Гост определение яйца гельминтов
Текст ГОСТ Р 55457-2013 Лошади. Методы лабораторной диагностики гельминтозов
ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ТЕХНИЧЕСКОМУ РЕГУЛИРОВАНИЮ И МЕТРОЛОГИИ
ЛОШАДИ
Методы лабораторной диагностики гельминтозов
3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН 8 ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 27 июня 2013 г. № 209-ст
4 ВВЕДЕН 8ПЕРВЫЕ
Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии
НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Методы лабораторной диагностики гельминтозов
Methods for laboratory helminthosis diagnostics
Дата введения - 2014 - 07 - 01
Настоящий стандарт распространяется на лошадей и устанавливает методы лабораторной диагностики гельминтозов.
8 настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:
ГОСТ Р 12.1.019-2009 Система стандартов безопасности труда. Электробеэоласность. Общие требования и номенклатура видов защиты
ГОСТ Р 54001-2010 Удобрения органические. Методы гельминтологического анализа ГОСТ Р 54627-2011 Животные сельскохозяйственные жвачные. Методы лаборной диагностики гельминтозов
ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда, вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности
ГОСТ 12.1.018-93 Система стандартов безопасности труда. Пожаро-взрывобезопасность статического электричества. Общие требования
ГОСТ 12.4.011-89 Система стандартов безопасности труда. Средства защиты работающих. Общие требования и классификация
ГОСТ 61-75 Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия
ГОСТ 244-76 Натрия тиосульфат кристаллический. Технические условия
ГОСТ 4523-77 Реактивы. Магний сернокислый 7-водный. Технические условия
ГОСТ 6709-72 вода дистиллированная. Технические условия
ГОСТ 22280-76 Реактивы. Натрий лимоннокислый 5,5>водный. Технические условия
8 настоящем стандарте применены термины по ГОСТ Р 54627.
Общие положения методов лабораторной диагностики гельминтозов лошадей - по ГОСТ Р 54627 (раздел 4),
5.1 Сотрудники, выполняющие работу по отбору, доставке и анализу проб, должны иметь рабочую спеиодежду: халаты, фартуки, перчатки, резиновую обувь по ГОСТ 12.4.011. Рабочие халаты подлежат обмену на чистые по истечении каждой рабочей недели. Спеиодежду и обувь хранят в шкафах.
Сотрудники должны быть обеспечены средствами и условиями для личной ж гиены и обязаны соблюдать санитарно-гигиенические требования.
5.2 Требования безопасности при работе с химическими реактивами - по ГОСТ 12.1.007. с электрооборудованием - по ГОСТ Р 12.1.019.
Требования пожарной безопасности - по ГОСТ 12.1.018.
5.3 Помещение, в котором проводят исследования, должно быть оборудовано приточновытяжной вентиляцией. Работы необходимо проводить в вытяжном шкафу с применением резиновых перчаток.
6.1 Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда, материалы и реактивы - по ГОСТ Р 54627 (раздел 6) со следующим дополнением.
Устройство для сбора личинок и мелких нематод из фекалий (звездочка).
Кислота уксусная по ГОСТ 61. раствор 3 %-ный.
Натрий лимоннокислый по ГОСТ 22280.
Сыворотка крови лошади.
6.2 Допускается применение других средств измерений, вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающим необходимую точность измерения, а также реактивов и материалов по качеству не хуже вышеуказанных.
7 Подготовка к исследованиям
Подготовку к исследованиям проводят по ГОСТ Р 54627 со следующими дополнениями.
7.1 Отбор и подготовка проб фекалий
Точечные пробы отбирают из фекалий лошадей, патологического материала, соскобов объектов внешней среды, промежуточных хозяев гельминтов.
Точечные пробы фекалий от живых лошадей берут из прямой кишки (10 г) или только что выделившегося испражнения.
В сопроводительном документе, направляемом с пробой в лабораторию, также указывают конюшню и число животных в конюшне.
При индивидуальном обследовании жеребцов-производителей. конематок и особо ценных спортивных лошадей номера на упаковке и в описи должны строго соответствовать.
7.2 Отбор и подготовка проб почвы, приготовление растворов по ГОСТ Р 54627.
7.3 Приготовление комбинированного раствора сернокислого магнмя и тиосульфата натрия плотностью 1,3 г/см 3
Раствор 1. 1000 г магния сернокислого 7-водного по ГОСТ 4523 растворяют в 1 дм 3 горячей дисстилированной воде по ГОСТ 6709. Через 24 ч раствор фильтруют в чистую стеклянную посуду.
