную ДНК выделяли из крови ЭДТА пациентов, контролей и когорты здоровых добровольцев с использованием стандартных методов, а для генотипирования использовали 5 нг ДНК. Мультиплексные анализы были разработаны с использованием Mass ARRAY Designer Software (Sequenom), а генотипы определялись с использованием Sequenom MALDI-TOF MS в соответствии с инструкциями производителя (Sequenom Inc., San Diego, CA, USA). Вкратце, область SNP амплифицировали локус-специфической ПЦР-реакцией. После амплификации было выполнено одно базовое расширение от праймера, смежного с SNP, для введения различий в массе между аллелями. Затем последовало удаление соли и пятно продукта на целевой чип с 384 патчами, содержащими матрицу. Затем MALDI-TOF MS использовалась для выявления различий в массе, а генотипы назначались в режиме реального времени с использованием программного обеспечения Typer 4 (Sequenom Inc. San Diego, CA, USA). В качестве контроля качества 5% образцов были генотипированы в двух экземплярах, и каждая 384-луночная пластинка также содержала по меньшей мере 8 положительных и 8 отрицательных контролей, никаких несоответствий не наблюдалось. Образцы ДНК, из которых половина или более SNP не удалась (N = 90), были исключены из анализа. Варианты с коэффициентами звонка ниже 90% также были исключены из дальнейшего анализа (n = 0).

Для целей контроля качества генотип по меньшей мере двух образцов для каждого гомозиготного генотипа был подтвержден путем секвенирования с использованием метода Сангера с использованием 3-го Терминатора Big Dye (Applied Biosystems). После реакции циклической последовательности образцы очищали осаждением этанолом и анализировали на анализаторе последовательностей 3730 (Applied Biosystems).

Ранее полиморфизмы в различных генах были генотипированы в двухэтапном исследовании ассоциации генома (GWAS) с использованием исследования GoldenGate Illumina в соответствии с инструкциями производителя, целью которых было выявление генов, соответствующих чувствительности к легочному ТБ в той же индонезийской когорте, участвующей в текущем исследовании [29 ]. Среди изученных SNP пять были в аутофагиальных генах и были включены в наш анализ данных (таблица 1). Наложение результатов исследования между текущим исследованием и GWAS показано на рисунке 1.

Клетки, выделенные из здоровых кавказских добровольцев, несущих различные генотипы, были исследованы на продукцию цитокинов, индуцированную ультразвуком M. tuberculosis H37Rv (n = 67). Эти люди были в возрасте 23-73 лет, 77% были мужчинами, и ни у кого не было известного контакта с ТБ. Все дали письменное информированное согласие, и исследование было одобрено Этическим комитетом Медицинского центра им. Радбуда Неймегена, Неймеген, Нидерланды.

Образцы крови были получены путем венопункции. Фракцию мононуклеарных клеток выделяли из крови путем центрифугирования крови с помощью центрифугирования, разбавляли 1:1 в пирогенном солевом растворе над Ficoll-Paque (Pharmacia Biotech, PA, USA). Клетки промывали дважды в физиологическом растворе и ресуспендировали в культуральной среде (RPMI, Invitrogen, CA, USA), дополненную гентамицином 10 мкг / мл, L-глутамином 10 мМ и пируватом 10 мМ. Клетки подсчитывали на счетчике Coulter (Coulter Electronics), и количество было доведено до 5 × 106 клеток / мл. Всего в 100 мкл объема RPMI было добавлено 5 × 105 мононуклеарных клеток в круглодонном 96-луночном планшете (Greiner) с или без ультразвука M. tuberculosis H37Rv (конечная концентрация: 1 мкг / мл). Через 24 ч 48 ч (без сыворотки) или 7 дней инкубации (в присутствии 10% сыворотки) супернатанты хранили при -20 ° С. Концентрации цитокинов оценивали в супернатантах с использованием иммуноферментного анализа с ферментным связыванием (ELISA).

Цитокиновые измерения TNF, IL-1β, IL-6, IL-8 (после 24-часовой инкубации); IFN-γ (после 48 часов инкубации) и IL-17 (инкубация 7 дней) проводили в супернатантах с использованием коммерческих ELISA из R & D Systems, MN, USA (TNF, IL-1, IL-8 и IL-17) или Sanquin, Амстердам, Нидерланды (IL-6 и IFN-γ).

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Наследникова И. О., Уразова О. И., Воронкова О. В., Новицкий В. В., Некрасов Е. В.

