Правила забора материала от больных корью
Бесплатная горячая линия юридической помощи
- Главная
- ПРИКАЗ Минздрава РФ от 21.03.2003 N 117 "О РЕАЛИЗАЦИИ "ПРОГРАММЫ ЛИКВИДАЦИИ КОРИ В РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ К 2010 ГОДУ"
ПРАВИЛА СБОРА, ХРАНЕНИЯ И ТРАНСПОРТИРОВКИ ОБРАЗЦОВ СЫВОРОТКИ КРОВИ И ВИРУССОДЕРЖАЩИХ МАТЕРИАЛОВ
Для лабораторной диагностики кори используются серологические методы исследования, основанные на выявлении вирусспецифических антител в одной или парных сыворотках крови.
В лабораторной сети Европейского региона для диагностики кори рекомендуют использовать метод иммуноферментного анализа (ИФА), предназначенный для обнаружения в сыворотке крови вирусспецифических LgM-антител, в редких случаях - LgG-противокоревых антител.
LgM-ИФА обладает высокой специфичностью и чувствительностью, требует для исследования одного образца сыворотки. Метод легко осуществим в лабораториях на местах, обеспечивает получение быстрых и достоверных результатов, на которые можно ориентироваться при проведении надзора за корью.
Только в случае получения сомнительных результатов в LgM-ИФА целесообразно использовать LgG-ИФА, однако при этом необходимо иметь для исследования две сыворотки, полученные от больного в активной фазе заболевания (4 - 5 день сыпи) и в период реконвалесценции (2-ую сыворотку допускается брать через 1 - 2 недели, но не позже 1,5 мес. с момента заболевания).
1.1. Техника взятия, маркировка и регистрация проб крови
Для серологической диагностики кори можно использовать как капиллярную, так и венозную кровь.
Капиллярную кровь берут из пальца в асептических условиях. Перед взятием крови кисть руки пациента согревают горячей водой, затем насухо вытирают чистым полотенцем. Палец, протерев 70 °C спиртом, прокалывают стерильным скарификатором одноразового пользования. Кровь в количестве 1,5 - 2,0 мл собирают в стерильную одноразовую центрифужную пробирку (или в специальные микропробирки для взятия капиллярной крови). После взятия крови место укола смазывают йодом, а пробирку закрывают резиновой пробкой.
Кровь из вены в количестве 5 мл берут стерильным шприцем в стерильную пробирку в строго асептических условиях, используя для этого специальное помещение, полностью соответствующее санитарно-эпидемиологическим требованиям.
На пробирку с кровью следует наклеить этикетку (лучше пользоваться полоской лейкопластыря) с указанием регистрационного (порядкового) номера, фамилии, имени, даты взятия крови.
При проведении серомониторинга к образцам крови (сыворотки) прилагается аккуратно заполненный сопроводительный документ "Список лиц, подлежащих серологическому обследованию" (Приложение 5), в котором указывают город (район); N детского дошкольного учреждения и группы: школы и класса; название вуза, факультета, группы; регистрационный (порядковый) номер (должен совпадать с номером на этикетке на пробирке с кровью), фамилию и имя пациента; дату рождения; дату вакцинации и ревакцинации ЖКВ; дату взятия крови; подпись ответственного лица.
При обследовании заболевшего корью или подозрительного на эту инфекцию заполняется "Направление в лабораторию регионального центра" и пробы крови (или сыворотки) направляются в лабораторию ЦГСЭН субъекта Федерации не позднее 48 часов с момента взятия крови (Приложение 2).
На месте сбора образцов сывороток крови следует хранить дубликаты списков обследованных лиц и результаты исследования сывороток в течение не менее 1 года.
1.2. Техника первичной обработки крови
Для получения сыворотки пробирку с кровью оставляют в наклонном (под углом 10° - 20°) положении при комнатной температуре на 30 минут для образования сгустка, после чего пробирку с кровью встряхивают (для отделения сгустка от стенки пробирки), закрывают пробкой и ставят на ночь в холодильник при температуре +4° - 8 °C.
После отделения сыворотки от сгустка (пробирки можно обвести по внутренней поверхности пастеровской пипеткой), ее центрифугируют при 500 g (1500 об./мин.) в течение 7 - 10 минут. Затем сыворотку отсасывают пипеткой в стерильные центрифужные (пластиковые) пробирки (или эппиндорфы) с обязательным переносом на них этикетки с соответствующей пробирки.