Срок хранения раствора 1 в стеклянной колбе - не более 30 дней.
Раствор 2. 2000 г натрия тиосульфата натрия по ГОСТ 244 растворяют в 1 дм 3 горячей дистиллированной воды по ГОСТ 6709. Через 24 ч раствор фильтруют в чистую стеклянную посуду.
Срок хранения раствора 2 в стеклянной колбе - не более 30 дней.
Раствор 3. Три части раствора 1 смешивают с тремя частями раствора 2. затем к шести частям получившейся смеси растворов добавляют одну часть дисстилированной воды. Ареометром проверяют плотность рабочего раствора, которая должна быть 1,3 г/см .
Срок хранения раствора 3 в стеклянной колбе - не более 30 дней.
8 Флотационные методы определения наличия яиц и личинок гельминтов
8.1 Для определения наличия яиц и личинок гельминтов лошадей применяют флотационные методы по ГОСТ Р 54627 (подразделы 8.1-8.4), а также комбинированный флотационный метод Вреза для диагностики нематодозов и цестодозов.
8.2 Комбинированный флотационный метод Бреза для диагностики нематодозов и цестодозов
Анализируюмую пробу массой Зге ступке заливают 10-15 см 3 комбинированного раствора сернокислого магния и тиосульфата натрия по 7. 2.1, растирают пестиком до гомогенного состояния, доливают комбинированным раствором до 45-50 см 3 , размешивают стеклянной палочкой и процеживают через металлическое сито с ячейкой диаметром 0,3-0.5 мм в чистый стакан и отстаивают в течение 10-15 мин.
Затем снимают капли поверхностной взвеси из разных мест легким прикосновением металлической петли диаметром 0.8 см. переносят на предметное стекло и исследуют под микроскопом.
Для диагностики фасциолеэа и других гельминтозов лошадей применяют оедиментационкый метод последовательного промывания по ГОСТ Р 54627 (подразделы 9.1-9.2).
Для определения гельминтозов лошадей применяют комбинированные (седиментационно-флотационные) методы Дарлинга. Щербовича и Вишняускаса по ГОСТ Р 54627 (раздел 10). а также метод Бреза со следующим уточнением.
Приготовленную в ступке водную суспензию из 3 г фекалий лошадей процеживают через сито в чистую стеклянную центрифужную пробирку вместимостью 10-15 см 3 и центрифугируют с частотой вращения 2000- 3000 об/мин в течение 2-3 мин. После этого надосадочную жидкость осторожно
сливают, а к осадку добавляют 10 см 3 одного из флотационных растворов: натрия хлористого (метод Дарлинга), магния сульфата (метод Щербовича), комбинированного раствора магния сульфата и тиосульфата натрия ( метод Бреза). хорошо размешивают и снова центрифугируют в том же режиме. После чего металлической петлей снимают по три капли поверхностной взвеси из каждой пробирки, переносят на предметное стекло и препарат исследуют под микроскопом.
Для диагностики диктиокаулеэа лошадей применяют гельминтолярвоскопические методы Бермана-Орлова и Шильникова (упрощенный метод Бермана) по ГОСТ Р 54627 (раздел 11) со следующим уточнением.
Для исследования по методу Бермана-Орлова берут 10 г анализируемой пробы фекалий лошадей (ослов, пони).
Определение количества яиц нематод, цестод и трематод в фекалиях лошадей - по ГОСТ Р 54627 (раздел 12).
Определение жизнеспособности яиц и личинок гельминтов проводят по ГОСТ Р 54001 (раздел 8) по морфологии, окрашиванию, культивированию и осуществляют биопробу.
Исследования павших животных на наличие гельминтов - по ГОСТ Р 54627 (раздел 14).
Исследование соскобов из объектов внешней среды на наличие яиц гельминтов - по ГОСТ Р 54627 (раздел 15).
Проведение исследований методом установления интенсивности инвазии - по ГОСТ Р 54627 (раздел 16).
Исследования почвы на наличие яиц гельминтов проводят по ГОСТ Р 54627 (раздел 17).
18.1 Методы определения наличия личинок гельминтов в крови
18.1.1 Сущность методов
Методы исследования крови основаны на обнаружении личинок гельминтов, локализующихся в различных органах и тканях лошадей, но выделяющих своих зародышей в кровь. Эти методы используют на практике для диагностики филяриатоэов - сетариоза лошадей (ослов, мулов) и парафиляриоэа лошадей. Для этих целей используют венозную и периферическую кровь.