Резюме. С привлечением современных молекулярно-генетических и иммунологических методов исследования освещены некоторые аспекты иммунопатогенеза туберкулеза легких. Установлено, что иммуногенетическим фактором, обладающим протективным эффектом в отношении подверженности туберкулезу легких, является аллель Т и гомозиготный генотип ТТ полиморфизма +874А/Т гена IFNγ. Подверженность туберкулезной инфекции ассоциирована с аллелем А, а также с генотипами АА и АТ полиморфизма +874A/T гена IFNγ. Течение туберкулеза легких сопровождается повышением продукции IFNγ.Abstract.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Наследникова И. О., Уразова О. И., Воронкова О. В., Новицкий В. В., Некрасов Е. В.

In present work, some immunogenetic aspects of pulmonary tuberculosis were studied, using modern techniques from molecular genetics and immunology. It is shown that carriage of Т allele and homozygous TT genotype in +874А/Т IFNγ gene polymorphism comprise a immunogenetic factor which correlated with a protective effect, regarding a susceptibility to pulmonary tuberculosis. Predisposition for tuberculosis infection is associated with A allele of this gene, as well as with АА and АТ genotypes of +874A/T IFNγ gene. Clinical evolution of pulmonary tuberculosis is accompanied by increase in IFNγ production.

АЛЛЕЛЬНЫЙ полиморфизм ГЕНА IFNy при ТУБЕРКУЛЕЗЕ ЛЕГКИХ

Никулина Е.Л., Наследникова И.О., Уразова О.И., Воронкова О.В., Новицкий В.В., Некрасов Е.В., Филинюк О.В., Чурина Е.Г., Михеева К.О., Хасанова Р.Р., Серебрякова В.А., Сухаленцева Н.А.

Резюме. С привлечением современных молекулярно-генетических и иммунологических методов исследования освещены некоторые аспекты иммунопатогенеза туберкулеза легких. Установлено, что иммуногенетическим фактором, обладающим протективным эффектом в отношении подверженности туберкулезу легких, является аллель Т и гомозиготный генотип ТТ полиморфизма +874А/Т гена IFNy. Подверженность туберкулезной инфекции ассоциирована с аллелем А, а также с генотипами АА и АТ полиморфизма +874A/T гена IFNy. Течение туберкулеза легких сопровождается повышением продукции IFNy.

Ключевые слова: туберкулез, гамма-интерферон, генный полиморфизм.

NikulinaE.L., NaslednikovaI.O., UrazovaO.I., VoronkovaO.V., Novitsky V.V., NekrasovE.V., FiliniukO.V., Churina E.G., Mikheyeva K.O., Hasanova R.R., Serebryakova V.A., Sukhalentseva N.A.

ALLELIC POLYMORPHISM OF IFNy GENE IN PATIENTS WITH PULMONARY TUBERCULOSIS Abstract. In present work, some immunogenetic aspects of pulmonary tuberculosis were studied, using modem techniques from molecular genetics and immunology. It is shown that carriage of Т allele and homozygous TT genotype in +874А/Т IFNy gene polymorphism comprise a immunogenetic factor which correlated with a protective effect, regarding a susceptibility to pulmonary tuberculosis. Predisposition for tuberculosis infection is associated with A allele of this gene, as well as with АА and АТ genotypes of +874A/T IFNy gene. Clinical evolution of pulmonary tuberculosis is accompanied by increase in IFNy production. (Med. Immunol., vol. 12, N3, pp 259-264)

Keywords: tuberculosis, interferon-y, gene polymorphism.

Туберкулез признан одной из самых серьезных медико-социальных проблем. Согласно последним статистическим данным, ежегодно количество больных туберкулезом увеличивается на 8-10 млн, около 3 млн из них умирают, причем 300 тыс. — дети [7]. Туберкулезная инфекция протекает достаточно длительное время и постепенно приводит к истощению пула участников иммунного ответа. Исследование цитокинового профиля имеет большое значение для оценки

Адрес для переписки:

Наследникова Ирина Олеговна 634057, г. Томск, ул. К. Ильмера, 8-96.

Тел.: (3822) 62-14-02.

Е-mail: ira naslednikova@mail.ru

состояния иммунной системы при заболеваниях различного генеза, в том числе и туберкулезе. В настоящее время в лечебной практике применяется исследование содержания цитокинов в зависимости от клинических и морфологических проявлений активности гранулематозного воспаления [2, 5].

Важнейшим провоспалительным цитокином является интерферон-гамма (IFNy), который продуцируется активированными Т-лимфоцитами и естественными киллерами (NK). IFNy играет ведущую роль в генезе индуцированной туберкулезным антигеном в ткани легкого гранулемы посредством экспрессии адгезивных молекул и хемокинов, необходимых для рекрутирования моноцитов/макрофагов в очаг воспаления [1]. Известно, что уровень IFNy в плазме крови

Никулина Е.Л. и др.

больных в активную фазу заболевания значительно повышен по сравнению с показателями у здоровых лиц. Большинство авторов склонно считать это показателем активности специфического процесса при туберкулезе [12]. Многочисленными экспериментальными исследованиями было показано, что недостаточная продукция IFNy ведет к неспособности организма ограничивать рост и размножение внутриклеточных микобактерий, и заболевание протекает тяжело, нередко с осложнениями и имеет неблагоприятный исход. В то же время более высокий уровень спонтанной и индуцированной продукции IFNy предопределяет и более благоприятный исход туберкулезного процесса [9].

Тот факт, что не у каждого человека, в организм которого попадают Mycobacterium tuberculosis, развивается заболевание, определяет существование в человеческой популяции групп риска. Одним из возможных факторов риска развития туберкулеза является генетическая предрасположенность [4]. Современные методы исследования позволяют находить иммуногенетические маркеры, а также выявлять ассоциации между структурой определенных кластеров генов и заболеваниями. Большое внимание уделяется изучению роли полиморфизмов гена IFNy в развитии заболеваний. По данным литературы, полиморфизм +874A/T гена IFNy связан с восприимчивостью к атипичной пневмонии, с тяжелым острым респираторным синдромом, туберкулезом и гепатитом В [8, 10, 18]. Также данный полиморфизм является маркером проявления артрита при системной красной волчанке [19].

Таким образом, изучение роли характера распределения аллельного варианта промоторного региона +874A/T гена IFNy, а также степени его ассоциированности с уровнем продукции соответствующего белкового продукта в иммунопатогенезе туберкулезной инфекции представляется весьма актуальным.

Материалы и методы

В программу исследования вошли 152 пациента европеоидного происхождения, проживающих на территории г. Томска и Томской области, с впервые выявленным инфильтративным туберкулезом легких (88 мужчин и 64 женщины в возрасте от 19 до 55 лет, средний возраст — 31,5±2,5 года), находившихся на стационарном лечении в Томской областной клинической туберкулезной больнице (главный врач — к.м.н. Янова Г.В.). Диагноз заболевания устанавливали на основании клинической картины заболевания, данных рентгенографии легких, результатов микроскопического и бактериологического исследования мокроты. Клиническая картина инфильтратив-

ного туберкулеза легких характеризовалась наличием синдрома воспалительной интоксикации (повышение температуры тела, ночные поты, озноб, повышенная утомляемость, слабость, снижение или отсутствие аппетита, потеря массы тела, тахикардия) и бронхолегочных симптомов (кашель более двух-трех недель, выделение мокроты, кровохарканье, одышка, боль в грудной клетке, связанная с дыханием). Бактериовыде-ление регистрировалось у 100% обследованных пациентов. Обследование пациентов проводили до начала специфической противотуберкулезной химиотерапии. В контрольную группу были включены 122 здоровых донора с сопоставимыми характеристиками по полу и возрасту, с отсутствием легочного анамнеза, патологических изменений в легких при обзорной рентгенографии, хронических инфекционных заболеваний, аллергических реакций и острых респираторных заболеваний в течение 3 месяцев, предшествующих исследованию.

Полиморфизм гена IFNy при туберкулезе легких

Для проверки нормальности распределения показателей использовали критерий Колмогорова—Смирнова; равенство выборочных средних проверяли по U-критерию Манна-Уитни. Распределение генотипов по исследованным полиморфным локусам проверяли на соответствие равновесию Харди-Вайнберга с помощью точного теста Фишера. Для сравнения частот аллелей между различными группами использовали критерий х2 Пирсона и точный тест Фишера. Обработку результатов генетических исследований осуществляли с помощью критерия отношения шансов (OR) с расчетом для него 95% доверительного интервала.

Результаты и обсуждение

Рассматривая проблему туберкулезной инфекции на молекулярном и клеточном уровнях, вероятно, нельзя четко разграничить значение биологических свойств Mycobacterium tuberculosis и иммунной системы макроорганизма. Благоприятный исход туберкулезной инфекции, с одной стороны, определяется патогенностью штамма возбудителя, с другой - адекватным противоинфекционным ответом со стороны системы иммунитета. Ключевым моментом, определяющим исход данной патологии, является баланс продукции цитокинов иммунокомпетентными клетками [3].

При туберкулезе легких развивается вторичная иммунологическая недостаточность, которая в большей степени затрагивает клеточное звено иммунной системы. В первую очередь проникшие в организм Mycobacterium tuberculosis поражают макрофагальное звено иммунитета, т.к. способны к паразитированию внутри фагоцитов, снижая их функциональную активность. Невозможность элиминации антигена макрофагами приводит к привлечению в очаг воспаления большого количества иммунокомпетентных клеток, а так как патоген занимает внутрикле-

точное положение, то в ответ на него активируется ТЫ-звено иммунной системы [13]. Логично предположить, что в случае проникновения в макроорганизм инфекционного агента, склонного к внутриклеточному паразитированию, поляризация иммунного ответа в направлении активации гуморального звена будет неблагоприятной. Известно, что гуморальный и клеточный иммунный ответ — два альтернативных пути, баланс которых главным образом определяется взаимоотношением CD4+ Т-лимфоцитов I и II типов [16].

ТЫ-лимфоциты, секретируя IFNy, фактор некроза опухолей TNFa и интерлейкин IL-2, играют защитную роль при туберкулезной инфекции, тогда как производство ^2-лимфоцитами IL-4, IL-6, IL-10 и трансформирующего фактора роста TGF-в способствует прогрессированию патологического процесса и его клинической манифестации. Невозможность элиминации Mycobacterium tuberculosis из организма может быть связана с неадекватным уровнем реагирования клеточного звена иммунитета, т.е. преимущественной реализации иммунного ответа по гуморальному типу [11].

Как показали проведенные нами исследования, у больных туберкулезом легких обнаруживается повышение спонтанной продукции IFNy мононуклеарами периферической крови относительно соответствующих показателей у здоровых индивидов (табл. 1). Обнаруженное увеличение продукции IFNy могло быть обусловлено несколькими причинами. С одной стороны, данный факт можно рассматривать как универсальную реакцию иммунной системы на подавление размножения Mycobacterium tuberculosis. Роль IFNy в противотуберкулезном иммунном ответе обусловлена его активирующим влиянием на фагоцитарную активность макрофагов, прямую цитотоксичность Т-лимфоцитов [14]. Следует заметить, что увеличение концентрации IFNy, вероятнее всего, могли поддерживаться за счет секреторных способностей NK-клеток, количество которых в крови у больных туберкулезом легких возрастает. В условиях дефицита Т-лимфоцитов NK-клетки, активность которых под влиянием IFNa или IL-12 повышается в десятки раз, могут компенсировать некоторые их функции, например продукцию IFNy [1]. С другой стороны, наличие повышенного уровня IFNy может указывать на то, что он определяет интерфероногенную активность самого возбудителя [9].

В промоторной зоне гена IFNy известен полиморфизм +874A/T, который относится к заменам SNP (single-nucleotide polymorphism) и характеризуется сменой аденинового нуклеотида на тиминовый. В ходе иммуногенетического исследования было выявлено, что среди больных

Никулина Е.Л. и др.

ТАБЛИЦА 1. УРОВЕНЬ СЕКРЕЦИИ IFNy (ПГ/МЛ) МОНОНУКЛЕАРАМИ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ У БОЛЬНЫХ

туберкулезом легких и у здоровых доноров, me (Q25%:Q75%)

Регистрируемый показатель Здоровые доноры Больные туберкулезом легких

IFNy 31,91 (30,05:40,44) 98,2 (54,8:147,3) p Не можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Регистрируемый показатель Здоровые доноры Больные туберкулезом легких

АА 44,73 (43,66:44,73) PAA/AT = 0,013 152,4 (142,9:166,35) р = 0,018 pAA/AT = 0,061

АТ 33,69 (26,6:40,44) pAT/TT = 0,905 105,5 (98,18:129,9) р = 0,001 pAT/TT = 0,036

ТТ 30,9 (29,9:31,91) pAA/TT = 0,009 58,34 (38,57:78,17) р = 0,039 pAA/TT = 0,064

Примечание. рдд/дТ, рдТ/тт, р^дт - достоверность различий показателей в зависимости от аллельного варианта локуса +874A/T гена IFNy.

Полиморфизм гена IFNy при туберкулезе легких

Таким образом, нами установлено значительное изменение соотношения аллельных вариантов промоторного +874A/T гена IFNy у больных туберкулезом легких. Эти данные вскрывают новые механизмы реализации предрасположенности человека к развитию туберкулеза легких и позволяют сделать предположение о причинах избирательности развития туберкулеза среди лиц, проживающих в одинаковых социальных условиях, ведущих сходный образ жизни и при равноценном воздействии общеизвестных факторов риска.

1. Воронкова О.В., Уразова О.И., Новицкий В.В., Стрелис А.К. Иммунопатология туберкулеза легких. — Томск: Изд-во Том. ун-та, 2007. - 194 с.

2. Гунтупова Л.Д., Борисов С.Е., Купавце-ва Е.А. Цитокиновый профиль при гранулематозных болезнях легких // Проблемы туберкулеза и болезней легких. — 2006. — № 6. — С. 10-13.

3. Еремеев В.В., Майоров К.Б. Взаимодействие макрофаг-микобактерия в процессе реакции микроорганизма на туберкулезную инфекцию // Проблемы туберкулеза и болезней легких. — 2002. — № 3. — С. 54-57.

4. Ерохин В.В., Земскова З.С. Современные представления о туберкулезном воспалении // Проблемы туберкулеза и болезней легких. — 2003. — № 3. — С. 11-21.

5. Кноринг Б.Е., Елькин А.В., Смирнов М.Н. Иммунокоррекция Ронколейкином при туберкулезе легких // Проблемы туберкулеза и болезней легких. — 1999. — № 5. — С. 26-36.

6. Новицкий В.В., Синицына В.А., Воронкова О.В. Цитокинпродуцирующая активность мононуклеарных лейкоцитов периферической крови у больных туберкулезом легких до лечения и на фоне химиотерапии // Проблемы туберкулеза и болезней легких. — 2005. — № 6. — С. 39-42.

7. Онищенко Г.Г. Эпидемическая ситуация в Российской Федерации и меры по ее стабилизации // Проблемы туберкулеза и болезней легких. — 2003. — № 1. — С. 4-9.

8. Рыдловская А.В., Симбирцев А.С. Функциональный полиморфизм TNFa и патология // Цитокины и воспаление. — 2005. — Т. 4, № 3. — С. 4-9.

9. Салина Т.Ю., Морозова Т.И. Продукция ИФН-у мононуклеарными клетками крови больных при разных типах течения туберкулезного процесса // Проблемы туберкулеза и болезней легких. — 2004. — № 10. — С. 19-21.

10. Симбирцев А.С., Громова А.Ю. Функциональный полиморфизм генов регуляторных молекул воспаления // Цитокины и воспаление. — 2005. — Т. 4, № 1. — С. 3-10.

11. Хаитов Р.М. Физиология иммунной системы. — М.: ВИНИТИ РАН, 2001. — 223 с.

12. Шкарин А.В., Белоусов С.С., Аникина О.А. Уровень цитокинов в плазме крови у больных активным инфильтративным туберкулезом легких // Проблемы туберкулеза и болезней легких. — 2008. — № 8. — С. 34-38.

13. Maher D., Raviglione M. Global epidemiology of tuberculosis //Clin. Chest .Med. — 2005. — Vol. 26. — Р. 167-169.

14. Mitchell S.A., Grove J., Scurland A. Association of the tumour necrosis factor-a — 308 but not the interleukin 10 — 627 promoter polymorphism with genetic susceptibility to primary sclerosing cholangitis // J. Gut. — 2001. — Vol. 49. — P. 288-294.

15. Moraes-Vrsconelos D., Orii N.M., Romano C.C. Characterization ofthe cellular immune function of patients with chronic mucocutaneous candidiasis // Clin. Exp. Immunol. — 2001. — Vol. 123. — P. 247-253.

Никулина Е.Л. и др.

16. Ryan A.W, Mapp J., Myna S. Levels of interpopulation differentiation among different functional classes of immunologically important genes // Genes Immun. - 2006. - Vol. 7. - Р 179.

17. Pedroza-Gonzalez A., Garcia-Romo G.S., Aguilar-Leon D. In situ analysis of lung antigen-presenting cells during murine pulmonary infection with virulent Mycobacterium tuberculosis // Int. J. Exp. Pathol. - 2004. - Vol.85. - P.135-145.

18. Pereira C.B., Palaci M., Leite O.H. Interferon-y-Receptor deficiency in an infant with fatal bacille

Calmette-Guerin infection // Microb. Infect. -2004. - Vol. 6. - P. 25-33.

19. Quesniaux V., Fremond C., Jacobs M. Tolllike receptor pathways in the immune responses to mycobacteria // Microbes Infect. - 2004. - Vol. 6. -P. 946-959.

поступила в редакцию — 14.08.2009 принята к печати — 12.11.2009