Если в лаборатории нет центрифуги, то цельную кровь надо оставить в холодильнике до тех пор, пока не произойдет полная ретракция сгустка (отделение сгустка эритроцитов от сыворотки). Осторожно, тщательно избегая повреждения эритроцитов, перенести сыворотку в другую стерильную пробирку, снабженную этикеткой. Сыворотка должна быть прозрачной, светло-желтого цвета, без выраженного гемолиза.
Поступившие в лабораторию ЦГСЭН в субъекте Российской Федерации сыворотки можно хранить до передачи в вирусологическую лабораторию регионального центра в бытовых холодильниках при температуре +4 °C не более 7 дней.
Исследование сывороток осуществляется в вирусологической лаборатории регионального центра, где они должны храниться замороженными при температуре -20 °C в течение 1 года. Многократное замораживание и оттаивание сыворотки не допускается, в связи с чем сыворотку перед замораживанием необходимо разлить в несколько эппиндорфов по 0,25 мл.
1.3. Транспортировка образцов сыворотки (крови)
Перед транспортировкой собранного материала очень важно принять меры предосторожности: проверить наличие маркировки и сопроводительной документации (аккуратно заполненные этикетки на пробирках, списки и направления), прочно закрыть пробирки пробкой, расположить пробы согласно их номерам, уложить сыворотки в пластиковый пакет.
Для транспортировки крови (сыворотки) следует использовать термоконтейнеры (сумки-холодильники, термос, пенопластовую коробку). Если используются холодильные элементы (они должны быть заморожены), то положите их на дно и по бокам контейнера (коробки), а затем внутрь поместите пластиковый пакет с образцами сыворотки, а сверху вновь положите замороженные элементы. Сопроводительные документы (списки и направления на лабораторное исследование), указав время и дату отправления, поместите в полиэтиленовый пакет, положите его под крышку термоконтейнера или коробки.
Когда приготовления к отправке будут закончены, проинформируйте получателя о времени и способе транспортировки. При пересылке проб железнодорожным или воздушным транспортом лабораторию необходимо известить (по телефону, телеграммой) о номере поезда и вагона (рейса), дате и времени отправки и прибытия, количестве проб и пр.
При транспортировке образцов цельной крови в зимнее время года следует особенно следить за ее сохранением, не допуская замораживания.
Образцы крови должны быть доставлены как можно скорее. Не ждите, пока образцы накопятся!
1.4. Обработка медицинского инструментария
Обработка лабораторного инструментария и перевязочного материала, а также сбор и утилизация отходов медицинского назначения осуществляются в соответствии с действующими нормативными документами.
В ходе реализации эпиднадзора за корью на этапе ее элиминации необходимо наладить слежение за циркуляцией вируса с помощью идентификации штаммов вируса кори и генетической характеристики вирусных изолятов.
Вирус кори можно выделить в продромальной стадии заболевания и в стадии высыпания из различных материалов от больного: из мочи, назофарингеальных секретов и из лимфоцитов периферической крови. Интенсивность экскреции вируса быстро падает. Обнаружение и идентификация вируса кори на культуре клеток занимает несколько недель. Эти исследования должны проводиться на базе Национального центра по надзору за корью для слежения за биологическими свойствами циркулирующих на территории России штаммов вируса кори.
Выделение изолятов вируса кори позволяет в дальнейшем проводить их генетический анализ и сравнивать штаммы, полученные из различных мест в разные годы. Таким образом можно получить исчерпывающую информацию об их происхождении и проследить пути передачи вируса. Для проведения молекулярно-эпидемиологического анализа надо иметь коллекции местных штаммов вируса из эндемичных стран.
Выделение вируса - это достаточно дорогостоящий и трудоемкий метод, который занимает много времени и требует наличия вирусологической лаборатории, оборудованной специально для работы с культурами клеток и выделения вирусов. Вирус кори чрезвычайно чувствителен к повышению температуры. Поэтому образцы материалов, предназначенные для выделения вируса, должны быть транспортированы в лабораторию как можно быстрее и в условиях строгого соблюдения холодовой цепи.
Сбор и транспортировка вируссодержащих образцов проводится на базе региональных центров по надзору за корью.
2.1. Сбор, транспортировка и хранение образцов мочи
Для исследования берут пробы мочи в объеме 10 - 50 мл. Целесообразно использовать первую утреннюю порцию мочи, содержащую большее число эпителиальных клеток, из которых, как правило, и выделяется вирус кори. Наиболее успешно удается выделение вируса из образцов мочи, полученных на самых ранних стадиях болезни - в момент появления сыпи и максимум в течение 5 дней от момента высыпания.
Мочу собирают в стерильную емкость, охлаждают до +4 - 8 °C, центрифугируют в ближайшие несколько часов после забора. Центрифугирование проводят при 500 g (1500 об./мин.) в течение 5 мин. при +4 °C. Надосадочную жидкость выливают, а осадок ресуспендируют в 1 мл вирусной транспортной среды (см. Примечание) или питательной среды для культур клеток (RPMI, ИГЛА и другие).
Ресуспендированный осадок может храниться при температуре 4 °C не более 48 часов перед доставкой его в Национальный центр по надзору за корью или другую лабораторию, занимающуюся молекулярно-генетическим типированием вируса кори. В противном случае осадок должен быть заморожен в транспортной вирусной среде при -70 °C и отправлен с сухим льдом в герметично закрытых пробирках, предохраняющих этот осадок от воздействия углекислого газа.
В герметично закрытых емкостях, при 4 °C, можно транспортировать образцы цельной мочи, но лучше мочу отцентрифугировать в течение 24 часов после сбора и транспортировать ресуспендированный осадок.
Ресуспендированный осадок не следует замораживать, если можно его отправить на исследование в течение ближайших 48 часов.
Образцы мочи не следует замораживать до окончания процедур концентрирования.
2.2. Сбор, транспортировка и хранение назофарингиальных образцов
Назофарингиальные образцы (образцы носоглоточных смывов) должны быть взяты у больного как можно раньше, не позднее пятого дня с момента появления сыпи. В это время в этих образцах будет наиболее высокая концентрация вируса.
Назофарингиальные образцы могут быть взяты у больного одним из следующих способов, перечисленных в порядке возможности выделения вируса:
Аспирация носового секрета. Производится путем введения в нос 2 - 3 миллилитров стерильного физиологического раствора шприцем через надетый на него тонкий резиновый зонд, после чего жидкость отсасывают и помещают в центрифужную пробирку с завинчивающейся крышкой, в которой находится специальная транспортная среда для вирусов.
Полоскание (промывные воды). Со слизистых оболочек носоглотки получают путем полоскания горла небольшим количеством физиологического раствора (2 - 3 мл); промывные воды вносят в транспортную среду для вирусов.
Назофарингиальные смывы. Для взятия используют ватный тампон, которым протирают слизистую оболочку носоглотки с достаточным усилием, чтобы снять часть эпителиальных клеток. Тампоны помещают в маркированные стерильные пробирки с завинчивающимися крышками, в которых содержится 2 - 3 мл транспортной среды для вирусов.
Образец носового секрета, взятого любым из перечисленных выше способов и помещенного в вирусологическую транспортную среду , должен быть доставлен для исследования в течение 48 часов на холоде (при температуре 4 - 8 °C). Если условия не позволяют быстро отправить образец смыва из носоглотки, пробирку с тампоном следует энергично встряхнуть так, чтобы смыть клетки, а затем извлечь тампон. Назальные аспираты или смывы центрифугируют при температуре 4 °C при 500 g (1500 об./мин.) в течение 5 минут, затем осадок ресуспендируют в 2 мл питательной среды для клеточных культур. Ресуспендированный осадок и надосадочную жидкость хранят раздельно при температуре -70 °C и транспортируют в лабораторию на сухом льду в герметично закрытых флаконах, чтобы избежать попадания в них углекислоты.
Если нет в наличии специальной транспортной вирусологической среды, ее можно заменить физиологическим раствором или средой для клеточных культур.
Поскольку вероятность выделения вируса максимальна в первые 3 дня с момента появления сыпи, не следует задерживаться со сбором клинического материала для изоляции вируса; не ожидать результатов лабораторного подтверждения клинического диагноза кори.
2.3. Сбор, транспортировка и хранение крови
Для выделения вируса из лимфоидных клеток кровь берут из вены в строго асептических условиях на 1 - 3 день сыпи в объеме 1,0 - 2,0 мл. Кровь берут в стерильную пробирку с плотно закрытой пробкой. В пробирке должно находиться 0,1 мл гепарина - 500 МЕ (в 1 мл жидкого гепарина - 5000 МЕ). Непосредственно перед взятием крови пробирку с гепарином раскатывают по твердой поверхности для смачивания стенок пробирки гепарином, что предотвращает образование сгустков (пробку не мочить!). Хранить при +4 °C не более 24 часов. Как можно раньше отправить в Национальный центр, соблюдая холодовой режим (+4 °C).