18.1.2 Методы исследования венозной крови с лимоннокислым натрием
18.1.2.1 Венозную кровь берут в соотношении 1:5. 1:7 или 1:10 с 3.8 %-ным раствором лимоннокислого натрия по ГОСТ 22280. центрифугируют, осадок микроскопируют.
18.1.2.2 Берут 20 см 3 венозной крови, цитрируют (на 10 см 3 крови добавляют 1 см 3 3.8%-ного раствора лимоннокислого натрия), отстаивают в течение 20-25 мин. В результате образуется три слоя: нижний - эритроциты, средний (узкое беловатое кольцо) - лейкоциты, верхний - сыворотка. Химической пипеткой диаметром 1.0-1.5 мм берут содержимое среднего слоя, где концентрируются личинки, наносят две - три капли на предметное стекло, покрывают покровным и микроскопируют.
В цитрированной венозной крови при комнатной температуре личинки сохраняют жизнеспособность в течение одного - двух дней.
18.1.3 Метод исследования венозной крови с дистиллированной водой
Венозную кровь и дистиллированную воду берут в соотношении 1:5 или 1:10. центрифугируют, осадок микроскопируют. В результате гемолиза образуется менее обильный, чем при других методах исследования, осадок, личинки в воде остаются подвижными и легко обнаруживаются.
18.1.4 Метод Штаубли
3-4 см 3 венозной крови смешивают с 3-5- или 10-кратным количеством 3 %-ного раствора уксусной кислоты для растворения эритроцитов. Смесь центрифугируют, осадок микроскопируют на предметном стекле.
18.1.5 Метод Фюллеборна
Взятую венозную кровь отстаивают, сыворотку сливают в другую пробирку и центрифугируют в течение 10 мин. Осадок берут пипеткой и каплями наносят на предметное стекло для микроскопирования.
При исследовании на сетариоз венозную кровь лучше брать рано утром или ночью, так как концентрация микросетарий в крови в это время выше.
Личинок сетарий часто обнаруживают при исследовании периферической и венозной крови весной и летом, с ноября по февраль их обнаружить трудно.
Высушенный препарат красят гематоксилином, а затем при необходимости докрашивают краской Романовского-Гимза. В случае инвазии обнаруживают яйца и вышедшие личинки филяриат.
18.2 Исследование содержимого желудка
Содержимое желудка исследуют е основном на драшейоз и габронемоз лошадей, ослов и мулов, вызываемые нематодами, драшеей Животное предварительно сутки выдерживают на голодной диете, затем вводят носопищеводный зонд по обычной методике, принятой в клинической диагностике. Убедившись, что зонд попал в желудок, откачивают шприцем желудочный сок. после этого вынимают зонд. Желудочным соком наполняют центрифужные пробирки, центрифугируют е течение 3-4 мин. осадок наносят на предметные стекла, покрывают покровными и микроскопируют. При заболевании находят яйца драшей и габронем. 18.3 Исследование соскобов с перианальных складок Гельминтологическое исследование перианальных складок проводят при диагностике оксиуроза лошадей. Для исследования готовят небольшие деревянные лопаточки с закругленными краями или обыкновенные слички. Смоченной в 50 %-ном растворе глицерина лопаточкой или спичкой делают соскоб с перианальных складок, с внутренней стороны корня хвоста и с кожи в области промежности. Соскоб переносят на предметные стекла в 2-3 капли смеси, состоящей из равных количеств глицерина и воды. Затем накрывают покровным стеклом и микроскопируют на наличие яиц оксиуры. 18.4 Исследование кожи Исследования кожи проводят при диатостике онхоцеркоза и кожного габронемоза и драшейоза лошадей. При онхоцеркоэе лошадей рекомендуется исследовать кусочки кожи. На месте экстирпации. в области холки, плеча или передней конечности, выбривают шерсть, кожу дезинфицируют. Выбритый участок кожи берут в складку и срезают бритвой или острыми ножницами небольшой кусочек кожи толщиной 3-4 мм и площадью 15-30 мм 2 . Кусочек кожи помещают в пробирку с 2-3 см 3 физиологического раствора или же смеси физиологического раствора с сывороткой крови лошади в равных частях. Пробирку оставляют на несколько часов при комнатной температуре или ставят в термостат при температуре 35 в С-37 *С. После этого кусочки кожи удаляют, а жидкость, в которую выделились личинки онхоцерков. выливают частями на предметное стекло и микроскопируют. 