С момента открытия в 1882 году Робертом Кохом возбудителя туберкулеза началась эпоха поиска путей диагностики этой инфекции. Особенностью туберкулеза является то, что заболевание может существовать в разных ипостасях: от инфицирования и латентной инфекции до активных и остро прогрессирующих форм. При наличии бактериовыделения выявить туберкулез легко, но это свидетельствует о поздней диагностике. Такие пациенты опасны для окружающих. Один больной хронической формой за один год заражает до 10-20 человек. Чаще инфицируются дети, особенно без вакцинации БЦЖ. Для выявления скрытой инфекции в 1907 году немецкий ученый фон Пирке предложил проводить пробу с разными разведениями туберкулина, а француз Манту рекомендовал использовать две туберкулиновые единицы (ТЕ) для раннего выявления туберкулеза. В 1932 году произведен очищенный туберкулин, позволивший исключить реакции на другие компоненты раствора.
С 1965 года проба Манту с 2 (ТЕ) PPD (англ. purified protein derivative), т.е. ППД-Л – белковый раствор для внутрикожного введения, с модификацией отечественного ученого Линниковой внедрен в СССР. Туберкулин не содержит возбудителя, являясь белковым раствором, который не может вызвать инфекционного процесса, а только диагностировать специфическую аллергическую реакцию замедленного типа, которая проявляется не ранее чем через 72 часа. В основном в препарате отсутствуют балластные примеси, однако он может содержать их в незначительно-минимальных количествах, что может влиять на результат реакции в первые, вторые сутки от момента введения. С помощью реакции Манту с 2 ТЕ выявляют момент первого попадания возбудителя туберкулеза в организм ребенка (вираж туберкулиновых проб или гиперергическую реакцию).
В 60-х годах прошлого века начали использовать вакцинацию в качестве профилактики распространенных, остропрогрессирующих форм туберкулеза, нередко приводящих к летальным исходам. Введение вакцины БЦЖ или БЦЖ-м снизило диагностическую ценность туберкулиновых проб из-за развития поствакцинного иммунитета. С одной стороны это затрудняет интерпретацию результатов туберкулиновых проб. С другой стороны рядом ученых доказано, что туберкулиновая проба косвенно является функциональной характеристикой иммунной системы. Правильная интерпретация результатов туберкулиновой чувствительности позволяет оценить состояние клеточного иммунитета. То есть помимо обследования для раннего выявления туберкулеза, туберкулиновые пробы могут сказать о состоянии иммунореактивности организма, что особенно важно у часто болеющих детей. Большое заблуждение, когда родители считают, что врач ставит диагноз туберкулеза только по математической разнице между результатами за прошлый и нынешний год. Следует признаться, что врачу приходится одновременно учитывать более десяти разных параметров, характеризующих состояние человеческого организма.
За сто лет использования туберкулинового теста изменились условия жизни: отмечен рост аллергических заболеваний в популяции, увеличение числа детей, реагирующих на введение 2 ТЕ развитием аллергических реакций немедленного типа, которые дают ложное представление о туберкулиновой чувствительности и, соответственно, туберкулезной инфекции. Из-за этого туберкулиновая проба имела много нареканий со стороны родителей детей. К сожалению, отказаться от нее на современном этапе невозможно по причине необходимости проведения вакцинации детям в возрасте 6-7 лет, имеющих отрицательные реакции на туберкулин. Полный отказ от вакцинации в России невозможен из-за высокого риска инфицирования, который превышает порог, допускающий не проводить прививки БЦЖ, в 10 раз!
В 2010 году в России зарегистрирован тест QuantiFeron-ТВ, а в 2014 году – T-SPOT-TB. При этом в лабораторных условиях определяется уровень γ-интерферона или Т-лимфоцитов, продуцирующих γ-интерферон в ответ на стимуляцию белками ESAT-6, CFP-10, ТВ.В7,7. Оба импортных теста не являются обязательными и проводятся только на коммерческой основе в частных лабораториях. Показаниями для проведения тестов QuntiFeron-ТВ и T-SPOT-TB вне организма человека являются наличие у пациента ВИЧ-инфекции, возраст детей до четырёх лет, атопический дерматит, планирование трансплантации органов и тканей, анти-ФНО-терапия и наличие почечной недостаточности.
Иммунологические методы исследования у больных туберкулезом
Оценка состояния основных систем иммунитета, определение их клеточных структур, а также степени развития специфических иммунологических реакций могут помогать в решении ряда задач в клинике туберкулеза: активность процесса, характер течения заболевания, дифференциальная диагностика. Уточнение иммунологического статуса больного важно перед оперативным вмешательством, а также при определении показаний к назначению иммуномодуляторов.
Иммунологические методы применяют для диагностики лекарственной непереносимости, возникающей в процессе химиотерапии. Для оценки иммунного статуса больных используют набор иммунологических методов: тесты оценки состояния Т- и В-лимфоцитов и их субпопуляций (особенно регуляторных) с количественной характеристикой и определением функциональной активности иммунокомпетентных клеток, определение сенсибилизированных к соответствующим антигенам Т- и В-лимфоцитов или их продуктов (медиаторов и антител).
Ценную информацию могут дать исследования, направленные на обнаружение антигенов микобактерий или других микроорганизмов в таком наиболее доступном материале, как кровь [Авербах М. М. и др., 1984]. Важное значение имеет определение факторов неспецифической реактивности, к которым относятся, например, различные компоненты системы комплемента. Широко используются также реакции для определения функции фагоцитов (полинуклеаров и макрофагов, особенно альвеолярных) при легочных заболеваниях, а также различных сывороточных белков, гормонов и др.
Тесты количественной и функциональной оценки Т-лимфоцитов и их субпопуляций. Розеткобразование с бараньими эритроцитами. Установлено, что розетки с эритроцитами барана образуют Т-лимфоциты [Чередеев А. Н., 1976; Jondal М. et al., 1972]. Для постановки данного теста выделяют лейкоцитарную массу путем отстаивания гепаринизированной или дефибринированной крови (спонтанное отстаивание или с добавлением желатина), затем лейкоциты осаждают центрифугированием либо лимфоциты выделяют из цельной крови центрифугированием в градиенте фиколл/гепак (уротраст, изопак, верографин). После этого лимфоциты соединяют с эритроцитами барана и через определенный срок инкубации готовят мазки, которые фиксируют глутаровым альдегидом и окрашивают азурэозином (или просматривают в камере Горяева нативные препараты).
В препаратах определяют процент лимфоцитов, образовавших розетки с эритроцитами (не менее 3 эритроцитов, прикрепившихся к одному лимфоциту). Рекомендуется также пересчет количества розеткообразующих клеток в абсолютных показателях (так как число лимфоцитов в крови при различной патологии, естественно, имеет большие колебания). В норме в крови обнаруживается 50-70% розеткообразующих Т-клеток.
Для определения и подсчета Т-лимфоцитов используют моноклональные антитела (ОКТ или других серий) против маркеров Т-лимфоцитов. Проба состоит из этапов добавления моноклональных антител к взвеси лимфоцитов, антисыворотки против иммуноглобулинов, включающей, например, радиоактивную или флюоресцирующую метку, с последующей ее регистрацией.
Реакция стимуляции Т-лимфоцитов митогенами. Показано, что ряд митогенов, в первую очередь таких, как фитогемагглютинин (ФГА) и конканавалин А (кон-А), вызывают бласттрансформацию и митозы Т-лимфоцитов [Ling М., 1975]. Для постановки теста с ФГА лейкоциты или лимфоциты выделяют описанным выше способом и затем культивируют в присутствии митогена в течение 72 ч. По окончании культивирования готовят мазки, которые окрашивают азурэозином или другим методом и определяют процент властных клеток (молодых клеточных форм) и/или митозы. В норме в культурах с ФГА обнаруживается 60-95% властных клеток.
Другим способом оценки активации лимфоцитов под действием митогенов является определение включения 3Н-тимидина (или других меченых предшественников нуклеиновых кислот или аминокислот) в ДНК. 3Н-тимин добавляют в культуры лимфоцитов за 2-12 ч до конца культивирования. После инкубации клеточную массу отмывают, лизируют NaOH, тиамином или растворителем NCS (для выхода включенной радиоактивности в жидкость), помещают в сцинтилляционную жидкость и определяют число импульсов в опыте (культура с ФГА) и контроле (без ФГА) в жидкостном сцинтилляционном счетчике (например, отечественный счетчик СБС).
Определение субпопуляций Т-лимфоцитов производят различными способами. Существуют способы определения по степени связывания этих клеток с эритроцитами барана (активное, авидное, стабильное, аффинное розеткообразование, гигантские розетки и т. д.), по чувствительности к теофиллину и др. Наиболее признанным и распространенным методом является определение количества Т-хелперов (индукторов и Т-супрессоров) цитотоксических лимфоцитов по наличию на их поверхности рецепторов для Fc-фрагментов IgM и IgG (Тр и Ту-лимфоциты) [Петров Р. В. и др., 1980; Moretta A. et al., 1977].
Для постановки данного теста используют эритроциты быка, покрытые кроличьими антителами класса IgM (для определения Т-хелперов) и IgG (для определения Т-супрессоров). Реакция состоит из нескольких этапов. Вначале выделяют лимфоциты на градиенте фиколл/верографин, от макрофагоподобных примесей освобождаются при инкубации клеток на пластиковых чашках Петри. Неприлипшие лимфоциты смешивают с эритроцитами барана, обработанными нейраминидазой. После инкубации вновь отделяют на градиенте Т-лимфоциты, образовавшие розетки с эритроцитами (в осадке при центрифугировании), от В-лимфоцитов (в интерфазе).
Этот этап можно повторить для лучшей очистки. Розетки разделяют хлоридом аммония или дистиллированной водой, и освобожденные Т-лимфоциты используют в реакции розеткообразования с эритроцитами быка с IgGантителами для определения Ту-лимфоцитов (супрессоров). После 12-часовой инкубации в термостате в культуральной среде, содержащей 15-20% телячьей эмбриональной сыворотки и некоторые добавки, для восстановления IgM-рецепторов Т-клетки используют в реакции розеткообразования с эритроцитами быка, покрытыми IgM-антителами для определения Т-лимфоцитов (хелперов).
Для функциональной оценки субпопуляций Т-хелперов и Т-супрессоров можно разделить эти клетки (после постановки реакций розеткообразования) центрифугированием в том же градиенте фиколя/верографин как это описано выше (см. выделение чистой взвеси Т-лимфоцитов). Получены моноклональные антитела (например, ОКТ4 и ОКТ8 или других серий) для определения Т-хелперов или Т-супрессоров.
Определение супрессорной активности лимфоцитов (мононуклеаров) [по Петрову Р. В. и др., 1980]. Супрессивная активность мононуклеаров может быть определена при активации кон-А, используемого в относительно высокой концентрации или в так называемом спонтанном варианте. В первом случае испытывается действие на реакцию стимуляции тест-лимфоцитов в культуре с ФГА. Лимфоциты выделяют из крови больного (в градиенте фиколл/верографин), инкубируют в течение 24 ч в культуральной среде в присутствии кон-А, затем их рост останавливают митомицином С.
Во втором случае применяют свежевыделенные лимфоциты больного, обработанные митомицином С и предварительно неинкубированные. Тест-лимфоцитами могут служить аутолимфоциты, свежевыделенные из крови больного, либо лимфоциты донора. В разных количествах их смешивают с лимфоцитами, супрессивное действие которых используется, и определяют их активность в стимуляции бласттрансформации или синтеза ДНК в стандартной реакции с ФГА.
По данным Р. В. Петрова и соавт. (1980), у здоровых людей примерно в 13% случаев может быть обнаружена не супрессия, а активация пролиферации тест-лимфоцитов в указанных условиях. Mizarski и соавт. (1981) указывают, что активация чаще происходит при использовании низких концентраций кон-А (5 мкг/мл), при повышении дозы (до 20 мкг/мл) активация может проявляться только при уменьшении (до 24 ч) времени инкубации. Czernicki и соавт. (1981) при обработке мононуклеаров 40 мкг/мл кон-А ни в одном случае не обнаружили активацию. Для оценки специфического клеточного противотуберкулезного иммунитета чаще используют реакции стимуляции лимфоцитов туберкулином (ППД) и торможения миграции лейкоцитов с тем же антигеном.
Реакция стимуляции лимфоцитов с ППД служит для определения степени сенсибилизации к микобактериальным антигенам (реакция обусловлена взаимодействием Т-клеток с ППД). Методика постановки реакции при морфологическом учете бласттрансформации или при оценке степени синтеза ДНК не отличается от учета реакции с ФГА (срок культивирования 96 ч, доза ППД варьирует от 10 до 200 мкг). У здоровых туберкулинотрицательных людей показатель реакции обычно не превышает 1% (при морфологическом учете).
Реакция торможения миграции с ППД предназначена для тех же целей, что реакция бласттрансформации. Лейкоциты получают, центрифугируя плазму, выделенную из крови одним из описанных выше методов (см. постановку реакции бласттрансформации с ФГА). Осадок лейкоцитов набирают в стеклянные капилляры диаметром 1 мм, центрифугируют в них и помещают в культуральные камеры, содержащие питательную среду (контроль) и ППД (опыт). Результат реакции оценивают через 24 ч по соотношению площадей, занимаемых мигрирующими клетками в опыте и контроле. ППД применяют в концентрации 100-200 мкг/мл. У здоровых людей индекс реакции обычно варьирует от 0,8 до 1,2 (в зависимости от дозы антигена и наличия сенсибилизации клеток). Применяют также иные варианты метода, например миграцию лейкоцитов в агарозе [Стрельцов В. П., Владимирский М. А., 1977].
Тесты оценки количества и реактивности В-клеток. Комплементарные розетки. Установлено, что в присутствии комплекса эритроциты — антисыворотка и комплемент розетки с эритроцитами (например, человека) образуют В-лимфоциты [Mendes М. et al., 1973]. Для постановки данного теста лимфоциты выделяют теми же способами, которые описаны выше. Затем тест-эритроциты человека (лучше с кровью группы 0) инкубируют с антиэритроцитарной сывороткой (получаемой от кроликов, иммунизированных эритроцитами человека). Следующий этап — инкубация эритроцитов, нагруженных антиэритроцитарными антителами, с комплементом (источник комплемента — донорская сыворотка крови человека). После этого готовую систему эритроциты — антитела к ним и комплемент соединяют с испытуемыми лимфоцитами, фиксируют их глутаровым альдегидом, делают мазки. Последний этап — окраска и подсчет розеткообразующих лимфоцитов — осуществляют тем же способом, что и при определении Т-розеток. В норме в периферической крови обнаруживают 10-20% комплементарных розеток.
Существуют и другие способы определения и подсчета В-лимфоцитов, основанные на выявлении поверхностных маркеров этих клеток, например по наличию иммуноглобулиновых рецепторов с использованием системы эритроциты + антитела в методе розеткообразования. В-лимфоциты также могут образовывать розетки с эритроцитами мышей, в норме обнаруживается примерно 15-20% таких В-клеток. В последние годы появилась возможность определять количество В-клеток с помощью моноклональных антител, полученных против их маркеров, аналогично определению других популяций и субпопуляций иммунокомпетентных клеток.
Определение иммуноглобулинов сыворотки крови методом иммунодиффузии по Mancini и соавт. (1965). Содержание иммуноглобулина в периферической крови отражает функцию В-клеток, поскольку данные белки являются продуктами клеток этой популяции. Для постановки теста исследуемые сыворотки помещают в лунки в агаровом геле, содержащем антииммуноглобулиновые сыворотки (анти-IgG, IgM, IgA). Результат реакции оценивают, измеряя диаметр колец преципитации, после чего вычерчивают график зависимости квадратов радиусов колец преципитации от концентрации исследуемого иммуноглобулина в стандартной сыворотке. Вычислив квадрат радиуса кольца преципитации исследуемой сыворотки и антисыворотки и отложив это значение на графике, можно узнать количество иммуноглобулина в каждой исследуемой сыворотке. Необходимо помнить, что нормальное количество иммуноглобулинов различных классов у здоровых людей варьирует в зависимости от возраста.
Реакция стимуляции В-лимфоцитов липополисахаридом (ЛПС). Известно, что существует ряд митогенов, которые вызывают трансформацию В-клетки (например, ЛПС Е. coli, S. marcesscens, декстрансульфат). Для постановки этого теста лейкоциты и лимфоциты получают описанным выше способом, затем их инкубируют с ЛПС в течение 72-96 ч и готовят мазки, в которых определяют число бластных клеток. Можно также учитывать активность В-лимфоцитов по степени включения 3Н-тимидина, как это описано для постановки РБТ с ФГА. Специфический гуморальный иммунитет можно оценить по количеству антител к антигенам микобактерий, выявляемых в сыворотке крови больных с помощью различных сывороточных тестов.
Реакция агрегатгемагглютинации. Данная реакция является высокочувствительным вариантом реакции пассивной (непрямой) гемагглютинации. Эритроциты обрабатывают глутаровым альдегидом, затем нагружают туберкулином (ППД). В модификации реакции гемагглютинации Миддлбрука — Дюбо туберкулином нагружают нативные, а в модификации Бойдена — обработанные таннином эритроциты. Затем эритроциты соединяют с сывороткой, в которой выявляют противотуберкулиновые антитела. Диагностическим титром, по данным разных авторов, считается 1:8-1:16.
Реакция потребления комплемента (РПК) является модификацией реакции связывания комплемента. В отличие от последней в ней используют комплемент, имеющийся в сыворотке, в связи с чем сыворотки не подвергаются температурной инактивации. Это выгодно отличает данную реакцию от ее прототипа, поскольку температурная обработка нередко снижает титр антител. РПК проводят в два этапа. Первый — взаимодействие антител, имеющихся в сыворотке крови больного, и антигена (например, ППД) и присоединения к комплексу антиген — антитело комплемента, содержащегося в исследуемой сыворотке.
Определение иммунных розеткообразующих лимфоцитов. Эта методика служит для количественного определения В-лимфоцитов, специфически сенсибилизированных к антигенам микобактерий. Лимфоциты выделяют обычным способом. Эритроциты человека (лучше с кровью группы 0) обрабатывают таннином и ППД. Как и в описанных выше других модификациях теста розеткообразования, эритроциты соединяют с лимфоцитами и определяют число розеток в окрашенных препаратах [Вахидова Г. А., 1977]. У здоровых людей обнаруживается 1-3% таких розеток.
Туберкулинпровокационные тесты. Информативность различных иммунологических методов в значительной степени повышается, если постановку тестов на специфический гуморальный (например, РАГА) и/или клеточный (например, РБТ и РТМ) иммунитет сочетать с подкожным введением ППД (провокация). Иммунологические реакции ставят до и через 48 ч после подкожного введения ППД (в среднем 20 ТЕ детям и 50-100 ТЕ взрослым) [Гергерт В. Я., Борзенко А. С., 1973; Гергерт В. Я., 1984].
А. Е. Рабухин и соавт. (1980), С. М. Лобанова (1982) успешно применили иммуноглобулино-туберкулиновую пробу. Авторы определяли количество иммуноглобулинов классов G, А и М до подкожной провокации ППД, через 48 ч после нее и повторно через 7 дней. Также определяют число иммунных розеткообразующих лимфоцитов в сочетании с подкожной провокацией ППД. Интерпретация результатов иммунологического исследования при туберкулезе приносит наибольшую пользу, если она осуществляется в сопоставлении с клинической характеристикой.
При активном туберкулезе показатели специфических иммунологических тестов обычно бывают положительными. В различные фазы течения активного туберкулеза эти показатели могут значительно варьировать. Так, по результатам, полученным при использовании реакций бласттрансформации и торможения миграции с ППД, первая реакция наиболее выражена при благоприятном течении процесса с быстрым рассасыванием специфических поражений (показатели более 10% властных клеток), а вторая — при прогрессирования процесса (индекс ниже 0,4-0,5) и наоборот. Наиболее высокие титры противотуберкулезных антител (1:256-1:1024) встречаются при выраженной активности процесса и начавшейся положительной динамике.
В эти же сроки можно отметить и самый высокий процент (5-10) обнаружения иммунных розеткообразующих лимфоцитов. По данным В. Я, Гергерта (1984), при вспышке заболевания уровень бластообразования в ответ на ФГА и число Т-розеткообразующих лимфоцитов оказываются сниженными (соответственно 45-60% и 35-50%). В активной фазе туберкулеза несколько повышены (15-25%) содержание В-розеткообразующих лимфоцитов и уровень иммуноглобулинов некоторых классов (чаще IgA и IgG).
Выявление скрытой активности. При минимальной активности туберкулезного процесса показатели иммунитета в основном нормализуются и приближаются по своим значениям к значениям, характерным для лиц с неактивными изменениями или для здоровых людей. В указанный период патологического процесса обычно не отмечается нарушений общих механизмов клеточного и гуморального иммунитета по количественным и функциональным характеристикам, показатели специфических тестов могут быть незначительно более выраженными (РБТ и уровень противотуберкулезных антител) по сравнению с таковыми при неактивном процессе или отрицательными (РТМ).
С помощью так называемых туберкулинпровокационных иммунологических тестов минимальную активность можно установить быстро и в достаточно высоком проценте случаев (75-90, по данным разных авторов). Обычно для этого применяют специфические клеточные иммунологические реакции в сочетании с подкожным введением ППД [Гергерт В. Я., Борзенко А. С., 1973; Рудой Н. М. и др., 1979; Гергерт В. Я., 1984]. Через 48 ч после такой провокации изменение показателей РБТ с ППД в сторону снижения не менее чем на 20% от первоначального уровня и уменьшение индекса РТМ с ППД не менее чем на 0,11 и ниже 0,8 указывают на наличие такой активности.
Иммуноглобулино-туберкулинпровокационный тест применялся [Лобанова С. М., 1982] для оценки активности туберкулеза легких, при этом учитывались изменения уровня иммуноглобулинов, особенно через 2 сут и неделю после провокации. Постепенное нарастание количества этих белков свидетельствует об отсутствии активности патологического процесса, а резкое повышение (через 48 ч) с последующим снижением (через 7 дней) — о ее наличии.
При успешной химиотерапии нарушения характеристик различных систем иммунокомпетентных клеток, как правило, быстро ликвидируются, а показатели специфических иммунологических тестов претерпевают описанные выше изменения, соответствующие благоприятному течению туберкулеза. Наблюдение в динамике позволяет контролировать эффективность лечения. Быстрое и эффективное восстановление показателей иммунитета совпадает по срокам (а иногда и предшествует) с быстро наступающей положительной динамикой. Сохранение нарушений иммунитета, как правило, наблюдается при торпидном, затяжном течении туберкулеза и неэффективной химиотерапии. Так, если в процессе лечения не восстанавливаются до нормы количество и функциональная активность Т-лимфоцитов, у таких больных возможны обострения. Стойкое сохранение подобных дефектов после окончания основного курса лечения должно настораживать клинициста в отношении появления рецидивов.
Иммунологическое исследование, безусловно, необходимо для определения показаний к назначению различных иммуномодуляторов (левамизол, диуцифон, тималин, Т-активин и др.) в комплексном лечении туберкулеза легких, а также в процессе этого лечения с целью контроля эффективности подобной терапии [Хоменко А. Г. и др., 1984; КнорингБ. Е. и др., 1984; Гергерт В. Я. и др., 1986].
Для оценки иммунной системы изучают характеристику функционального состояния иммунокомпетентных клеток и интенсивности специфического ответа их на аллерген (туберкулин). Главной задачей иммунологических исследований при туберкулезе является выявление возможных сдвигов в том или ином звене иммунной системы, которые могут быть обусловлены закономерной реакцией на антиген или быть проявлением иммунодефицита (см. табл.). Для оценки состояния иммунокомпетентных клеток проводятся исследования, которые характеризуют их количество и функцию. С этой целью используется большой набор иммунологических методик, которые позволяют оценить системные и местные защитные механизмы.
Методы иммунологических исследований при туберкулезе (Чернушенко К.Ф., 2003)
КРОВЬ
Реакция на митогены и аллергены
В-лимфоциты
Реакция на митогены
Уровень 1 β ( А, 0, М, Е )
Содержание антител (природных,
Фагоцитирующие клетки ( НГ, Мц )
Адгезия, миграция, хемотаксис
Поглощающая активность (неспецифічні
и специфические тест-объекты
Активность клеточных ферментов
У большинства больных туберкулезом имеющиеся изменения в иммунной системе, сказываются:
- снижением числа Т-лимфоцитов и их пролиферативной способности;
- изменением соотношения субпопуляционных клеток (хелперов, киллеров);
- дисфункцией В-клеточного звена (увеличением или уменьшением содержания В-клеток, дисиммуноглобулинемия, снижением содержания естественных антител);
- изменением функционального состояния фагоцитирующих клеток (снижением или усилением их поглощающей способности, адгезии, миграции, активности клеточных ферментов), активацией специфических клеточных и гуморальных реакций (табл.).
Изменения в иммунной системе при туберкулезе
Основные изменения в иммунной системе при туберкулезе (Чернушенко К. Ф., 2003)
снижение числа Т-ЛФ
• изменение Тх / Т5
• снижение пролиферации Т-ЛФ на неспецифические митогены (ФГА, Кон-А, ПМ)
• активация ферментов
• увеличение числа сенсибилизированных Т-ЛФ
• увеличение пролиферации Т-ЛФ на специфические аллергены
• активация ферментов в Т-ЛФ под действием аллергенов
• изменение (чаще увеличение) числа В-ЛФ
• снижение уровня "естественных" антител
• дисиммуноглобулинемия (1§М 0, А, Е)
• увеличение уровня специфических антител и ИК
Выраженность и направленность указанных изменений неоднозначны при различных формах и фазах туберкулезного процесса, зависят от степени интоксикации, длительности заболевания, наличия деструктивных изменений, массивности бактериовыделения.
Заключение о состоянии иммунокомпетентных клеток (ИКК) должно быть индивидуальным, учитывающим особенности клинической симптоматики. Иммунодиагностика больных туберкулезом включает не только оценку ИКК, циркулирующих в крови, но и местных реакций. Для этого проводится исследование бронхоальвеолярного смыва (БАЗ) или плеврального экссудата. Для характеристики местного иммунитета применяют комплекс клеточных и гуморальных реакций: определение количества клеток, их структуры, жизнеспособности, функциональной активности альвеолярных макрофагов (АМФ) и нейтрофилоцитов (Нф), содержания гуморальных факторов.
При туберкулезе количество клеток в БАЗ обычно не отличается от нормы, их жизнеспособность снижается умеренно, но значительно изменяется клеточный состав БАЗ за счет уменьшения содержания АМФ и лимфоцитов и увеличение содержания Нф. Изменяется функциональная активность фагоцитирующих клеток: снижаются их миграционная, адгезивная и поглощающая способности, но кислородзависимый метаболизм и активность клеточных ферментов усиливаются. Эти показатели зависят от тяжести патологического процесса в легких.
Исследование гуморальных факторов: β1-3, лизоцима, антител достаточно сложное. Это связано с неодинаковым объемом и насыщенностью смыва, что является причиной значительного расхождения показателей у отдельных больных. Поэтому Чернушенко К.Ф. был применен расчет показателей с учетом содержания белка в БАЗ. Содержание и лизоцима у больных туберкулезом значительно ниже, чем у здоровых лиц, и зависит от состояния слизистой оболочки бронхиального дерева (атрофии, гиперплазии и т.д.), наличии признаков хронического бронхита.
Проведение исследования состояния местного иммунитета возможно не у всех больных, так как промывание глубоких отделов легких опасно при наличии деструкции в легких. Поэтому проводилось сравнение аналогичных показателей состояния фагоцитирующих клеток (альвеолярных макрофагов — АМФ и нейтрофилов — Нф) БАЗ и моноцитов (Мц) и Нф периферической крови. Параллелизма указанных показателей выявлено не было, наоборот, изменения клеток БАЗ были интенсивными, чем клеток крови. Не отмечено параллелизма и в уровнях 8Іβ и сывороточного Іβ, лизоцима в крови и БАЗ. Расхождение этих показателей в крови и БАЗ свидетельствует об определенной автономности местных защитных механизмов и необходимости их оценки при патологии легких, в том числе при туберкулезе.
Значение специфической клеточной ПЧСТ (повышенная чувствительность замедленного типа), развивающейся в организме в ответ на проникновение МБТ, заключается в том, что она является классическим примером иммунодиагностики. Проба Манту как отражение ПЧСТ используется при определении показаний к ревакцинации БЦЖ, которая проводится только туберкулинонегативным детям. Используется проба и для дифференцирования поствакцинального и инфекционного иммунитета (обусловлен инфицированием вирулентными МБТ), что имеет значение для определения потребности в химиопрофилактике. Определение интенсивности туберкулиновой реакции имеет значение для проведения дифференциальной диагностики заболеваний различных органов туберкулезной и нетуберкулезной этиологии. При этом учитывают характер и интенсивность реакции.
Гиперергические реакции
В практическом плане очень сложными являются вопросы диагностического значения гиперергических реакций при отсутствии клинических признаков туберкулезного процесса и негативных результатов — при наличии туберкулеза. Поскольку туберкулиновая аллергия является проявлением противотуберкулезного иммунитета, практическое значение имеет вопрос о сущности гиперергических реакций, или отображают они высокую устойчивость против МБТ. По мнению К. Ф. Чернушенко, туберкулиновая гиперергия свидетельствует о наличии длительного антигенного стимула и о возможности организма ответить бурной реакцией на аллерген-туберкулин, а также на повторное введение даже незначительных доз МБТ. Это объясняет высокую заболеваемость туберкулезом лиц с гиперергическими туберкулиновыми реакциями и оправдывает отнесение их к группе риска. В то же время ориентация только на туберкулиновые пробы может осложнить дифференциальную диагностику заболеваний со схожей клинической симптоматикой.
Гиперергические реакции могут быть обусловлены не только наличием сенсибилизации к МБТ, но и повышенной чувствительностью к другим инфекционным и неинфекционным аллергенам. Это объясняется феноменом параалергии, механизм которого обусловлен наличием подобных антигенных детерминант, а также пролиферацией клонов лимфоцитов, преадаптованных ко многим аллергенам. Явление параалергии имеет особое практическое значение при дифференциации поствакцинальных аллергии и виража у детей с наличием хронических тонзиллитов, часто болеющих ОРВИ. Таким пациентам иногда назначается химиопрофилактическое применение противотуберкулезных препаратов.
В ряде случаев возникают диагностические проблемы у больных туберкулезом с негативными реакциями на туберкулин. Многие авторы считают, что это - результат ареактивности вследствие тяжести патологического процесса. Существует ряд факторов, объясняющих отрицательный ответ на туберкулин: нарушение клеточного взаимодействия регуляторных клеток вследствие высокого уровня антигенов, активация супрессорного действия макрофагов и др. Уменьшение антигенной нагрузки при антибактериальной терапии ведет к появлению положительных туберкулиновых реакций. Наличие как анергии, так и гиперергии у лиц с легочной патологией требует серьезного их обследование, которое включает не только определение интенсивности кожных туберкулиновых реакций, но и применение иммунологических тестов, особенно регуляторных — хелперов, супрессоров.
Сейчас разработаны и применяются пробы, характеризующие реакцию организма на туберкулин: реакция бластной трансформации лимфоцитов (РБТЛ), реакция торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ), реакция торможения адгезии лейкоцитов (РГАЛИ), которые выявляют наличие и степень чувствительности к туберкулину. Эти тесты целесообразно проводить с различными дозами туберкулина, что позволяет выявить характер чувствительности (адекватный, парадоксальный, уравнительный), что имеет значение при решении вопроса о скрытой активность туберкулезного процесса.
Определение уровня специфических антител
Диагностическое значение имеет и определение интенсивности другого феномена противотуберкулезного иммунитета — уровня специфических антител, большой спектр которых (преципитинов, агглютинины, лизины и др.) Обусловлен особенностями антигенного состава МБТ. Для их выявления предложены различные серологические реакции (преципитации, гемагглютинации, гемолиза, связывания комплемента, иммуноферментный анализ.).
Несмотря на почти вековую историю использования серологических реакций при туберкулезе, до сих пор не определена роль специфических антител в механизме противотуберкулезного иммунитета. Четко установлено, что они не имеют самостоятельного протективного эффекта: сыворотки крови, содержащие антитела, не подавляют рост МБТ. В то же время доказано, что антитела усиливают активность фагоцитирующих клеток. Следовательно, преимущественно клеточный характер противотуберкулезного иммунитета дополняется включением на определенном этапе гуморального звена объясняется кооперативной взаимодействием Т, В-лимфоцитов и фагоцитирующих клеток.
Несмотря на значительные антигенные свойства МБТ, титр противотуберкулезных антител у больных туберкулезом достаточно низкий (1: 8 - 1:64). Изучена зависимость между частотой их выявления и содержания и продолжительностью заболевания туберкулезом. Антитела обнаруживаются довольно часто (95-98%) у больных с хроническими деструктивными процессами и значительно реже (35-50%) у пациентов с "малыми" формами туберкулеза.
В последнее время предложены методы выявления противотуберкулезных антител с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). Но пока еще не существует достаточно убедительных серологических методик, которые можно использовать для дифференциальной диагностики и определения степени активности туберкулезных изменений. Однако высокий титр антител (1:32 - 64) рассматривается как основание для целенаправленного обследования пациента.
Выявление туберкулезных антигенов
Иммунодиагностика туберкулеза включает определение не только титра антител, но и выявление туберкулезных антигенов. Эта задача достаточно сложная в силу сходства антигенов патогенных МБТ к антигенам микобактерий-сапрофитов, нокардий, листерий и коринебактерий. С этой целью используются различные методы электрофореза, основанные на физико-химическом фракционировании. Затрудняет обнаружение антигенов их локализация в иммунных комплексах. Для выявления антигенов используют и моноклональные антитела, но для практических целей эти методы еще не применяются.
Специфические иммунологические методы могут быть применены и для типирования МБТ, выделяемых больными туберкулезом. Для этого используют молекулярно-генетические методы, которые основаны на различиях ДНК различных видов МБТ, оказываются в патологических материалах (полимеразная цепная реакция, ДНК-зонды). В последние годы применяются моноклональные видоспецифические антитела к антигенам микобактерий. Однако все эти методы идентификации микобактерий и выявления антигенов достаточно трудоемки и используются главным образом в научных целях.
При туберкулезе регистрируются аутоиммунные процессы. Наличие поврежденной, т.е. измененной в антигенном отношении ткани, ведет к развитию аутоиммунных реакций, интенсивность которых стимулируется адъювантным влиянием МБТ. Высокий уровень противолегочных антител отмечается при деструктивных процессах.
Существуют различные точки зрения на патогенетическую роль аутоиммунизации: одни авторы рассматривают ее как аутоагрессию, другие считают ее защитным процессом, третьи утверждают, что она никак не влияет на течение основного заболевания. По мнению К. Ф. Чернушенко, патогенетическая роль аутоиммунизации определяется ее степенью и выразительностью: умеренная — не имеет существенного выброса на течение основного (туберкулезного) заболевания, но высокий уровень аутоантител может быть фактором, который способствует развитию иммунологического воспаления — аутоагрессивной пневмонии, требующей специальной патогенетической терапии. Для диагностики аутоиммунизации используются различные реакции (агглютинации, связывания комплемента, ИФА и др.), Сложность их выполнения заключается в отсутствии стандартных тканевых антигенов.
Интенсивность специфических реакций, обусловленных вторичной микрофлорой, и аутоиммунных процессов в значительной степени определяется состоянием иммунной системы, особенно ее регуляторной звена. Характер выявленных нарушений зависит от ряда факторов — степени интоксикации, наличия биологически активных веществ, нарушений в других органах, состояния нервной и эндокринной систем и т. д.
В клинической практике иммунологические исследования у больных туберкулезом используются не только для целей диагностики и выяснения состояния иммунной системы пациента, но могут иметь значение и для определения прогноза течения заболевания, выявления возможного рецидива. Особое значение имеет анализ неспецифических и специфических показателей, продолжительности сохранения значительных нарушений, сопоставление их и: клинико-рентгенологической симптоматикой процесса. Длительное сохранение Т-клеточного дефицита, высоких уровней ауто- и противотуберкулезных антител, отсутствующей или пониженной реакции лимфоцитов на туберкулин характерно для прогрессирующего течения туберкулеза. Наличие указанных признаков еще на ранних этапах наблюдения должно быть основой для включения патогенетических средств в комплексную терапию туберкулеза.
Иммунологические исследования могут быть использованы и для определения эффективности лечения и полноты выздоровления больных. Сравнивая характер нарушений в иммунной системе к лечению, в процессе проведения терапии и после ее завершения, можно выявить определенную динамику изменений. В большинстве случаев при эффективной терапии происходит улучшение иммунологических показателей, а в некоторых больных — их нормализация. Однако клиническое выздоровление обычно опережает нормализацию иммунного статуса.
В случае сохранения туберкулезного воспаления иммунологические показатели длительное время могут оставаться измененными, особенно специфические тесты. Длительное сохранение значительных нарушений является основанием для пересмотра проводимой терапии и решения вопроса о назначении иммунокоректирующих препаратов. При применении последних следует учитывать характер выявленных иммунологических изменений с определением преимущественно возбужденного звена иммунной системы, степени чувствительности ИКК к назначенному препарату. Для этого существуют специальные иммунологические методы отбора иммунокоректирующих препаратов, основанных на определении характера действия их различных доз.
Тщательный анализ характера нарушений функционального состояния иммунной системы, интенсивности специфических и неспецифических реакций иммунокомпетентных клеток, клинической симптоматики, оценка состояния различных органов и систем может определить терапевтическую тактику врача у постели больного туберкулезом.
Читайте также:
Пожалуйста, не занимайтесь самолечением!При симпотмах заболевания - обратитесь к врачу.