Примечания. 1. Транспортная среда для выделения вирусов:
основной раствор Хенкса pH 7,4 с ХЕПЕС буфером (имеется концентрированный коммерческий раствор 10X);
бычий сывороточный альбумин - 2,0 г;
раствор пенициллина со стрептомицином (см. ниже) - 1,0 мл;
феноловый красный, 0,4%-ный раствор - 0,2 мл.
Растворите 2,0 г бычьего сывороточного альбумина в 100 мл дистиллированной воды, добавьте к 80 мл дистиллированной воды 10 мл раствора Хенкса, затем добавьте 10 мл 2%-ного раствора бычьего сывороточного альбумина и 0,2 мл раствора фенолового красного. Стерилизуйте фильтрованием. Добавьте 1 мл раствора пенициллина со стрептомицином, разлейте в стерильные флаконы и храните при 4 °C.
2. Раствор пенициллина со стрептомицином:
кристаллический пенициллин С;
Растворите 10 в 6 ЕД пенициллина и 1,0 г стрептомицина в 100 мл стерильного ФБР. Разлейте во флаконы по 5 мл, храните при -20 °C. Добавление 1 мл этого раствора к 100 мл питательной среды позволяет получить раствор с окончательной концентрацией 1200 ЕД пенициллина и 100 мкг стрептомицина в 1 мл раствора.
3. Доставка вируссодержащих образцов в Национальный центр осуществляется по запросу Национального центра с заполнением части А "Направления в лабораторию центра госсанэпиднадзора с функциями контроля за корью" (Приложение N 2).
Приложение N 5
к Приказу
Министерства здравоохранения
Российской Федерации
от 21 марта 2003 г. N 117
Для постановки диагноза корь зачастую необходимо лабораторное подтверждение инфекции. Самое лучшее время для сдачи анализов — первый контакт пациента с врачом. Врача необходимо вызывать на дом, так как корь — это заразное заболевание и поход в поликлинику может стать причиной заражения многих восприимчивых детей и взрослых. Забор материала для исследования может выполнить врач или медсестра, которую доктор может прислать чуть позже.
Стандартом лабораторной диагностики кори в большинстве стран являются серологическое исследование и ПЦР-диагностика.
1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).
Суть метода заключается в идентификации РНК вируса кори в крови, слизи носоглотки/ротоглотки, бронхиальном секрете или моче.
ПЦР-исследование рекомендуется проводить как можно раньше после появления сыпи, так как количество вируса в организме снижается с течением времени. Наиболее информативным является период первых 1—3—7 дней от начала высыпаний [2—5]. В литературе имеются сведения о том, что у некоторых пациентов вирус кори может определяться в носоглоточном секрете до 10—14 дня болезни [5].
Для наиболее точной диагностики рекомендуется производить забор материала из трех разных локусов (кровь, мазок из носоглотки или ротоглотки и моча). Это повышает вероятность правильного диагноза [4,5].
После забора материала для ПЦР (мазок и моча) допустимо его хранение до 1 суток в холодильнике (4 °С), возможно замораживание. Если для исследования используется моча, то ее объем должен быть не менее 10 мл, но лучше 50 мл. Утренняя первая моча содержит максимальное количество вируса [4].
Отрицательный результат ПЦР не исключает диагноза кори [6].
Ложноотрицательный результат может быть получен при позднем заборе материала (более 3—7 дней с момента появления сыпи), предшествующей недавней вакцинации против кори, при нарушениях хранения и/или транспортировки образцов [4,5].
В соответствии с международными рекомендациями при выполнении ПЦР желательно определять генотип вируса кори. Это необходимо для четкого различения происхождения вируса (дикий штамм или вакцинный), учета распространения вируса по земному шару и происхождения очагов/вспышек заболевания [4].
На сегодняшний день известно 24 генотипа вируса кори. Большинство из них вышло из циркуляции, однако менее 10 из них (по данным ВОЗ — 6 [7]) все еще присутствуют на нашей планете [8].
2. Серологический метод.
Метод заключается в определении специфических антител (IgM и IgG) против вируса кори в сыворотке крови.
Для верификации диагноза кори достаточно определить один класс антител IgM или IgG. Каковы особенности анализа?
— IgM.
IgM определяется в крови в течение 1 месяца (28 дней [3]) у больного корью после появления высыпаний. Пик IgM отмечается на 7—10 сутки от момента появления сыпи, а затем количество антител постепенно снижается. Через 6—8 недель от начала сыпи IgM уже может не определяться [9].