18.5 Исследования травы Траву исследуют на наличие личинок нематод (стронгилят пищеварительного тракта, диктиокаулюсов и других), а также на наличие адопескариев трематод (фасциол). Личинки нематод способны мигрировать в горизонтальном и вертикальном направлениях, но наибольшее их количество обнаруживается в прикорневой части стебля на расстоянии 3-5 см от корня, поэтому для исследования используют нижнюю часть растений. Собранные из разных участков пастбищ пробы травы объединяют путем перемешивания. Из объединенной пробы берут лабораторную пробу травы массой 1000 г. Ножницами разрезают на части и закладывают в аппарат Бермана (по частям) с теплой водой и оставляют на 2 ч. Пробирки с осадком центрифугируют при 1500- 2000 об/мин в течение 1-2 мин. затем верхний слой сливают, а осадок переносят на предметное стекло и исследуют под микроскопом. 18.6 Дифференциация личинок паразитических и свободноживущих нематод 8 почве и на траве встречаются свободноживущие нематоды и их личинки. Для отличия личинок свободноживущих нематод от паразитических применяют метод Корта. Суть метода заключается в действии формалина на личинки нематод, при котором личинки свободноживущих нематод погибают быстрее, чем паразитические. Личинки нематод помещают в чашку Петри или на часовое стекло в воду. При добавлении 40 %-ного формалина к жидкости с личинками нематод в соотношении 1:5. личинки свободноживущих нематод гибнут через 5-7 мин. паразитические остаются живыми в течение 15-20 мин. но подвижность их замедляется. 19.1 Исследования промежуточных хозяев нематод, цестод и трематод на зараженность - по ГОСТ Р 54627 (раздел 18) со следующим дополнением. Личинки парафилярий лошадей развиваются в полости тела мухи семейства Muscidae. в жировом теле. Инвазионные личинки парафилярий находятся в головке, грудке и хоботке мухи-жигалки. 19.2 Особенности исследования комаров Culicidae Собранных с животных комаров вскрывают иглами в капле физиологического раствора под стереоскопическим микроскопом. Личинки сетарий лошадей развиваются в грудке, а инвазионные находятся в хоботке комара. 19.3 Особенности исследования панцеркых клещей Oribatei Собранных из почвы несколько увлажненных участков пастбищ и лугов клещей исследуют в капле воды под стереоскопическим микроскопом, вскрывая их иглами. Цистициркоиды аноплоцефалят лошадей локализуются в полости тела клеща, они имеют шаровидную форму, в цисте находится сколекс с присосками и шейка. Пример записи в журнале результатов гельминтологических исследований А.1 Пример записи в журнале результатов гельминтологических исследований проб фекалий от лошадей, соскобое из объектов внешней среды, почвы, травы, промежуточных хозяев гельминтов, а также пробы крови, содержимого желудка, соскобов с перианальных складок и биопсия кожи приведен в таблице А.1. Бесплатная горячая линия юридической помощи 7.7. Методы определения жизнеспособности яиц и личинок гельминтов Жизнеспособность яиц гельминтов определяют по внешнему виду, путем окрашивания витальными красками, культивированием в оптимальных условиях и постановкой биологической пробы. Яйца гельминтов микроскопируют вначале при малом, затем при большом увеличении. У деформированных и мертвых яиц гельминтов оболочка разорвана или прогнута внутрь, плазма мутная, разрыхлена. У сегментированных яиц шары дробления (бластомеры) неравного размера, неправильной формы, часто сдвинуты к одному полюсу. Иногда встречаются аномальные яйца, которые, имея внешние уродства, развиваются нормально. У живых личинок аскарид мелкая зернистость имеется только в средней части тела, по мере их гибели она распространяется по всему телу, появляются крупные блестящие гиалиновые вакуоли, так называемые "нитки жемчуга". Для определения жизнеспособности зрелых яиц аскарид, власоглавов, остриц следует вызывать активные движения личинок легким подогреванием препарата (до температуры не выше 37 °С). Жизнеспособность личинок аскарид и власоглавов удобнее наблюдать после их выделения из скорлупы яйца надавливанием на покровное стекло препарата препаровальной иглой или пинцетом. У инвазионных личинок аскарид часто замечается чехлик, отслоившийся на головном конце, а у закончивших развитие в яйце личинок власоглавов на этом месте при большом увеличении обнаруживается стилет. У погибших личинок гельминтов независимо от их места нахождения (в яйце или вне его) замечают распад тела. При этом внутренняя структура личинки становится глыбчатой или зернистой, а тело мутным и непрозрачным. В теле обнаруживаются вакуоли, а на кутикуле - разрывы. Жизнеспособность онкосфер тениид (бычьего, свиного цепней и др.) определяют по движению зародышей при воздействии на них пищеварительных ферментов. Яйца помещают на часовое стекло с желудочным соком собаки или искусственным дуоденальным соком. Состав последнего: панкреатина - 0,5 г, натрия бикарбоната - 0,09 г, дистиллированной воды - 5 мл. Часовые стекла с яйцами ставят в термостат при 36 - 38 °С на 4 часа. При этом живые зародыши освобождаются от оболочек. Оболочки живых онкосфер также растворяются в подкисленном пепсине и в щелочном растворе трипсина через 6 - 8 часов в термостате при 38 °С. Если поместить яйца тениид в 1%-ный раствор натрия сульфида или 20%-ный раствор натрия гипохлорида, или же в 1%-ный раствор хлорной воды при 36 - 38 °С, зрелые и живые зародыши освобождаются от оболочек и не изменяются в течение 1 суток. Незрелые и мертвые онкосферы сморщиваются или набухают и резко увеличиваются, а затем "растворяются" в течение 10 минут - 2 часов. Живые зародыши тениид также активно двигаются в смеси 1%-ного раствора натрия хлорида, 0,5%-ного раствора натрия гидрокарбоната и желчи при 36 - 38 °С. Жизнеспособность адолескариев фасциол, собранных на растениях и других объектах водоемов, проверяют исследованием их на предметном стекле в физиологическом растворе под микроскопом с нагревательным столиком. При подогревании личинки трематоды, находящиеся в цисте, начинают двигаться. Для определения жизнеспособности яиц карликового цепня наиболее проста методика Иониной Н.С.: у живых яиц медианная пара эмбриональных крючьев или параллельна латеральным, или последние образуют с медианной угол у основания меньше 45°. У мертвых яиц латеральные пары образуют у основания угол с медианной парой больше 45° или же крючья беспорядочно разбросаны (утрачивается их парное расположение); иногда наблюдается сморщивание зародыша, образование зернистости. Более точен метод, основанный на появлении движений онкосферы при резкой смене температур: от 5 - 10° до 38 - 40 °С. Определение жизнеспособности незрелых яиц нематод следует изучать во влажной камере (чашках Петри), помещая яйца аскарид в 3%-ный раствор формалина, приготовленный на изотоническом растворе натрия хлорида при температуре 24 - 30 °С, яйца власоглавов в 3%-ном растворе соляной кислоты при температуре 30 - 35 °С; яйца остриц в изотоническом растворе натрия хлорида при температуре 37 °С. Чашки Петри следует открывать 1 - 2 раза в неделю для лучшей аэрации и снова увлажнять фильтровальную бумагу чистой водой. Наблюдения за развитием яиц гельминтов ведут не реже 2 раз в неделю. Отсутствие признаков развития в течение 2 - 3 месяцев свидетельствует о их нежизнеспособности. Признаками развития яиц гельминтов являются сначала стадии дробления, деление содержимого яйца на отдельные бластомеры. В течение первых дней развивается до 16 бластомер, которые переходят во вторую стадию - морулу и т.д. Яйца анкилостомид культивируют в стеклянном цилиндре (высотой 50 см и диаметром 7 см), закрытом пробкой. Смесь из равных объемов стерильного песка, древесного угля и испражнений с яйцами анкилостомид, разведенную водой до полужидкой консистенции, наливают осторожно на дно цилиндра при помощи стеклянной трубки. В течение 1 - 2-суточного отстаивания в темноте при температуре 25 - 30 °С из яиц вылупляются рабдитовидные личинки, а через 5 - 7 суток они становятся уже филяриевидными: личинки выползают вверх по стенкам цилиндра, где видны даже невооруженным глазом. Яйца трематод, естественно развивающиеся в воде, например описторхисов, дифиллоботриид, фасциол и других, помещают на часовое стекло, чашку Петри или в другой сосуд, наливают небольшой слой обычной воды. При культивировании яиц фасциол следует учесть, что они развиваются быстрее в темноте, при этом в живых яйцах при температуре 22 - 24 °С через 9 - 12 суток формируется мирацидий. При микроскопировании развивающихся яиц трематод хорошо заметны движения мирацидия. Мирацидий фасциолы из оболочек яйца выходит только на свету. Метод Фюллеборна. Личинки анкилостомид и стронгилид культивируют на агаре в чашке Петри с животным углем. После выдерживания в термостате при температуре 25 - 30 °С в течение 5 - 6 часов личинки расползаются по агару, оставляя за собой дорожку из бактерий. Метод Харада и Мори. В пробирки, помещенные в штатив, добавляют 7 мл дистиллированной воды. Деревянной палочкой берут 0,5 г испражнений и делают мазок на фильтровальной бумаге (15 х 150 мм) в 5 см от левого края (эту операцию проводят на листе бумаги, чтобы защитить поверхность лабораторного стола). Затем полоску с мазком вставляют в пробирку так, чтобы свободный от мазка левый конец достигал дна пробирки. Накрывают верхний конец куском целлофана и плотно обхватывают резинкой. На пробирке пишут номер, фамилию обследуемого. В таком состоянии пробирки хранят 8 - 10 суток при температуре 28 °С. Для изучения личинок снимают и удаляют целлофановую крышку и извлекают пинцетом полоску фильтровальной бумаги. При этом следует проявлять осторожность, так как небольшое количество инвазионных личинок может передвигаться к верхнему концу фильтровальной бумаги или к стенке пробирки и проникать под поверхность целлофана. Пробирки помещают в горячую водяную баню при температуре 50 °С на 15 минут, после чего содержимое их встряхивают и быстро переливают в 15-миллилитровую пробирку для осаждения личинок. После центрифугирования надосадочную жидкость удаляют, а осадок переносят на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и микроскопируют под малым увеличением. Для дифференциального диагноза филяриевидных личинок необходимо пользоваться данными таблицы 3. ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА ФИЛЯРИЕВИДНЫХ ЛИЧИНОК A. DUODENALE, N. AMERICANUS, S. STERCORALIS, trICHOStrONGYLUS SP. Мертвые ткани в большинстве случаев воспринимают краски быстрее, чем живые. Эти особенности используют в гельминтологии для определения жизнеспособности яиц и личинок гельминтов. Однако в отдельных случаях некоторые краски лучше воспринимаются живыми тканями, чем мертвыми. Для дифференциального определения живых и мертвых яиц и личинок применяют следующие краски и способы. Для окраски живых и мертвых тканей часто используют лейкобазу метиленового синего. Живая клетка или ткань редуцирует метиленовый синий в бесцветную лейкобазу, мертвая ткань не обладает такой способностью, поэтому приобретает окраску. Критерием состояния яйца является окрашивание зародыша, но не оболочки. Такая его способность связана с условиями гибели яйца. В тех случаях, когда волокнистая оболочка в мертвом яйце не теряет свойств полупроницаемости, она не будет пропускать красители, следовательно, мертвый зародыш не будет окрашиваться. Окрашенный зародыш всегда свидетельствует о гибели яйца. Для окраски яиц аскарид можно использовать метиленовый синий в растворе молочной кислоты с едкой щелочью (метиленового синего 0,05 г, едкого натра 0,5 г, молочной кислоты - 15 мл). Живые яйца окраску не воспринимают; окрашиваются в синий цвет зародыши мертвых яиц. Окрашивание личинок аскарид основным раствором краски бриллианткрезилового синего в концентрации 1:10000 осуществляют следующим образом: на предметное стекло наносят каплю жидкости с яйцами аскарид и каплю основного раствора краски. Препарат накрывают покровным стеклом, которое плотно прижимают к предметному стеклу при легком постукивании препаровальной иглой. Под микроскопом наблюдают количество вышедших личинок и степень их окрашиваемости; после чего этот же препарат просматривают повторно через 2 - 3 часа. Живыми считаются только недеформированные личинки, не окрасившиеся в течение 2 часов. Мертвые личинки или не выходят из яиц, или окрашиваются при разрыве скорлупы (частично или полностью). При определении жизнеспособности яиц аскаридий птиц возможна окраска препаратов 5%-ным спиртовым раствором йода. При его нанесении на препарат зародыши мертвых яиц аскаридий в течение 1 - 3 сек. окрашиваются в оранжевый цвет. Мертвые яйца описторхисов и онкосферы бычьего цепня окрашиваются раствором толуидинового синего (1:1000), а мертвые онкосферы бычьего цепня - раствором бриллианткрезилового синего (1:10000). При этом приобретают цвет зародыши и оболочки как мертвых, так и живых яиц. Поэтому после окраски яйца и онкосферы отмывают в чистой воде и дополнительно окрашивают их сафранином (в разведении 1:10000 спирта 10 °С). Спирт удаляет краску с оболочек, а сафранин окрашивает в красный цвет. В результате живые яйца окрашиваются в красный цвет; яйца с мертвыми зародышами - в синий, а оболочка остается красной. Мертвые зародыши онкосфер бычьего цепня быстро, в течение нескольких минут, окрашиваются в ярко-красный или розовый цвет сафранином или в синий цвет бриллианткрезиловым синим в разведении 1:4000, или индигокармином в разведении 1:1000 - 1:2000. Живые зародыши не изменяются под влиянием этих красок даже спустя 2 - 7 часов. Для определения жизнеспособности яиц карликового цепня рекомендуется использовать следующие краски: 1. Бриллианткреазиловый синий (1:8000) - через 1 час у мертвых яиц особенно ярко окрашивается онкосфера, которая резко выделяется на бледном или бесцветном фоне остальной части яйца. 2. Сафранин (1:8000 при воздействии в течение 2 часов и 1:5000 - в течение 3 - 5 часов). 3. 50%-ный раствор пирогалловой кислоты в разведении 1:2 - при воздействии в течение 1 часа при температуре 29 - 30 °С (чем ниже температура, тем продолжительнее процесс окрашивания). Люминесцентная микроскопия дает возможность дифференцировать живые и мертвые объекты без повреждения яйца. Для флюоресценции используются не ультрафиолетовые лучи, а сине-фиолетовая часть видимого света, с обычным микроскопом и предметными стеклами; к осветителю ОИ-18 добавляют специальный набор цветных фильтров. Живые и мертвые яйца аскарид, остриц, карликовых цепней, бычьего цепня, широкого лентеца и других гельминтов люминесцируют неодинаково. Это явление наблюдается как при первичной люминесценции без применения красителей, так и при окраске флюорохромами (акридиновый оранжевый, корифосфин, примулин, ауролин, сульфат берлерина, трипафлавин, риванол, акрихин и др.). Неокрашенные, живые несегментированные яйца аскарид светятся ярко-зеленым светом с желтоватым оттенком; у мертвых яиц оболочка излучает зеленый свет значительно ярче, чем темно-зеленая зародышевая часть; у яиц аскарид с личинкой проявляется только оболочка, а у мертвых - и оболочка, и личинка ярко-желтого цвета. Непигментированные и несегментированные живые яйца остриц и карликовых цепней излучают зеленовато-желтый свет, у мертвых яиц интенсивно люминесцирует оболочка на фоне темно-зеленой зародышевой массы. При вторичной люминесценции (при окраске акридин оранжевым в разведении 1:10000 и 1:50000 от 30 минут до 2 часов) оболочка живых и мертвых нематод, трематод и цестод люминесцирует неодинаково. Скорлупа живых и мертвых яиц аскарид, токсокар, остриц, карликовых цепней, крысиных цепней, бычьего цепня, лентецов окрашивается в оранжево-красный цвет. Зародыши живых яиц аскарид, токсаскарисов, крысиного цепня, широкого лентеца и онкосферы бычьего цепня люминесцируют тусклым темно-зеленым или серо-зеленым цветом. Мертвые зародыши яиц этих гельминтов излучают "горящий" оранжево-красный цвет. Живые личинки остриц и токсокар (освобожденные от скорлупы яйца) излучают тусклый серо-зеленый свет, при их гибели цвет изменяется от головного конца в "горящий" светло-зеленый, затем желтый, оранжевый и, наконец, в ярко-оранжевый. При окраске флюорохромами - корифосфилом, примулином у мертвых яиц аскарид и власоглавов наблюдается свечение от лилово-желтого до медно-красного цвета. Жизнеспособные яйца не люминесцируют, а окрашиваются в темно-зеленый цвет. Живые яйца трематод (парагонимусов и клонорхисов) не люминесцируют после окраски акридиновым оранжевым, а от мертвых яиц исходит желтовато-зеленый цвет. Метод люминесценции может быть применен и для определения жизнеспособности личинок гельминтов. Так, флюорохромированные раствором акридинового оранжевого (1:2000) личинки стронгилят, рабдитат светятся: живые - зеленым (с оттенком), мертвые - ярко-оранжевым светом. Живые мирацидии, вышедшие из оболочки, излучают тусклый голубоватый свет с еле заметным светло-желтым венчиком ресничек, но спустя 10 - 15 минут после гибели проявляются ярким "горящим" светло-зеленым, а затем - оранжево-красным светом. Биологическая проба - определение жизнеспособности инвазионных яиц гельминтов посредством их скармливания лабораторным животным. Это наиболее точный метод. Личинками гельминта заражают соответствующего промежуточного или окончательного хозяина, можно использовать также лабораторных животных, которым скармливают зрелые яйца или личинки паразитов. Например, для определения жизнеспособности яиц аскаридат (аскариды свиные, человека, токсокары, токсаскарис и др.) на одно животное (морские свинки, мыши) необходимо не менее 100 - 300 яиц с развившейся личинкой. Яйца аскаридат в изотоническом растворе натрия хлорида вводят пипеткой через рот мыши или морской свинки. Через 6 - 7 суток животное забивают, вскрывают и исследуют его печень и легкие в отдельности на наличие личинок аскаридат. Для этого печень и легкие измельчают ножницами на мелкие кусочки и исследуют их по методу Бермана или Супряги (раздел 6.1.2). Если животных заражали живыми инвазионными яйцами, то при вскрытии в печени и легких обнаруживают мигрирующие личинки аскаридат. Для определения жизнеспособности адолескариев фасциол, собранных на растениях в биотопах малого прудовика - промежуточного хозяина паразита, используют мышей, морских свинок или кроликов, которым скармливают эти личинки или вводят их пипеткой через рот. В случае заражения яйца фасциол в фекалиях лабораторных животных можно обнаружить у кроликов через 2 месяца, у морских свинок - через 50 суток, у мышей - через 35 - 40 суток. Для более быстрого получения ответа лабораторных животных вскрывают через 20 - 30 суток и исследуют печень на наличие молодых фасциол. Для определения жизнеспособности яиц карликового цепня также рекомендуется их скармливание незараженным ими ранее белым мышам с последующим вскрытием животных через 92 - 96 часов и выявлением цистицеркоидов в кишечных ворсинках или цестод в просвете кишечника. Для определения жизнеспособности яиц описторхисов рекомендуется метод (Герман С.М., Бэер С.А., 1984), основанный на физико-химической активации железы вылупления мирацидия и стимуляции двигательной активности личинки, что приводит к открыванию крышечки яйца и активному выходу мирацидия в экспериментальных условиях. Взвесь яиц описторхисов в воде предварительно охлаждают до 10 - 12 °С (все последующие операции осуществляют при комнатной температуре 19 - 20 °С). В центрифужную пробирку вносят 1 каплю взвеси, содержащую 100 - 150 яиц. Пробирку ставят в штатив на 5 - 10 минут. За это время все яйца успевают опуститься на дно. Затем полоской фильтровальной бумагой осторожно отсасывают излишек воды и в пробирку добавляют 2 капли специальной среды. Среду готовят на 0,005 М Трис-HCl буфере; в буфер добавляют 12 - 13%-ный раствор этанола и краситель (фуксин, сафранин, эозин, метиленовый синий и т.д.). Пробирку встряхивают, ее содержимое переносят пипеткой на предметное стекло и оставляют на 10 минут, слегка покачивая. Затем добавляют 2 капли указанной среды. Препарат готов для микроскопирования под обычным световым микроскопом при 20-кратном увеличении. За это время у жизнеспособных личинок открывается крышечка, и мирацидий активно выходит в указанную среду. Благодаря наличию в ней этанола, они через 2 - 5 минут обездвиживаются и затем окрашиваются с помощью красителя. Их легко можно обнаружить и посчитать при микроскопировании.
Личинки Размеры Характерные признаки A. duodenale Длина тела около 660 мкм, чехлика - 720 нм Исчерченность чехлика менее выражена, ротовой выступ менее заметен, передний конец тела (но не чехлика) тупой, диаметр кишечной трубки меньше, чем бульбус пищевода, хвостовой конец тупой N. americanus Длина тела около 590 мкм, чехлика - 660 нм Чехлик заметно исчерчен, особенно в хвостовой части тела, ротовой выступ кажется темным, передний конец тела (но не чехлика) закруглен подобно узкому концу куриного яйца, передняя часть кишечной трубки такого диаметра, как бульбус пищевода, хвостовой конец резко заострен S. stercoralis Длина тела около 500 мкм Личинка без чехлика, пищевод составляет около половины длины тела, хвост тупой или разветвленный Trichostrongylus sp. Длина тела около 750 мкм Просвет кишечника не прямой, а зигзагообразный, хвостовой конец закруглен и имеет форму кнопки
Читайте также:
