Методы выявления и определения количества бактерий группы кишечных палочек колиформных

ГОСТР 50474-93 (идентичен ГОСТу 30518-97) Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий);

ГОСТ 29184-91 Методы выявления и определения количества бактерий семейства ENTEROBACTERIACEAE;

ГОСТ 7702.2.2-93 Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты птичьи. Методы выявления и определения количества бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий родов Escherichia, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Serratia);

ГОСТ 9958-81 Колбасные изделия и продукты из мяса. Методы бактериологического анализа;

ГОСТ 9225-84 Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа;

ГОСТ 30364.2-96 Продукты яичные. Методы микробиологического контроля.

ГОСТ 21237-75 Мясо. Методы бактериологического анализа. ГОСТ 20235.2-74 Мясо кроликов. Методы бактериологического анализа.

ГОСТ 30425-97 Консервы. Метод определения промышленной стерильности.

Методические указания МЗ СССР 4.2.012-82.

ГОСТ 30518-97/Р 50474-93 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий).

ГОСТ 30726-2001 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli.

а) Выявление колиформных бактерий в определенной навеске продукта. Для посева используется то количество продукта, в котором, в соответствии с установленными нормами, предусматривается отсутствие бактерий группы кишечных палочек (БГКП). При определении присутствия (отсутствия) колиформных бактерий в определенной навеске продукта или его эквивалентном разведении эту навеску (или разведение) вносят в одну из следующих питательных сред (бульон лактозный с бриллиантовым зеленым и желчью, бульон Мак-Конки, среда Кесслера) в двух повторностях. В ряде случаев, помимо перечисленных сред, допускается использование сред Хейфеца (при исследовании яичных продуктов, колбасных изделий и изделий из мяса, мяса птицы, субпродуктов и полуфабрикатов птичьих). При посеве соотношение между количеством высеваемого продукта (или его разведением) и питательной средой должно составлять 1:9, а для сред двойной концентрации—1:1.

При анализе очень кислых продуктов возможно существенное снижение pH питательной среды (на 0,5 и более единиц), обусловленное внесением в нее такого продукта (или его разведения). Поэтому в подобных случаях pH среды обязательно доводят до допустимого значения при помощи стерильного раствора гидроокиси натрия (100 г/дм 3 ).

Посевы культивируют при 36(±1)°С в течение 24-48 ч. Через 24(±3) ч проводят предварительный учет и отмечают положительные посевы. Окончательный учет проводят через 48(±3) ч. Положительными считают посевы, в которых отмечены признаки интенсивного роста микроорганизмов — помутнение среды, образование газа, изменение цвета среды, свидетельствующее о ее подкислении. При отсутствии признаков роста (газообразования или изменения цвета среды) делают заключение о соответствии исследуемого продукта нормативу.

При необходимости для подтверждения принадлежности выделенных микроорганизмов к колиформным бактериям производят высев из жидких сред штрихами на поверхность агаризованных селективно-диагностических сред (агар лактозный с бриллиантовым зеленым и феноловым красным, среда Эндо). В ряде случаев помимо перечисленных сред допускается также использование сред Левина (при исследовании мяса, мяса кроликов, колбасных изделий и продуктов из мяса, мяса птицы, субпродуктов и полуфабрикатов птичьих) и Плоскирева (при исследовании мяса, мяса кроликов, колбасных изделий и продуктов из мяса). Описание колоний, характерных для колиформных бактерий, приведено в таблице ниже. Из посевов отбирают не менее чем по пять характерных колоний.

Из каждой выбранной колонии готовят мазки и окрашивают их по Граму. К колиформным бактериям относятся аэробные и факультативно-анаэробные, не образующие спор грамотрицательные палочки, сбраживающие лактозу с образованием кислоты и газа. Результат считают положительным при обнаружении хотя бы одной колонии колиформных бактерий.

б) Определение количества колиформных бактерий посевом на агаризованные селективно-диагностические среды. Метод используется для анализа пищевых продуктов, содержащих в 1 г твердого продукта более 1500 либо в 1 см 3 жидкого продукта (или смыва) более 150 КОЕ колиформных бактерий.

1. Первый способ. По 0,1 или 0,2 см 3 навески продукта или его разведения (либо смыва) наносят на поверхность подсушенной плотной селективно-диагностической среды (агар лактозный с бриллиантовым зеленым или среда Эндо), разлитой в две параллельные чашки Петри. Посевной материал немедленно равномерно растирают по поверхности среды стеклянным шпателем. Засеянную поверхность подсушивают, выдерживая чашки в горизонтальном положении в течение 15 мин.

Затем чашки переворачивают дном вверх и инкубируют при температуре 36(±1) °С в течение 24-48 ч. По окончании срока инкубации посевы просматривают и отмечают рост характерных колоний. Отбирают для дальнейшего анализа чашки, на которых выросло от 15 до 150 характерных колоний. Для подтверждения принадлежности выделенных микроорганизмов к колиформным бактериям отбирают не менее чем по пять подозрительных колоний. Из каждой отобранной колонии готовят мазки и окрашивают их по Граму. Колиформные бактерии являются грамотрицательными палочками. Если подтверждается, что из выбранных пяти колоний не менее четырех характерных колоний (т. е. не менее 80 %) можно отнести к колиформным бактериям, то считают, что все характерные колонии на чашке Петри принадлежат к этим бактериям. В остальных случаях количество колиформных бактерий определяют исходя из процентного отношения подтвержденных колоний к общему количеству характерных колоний, взятых для подтверждения.

Пересчет количества колиформных бактерий на 1 г (см 3 ) продукта осуществляют по формуле:

где М—количество микроорганизмов в 1 г (см 3 ) продукта;
N — степень разведения навески;
m — количество инокулята, внесенное для посева в чашку Петри;
С — округленное среднеарифметическое значение числа колоний.

Конечный результат вычисления выражают числом от 1,0 до 9,9x10 n .

2. Второй способ. Используют метод мембранных фильтров. Подготовка указанных фильтров и аппарата для фильтрования, а также сама техника фильтрования описаны в разделе, посвященном определению ОКБ и ТКБ воды.методом мембранных фильтров. Если анализу подвергают растворы, содержащие антимикробные вещества, или растворы с высоким осмотическим давлением, то после осаждения микроорганизмов на фильтре его промывают стерильной дистиллированной водой (или пептонно-солевым раствором). Фильтры с осевшими на них бактериями, не переворачивая, переносят на поверхность лактозного агара с бриллиантовым зеленым или среды Эндо.

При этом важно, чтобы между средой и фильтром не было пузырьков воздуха. В дальнейшем ход анализа аналогичен описанному выше. Для пересчета количества колиформных бактерий на 1 г (или 1 см 3 ) продукта число колоний, выросших на фильтре (даже если их число меньше 15), умножают на степень разведения и делят на объем профильтрованной жидкости.

в) Определение количества колиформных бактерий посевом в агаризованные селективно-диагностические среды. Метод используется для исследования пищевых продуктов, содержащих в 1 г твердого продукта более 150 или в 1 см 3 жидкого продукта (смыва) более 15 КОЕ колиформных бактерий.

По 1 см 3 навески продукта или его разведения вносят в две параллельные стерильные чашки Петри. Не позднее, чем через 15 мин чашки заливают 15-20 мл расплавленной и охлажденной до 45(±1)°С селективно-диагностической среды (лактозный агар с бриллиантовым зеленым или среда Эндо). Содержимое чашек немедленно осторожно перемешивают круговыми движениями. После застывания среды чашки переворачивают вверх дном. В дальнейшем анализ проводят как описано в выше.

г) Определение количества колиформных бактерий методом наиболее вероятного числа. Метод предназначен для пищевых продуктов, содержащих в 1 г твердого продукта менее 150 или в 1 см 3 жидкого продукта (смыва) менее 15 клеток колиформных бактерий.

Высевают три последовательные навески продукта и (или) его разведения, отличающиеся по количеству продукта в них в 10 раз. Каждую навеску (разведение) в трехкратной повторности высевают в колбы или пробирки с селективной средой (бульон лактозный с бриллиантовым зеленым и желчью, или бульон Мак-Конки, или среда Кесслер). Соотношение между посевным материалом и питательной средой 1:9, а для сред двойной концентрации—1:1. Посевы культивируют при 36(±1 )°С в течение 24-48 ч.

В дальнейшем ход анализа аналогичен описанному выше. НВЧ определяют по количеству колб (пробирок) с положительным результатом, используя при этом специальные таблицы. Положительными считают посевы, в которых отмечены признаки роста в жидкой среде, и при последующем пересеве которых на плотные среды и подтверждении характерных колоний хотя бы одна из них отнесена к колиформным бактериям.

д) Выявление колиформных бактерий при определении промышленной стерильности пастеризованных газированных фруктовых соков и напитков. Перед анализом необходимое количество сока или напитка отбирают в стерильную колбу с ватной пробкой. Затем колбу с продуктом помещают в водяную баню температурой 30-35 °С и, встряхивая колбу, освобождают продукт от углекислоты. Отсутствие выделения пузырьков газа свидетельствует о завершении процесса. После этого продукт нейтрализуют до pH 7,0(±0,3) стерильным раствором гидроокиси натрия массовой концентрацией 100 г/дм 3 . Значение pH контролируют по индикаторной бумаге или при помощи рН-метра.

Если продукта из одной упаковочной единицы недостаточно для определения, то объединяют две или более единицы в одну.

Подготовленный описанным выше образом продукт высевают в одну из селективных сред (бульон лактозный с бриллиантовым зеленым и желчью, бульон Мак-Конки, среда Кесслер). При этом высевают: три объема по 100 см 3 — во флаконы (колбы), содержащие по 100 см 3 среды двойной концентрации; три объема по 10 см 3 — в пробирки, содержащие по 10 см 3 среды двойной концентрации; три объема по 1 см 3 — в пробирки, содержащие по 10 см 3 среды нормальной концентрации. В дальнейшем анализ проводят как описано выше.

е) Выявление и определение количества Е. coli. При исследовании на наличие Е. coli в определенном продукте необходимую навеску последнего или его эквивалентное разведение высевают на среду Кесслер с лактозой. Посевы инкубируют при 44(±1) °С в течение 24-48 ч и затем регистрируют образование газа. Из положительных посевов производят посев штрихом на поверхность плотной селективно-диагностической среды (среда Эндо и др.) с таким расчетом, чтобы получить изолированные колонии. Посевы культивируют 18-24 ч при 36(±1) °С.

По три характерных колонии каждого типа пересевают в пробирки со скошенным МПА и инкубируют 18-24 ч при 36(±1)°С. Одновременно из каждой выбранной колонии готовят мазки и окрашивают их по Граму, определяют наличие оксидазы.

Дальнейшую дифференциацию выделенных культур (оксидазоотрицательных, грамотрицательных палочек) проводят по тестам ИМАЦ (реакции на индол, метил-рот, ацетилметилкарбинол и цитрат), утилизации глюкозы, сорбита, целлобиозы, способности к образованию сероводорода.

1. Тест на индол. Культуру со скошенного МПА петлей пересевают в пробирку с 5 см 3 мясопептонного бульона с триптофаном и инкубируют 24 ч при 36(±1)°С. Выявление индола проводят так же, как описано в разделе 5.2.8.4.

3. Тест с метил-рот проводят параллельно с постановкой теста Фогес-Проскауэра. В пробирку с культурой, выращенной на мясопептонном бульоне с глюкозой, после отбора культуральной жидкости для реакции на ацетилметилкарбинол, добавляют 4-5 капель индикатора метил-рот. Если реакция положительная (имеет место образование кислоты из углеводов), то появляется красное окрашивание.

4. Тест на утилизацию цитрата. Культуру со скошенного МПА петлей пересевают на цитратную среду Козера или на среду Симмонса. Посевы инкубируют 96 ч при 36(±1) °С. Отсутствие роста и изменения цвета среды свидетельствуют об отрицательной реакции. При положительной реакции наблюдается наличие роста и изменение окраски среды с оливково-зеленого цвета на васильковый.

Для выявления способности к сбраживанию глюкозы, целлобиозы и сорбита используют соответствующие среды. Посевы инкубируют 24 ч при 36(±1)°С. Изменение цвета среды вследствие кислотообразования свидетельствует о том, что исследуемые микроорганизмы способны к ферментации субстрата, входящего в состав среды. Е. coli, сбраживают глюкозу и сорбит, но не ферментируют целлобиозу.

Для определения способности образовывать сероводород культуры с МПА высевают методом укола в столбик среды Кристенсена и инкубируют при 36(±1)°С в течение 24-48 ч. Микроорганизмы, образующие сероводород, окрашивают среду в черный цвет.

Обобщают все полученные результаты. К Е. coli относят аэробные и факультативно-анаэробные не образующие спор грамотрицательные палочки, оксидазоотрицагельные, образующие газ из лактозы при 44(±1)°С, дающие положительную (или отрицательную реакцию на индол), положительную реакцию с метил-рот, отрицательную реакцию на цитрат и отрицательную реакцию Фогес-Проскауэра, ферментирующие глюкозу и сорбит и не ферментирующие целлобиозу. Е. coli не образует сероводород. Бактерии, не сбраживающие сорбит и целлобиозу, но по другим биохимическим признакам показавшие типичные для Е. coli реакции, относят к сорбитотрицательным штаммам Е. coli.

Если при подтверждении характерных колоний не менее двух из выбранных трех колоний (т. е. не менее 66%) можно отнести к Е. coli, то считают, что все характерные колонии на чашке Петри принадлежат к Е. coli. В остальных случаях количество Е. coli определяют исходя из процентного отношения подтвержденных колоний к общему количеству характерных колоний, взятых для подтверждения. Количественный учет Е. coli в 1 г (или 1 см 3 ) продукта можно производить методом НВЧ по количеству положительных посевов в жидкую среду (принцип метода).

При необходимости выявляют также способность дезаминировать фенилаланин (Е. coli не дезаминирует фенилаланин) и способность расщеплять мочевину (Е. coli не расщепляет мочевину).

Для определения способности бактерий дезаминировать фенилаланин производят обильный посев суточной культуры, выращенной на МПА, в пробирки со скошенным фенилаланиновым агаром. Посевы культивируют в термостате при 36(±1)°С в течение 4-24 ч, после чего на поверхность скошенного агара с культурой вносят по 4-5 капель раствора хлорного железа (FeCl₃*6H₂O) массовой концентрацией 100 г/дм 3 . При дезаминировании фенилаланина среда окрашивается в зеленый цвет.

Для установления способности расщеплять мочевину культуру высевают на среду Кристенсена с мочевиной и инкубируют при 36(+1)°С в течение 24 ч. При наличии бактерий, расщепляющих мочевину, среда становится резко щелочной и приобретает малиновый цвет.

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 10.10.2019

ГОСТ 7702.2.2-93
Группа H19

МЯСО ПТИЦЫ, СУБПРОДУКТЫ И ПОЛУФАБРИКАТЫ ПТИЧЬИ

Методы выявления и определения количества бактерий группы кишечных
палочек (колиформных бактерий родов Escherichia, Citrobacter, Enterobacter,
Klebsiella, Serratia)

Poultry meat, edible offal, ready-to-cook products. Methods for detection
and quantity determination of coliform bacteria (Escherichia, Citrobacter,
Enterobacter, Klebsiella, Serratia)

Дата введения 1995-01-01

1 РАЗРАБОТАН Госстандартом России
ВНЕСЕН Техническим секретариатом Межгосударственного Совета по стандартизации, метрологии и сертификации

2 ПРИНЯТ Межгосударственным Советом по стандартизации, метрологии и сертификации 21 октября 1993 г.
За принятие проголосовали:

Наименование национального органа
по стандартизации

Госстандарт Республики Беларусь

3 Постановлением Комитета Российской Федерации по стандартизации, метрологии и сертификации от 02.06.94 N 160 межгосударственный стандарт ГОСТ 7702.2.2-93 введен в действие непосредственно в качестве государственного стандарта Российской Федерации с 01.01.95

4 ВЗАМЕН ГОСТ 7702.2-74 в части метода определения бактерий рода Эшерихи

ССЫЛОЧНЫЕ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ

Обозначение НТД, на который дана ссылка

ГОСТ 7702.2.0-95/ГОСТ Р 50396.0-92

ГОСТ 7702.2.1-95/ГОСТ Р 50396.1-92

Настоящий стандарт распространяется на предназначенные для реализации и промышленной переработки:
мясо птицы в виде потрошеных, полупотрошеных и потрошеных с комплектом потрохов и шеей тушек, частей, полученных при их разделке, а также обваленное и измельченное;
субпродукты и полуфабрикаты птичьи.
Стандарт устанавливает методы выявления бактерий группы кишечных палочек и определения их количества.
Метод выявления основан на высеве определенного количества продукта или смывов с его поверхности и (или) их разведений в жидкие лактозосодержащие среды, инкубировании посевов при температуре (37±1) °С в течение (48±3) ч, подтверждении принадлежности выросших микроорганизмов по сбраживанию лактозы с образованием кислоты и газа и морфологическим признакам к бактериям группы кишечных палочек.
Метод определения количества бактерий группы кишечных палочек посевом в агаризованные дифференциальные среды предназначен для проб, содержащих в 1 г продукта более 150 КОЕ или в 1 см смыва более 15 КОЕ бактерий группы кишечных палочек.
Метод определения количества бактерий группы кишечных палочек посевом в жидкие питательные среды основан на методе наиболее вероятного числа (НВЧ) и предназначен для проб, содержащих в 1 г продукта менее 150 КОЕ, но в 10 г более 3 КОЕ или в 1 см смыва менее 15 КОЕ, но в 100 см смыва более 3 КОЕ.

1 Методы отбора проб и подготовка к исследованиям

1 Методы отбора проб и подготовка к исследованиям - по ГОСТ 7702.2.0/ГОСТ Р 50396.0

2 Проведение исследования

2.1 Выявление бактерий группы кишечных палочек

2.1.1 Из продукта или его смыва в пробирки со средой Кесслер с поплавками по ГОСТ 7702.2.0/ГОСТ Р 50396.0 пп.2.4.6; 2.4.7 проводят посев из соответствующих разведений. Посевы инкубируют при температуре (37±1) °С, предварительно их просматривают через (24±3) ч, отмечают положительную реакцию (пробирки с помутневшей средой, изменившей цвет с фиолетового на желто-зеленый, с наличием пузырьков газа в поплавках). При отсутствии газообразования реакцию считают сомнительной. Окончательный учет проводят через (48±3) ч.

2.1.2 Для подтверждения принадлежности микроорганизмов, выросших на среде Кесслер, к бактериям группы кишечных палочек делают пересевы штрихами на поверхность среды Эндо по ГОСТ 7702.2.0/ГОСТ Р 50396.0 п.2.4.10 для получения изолированных колоний. Посевы инкубируют при температуре (37±1) °С в течение (24±3) ч. Чашки с посевами инкубируют дном вверх.
На среде Эндо бактерии группы кишечных палочек образуют красные, розовые, бледно-розовые колонии с металлическим блеском или без него.

2.1.3 Не менее чем из 5 колоний, выросших на агаризованной среде, готовят мазки с окрашиванием по Граму по ГОСТ 36425.
Бактерии группы кишечных палочек - грамотрицательные неспорообразующие палочки.
Результат считают положительным при обнаружении даже одной колонии с признаками бактерий группы кишечных палочек.

2.1.4 Для выявления бактерий группы кишечных палочек допускается использование жидких лактозосодержащих сред (Хейфеца по ГОСТ 7702.2.0/ГОСТ Р 50396.0, 2.4.8 или бульона лактозного с бриллиантовым зеленым и желчью по ГОСТ 7702.2.0/ГОСТ Р 50396.0, 2.4.9) с посевами и анализом по 2.1.1.
Для проведения пересевов (см. п.2.1.2) допускается использование среды Левина по ГОСТ 7702.2.0/ГОСТ Р 50396.0, 2.4.10. Бактерии группы кишечных палочек на среде Левина образуют колонии блестящие черные или темные с черным центром, или сиреневые с темным центром.

2.2 Определение количества бактерий группы кишечных палочек

2.2.1 При определении количества бактерий группы кишечных палочек посевом на агаризованную среду по 0,1 или 0,2 см разведения продукта или смыва с него наносят на поверхность двух параллельных чашек Петри со средой Эндо.
Посев немедленно равномерно растирают по поверхности среды шпателем - изогнутой стеклянной палочкой. Засеянную поверхность подсушивают в течение 15 мин, для этого открытые чашки переворачивают вверх дном и выдерживают в горизонтальном положении в условиях, обеспечивающих испарение конденсационной влаги, исключающих микробное загрязнение. Посевы инкубируют при температуре (37±1) °С в течение (24±3) ч. Отбирают чашки, на которых выросло от 15 до 150 характерных колоний. Не менее 5 колоний используют для микроскопирования и пересева на жидкие лактозосодержащие среды для подтверждения их принадлежности к бактериям группы кишечных палочек.

2.2.2 При определении количества бактерий группы кишечных палочек по методу НВЧ высевают три последовательных 10-кратных разведения продукта или смыва с него. Каждое разведение в трехкратной повторности высевают в пробирки с одной из жидких лактозосодержащих питательных сред. Соотношение между количеством высеваемого материала и питательной средой 1:9. Инкубирование и анализ проводят, как указано в 2.1.1-2.1.4.

3 Обработка результатов

3.1 Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.

3.2 При обнаружении в посевах грамотрицательных неспорообразующих палочек, сбраживающих при температуре (37±1) °С лактозу с образованием кислоты и газа, дают заключение о том, что обнаруженные микроорганизмы относятся к бактериям группы кишечных палочек.

3.3 Результаты записывают следующим образом.

3.3.1 При выделении бактерий группы кишечных палочек из продукта или смыва с него записывают: бактерии группы кишечных палочек обнаружены или не обнаружены, при этом указывается навеска продукта в граммах или объем смыва в кубических сантиметрах, или площадь смыва в квадратных сантиметрах.

3.3.2 При определении количества бактерий группы кишечных палочек посевом в агаризованные среды подсчет микроорганизмов проводят по ГОСТ 7702.2.1/ГОСТ Р 50396.1, 3.2, при посеве в жидкие питательные среды - по ГОСТ 36425.

3.3.3 Результаты количественного определения бактерий группы кишечных палочек записывают, как указано в ГОСТ 7702.2.1/ГОСТ Р 50396.1, 3.3.

Средства для стирки. Общие технические условия

Товары бытовой химии в аэрозольной упаковке. Общие технические условия

Товары бытовой химии. Общие технические требования

Товары бытовой химии. Методы определения фосфорсодержащих соединений

Товары бытовой химии. Методы определения анионного поверхностно-активного вещества

Товары бытовой химии. Метод определения смываемости с посуды

Товары бытовой химии. Метод определения нерастворимого в воде остатка (абразива)

ГОСТ 30518-97/ГОСТ Р 50474-93

Методы выявления и определения количества бактерий группы
кишечных палочек (колиформных бактерий)

Food products. Methods for detection and quantity determination of coliformes

МКС 07.100.30
ОКСТУ 9109

Дата введения 1994-01-01

1 РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН Всероссийским научно-исследовательским институтом консервной и овощесушильной промышленности (ВНИИКОП) и Техническим комитетом по стандартизации ТК 93 "Продукты переработки плодов и овощей"

2 ПРИНЯТ Межгосударственным Советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол N 11 от 23 апреля 1997 г.)

3 Настоящий стандарт соответствует ИСО 4831-78 "Микробиология. Общее руководство по подсчету колибактерий. Методика расчета наиболее вероятного значения после инкубации при 30 °С" и ИСО 4832-78 "Микробиология. Общее руководство по подсчету колиформ. Метод подсчета колоний при температуре 30 °С" в части сущности методов

4 Постановлением Госстандарта России от 16 апреля 1998 г. N 122 ГОСТ 30518-97 введен в действие в качестве государственного стандарта Российской Федерации с момента принятия указанного постановления и признан имеющим одинаковую силу с ГОСТ Р 50474-93 на территории Российской Федерации в связи с полной аутентичностью их содержания

За принятие проголосовали:

Наименование национального органа
по стандартизации

Госстандарт Республики Беларусь

Госстандарт Республики Казахстан

5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

6 ССЫЛОЧНЫЕ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ

Обозначение НТД, на который дана ссылка

5.1.2, 5.5, 6.3, 6.4, 6.5

Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты и устанавливает метод выявления в определенной навеске пищевого продукта колиформных бактерий и три метода определения их количества: метод наиболее вероятного числа (НВЧ) и методы посева в или на агаризованные селективно-диагностические среды.

1 Сущность методов

1 Сущность методов

Методы выявления и определения наиболее вероятного числа колиформных бактерий основаны на высеве определенного количества продукта и (или) разведений навески продукта в жидкую селективную среду с лактозой, инкубировании посевов, учете положительных пробирок (колб), пересеве, при необходимости, культуральной жидкости на поверхность агаризованной селективно-диагностической среды для подтверждения по биохимическим и культуральным признакам роста принадлежности выделенных колоний к колиформным бактериям.

Методы определения количества колиформных бактерий посевом в (на) агаризованные селективно-диагностические среды основаны на высеве определенного количества продукта или его разведений в или на агаризованную селективно-диагностическую среду с лактозой, инкубировании посевов, подсчете типичных колоний, подтверждении, при необходимости, по биохимическим признакам принадлежности выделенных колоний к колиформным бактериям.

2 Отбор и подготовка проб

3 Аппаратура, материалы, реактивы и питательные среды

весы лабораторные общего назначения с метрологическими характеристиками по ГОСТ 24104* с наибольшим пределом взвешивания 200 г, 2-го класса точности (для взвешивания реактивов);

весы лабораторные общего назначения с метрологическими характеристиками по ГОСТ 24104* с наибольшим пределом взвешивания 1 кг, 4-го класса точности (для взвешивания продукта);
_____________
* С 01.07.2002 г. вводится в действие ГОСТ 24104-2001.

поплавки (трубки Дархема);

термостат с диапазоном рабочих температур 28-55 °С, позволяющий поддерживать заданную температуру с допустимой погрешностью ±1 °С.

желчь говяжья сухая или натуральная;

3.2 Для проведения испытания применяют питательные среды:

агар лактозный с бриллиантовым зеленым и феноловым красным;

бульон лактозный с бриллиантовым зеленым и желчью;

4 Подготовка к испытанию

4.1 Приготовление растворов

4.1.1 Щелочной раствор бромкрезолового пурпурного концентрацией 10 г/дм : 1 г бромкрезолового пурпурного переносят в фарфоровую ступку с 19 см раствора гидроокиси натрия (NaOH)=0,1 моль/дм и после растворения добавляют 80 см дистиллированной воды.

4.1.2 Раствор бриллиантового зеленого концентрации 5 г/дм : 0,5 г бриллиантового зеленого переносят в фарфоровую ступку и постепенно растворяют в дистиллированной воде. Раствор переливают в мерную колбу вместимостью 100 см и доводят дистиллированной водой до метки.

4.1.3 Раствор генцианвиолета или кристаллического фиолетового, или метилового фиолетового концентрацией 10 г/дм : 1 г одной из анилиновых красок переносят в фарфоровую ступку и постепенно растворяют в дистиллированной воде. Раствор переливают в мерную колбу вместимостью 100 см и доводят дистиллированной водой до метки.

4.1.4 Раствор фенолового красного концентрации 2 г/дм : 0,2 г фенолового красного переносят в фарфоровую ступку и постепенно растворяют в дистиллированной воде. Раствор переливают в мерную колбу вместимостью 100 см и доводят дистиллированной водой до метки.

4.1.5 Растворы, приготовленные по 4.1.1-4.1.4, хранят в закрытых сосудах из темного стекла при комнатной температуре не более 3 мес.

4.2 Приготовление питательных сред

4.2.1 Агар лактозный с бриллиантовым зеленым и феноловым красным: 3,0 г мясного экстракта, 10,0 г пептона, 10,0 г лактозы, 5,0 г хлористого натрия, 0,5 г фосфорнокислого двузамещенного калия, 15,0 г агара добавляют к 1000 см дистиллированной воды. При отсутствии мясного экстракта допускается использовать вместо мясного экстракта, пептона и дистиллированной воды мясопептонный бульон по ГОСТ 10444.1. Смесь нагревают до полного растворения компонентов, охлаждают до 45-55 °С, устанавливают рН так, чтобы после стерилизации она составляла при 25 °С (7,0±0,1). Среду стерилизуют в течение 20 мин при температуре (115±1) °С, затем охлаждают до 45-55° и прибавляют 40 см раствора фенолового красного, приготовленного по 4.1.4, и 2 см раствора бриллиантового зеленого, приготовленного по 4.1.2, тщательно перемешивают и разливают в стерильные чашки Петри, колбы или флаконы.

4.2.2 Бульон лактозный с бриллиантовым зеленым и желчью: 10,0 г пептона, 5,0 г лактозы, 6,45 г двузамещенного фосфорнокислого безводного натрия, 2,0 г однозамещенного фосфорнокислого безводного калия, 20,0 г сухой говяжьей желчи или 200 см натуральной желчи, 3 см раствора бриллиантового зеленого, приготовленного по 4.1.2, добавляют к 1000 см дистиллированной воды (в случае использования натуральной желчи к 800 см дистиллированной воды), тщательно перемешивают, нагревают на слабом огне до кипения, кипятят 1-2 мин, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, охлаждают до 45-55 °С и устанавливают рН таким образом, чтобы она составляла при 25 °С (7,2±0,1), после чего среду вновь доводят до кипения. Среда не подлежит стерилизации в автоклаве, ее разливают с соблюдением правил асептики по 10 см в стерильные пробирки с поплавками или по 100 см в колбы.

4.2.3 Бульон Мак-Конки: 20,0 г пептона, 10,0 г лактозы, 5,0 г хлористого натрия, 5,0 г сухой говяжей желчи или 50 см натуральной желчи, 1 см раствора бромкрезолового пурпурного, приготовленного по 4.1.1, добавляют к 1000 см дистиллированной воды (в случае использования натуральной желчи к 950 см дистиллированной воды), нагревают на слабом огне до кипения, кипятят 1-2 мин, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, охлаждают до 45-55 °С и устанавливают рН таким образом, чтобы после стерилизации она составляла при 25 °С (7,2±0,1). Среду разливают по 10 см в пробирки с поплавками или в колбы по 100 см и стерилизуют 15 мин при температуре (121±1) °С.

4.2.4 Среда Кесслер: 10,0 г пептона, 2,5 г лактозы, 5,0 г сухой говяжьей желчи или 50 см натуральной желчи, 2 см раствора генцианвиолета или кристаллического фиолетового, или метилового фиолетового, приготовленного по 4.1.3, добавляют к 1000 см дистиллированной воды (в случае использования натуральной желчи к 950 см дистиллированной воды), тщательно перемешивают, нагревают на слабом огне до кипения, кипятят 1-2 мин, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, охлаждают до 45-55 °С, устанавливают рН таким образом, чтобы после стерилизации она составляла при 25 °С (7,3±0,2). Среду разливают по 10 см в пробирки с поплавками или в колбы по 100 см и стерилизуют 20 мин при температуре (115±1) °С,

4.2.5 Среда Эндо: выпускается Дагестанским НПО "Питательные среды" и готовится по прописи, указанной на этикетке.

4.2.6 Жидкие среды двойной концентрации готовят по 4.2.2-4.2.4, но при приготовлении берут удвоенную массу (объем) ингредиентов, кроме дистиллированной воды, и разливают в посуду с учетом последующего количества добавляемого жидкого продукта.

5 Проведение испытания

5.1 Посевы для определения количества колиформных бактерий

5.1.1 Из навески продукта готовят исходное и ряд десятикратных разведений по ГОСТ 26669 так, чтобы можно было определить в 1 г (см ) продукта предполагаемое количество колиформных бактерий или их количество, указанное в нормативном документе на конкретный продукт.

5.1.2 При определении количества колиформных бактерий посевом на агазированные селективно-диагностические среды по 0,1 или 0,2 см навески продукта или его разведения наносят на поверхность одной из сред, приготовленных по 4.2.1 или 4.2.5 и разлитых в две параллельные чашки Петри. Подготовку чашек Петри со средой к посеву и посев проводят по ГОСТ 26670.

При применении метода мембранных фильтров по ГОСТ 26670 фильтры переносят на поверхность агаризованной селективно-диагностической среды, избегая образования пузырьков воздуха между средой и фильтром. Поверхность фильтра с осевшими на ней бактериями должна быть обращена вверх.

При определении количества колиформных бактерий посевом в агаризованные селективно-диагностические среды по 1 см навески продукта или его разведения вносят в две параллельные чашки Петри. Посевы заливают по ГОСТ 26670 на поверхность одной из агаризованных сред, приготовленных по 4.2.1 или 4.2.5.

5.1.3 При определении количества колиформных бактерий по методу НВЧ высевают три последовательные навески продукта и (или) его разведения, отличающиеся по количеству продукта в них в 10 раз.

Каждую навеску продукта и (или) его разведение в трехкратной повторности высевают в колбы или пробирки с одной из питательных сред, приготовленной по одному из следующих пунктов: 4.2.2, 4.2.3, 4.2.4.

Соотношение между количеством высеваемого продукта или его разведения и питательной средой 1:9, а для сред двойной концентрации - 1:1.

5.2 Посев для выявления колиформных бактерий в определенной навеске продукта

При выявлении колиформных бактерий в определенной навеске продукта или его эквивалентном разведении эту навеску или разведение вносят в одну из питательных сред, приготовленную по одному из следующих пунктов 4.2.2, 4.2.3, 4.2.4. Соотношение между количеством высеваемого продукта или его эквивалентным разведением и питательной средой 1:9, а для сред двойной концентрации - 1:1.

5.3 При испытании высококислотных продуктов для предотвращения резкого снижения рН (на 0,5 и более) питательных сред при внесении в них продукта или его разведений рН питательных сред доводят до допустимых значений с помощью стерильного раствора гидроокиси натрия, приготовленного по ГОСТ 10444.1, или при приготовлении питательных сред рН устанавливают выше заданного с учетом ее последующего снижения при внесении продукта. Количество добавляемого раствора гидроокиси натрия или величину, на которую необходимо увеличить рН при приготовлении питательных сред, устанавливают опытным путем.

5.4 Посевы на агаризованных и жидких средах инкубируют при температуре (36±1) °С в течение 24-48 ч. Чашки Петри с посевами инкубируют дном вверх. Посевы просматривают через (24±3) ч, отмечают положительные посевы в жидкие среды, а окончательный учет проводят через (48+3) ч.

Положительными считают посевы в жидкие среды, в которых имеет место интенсивный рост микроорганизмов, проявляющийся в помутнении среды, образовании газа, подкислении среды (то есть изменении цвета среды).

5.5 При необходимости, для подтверждения принадлежности микроорганизмов, выросших на жидких средах, к колиформным бактериям делают пересевы по ГОСТ 26670 на поверхность одной из агаризованных селективно-диагностических сред, приготовленных по 4.2.1 или 4.2.5. Посевы инкубируют при температуре (36±1) °С в течение (24±3) ч.

5.6 Посевы на агаризованных средах по 5.1 и 5.5 после инкубирования просматривают и отмечают рост характерных колоний.

На агаре лактозном с бриллиантовым зеленым и феноловым красным колиформные бактерии образуют ярко-желтые колонии диаметром 2-4 мм с желтой прозрачной зоной диаметром 1-3 мм вокруг колонии.

На среде Эндо колиформные бактерии образуют колонии бледно-розового или красного цвета, часто с металлическим блеском.

В посевах по 5.1.2 отбирают чашки, на которых выросло от 15 до 150 характерных колоний. При посеве методом мембранных фильтров на них подсчитывают количество колоний и в том случае, если их менее 15.

Колиформные бактерии являются грамотрицательными палочками.

6 Обработка результатов

6.1 Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.

6.2 К колиформным бактериям относят аэробные и факультативно-анаэробные не образующие спор грамотрицательные палочки, сбраживающие лактозу с образованием кислоты и газа.

6.3 При определении НВЧ или при выявлении колиформных бактерий в определенной навеске продукта посевы в жидких средах считают положительными, если при последующем пересеве и подтверждении характерных колоний хотя бы в одной колонии будут обнаружены колиформные бактерии.

НВЧ колиформных бактерий в 1 г (см ) продукта определяют по количеству положительных колб (пробирок) по ГОСТ 26670.

6.4 Если при подтверждении характерных колоний в 80% случаев, то есть не менее чем в 4 из 5 колоний, подтвержден рост колиформных бактерий, то считают, что все характерные колонии, выросшие на чашке Петри (см. п.5.6), принадлежат к колиформным бактериям. В остальных случаях количество колиформных бактерий определяют, исходя из процентного отношения подтвержденных колоний к общему количеству характерных колоний, взятых для подтверждения.