Если больной ранее прививался против кори (1 или 2 прививки) то при реинфекции вирусом кори IgM у него может не определяться вовсе или быть повышенным только короткий промежуток времени, который трудно зафиксировать [6].
Отрицательный анализ на IgM не исключает наличие заболевания у ранее привитых.
В некоторых случаях у ранее не привитых пациентов IgM может быть ложноотрицательными (около 20—25% проб). Это характерно для образцов, взятых в первые 72 часа от начала появления сыпи. Дело в том, что концентрация антител в первые дни болезни еще мала и недостаточна для определения [10,11].
Если результат был отрицательным и сыпь присутствует более 72 часов должен быть выполнен повторный анализ (допустимо выполнить анализ до 10 дня болезни) [6].
Кроме того, ложноотрицательный результат может быть получен, если анализ выполнен позже 28 дней с момента появления сыпи.
Ложноположительный результат возможен при проведенной ранней вакцинации против кори (в течение предшествующих 6 недель до появления сыпи), наличии повышенного ревматоидного фактора, при сопутствующих острых воспалительных заболеваний [5].
В каждом отдельном случае проводится изучение течения заболевания, особенностей пациента и/или дополнительная диагностика.
Наряду с определением IgM / IgG для диагностики кори, также настоятельно рекомендуется выполнять ПЦР [12].
Положительный анализ на IgM только при наличии характерной клинической картины и данных о контакте с больным корью свидетельствует об остром течении коревой инфекции. Положительный анализ на IgM при отсутствии характерной клинической картины или контакта с больным корью не является основанием для постановки диагноза. В таких случаях рекомендуется выполнить ПЦР исследование [3].
— IgG.
Определение IgG является информативным анализом для подтверждения кори в случае отсутствия возможности провести ПЦР исследование и/или когда IgM является отрицательным или сомнительным [6].
Исследование проводится в парных сыворотках: первый анализ должен быть выполнен в первые 4—7 дней от начала высыпаний, второй — в течение 10—30 дней после первого [2,3].
IgG достигают пика через 4 недели от начала сыпи [9].
Положительным результат считается, если:
— произошла сероконверсия (в первом анализе IgG отрицательны, во втором — положительны);
— отмечается значительное (в 4 и более раз) повышение уровня IgG.
Сероконверсия не является информативной при недавно проведенной вакцинации (в течение предшествующих 6 недель).
Ранее вакцинированные, получившие две прививки и не выработавшие защитных антител (такое встречается, но очень редко), при заболевании корью могут не иметь повышение IgG в 4 раза при втором анализе IgG по сравнению с первым [3]. Отрицательное значение IgG в двух анализах исключает наличие коревой инфекции.
ИФА — метод, одобренный ВОЗ для определения IgG и IgM для диагностики коревой инфекции [10].
3. Вирусологический метод.
Для идентификации вируса кори иногда может применяться вирусологический метод. Суть его заключается в том, что вирус, полученный от больного, культивируется в клеточной культуре. Этот метод является особо точным, но занимает около двух недель. Вирусологический метод не рекомендуется для рутинного обследования при подозрении на корь [2,5,6,8].
[1] Strebel PM, Orenstein WA. Measles. N Engl J Med. 2019 Jul 10; 381:349-357. DOI: 10.1056/NEJMcp1905181.
[2] Профилактика кори, краснухи и эпидемического паротита. Санитарно-эпидемиологические правила СП 3.1.2952-11; 2011.
[3] An Advisory Committee Statement Measles and Rubella Elimination Working Group. Guidelines for the Prevention and Control of Measles Outbreaks in Canada. Can Commun Dis Rep 2013;39. DOI:10.14745/ccdr.v39i00a03.
[6] American Academy of Pediatrics. Masles. In: Kimberlin DW, Brady MT, Jackson MA, Long SS, editors. Red Book: 2018-2021 Report of the Committee on Infectious Diseases. 31th ed. American Academy of Pediatrics; 2018. pp. 537–50.
[11] Gershon AA. Measles Virus (Rubeola). In: Bennett JE, Dolin R, Blaser MJ, editors. Mandell, Douglas, and Bennett’s Principles and Practice of Infectious Diseases. 9th edition. Elsevier;2020. pp. 2110—16.
[youtube.player]| Информация о документе | |
| Дата добавления: | |
| Размер: | |
| Доступные форматы для скачивания: |
Сбор, подготовка, транспортировка и хранение клинических образцов для изоляции вируса кори и генотипирования.
I . Общая информация
I .1. Краткое описание
В качестве клинических образцов для изоляции вируса кори на культуре клеток и экстракции РНК вируса с последующим проведением ПЦР и генотипирования от больных корью и подозрительных на эту инфекцию пациентов используются цельная кровь, моча, носоглоточные соскобы/смывы. Для успешного тестирования целесообразно собирать как минимум два клинических образца – мочу и носоглоточный соскоб/смыв .
I .2. Информация по биологической безопасности
Клинические образцы потенциально могут содержать широкое разнообразие возбудителей инфекционных заболеваний, в связи с чем, все манипуляции необходимо проводить с соблюдением правил работы с инфицированными материалами. Всегда следует надевать перчатки, при работе вне бокса – использовать защитные очки.
I .3. Материалы и оборудование
Градуированные центрифужные пластиковые пробирки с завинчивающейся крышкой
Пластиковые пробирки с завинчивающейся крышкой 2 мл для замораживания образцов;
Антибиотики: бензилпенициллина натриевая (калиевая соль) соль;
Вакутейнеры с ЭДТА;
Пластиковые контейнеры 50 мл для сбора мочи;
Набор для взятия носоглоточных соскобов (стерильный зонд – тампон в пробирке)
I .4. Важные указания
Исследование нескольких образцов от одного пациента существенно повышает вероятность выделения вируса. Вероятность выделения вируса наиболее велика при исследовании образцов, собранных в первые 3 суток с момента появления сыпи, не следует задерживать сбор образцов.
В случае, если клинические обрацы могут быть доставлены в тестирующую лабораторию в течение 48 часов с момента забора при условии хранения и транспортировки при 0 0 С (на тающем льду) замораживать образцы нецелеесообразно.
Все манипуляции с клиническими образцами следует проводить в условиях максимально возможной стерильности. Работать необходимо с охлажденными до 2…4 o С образцами , не допуская их нагревания и воздействия прямого солнечного света.
II . Сбор, подготовка, хранение клинических образцов
II .1. Взятие мочи для выделения вируса кори и экстракции РНК вируса кори
Для выделения вируса кори и экстракции РНК вируса кори может быть использована моча, собранная не позже 7 дня с момента появления сыпи.
Соберите не менее 50 мл мочи в стерильную емкость. Предпочтительно собирать первую утреннюю порцию. У детей в возрасте до 1г. допустимо использование меньшего количества мочи, но не менее 10 мл.
Охладите образец до +4 o С. Цельную мочу не замораживать. ;
Осадите клеточную фракцию путем центрифугирования при +4 o С 1500 об/мин в течение 5 мин;
Удалите надосадочную жидкость в емкость с дезраствором;
Растворите осадок в 1 мл транспортной среды (стр.5);
Образец необходимо доставить в лабораторию для исследования при 2…4 o С (оптимально при 0 0 С, на тающем льду) в течение 48 часов;
В случае отсутствия возможности для доставки образца в указанные сроки заморозьте и храните образец при температуре не выше - 20 o С (оптимально при -70 o С). Замороженный образец необходимо доставить в лабораторию для исследования как можно скорее при -70 o С (в сухом льду).
II .2. Взятие носоглоточных соскобов и смывов для выделения вируса кори и экстракции РНК вируса
Для выделения вируса кори и экстракции РНК вируса кори может быть использован носоглоточный смыв или соскоб (предпочтительнее), собранные не позже 7 дня с момента появления сыпи.
Стерильным ватным тампоном с усилием (чтобы собрать достаточное количество клеток) протрите слизистую оболочку полости рта и ротоглотки пациента в области лимфоидных образований (язычная, небная, носоглоточная миндалины);
Тампон поместите в стерильную пробирку с крышкой, содержащую 3 мл транспортной среды;
Образец необходимо доставить в лабораторию для исследования при 2…4 o С (оптимально при 0 0 С, на тающем льду) в течение 48 часов;
В случае отсутствия возможности для доставки образца в указанные сроки, пробирку с тампоном энергично встряхните, чтобы смыть клетки, и извлеките тампон;
Осадите клеточную фракцию путем центрифугирования при +4 o С 1500 об/мин в течение 5 мин;
Растворите осадок в 1 мл транспортной среды;
Заморозьте и храните образцы при температуре не выше - 20 o С (оптимально при -70 o С). Замороженный образец необходимо доставить в лабораторию для исследования как можно скорее при -70 o С (в сухом льду).
Не собирайте носоглоточные соскобы в пробирки с гелевой средой, указанные пробирки предназначены для бактериологических исследований и для тестирования на корь непригодны.
Предложите пациенту прополоскать горло 3 – 5 мл физиологического раствора;
Соберите промывные воды в стерильную пробирку;
Осадите клеточную фракцию путем центрифугирования при +4 o С 1500 об/мин в течение 5 мин;
Удалите надосадочную жидкость в емкость с дезраствором;
Растворите осадок в 1 мл транспортной среды;
Образцы необходимо доставить в лабораторию для исследования при 2…4 o С (оптимально при 0 0 С, на тающем льду) в течение 48 часов;
В случае отсутствия возможности для доставки образцов в указанные сроки заморозьте и храните образцы при температуре не выше - 20 o С (оптимально при -70 o С). Замороженный образец необходимо доставить в лабораторию для исследования как можно скорее при -70 o С (в сухом льду)
II .3. Взятие крови для выделения вируса кори и экстракции РНК вируса кори
Цельная кровь, собранная в соответствующие сроки, является оптимальным образцом для выделения вируса кори и экстракции РНК вируса кори. Современные методы исследования позволяют генотипировать вирус из клинических образцов (только носоглоточный соскоб и моча, осадок ) направление на исследование цельной крови не является обязательным.
Кровь необходимо забирать не позже 5 суток с момента появления сыпи.
В случае забора цельной крови у пациента до появления сыпи, данный образец также можно использовать для экстракции РНК вируса кори и диагностической ПЦР.
Заберите 5 мл венозной крови в вакутейнер с ЭДТА (использование ЭДТА в качестве антикоагулянта предпочтительнее, так как гепарин может оказывать негативное влияние на процедуру экстракции РНК и тест ПЦР );
Образец необходимо доставить в лабораторию для исследования при 2…4 o С (оптимально при 0 0 С, на тающем льду) в течение 48 часов. Цельную кровь не замораживать.
В случае отсутствия возможности для доставки образца в указанные сроки выделите суспензию мононуклеаров в градиенте плотности Fikoll – paque, заморозьте и храните при температуре не выше - 20 o С (оптимально при -70 o С).
Замороженный образец необходимо доставить в лабораторию для исследования как можно скорее при -70 o С (в сухом льду).
III . Транспортировка образцов
Собранные образцы необходимо поместить в отдельные пластиковые пакеты с замком с небольшим количеством ваты для адсорбции влаги. Не допускается упаковка клинических образцов от разных пациентов в один пакет. Несколько клинических образцов от одного пациента могут быть упакованы в один пакет большего размера.
Для транспортировки образцов необходимо использовать термоконтейнеры или термосы с хладоэлементами. Замороженные (охлажденные до 2…4 o С) хладоэлементы (можно использовать лед в герметичных пластиковых пакетах или бутылках) следует поместить на дно и по бокам контейнера, внутрь положите образцы, а сверху поместите дополнительные хладоэлементы.
Образцы для выделения вируса и экстракции РНК можно транспортировать при температуре 2…4 o С (не более 48 часов с момента забора), используя хладоэлементы, охлажденные до соответствующей температуры, или в замороженном состоянии (-70 o С в сухом льду в герметичных укупорках во избежание воздействия на образцы углекислоты). Размораживание образцов в процессе транспортировки недопустимо.
Под крышку контейнера поместите сопроводительные документы (письмо с указанием вида и количества образцов, времени и даты отправки, направления на исследование).
При одновременной отправке замороженных и хранящихся при 2…4 o С образцов используйте отдельные контейнеры с хладоэлементами, обеспечивающими соответствующий температурный режим.
Транспортная среда для выделения вирусов
основной раствор Хенкса рН 7,4 с ХЕПЕС буфером;
бычий сывороточный альбумин;
0,4% раствор фенолового красного
Растворите 2.0 г бычьего сывороточного альбумина в 100 мл дистиллированной воды. Добавьте к 80 мл дистиллированной воды 10 мл раствора Хенкса, затем добавьте 10 мл 0,2% раствора бычьего сывороточного альбумина (см. выше) и 0,2 мл раствора фенолового красного. Стерилизуйте фильтрованием. Добавьте 1 мл раствора антибиотиков.
Растворите 10 6 ЕД пенициллина и 1,0 г стрептомицина в 100 мл стерильного фосфатного буферного раствора. Разлейте во флаконы по 5 мл и храните при -20 o С. Добавление 1 мл этого раствора к 100 мл питательной среды позволяет получить рабочий раствор с окончательной концентрацией 100 ЕД пенициллина и 100 мкг стрептомицина в 1 мл раствора.
Примечание: при отсутствии транспортной среды можно использовать питательную среду для культур клеток (RPMI, ИГЛА и др.) с антибиотиками и 0,2% БСА. В случае отсутствия указанных сред, если образец может быть доставлен в лабораторию в течение 48 часов с момента сбора, допускается использование в качестве транспортной среды буферированного физиологического раствора с антибиотиками.
Направление на генотипирование вируса кори
Эпидномер пациента (при наличии):
Адрес места жительства:
Дата заболевания (повышения температуры тела): / /
Дата появления сыпи: / /
Предварительный клинический диагноз:
Лечебное учреждение, Ф.И.О. сотрудника, направляющего образцы на исследование:
Адрес электронной почты:
Клинические образцы необходимо доставить с соблюдением холодовой цепи в Национальный научно – методический центр по надору за корью/краснухой (ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского, г.Москва, ул Адмирала Макарова д.10, каб 217 – 219). Телефон для консультаций (495) 452-28-26. Протоколы сбора образцов и бланк направления на исследование в электронном виде можно получить при запросе на электронный адрес s.shulga@ .
На все образцы от одного пациента заполняется один бланк направления.
Все графы направления обязательны для заполнения (если не указано иное). При отсутствии информации указывать НД – нет данных. Обязательно указывать контактные данные (телефон с указанием междугороднего кода, электронная почта) сотрудника, направляющего образцы на исследование.
В соответствии с рекомендациями ВОЗ отсутствие местной циркуляции вируса кори является одним из ключевых критериев достижения и поддержания фазы элиминации инфекции на территории. Для доказательства отсутствия эндемичной циркуляции необходимо генотипировать не менее 80% цепочек передачи вируса (очаги группового заболевания + спорадические случаи).
При вспышечной заболеваемости необходимо обеспечить молекулярно-генетическое обследование очагов краснухи, для чего организовать сбор клинических образцов от:
- первых 5 случаев при каждой вспышке, всего не более 10 случаев от вспышки на протяжении 1 месяца;
- при продолжительности вспышки более 1 месяца осуществлять сбор образцов не чаще 1 раза в месяц от 2-3 последних зарегистрированных случаев;
- всех импортированных случаев (при невозможности сбора клинических образцов в регламентируемые сроки от импортированного случая по возможности образцы должны быть собраны от вторичных случаев, связанных с импортированным);
Генотипирование 100% случаев инфекции при вспышечной заболеваемости нецелесообразно! Необходимо осуществлять сбор клинических образцов для исследования только от репрезентативной выборки случаев инфекции. По достижению спорадической заболеваемости (менее 1 случая/млн. населения) сбор образцов осуществляется от всех 100% зарегистрированных случаев.
Для образцов, собранных позже 7 дня с момента появления сыпи, вероятность выделения вируса значительно снижается. Сбор образцов в неадекватные сроки, а также сбор неоправданно большого числа образцов приводит к избыточной нагрузке на службы эпиднадзора и лабораторную сеть, перерасходу ресурсов, задержке в проведении исследований и получении результатов исследования всеми заинтересованными специалистами.
При наличии возможности хранения образцов в замороженном состоянии при -70 0 С отправку образцов в ННМЦ в замороженном состоянии (сухой лед, замороженные хладоэлементы) осуществлять только после получения положительных результатов тестирования на IgM корь/краснуха из лаборатории Регионального центра. Размораживание образцов в процессе транспортировки недопустимо.
При отсутствии возможности хранения образцов в замороженном состоянии при -70 0 С доставлять образцы при 0 0 С (на тающем льду) в течение 48 часов с момента сбора , не замораживая.
При наличии результатов тестирования на IgM корь/краснуха целесообразно указывать данные результаты в направлении на исследование.
При направлении на исследования образцов, для которых является важным проведение диагностического теста ПЦР в случаях:
сомнительных результатов серологических исследований либо отсутствия возможности собрать сыворотку для тестирования на специфические IgM;
необходимости принятия решения о проведении экстренных противоэпидемических мероприятий в очагах инфекции;
Указывать вышеперечисленные обстоятельства в направлении на исследование, в таких случаях образцы будут тестированы в диагностической ПЦР вне очереди в максимально сжатые сроки.
[youtube.player]Читайте также:
