Трансформация клеток кишечной палочки

4µl 0.5M bMeEtOH,
2µl (10pg) pDNA;

1. аналогично "контрольной";
2. на одну аликвоту можно брать pDNA в объёме 10µl;
3. высев - в зависимости от задачи:

* если требуется получить несколько индивидуальных колоний (например, при создании генно-инженерной конструкции), то высеять 100-200µl (обязательно неравномерно - растереть шпателем по одной половине чашки, и только когда жидкость подсохнет, сделать один (!) мазок по второй половине),
* если требуется получить как можно больше колоний при разумной плотности (например, при создании библиотеки), то высеять 10-50µl для определения титра ( равномерно ), оставшиеся клетки хранить ON при 0 o С (титр при этом не изменяется). На следующий день рассчитать количество клеток на высев, высеять.

10%. Частота трансформации постоянна до

10ng pDNA/100µl клеток, далее весьма быстро падает.

20µl), (ii) высевать штрихом сразу после теплового шока (без "оживления").

1. Химически компетентные клетки можно трансформировать неочищенной лигазной смесью (и вообще DNA, находящейся в умеренно солевом буфере). В случае электрокомпетентных - DNA должна быть очищена, т.к.: (i) слишком высокая концентрация соли способна вызвать искровой разряд в ячейке (ii) при электротрансформации в оболочке E. coli появляются дырки, в них может проникнуть фермент, используемый для лигирования.
2. Количество клеток в электрокомпетентной фасовке значительно больше, чем в химически-компетентных, поэтому не стоит пытаться высевать на одну чашку слишком большую долю фасовки. Это чревато подростом (появлением сателлитных колоний) и снижением компетентности.

PIPES в составе TB можно заменить на HEPES или BES. Это приведёт лишь к небольшому уменьшению компетентности. Эффективность трансформации практически постоянна в диапазоне pH 5.6-7.0, однако при pH>7.0 MnCl 2 выпадает в осадок.

DMSO токсичен для бактерий в высокой концентрации (это позволяет не заботится о его стерильности), поэтому он добавляется к клеткам в два этапа. Причем, лучше добавлять так, чтобы не возникало зон "высокой концентрации" (но погружать конец типчика в суспензию клеток нельзя - DMSO замерзнет и закупорит тип). Либо по каплям при постоянном перемешивании, либо нанести на стенки охлажденной пробирки (где DMSO замерзнет), с которых смыть, помешивая пробирку.

Процесс проникновения плазмидной ДНК в бактериальную клетку называется трансформацией. В естественных условиях бактериальные клетки не способны к поглощению ДНК. Это связано, прежде всего, с прочной клеточной стенкой, состоящей из пептидогликанов, которую имеет клетка E.coli, а также с отрицательным зарядом ее внешней мембраны, в состав которой входят фосфолипиды и липополисахариды. Поскольку молекула ДНК также заряжена отрицательно, то ее проникновение в бактериальную клетку становится проблематичным по механическим и электростатическим причинам. Для решения этой проблемы было разработано три метода трансформации: химическая трансформация, электропорация и трансформация с помощью минералов(см презентацию). В первом случае для того, чтобы проникновение ДНК в клетку стало возможным, необходимо подготовить бактериальные клетки к поглощению ДНК, т.е. сделать их компетентными. Для этого клетки E.coli обрабатывают раствором бивалентных катионов (Ca 2+ , Mg 2+ , Rb + , Mn 2+ ) при низких температурах. Это приводит с одной стороны к снижению общего отрицательного заряда поверхности бактериальной клетки E.coli, а с другой стороны меняет подвижность фосфолипидного бислоя (он становится менее подвижным). Некоторые протоколы приготовления компетентных клеток включают в себя обработку клеток такими веществами, как PEG и DMSO. Было показано, что в присутствие этих веществ трансформация проходит гораздо эффективнее. Возможно, это связано с тем, что добавление этих веществ увеличивает общую вязкость раствора и стерически облегчает взаимодействие клеток и ДНК. Кроме этого, эти вещества являются криопротекторами, т. е. обеспечивают хранение готовых препаратов компетентных клеток при отрицательных температурах.

Вторая стадия заключается в очень кратком (от 30-40c или до минуты) тепловом шоке при 42°С. На этой стадии из-за резкого повышения температуры текучесть фосфолипидного бислоя резко увеличивается, в мембранах бактериальных клеток появляются поры, через которые ДНК проникает в клетку. Очень важно после проведения теплового шока сразу охладить смесь клеток с ДНК на льду, поскольку при температурах 40°С - 42°С клетки E.coli гибнут.

На третьей стадии к смеси клеток с ДНК добавляют питательную среду без антибиотиков (LB или SOC) и растят при перемешивании при 37°С. На этой стадии происходит восстановление трансформированных клеток и их размножение. После этого суспензию клеток высевают на чашку с твердой питательной средой, содержащей необходимый антибиотик. Метод химической трансформации обычно используют, когда работают с плазмидами размером 2 – 10 kb.

В случае электропорации проникновение ДНК в бактериальную клетку происходит под действием электрического поля при высоком напряжении в течение краткого времени. Условия электропорации (напряженность поля и длительность импульса) могут требовать предварительной оптимизации. Подготовка клеток не требует обработки их ионами двухвалентных металлов, но необходимо несколько раз промыть их стерильным раствором 10% глицерина от солей, содержащихся в питательных средах, так как наличие даже их минимальных концентраций может резко увеличить проводимость при электропорации (опасно для жизни. ) и снизить общую эффективность трансформации. Электропорацию проводят в электропораторах в специальных кюветах. В кювете смешивают электрокомпетентные (отмытые от солей) клетки и ДНК, затем кювету помещают в электропоратор и проводят электропорацию. Затем к смеси клеток и ДНК добавляют питательную среду, доращивают клетки и высевают их на чашки, как в случае химической трансформации. Метод электропорации обычно используют, когда 1)работают с плазмидами с молекулярной массой выше 10 kb, 2) необходимо сделать котрансформацию двух (или даже трех!) плазмид, 3) при работе с библиотеками ДНК, требующих большого количества трансформаций.

В обоих случаях после получения свежего препарата компетентных/электрокомпетентных клеток необходимо провести их контрольную трансформацию известным количеством плазмиды для того, чтобы 1) проверить чистоту полученного препарата компетентных клеток, 2) примерно оценить их компетентность. Компетентность клеток можно определить, как количество колоний, которое вырастает на чашке после трансформации клеток 1 мкг ДНК.

Чтобы оценить компетентность полученного препарата, необходимо посчитать количество колоний, выросших на чашке после трансформации (если выросло много колоний, чашку удобно делить на сектора, считать число колоний в каждом секторе, а потом умножать полученное значение на число секторов), и зная количество ДНК, которое было взято на трансформацию, рассчитать компетентность клеток на 1 мкг ДНК. Компетентность клеток 10 7 - 10 8 может быть оценена, как высокая.

Приготовление компетентных клеток для химической трансформации (метод Mg 2+/ PEG)

Кишечная палочка (лат. Escherichia coli, E. coli, по имени Теодора Эшериха) - грамотрицательная палочковидная бактерия, широко встречается в нижней части кишечника теплокровных организмов.E. coli - грамотрицательная бактерия, факультативный анаэроб, не образует эндоспор. Клетки палочковидные, со слегка закруглёнными концами, размером 0,4-0,8 х 1-3 мкм, объём клетки составляет около 0,6-0,7 мmі. Штаммы, имеющие жгутики, способны передвигаться. Жгутики расположены перитрихально. Протопласт E. coli одет в муреиновый мешок, прилегающий к внешней мембране. E. coli относится к микроорганизмам, не обладающим физиологической компетентностью к поглощению экзогенной ДНК.

Кишечная палочка может жить на разных субстратах. В анаэробных условиях E. coli образует в качестве продукта жизнедеятельности лактат, сукцинат, этанол, ацетат и углекислый газ. Часто при этом образуется молекулярный водород, который мешает образованию указанных выше метаболитов, поэтому E. coli часто сосуществует с микроорганизмами, потребляющими водород - например, с метаногенами или бактериями, восстанавливающими сульфат.

Оптимальный рост достигается культурами E. coli при температуре 37 °C, некоторые штаммы могут делиться при температурах до 49 °C. Рост может стимулироваться аэробным или анаэробным дыханием, различными парами окислителей и восстановителей, в том числе, окислением пирувата, формиата, водорода, аминокислот, а также восстановлением кислорода, нитрата, диметилсульфоксида и триметиламин N-оксида.

E. coli играет важную роль в современной промышленной микробиологии и биологической инженерии. Работа Стенли Нормана Коэна и Герберта Бойера на E. coli, с использованием плазмид и эндонуклеаз рестрикции для создания рекомбинантной ДНК, находится у истоков современной биотехнологии. Усовершенствование методов получения сферопластов E. coli и их трансфекции позволили достичь достаточно высокой эффективности трансформации молекулами ДНК различных фагов.

Кишечную палочку считают универсальным организмом для синтеза чужеродных белков. В E. coli исследователи вводят гены при помощи плазмид, что позволяет осуществлять биосинтез белков для промышленной ферментации. Также разработаны системы для синтеза в E. coli рекомбинантных белков. Одним из первых примеров использования технологии рекомбинантных ДНК является синтез аналога инсулина человека. Модифицированные E. coli используют при разработке вакцин, синтеза иммобилизованных ферментов и решения других задач. Однако, в организмеE. coli невозможно получать некоторые крупные белковые комплексы, содержащие дисульфидные связи, в частности, белки, для проявления биологической активности которых требуется посттрансляционная модификация.

Чужеродные гены клонируют в так называемых челночных векторах. Эти вектора с одинаковым успехом реплицируются в клетках нескольких хозяев, в данном случае, в клетках E. coli. Векторы были получены комбинацией in vitro фрагментов этих плазмид.

Для конструирования рекомбинантной ДНК, содержащей в своем составе ген, который должен экспрессироваться, придерживаются следующей стратегии. Синтезируют к ДНК или из клонотеки выделяют клетки, несущие фрагмент генома с нужным геном, и клонируют их в соответствующем векторе. Фрагменты геномной ДНК подвергают модификации - удаляют из них некодирующие области и участки соседних генов. Часто для проведения этой операции необходимо секвенирование данного фрагмента ДНК. Затем конструируются промежуточные рекомбинантные ДНК, в которых ген помещается под контроль бактериальных регуляторных элементов (промотор, оператор, точка связывания с рибосомами). Эти регуляторные элементы выделяют из гибридных плазмид, сконструированных специально как источники регуляторных элементов. Полученная конструкция встраивается в подходящий вектор, например, pBR 322, и ген экспрессируется в бактериальной клетке.

Однако удобнее встраивать ген в специальный вектор для экспрессии, который уже содержит регуляторные элементы, обеспечивающие активную экспрессию после введения рекомбинантной плазмиды в бактериальную клетку. К таким эффективным регуляторным участкам относится, например, сильный промотор гена бэта-лактамазы (ген устойчивости к пенициллину, входящий в состав плазмиды pBR 322). Ряд генов, в том числе и ген инсулина, встраивали в сайт рестрикции Pst I, который расположен в структурной части гена. Промотор этого гена обеспечивает эффективную транскрипцию, которая продолжается до тех пор, пока РНК-полимераза не дойдет до сигнала терминации встроенного гена.

В качестве примера маркирования вектора могут служит первые эксперименты с E. coli, а точнее с одной из ее плазмид рBR322, проведенные Гилбертом для получения инсулина. Плазмида pBR322 содержит 2 гена, которые определяют устойчивость к ампициллину и тетрациклину. Рестриктаза PstI расщепляет плазмиду в средней части гена, кодирующего фермент устойчивости к ампициллину. После расщепления плазмиды на ее концы с помощью концевой трансферазы надстраивали последовательность из четырех нуклеотидов с остатками гуанина. Затем, как обычно, с помощью лигаз "вшивали" ген проинсулина, получая рекомбинантную ДНК. Встроенный в плазмиду фрагмент ДНК нарушал синтез фермента, разрушающего ампициллин, но ген, обеспечивающий устойчивость к тетрациклину, оставался активным. Трансформированные таким образом клетки E. coli синтезировали гибридный белок, содержащий последовательности пенициллазы и проинсулина, поэтому биологически активный инсулин получали путем отщепления пенициллазы и среднего сегмента проинсулина.

С другой стороны, если фрагмент чужеродной ДНК встраивается в один из генов устойчивости, то последний инактивируется. Следовательно, успешное встраивание фрагмента чужеродной ДНК в один из этих генов легко детектировать по исчезновению у бактерий устойчивости к данному антибиотику.

Один из наиболее распространенных способов получения клеток E.coli для последующей трансформации с очищенной ДНК – инкубация бактерий при низкой температуре в жидкой среде, содержащей катионы Ca. Данная методика была разработана японскими специалистами в области генной инженерии в 1996 году. Метод включает несколько последовательных этапов.

Выращивание колоний E.coli в агаризированной среде SOB

Мягкие и твердые стерильные одноразовые микробиологические петли из полистирола производства итальянской компании Promed выпускаются объемом 1 и 10 мкл

Для этого в стерильных условиях в пробирку с культурой E.coli вводится простерилизованная многоразовая или стерильная одноразовая бактериологическая петля, с помощью которой осуществляется забор материала, перенос его на селективную питательную среду и распределение по ее поверхности зигзагообразным движением.

Выращивать колонии в чашках Петри можно при 37°C или при 18°C. В первом случае материал для дальнейшей работы будет готов уже на следующее утро, однако уровень компетентности выращенных таким образом бактериальных клеток получится умеренным.

Для получения клеток с более высокой компетентностью материал рекомендуется инкубировать при t 18°C, однако нужно учитывать, что в таком температурном режиме нужной плотности колонии достигнут лишь через несколько суток.

Глубинное культивирование и охлаждение

После инкубирования 10-12 колоний диаметром от 2 до 3 мм отбираются в колбу емкостью 0,5-1л с 40 мл жидкой среды SOB. Колба помещается на качалку, установленную в термостат, где при температуре 37°C и интенсивном встряхивании (200-300 об/мин) осуществляется глубинное культивирование культуры в течение 2-2,5 часов до достижения оптической плотности 0,6.

После этого сосуд с материалом ставят в мелко-колотый лед, где и производятся все дальнейшие манипуляции.

Центрифугирование и ресуспензирование

Охлаждение после культивирования осуществляется в течение 30 минут, после чего из колбы отбирают 30 мл культуры и центрифугируют материал в пробирке емкостью 50 мл при температуре 4°C в течение 10 минут при скорости 3000 об/мин.

Затем супернатант сливают и центрифугируют бактериальные клетки в течение 20 секунд при аналогичных указанным выше скорости и температуре. После этого жидкую фракцию удаляют пипеткой, а осадок суспензируют в 10 мл буфера ТВ и оставляют на 10-15 минут в мелко-колотом льду (t - 0°C).

Диметилсульфоксид используется при выращивании компетентных клеток E.coli в качестве криопротектора

Вслед за этим материал вновь подвергается двукратному центрифугированию вышеописанными способами. Выпавшие в осадок клетки ресуспензируются в 2 мл буфера.

Затем к культуре добавляется диметилсульфоксид (криопротектор) до достижения концентрации 3,5%, и сосуд выдерживается при 0°C в течение 10-15 минут.

Вслед за этим культура вновь центрифугируется при 4°C и скорости 3000 об/мин в течение 10 минут, после чего супернатант сливается.

Разлив и хранение

Выбор оборудования и материалов

Встряхиватель KS 130 kontrol nol марки IKA может работать при температурах от 5 до 50 градусов Цельсия

Выбрать устройство для встряхивания не составляет проблемы – рынок современных лабораторных шейкеров и качалок представлен широким перечнем высокотехнологичных приборов, среди которых можно без труда подобрать аппарат с оптимальными характеристиками.

Для центрифугирования идеальным решением по сочетанию цены, функциональности и эксплуатационных характеристик станет выбор в пользу оборудования британской марки Centurion Scientific. Главное преимущество рефрижераторных моделей этой марки – использование уникальной запатентованной технологии принудительного охлаждения, обеспечивающей исключительную точность и стабильность температуры по всему объему центрифужной камеры.

Под этой маркой выпускаются лабораторные центрифуги со сменными роторами, работающие в различных диапазонах скоростей и предназначенные для решения разных задач.

Универсальная центрифуга PrO-Hospital HLR идеально справится с подготовкой E.coli для последующей трансформации и позволит успешно решать другие задачи

Если работу с материалом планируется вести по стандартным методикам, вполне достаточным может оказаться функционал охлаждаемых универсальных центрифуг для клинических исследований с 10 ячейками встроенной памяти. Эти приборы относятся к серии Pro-Hospital. Такие же модели, как, например, цитоцентрифуга Pro-CYTLCD или ее более простая модификация Pro-CYTLED, а также центрифуги для разделения крови серии Pro-PRP разработаны с целью подготовки образцов для гистологического анализа методом жидкостной цитологии и получения богатой тромбоцитами плазмы соответственно. Они совместимы с определенными типами роторов, оснащаются предустановленными программами центрифугирования в строго определенных режимах и работают при комнатных температурах. Поэтому при выборе оборудования для работы с клеточными культурами следует обращать внимание именно на аппараты линейки Pro-Hospital с подходящим функционалом – HLR или LLR.

Для нужд научно-исследовательских лабораторий великолепно приспособлены аппараты серии Pro-Research с сенсорной панелью управления, максимально гибкой настройкой и большим объемом встроенной памяти, позволяющей одномоментно хранить и быстро запускать до 108 методик с различными параметрами.

Крайне важно использовать высококачественные среды и реактивы – это на порядок повышает продуктивность и сводит к минимуму риск порчи биоматериала. Один из лидеров в этой нише рынка – французская компания Biochem, в перечень продукции которой входят стандартные растворы, готовые буферы и среды, а также реактивы для их приготовления.

Компетентные клетки Е. coli можно либо приобрести у коммерческих фирм (BRL, Gaithersburg, Maryland, USA), либо получить в лаборатории и использовать их немедленно или заморозить. Коммерческие препараты компетентных клеток обладают высоким качеством и позволяют получить частоту трансформации более 108 колоний на 1 мкг сверхспиральной плазмидной ДНК. Однако эти препараты очень дороги.

В протоколе описан метод получения компетентных бактериальных клеток, обеспечивающий частоту трансформации

10 7 трансформированных колоний на 1 мкг плазмидной ДНК. Он идеально подходит для таких бактериальных штаммов, как JM109, НВ101, TG1 и TG2, но с его помощью можно трансформировать примерно с такой же частотой практически любой бактериальный штамм. Такая эффективность трансформации достаточно высока для осуществления всех рутинных операций клонирования в плаз-мидах, однако, например, для получения плазмидных библиотек кДНК, синтезированных на редких мРНК, нужна более высокая частота трансформации и необходимы альтернативные методы.

Метод, описанный в работе, позволяет получать компетентные культуры клеток Е. coli штаммов DH1, DH5 и ММ294, для которых частота трансформации достигает 7,5 • 108 колоний на 1 мкг сверхспиральной плазмидной ДНК. Более высокую частоту (109—1010) можно получить только с помощью электропорации. Этот метод разрабатывался для введения ДНК в клетки эукариот, но недавно его использовали и для трансформации Е. colt. Необходимые для электропорации специальный высоковольтный мини-электрод и кювета для образца вместе с детальным описанием процедуры трансформации поставляются фирмой Bio-Rad. Успешное получение компетентных клеток с помощью описанного в протоколе метода зависит от нескольких факторов. Особое внимание следует обратить на:

а) плотность культуры бактериальных клеток;
б) поддержание во время всех процедур температуры на уровне 0-4 С.
Получение компетентных клеток Е. coli обработкой хлористым кальцием

Материалы
• 0,1 М СаС12
• Диметилсульфоксид (ДМСО)
• Среда LB: 10 г бакто-триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 10 г NaCl растворяют в 1 л деионизованной воды и доводят рН до 7,0 с помощью 5 М NaOH. Стерилизуют автоклавированием в жидком цикле.
• Для получения LB-arapa на 1 л среды добавляют 15 г агара Difco и стерилизуют автоклавированием, как описано выше.
• Среда SOB: 20 г бакто-триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 0,5 г NaCl растворяют в 950 мл деионизованной воды, добавляют 10 мл 250 мМ НС1, доводят рН до 7,0 с помощью 5 М NaOH и доводят объем до 1 л. Стерилизуют, как описано выше.
• Среда SOC: идентична среде SOB за исключением того, что содержит также 20 мМ глюкозу. После автоклавирования среды SOB ее охлаждают и добавляют 20 мл 1 М стерилизованной фильтрацией глюкозы.

Методика
1. Снимают одиночную бактериальную колонию с чашки с LB-агаром, инкубированной при 37 'С в течение 16—20 ч, и переносят ее в 10 мл LB-среды в пробирке на 20 мл. Инкубируют при 37 °С и сильной аэрации (200 об/мин на круговом шейкере) в течение ночи.
2. 1 мл полученной ночной культуры вносят в 100 мл среды LB, налитой в колбу на 1 л, и инкубируют ее при 37 °С и сильной аэрации (200 об/мин на круговом шейкере) в течение примерно 2 ч до достижения плотности

108 клетка/мл (ОД600

0,4).
3. Переносят культуру в стерильные охлажденные центрифужные пробирки на 50 мл (Falcon 2070) и охлаждают до 0 С инкубацией во льду в течение 10 мин.
4. Собирают клетки центрифугированием (ротор Sorvall GS3 или аналогичный) при 4300 g в течение 5 мин при 4 С.

5. Сливают надосадок и переворачивают пробирку на 1 мин для полного его стекания.
6. Ресуспендируют клеточный осадок в 10 мл ледяного 0,1 М СаСl2 при осторожном встряхивании и инкубируют клетки во льду в течение 30 мин.
7. Собирают клетки центрифугированием (ротор GS3 или аналогичный) при 4300 g в течение 5 мин при 4 С.
8. Сливают супернатант и переворачивают пробирку на 1 мин, с тем чтобы супернатант полностью стек.
9. Ресуспендируют каждый осадок в ледяном 0,1 М СаСl2(из расчета 2 мл на 50 мл исходного объема культуры). До использования суспензию лучше оставить на 1 ч при 4 С; при 4 °С ее можно хранить до 48 ч (но после 24 ч хранения эффективность трансформации будет снижаться). Суспензию можно разлить на аликвоты и хранить при -70 С.
10. С помощью охлажденного стерильного наконечника для микропипетки переносят по 200 мл каждой суспензии в стерильную полипропиленовую пробирку (Falcon 2059 17 х 100 мм). Добавляют сверхспиральную плазмидную ДНК (не более 50 нг в объеме не более 10 мкл), осторожно перемешивают и 30 мин инкубируют во льду.

Контроли
• Компетентные клетки, к которым добавлено известное количество (от 1 до 20 нг) сверхспиральной плазмидной ДНК.
• Компетентные клетки, к которым плазмидная ДНК не добавлялась.
11. Переносят пробирки ровно на 90 с в водяную баню на 42 °С, Пробирки при этом не встряхивают.
12. Быстро переносят пробирки обратно в лед и инкубируют 2 мин.

13. Добавляют в каждую пробирку 800 мкл среды SOC и для индукции экспрессии кодируемого плазмидой маркера устойчивости к антибиотикам инкубируют их при умеренной аэрации (100 об/мин) в течение 45 мин при 37 С.
14. Переносят до 200 мкл трансформированных компетентных клеток в содержащие соответствующий антибиотик чашки Петри диаметром 90 мм с LB- или SOB-средой. Равномерно распределяют трансформированные клетки по поверхности агара стерильной изогнутой стеклянной палочкой.
15. Оставляют чашки при комнатной температуре до подсыхания.
16. Переворачивают чашки и инкубируют их при 37 С. Колонии становятся видимыми через 12-16 ч.

- Добавляют к 2 мл ресуспендированных клеток 70 мкл ДМСО, аккуратно перемешивают и помещают суспензию на 15 мин в лед.
- Добавляют к каждой суспензии еще 70 мкл ДМСО, опять аккуратно перемешивают и помещают суспензию в лед.
- Быстро разливают суспензию порциями по 50 мкл в охлажденные стерильные микроцентрифужные пробирки и замораживают компетентные клетки в жидком азоте. До использования хранят пробирки при - 70 С.
- При необходимости суспензию размораживают, подержав пробирку в руках, и помещают в лед как минимум на 10 мин.

Рис. 1. Снимок химерных клеток кишечной палочки и дрожжей, сделанный с помощью конфокального флуоресцентного микроскопа. Голубым окрашены клетки дрожжей, фиолетовым — РНК кишечной палочки. Изображение из обсуждаемой статьи в PNAS

Общепринятая на данный момент теория симбиогенеза предполагает, что митохондрии в эукариотических клетках произошли от симбиотических бактерий. Однако поиски предковой бактерии и реконструкция событий симбиогенеза еще далеки от завершения. Авторы новой статьи в журнале PNAS подошли к проблеме с другого конца: они смоделировали симбиогенез на примере хорошо изученной бактерии (Escherichia coli) и хорошо изученной эукариотической клетки (Saccharomyces cerevisiae). Теперь у нас есть отработанная методика получения химерных клеток, с помощью которой можно проверять, какие именно свойства предковой бактерии были необходимы для симбиогенеза.

Общий принцип, которым руководствовались авторы эксперимента, можно сформулировать так: чтобы заставить две клетки вступить в симбиоз, нужно отобрать у них что-то жизненно важное, тогда их существование по отдельности станет невозможно (рис. 2).

Всю работу можно условно разделить на пять шагов.

Шаг 1 — лишить кишечную палочку самодостаточности. Чтобы эндосимбиоз оказался выгодным решением для бактерии, она должна стать ауксотрофом — быть неспособной производить какое-нибудь жизненно необходимое вещество. Для многих бактерий таким веществом является тиамин (витамин B₁) — кофермент в реакциях углеводного обмена. Поэтому в геноме E. coli ген биосинтеза тиамина был заменен на кассету (см. Gene cassette) с GFP (зеленым флуоресцентным белком) и геном устойчивости к антибиотику канамицину. Теперь клетки не могут выживать без внешнего источника тиамина (который они сквозь мембрану закачивают внутрь), их можно отобрать под действием антибиотика и отследить во флуоресцентный микроскоп.

Шаг 2 — сделать кишечную палочку полезной. Авторы гипотезы происхождения митохондрии из внутриклеточных паразитов полагают, что одним из ключевых белков был АТФ/АДФ-антипортер (см. Antiporter). Это белок-переносчик, который обменивает АТФ на АДФ, меняя их местами по разные стороны мембраны. У паразитической бактерии он должен работать на благо бактерии: захватывать АТФ снаружи (то есть отбирать у клетки-хозяина) и менять на отработанные АДФ бактерии. Однако этот механизм можно заставить работать и в обратную сторону, если концентрации веществ поменяются местами. При этом бактерия начнет забирать АДФ из цитоплазмы хозяина и отдавать АТФ. Так или иначе, АДФ/АТФ-антипортеры есть как у современных митохондрий, так и у внутриклеточных паразитов. У свободно живущей кишечной палочки такого белка нет, поэтому пришлось снабдить клетки E. coli плазмидой с соответствующим геном.

Шаг 3 — лишить дрожжи самодостаточности. Чтобы заставить дрожжи вступить в симбиоз, их нужно лишить энергии, то есть АТФ. Тогда единственным выходом будет получить его от кишечной палочки. Но у дрожжей, как у почти всех эукариот, есть свои митохондрии. Поэтому авторы эксперимента взяли мутантный штамм дрожжей, лишенный одного из ключевых митохондриальных генов. Такие клетки содержат митохондрии, но не получают от них энергии. Они не могут расти в среде, где из питательных веществ есть только глицерин. Однако оказалось, что и в симбиоз с E. coli они тоже не вступают.

Рис. 3. Ультраструктура химерных клеток: результаты томографии под действием мягкого рентгеновского излучения. Сверху вниз — три плана в разных плоскостях. Левый столбец — просто снимок, средний столбец — снимок с выделенными органеллами, правый столбец — реконструкция клетки с обозначением плоскости среза (пунктирная линия). Изображение из обсуждаемой статьи в PNAS

Шаг 5 — убрать лишнее. В ходе эволюции митохондрия утратила большую часть ДНК (у млекопитающих, например, в ее геноме осталось лишь 37 генов). Это значит, что она становилась всё более зависимой от своей клетки-хозяина. Авторы обсуждаемой статьи попробовали воспроизвести и этот этап тоже. Для этого они удалили у клеток кишечной палочки ген биосинтеза НАД + — еще одного важного кофермента. Клетки, лишенные НАД + , так же как и их предшественники, лишенные тиамина, успешно образовывали химеры с дрожжами. И даже двойные мутанты, неспособные производить ни один из этих коферментов, также вступали в эндосимбиоз (рис. 4).

Рис. 4. Колонии химерных клеток, образованные разными штаммами кишечной палочки. А. Слева направо: контроль (клетки дрожжей), длина масштабного отрезка 10 мкм; химера с E. coli, дефицитными по тиамину, длина масштабного отрезка 5 мкм; химера с E. coli, дефицитными по НАД + ; химера с E. coli, дефицитными по обоим коферментам. Зеленым светится GFP в клетках кишечной палочки. В. Слева направо: контроль, химера с E. coli, дефицитными по тиамину и по НАД + . Дрожжи окрашены голубым (краситель FITC), бактерии — фиолетовым зондом, связывающимся с бактериальной РНК. Желтые стрелки указывают на примеры химерных клеток. Длина масштабного отрезка 10 мкм. Изображение из обсуждаемой статьи в PNAS

Перед нами — отработанная методика, с помощью которой можно моделировать ранние события эндосимбиоза. Клетки кишечной палочки, дефицитные по разным веществам, равно хорошо образуют химеры, которые воспроизводятся из поколения в поколение. Следующий шаг — поиск предельной редукции генома E. coli, возможной в данной ситуации. Авторы статьи отмечают, что удаление всего двух путей биосинтеза уже дало экономию в 7,7 тысяч пар нуклеотидов (для сравнения, весь митохондриальный геном человека составляет примерно 15 тысяч пар). Поэтому нам еще предстоит найти ту грань, на которой экономия размера генома столкнется с возможностью выживания клетки-симбионта.

Кроме того, как ехидно указывают авторы в конце текста, при таком раскладе не очень понятно, кто в этой истории настоящий паразит. Если бактерия, попавшая внутрь археи, лишь постепенно утрачивала свои метаболические пути, то возможно настоящим паразитом здесь стоит считать архею, которая потребляла энергию, производимую бактерией.