Устойчивость к бактериофагам сальмонеллез свиней лекция

САЛЬМОНЕЛЛЕЗ (паратиф)

САЛЬМОНЕЛЛЕЗ (паратиф) - инфекционная болезнь, поражающая пороят-сосунов и отъемышей и характеризующаяся расстройствами желудочно-кишечрго тракта и септицемией.

Этиология. Возбудители сальмонеллезов относятся к роду Salmonella семейгва Enterobacteriaeccae. Род Salmonella состоит из серологически родственных, амотрицательных, аэробных, неспороносных палочек. В настоящее время насчитается более 1600 серотипов сальмонелл. Почти все они не ферментируют лактозу и сахарозу, не разжижают желатин, не образуют индола, разлагают глюи маннит с образованием кислоты и газа, не расщепляют мочевину, дают можительную реакцию с метилротом и отрицательную Фогеса - Проскауера

Сальмонеллы погибают при 70-75° истечение 15-30 мин. Бактерии устойчивы к дезинфекционным средствам. От них надежно обезвреживают мещення 4-процентный раствор гидроокиси натрия, 5-процентная эмульсия к лонафта, 5-процентный раствор однохлористого йода, 1-процентный раствор к боловой кислоты и креолина, хлорная известь, содержащая 4% активного хлора, 20-процентная взвесь свежегашеной извести.

Эпизоотология. Сальмонеллезы, как правило, возникают на фоне антнса тарных условий содержания (повышенная влажность в помещениях, отсутствии вентиляции, низкая температура, скопление вредных газов и др.), на почве 1 таминозов, скармливания недоброкачественных кормов, алиментарной а нем различных отравлений, истощений, легочных болезней и т. п. Наиболее восприимчивы поросята от 1 до 4 мес.

Источником возбудителя инфекции являются больные поросята и подсвинки а также переболевшие животные-бактерионосители. Немаловажную роль в нространении болезни играют грызуны, которые могут болеть сальмонеллезо служить механическими переносчиками возбудителя, а также корма, загрязн ные выделениями больных животных. Наиболее опасны корма животного про хождения (мясо-костная и рыбная мука необезвреженные боенские отходы).

Сальмонеллезоносительство в той илииной мере регистрируют практиче у всех видов животных и многих домашних птиц. Особенно оно распростран в неблагополучных стадах, где остаются переболевшие Сальмонеллезом. Клическое проявление болезни у реконвалесцентов бывает стертым ихарактеризу ся энтеритами с выделением во внешнюю среду большого количества возбуд ля. Ввод свиней-бактерионосителей в i благополучные стада приводит к вспы болезни. Причиной повторной вспышки болезни могут стать помещения, п продезинфицированные после вывода больных сальмонеллезом животных, что св зано с высокой устойчивостью сальмонелл: во внешней среде.

Патогенез. Попадая в организм алиментарным путем (с молоком, кормом, и пр.), сальмонеллы и их токсины нарушают целостность слизистой обо ки кишечника и проникают в кровь. Они повреждают стенку сосудов, в результате чего происходит выход эритроцитов в окружающие ткани, развиваются судативные процессы. Одновременно сальмонеллы и продукты их жизнедея Я ности воздействуют на центральную нервную систему, вызывая токсико-дис фические изменения и нарушая функции всего организма.

Клинические признаки. Инкубационный период - от 3 до 20 дней. У поро сосунов он короче, у отъемышей - продолжительнее.

Различают острое, подострое и хроническое течение сальмонеллеза. Форма заболевания зависит от возрастной восприимчивости свиней к болезни. У молодых животных оно проявляется более остро, у старших - хронически и латентно.

Первые случаи сальмонеллеза протекают остро, температура тела повышается до 42° С, аппетит снижается, у некоторых животных исчезает вовсе. К больного поросенка теряет блеск и становится бледно-серой, животное дроЗ зарывается в подстилку, развивается конъюнктивит. Вскоре появляется фекалии становятся жидкими, грязно-серого цвета, иногда с примесью зловонного запаха. Кожа ушей, нижней части груди, живота принимает та фиолетовый цвет. При остром течении поросята гибнут в течение 2-3 дней.

Подострое течение характерно для поросят, заболевших в более поздние сропосле начала вспышки. Сначала ухудшается аппетит, движения больного медительны, он забивается в угол, температура тела повышается до 41° С. Чаще температура колеблется от 40,3 до 40,8° С. Значительно выражены изменеВця со стороны желудочного тракта - понос, фекалии от желтого до грязно-се" г0 цвета с пузырьками газа, зловонного запаха. Понос бывает рецидивирующим. Со временем больное животное приобретает истощенный вид, развивается синюшность подгрудка, живота, промежности, особенно ушей. Иногда наблюдают омертвление и отпадание кончика ушей и хвоста, появляются приступы кашля. Смерть наступает от интоксикации и истощения после нескольких недель болезни. При хроническом течении температура тела редко поднимается выше 40,0- 40 3° С, животное прогрессивно худеет. У больного понос часто сменяется запором. В фекалиях нередко обнаруживают примесь крови и слизи. Более выражены изменения в легких - болезнь осложняется пневмонией. Животные постепенно слабеют, истощаются и гибнут. Иногда выздоравливают, но становятся бактерионосителями.

Патологоанатомические изменения. При остром течении обнаруживают признаки, характерные для бактериальной септицемии: кровоизлияния под эпикардом, на легочной плевре, корковом слое почек, железистой части желудка В кишечнике резкое покраснение и отек слизистой. На припухшей утолщенной слизистой оболочке кишок наблюдают ограниченные и диффузные кровоизлияния. Мезентериальные лимфатические узлы увеличены, серо-красного цвета. Печень незначительно увеличена, в ней иногда заметны некротические фокусы сероватого цвета, дряблая. Селезенка увеличена, серо-красного цвета, капсула напряжена.

В подострых случаях и при хроническом течении патанатомическая картина отличается специфичностью изменений. Кровоизлияний значительно меньше - они очень редки. При более длительном течении изменения сосредоточены в толстом кишечнике и частично в тонких кишках. Наблюдают некроз и дифтеритическое воспаление слизистой оболочки. Этот процесс первично локализуется в лимфатических фолликулах. Они подвергаются воспалительной гиперплазии, некротизируются. Некрозу подвергается прежде всего покрывающая фолликул слизистая оболочка, а затем близлежащие ткани. Таким образом, развивается очаг омертвения, покрытый струпьями. Соединительная ткань подслизистого слоя разрастается и стенка кишечника значительно утолщается, часто она собрана в складки. После отпадания струпьев образуются язвы, дно которых покрыто серогрязными казеозными массами.

Мезентериальные лимфатические узлы значительно увеличены, светло-серого цвета, сочные, на разрезе иногда заметны некротические очаги распада. В печени также встречаются воспалительно-некротические очажки желто-серого цвета.

При хронической форме часто находят изменения в легких. Они появляются в виде катарального воспаления - пораженные участки плотные, серо-красного Цвета.

Диагностика. Диагноз ставят на основании эпизоотологических, клинических и патологоанатомических данных, а также результатов бактериологических и серологических исследований. -

Эпизоотологически сальмонеллез можно подозревать, если среди поросят от До 6 мес наблюдаются заболевания, сопровождающиеся исхуданием, поносами, проявлением бронхопневмонии, увеличением количества поросят-заморышей.

Для подтверждения диагноза в лабораторию направляют свежие трупы поросят или паренхиматозные органы (печень с желчным пузырем и лимфатическими узлами, селезенку, почку, мезентериальные лимфатические узлы, трубчатую Кость). Посевы производят на МПА, МПБ и элективные среды Эндо, Левина, Плоскирева. Колонии бактерий, выросшие на этих средах, подвергают микроскопическим и биохимическим исследованиям с последующей серологической идентификацией полученных культур с помощью монорецепторных сывороток.

С целью выявления сальмонелл в кормах берут 20 г комбикорма, мясной, костной или рыбной муки, которые разводят в 180 мл мясо-пептонного бульона.

Полученную смесь встряхивают 10-15 ч в щуттель-аппарате при комнатной те пературе. После отстаивания делают высевы из надосадочной жидкости на элек тявные среды (Эндо, Плоскирева, Левина). Через 24 ч инкубации при 37° С учитывают рост и проводят .идентификацию выросших колоний-

Для прижизненной диагностики широко используют исследование сыворот крови свиней в реакции агглютинации с сальмонеллезными антигенами. Наличи агглютинационных титров выше 1 : 100 дает основание подозревать сальмонелле

При диагностике сальмонеллеза для идентификации возбудителя применяю метод люминесцирующих антител. Необходимо исключить чуму, вирусный raci роэнтерит, дизентерию и колибактериоз. .

По клиническим и патологоанатомическим признакам сальмонеллез сходе с чумой, но последней болеют свиньи всех возрастов. При чуме температура тел у животных выше, чем при сальмонеллезе, и держится устойчиво, заметны крс воизлияиия на коже, конъюнктиве, очень часты, инфаркты в селезенке. В слом ных, затруднительных случаях рекомендуется ставить биопробу.

Вирусный гастроэнтерит, как и чума, поражает свиней всех возрастов, н протекает остро с охватом за короткое время большого поголовья. При вирусног гастроэнтерите поросята-сосуны до 15-дневного возраста, как правило, гибну дифтеритических изменений в кишечнике не наблюдают. Крови в фекалиях и бывает.

Дизентерией поражаются поросята-отъемыши и свиньи старшего возрасте течение острое. Отличительным признаком является кровавый понос. Применени осарсола, трихопола и других противодизентерийных средств обрывает заболевние.

Колибактериозом болеют в основном поросята-сосуны, но в условиях этому заболеванию подвержены и поросята-отъемыши. Болезнь сопровож дается энтеритом, колитов практически не регистрируют.

При бактериологических посевах из органов выделяют чистую культуру кишечной палочки.

Лечение. Широко применяют антибиотики, сульфаниламидные и нитрофур новые препараты. Из антибиотиков чаще всего получают положительные резу.гц таты при лечении левомицетином в дозе 30-40 мг на 1кг массы животных 2 раза в день. Эффективен также тетрациклин в такой же дозе. Их задают внутр на протяжении 4-6 дней. Выраженными лечебными свойствами обладает нео мицин. Фуразолидон применяют по 0,2 г (доза для 2-месячных поросят) 2 раз в день.

Хорошие результаты дает сочетанное применение антибиотиков и сульфан ламидных препаратов (норсульфазол, этазол, сульфадимезин).

Антибиотики, как правило, следует назначать после определения чувства тельности к ним возбудителя болезни.

Иммунитет. Переболевшие свиньи не восприимчивы к повторному заражению Установлено, что иммунитет при сальмонеллезе имеет антитоксическую и ант« бактериальную природу. Устойчивость свиней к болезни значительно зависит о физиологического состояния организма и его генетической устойчивости к забо леванию. Важным фактором в профилактике сальмонеллеза является наличие за щитных антител в молозиве свиноматки.

В нашей стране широко используется несколько вакцин против сальмонелле за: формолвакцина против паратифа поросят, концентрированная поливалентна формолквасцовая вакцина против паратифа, пастереллеза и диплококковой сей тицемии поросят, поливалентная вакцина против паратифа и колибактериоза пун ных зверей, птиц, телят и поросят, сухая живая вакцина против паратифа свине из штамма ТС-177.

При вспышке болезни формолвакцину поросятам вводят трехкратно: первы раз в дозе 3 мл, второй -через 5-8 дней после первой прививки в дозе 45 мл и третий - через 10-20 дней после второй в дозе 5 мл. Первую прививк производят поросятам-сосунам в возрасте 20-30 дней. С профилактической целью поросят вакцинируют с 20-дневного возраста двукратно в дозе 4-5 мл с интервалом между прививками 5-8 дней. Поросятам старше 2 мес рекомендуется вводить вакцину по 5 мл.

Сухую живую вакцину против паратифа свиней из штамма ТС-177 применяют с профилактической целью в неблагополучных по сальмонеллезу свиней хозяйствах, в которых бактериологически установлен возбудитель Sal. cholerae suis или Sal. typhi suis. Прививке подлежат все клинически здоровые животные с 2-недельного возраста. Вакцинацию проводят двукратно с интервалом в 10- 15 суток подкожно в следующих дозах, мл:

Иммунитет после вакцинации наступает через 10-14 суток и сохраняется в течение 6-8 мес. В репродукторных хозяйствах целесообразно проводить ревакцинацию свинок за 1-1,5 мес до случки в дозе 2 мл.

В хозяйствах, особо неблагополучных по сальмонеллезу, вакцинируют маток перед опоросом. При этом используют формолвакцину против паратифа, поливалентную вакцину против паратифа и колибактериоза поросят или концентрированную поливалентную вакцину против паратифа, пастереллеза и диплококконой септицемии поросят, которые вводят трехкратно.

Меры борьбы и профилактики. В комплекс мероприятий по предупреждению сальмонеллеза входят: недопущение заноса возбудителя заболевания извне, соблюдение оптимальных условий содержания и кормления животных, а также ветеринарно-санитарного режима в хозяйстве, иммунизации животных в случае угрозы заноса заболевания. Особое внимание следует обращать на качество кормов. Поступающие корма подвергают бактериологическим исследованиям на наличие сальмонелл. Весной все поголовье выводят в лагеря. При безвыгульном содержании свиней обеспечивают полноценным рационом (белки, витамины, микроэлементы и минеральные вещества).

Важным звеном в профилактике болезни являются комплектация и ремонт основного стада благополучным в отношении сальмонеллеза поголовьем. Для этого во время нахождения животных в карантине проводят исследование сывороток крови в РА и бактериологические анализы фекалий на носительство сальмонелл.

При появлении заболевания хозяйство объявляют неблагополучным по сальмонеллезу. Все поросята-отъемыши и сосуны старше 1 мес подвергаются клиническому осмотру. Их делят на две группы: явно больные поросята с острой, подострой и хронической формой течения болезни и повышенной температурой; поросята с нормальной температурой тела, не имеющие клинических признаков сальмонеллеза. После изоляции поросят первой группы лечат сывороткой, антибиотиками, сульфаниламидными и нитрофурановыми препаратами, симптоматическими средствами, ПАБК. Поросят второй группы после термометрии вакцинируют. При вспышке болезни рекомендуется применять моновакцины.

В неблагополучных свинарниках еженедельно проводят дезинфекцию 4-прочентным горячим (60° С) раствором гидроокиси натрия. Такую же обработку осуществляют и в угрожаемых помещениях. Одновременно принимают меры для уничтожения грызунов.

Хозяйство объявляют благополучным через месяц после прекращения заболевания и проведения в нем заключительной дезинфекции.

На правах рукописи

ШИТОВА ОЛЬГА ИВАНОВНА

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПРОИЗВОДСТВА

ПРЕПАРАТОВ САЛЬМОНЕЛЛЕЗНОГО БАКТЕРИОФАГА

14.04.01 – технология получения лекарств

диссертации на соискание ученой степени

кандидата фармацевтических наук

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук

доктор фармацевтических наук, доцент

доктор медицинских наук, профессор

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат фармацевтических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Актуальность проблемы заболеваемости сальмонеллезами, которые в структуре острых кишечных инфекций занимают одно из ведущих мест, определяется их повсеместным распространением, тяжестью течения патологического процесса, возможностью неблагоприятных исходов, длительностью бактерионосительства и значимостью социально-экономического ущерба. Эпидемическая ситуация по сальмонеллезам в мире продолжает оставаться неблагополучной. В последние годы наблюдается тенденция роста заболеваемости сальмонеллезами и в России. Ее уровень в 2011 г. составил 36,13 на 100 тыс. населения [, 2010; , 2009; , 2008]. Устойчивость сальмонелл к антибиотикам, основным средствам этиотропной терапии, появление полирезистентных вариантов возбудителя [, 2010; , 2008] ставят задачу поиска новых лекарственных антимикробных средств, созданных на основе современных биотехнологий.

Одним из направлений в решении этой сложной проблемы является использование лечебно-профилактических препаратов бактериофагов, обеспечивающих специфическое литическое действие на возбудителя и не оказывающих побочных токсических и аллергических реакций на организм человека. В условиях роста антибиотикорезистентности микроорганизмов бактериофаги начинают все шире использоваться в клинической практике [, 2006; , 2010; , 2003 и др.].

В сфере изготовления препаратов бактериофагов актуальными являются задачи, связанные с усовершенствованием технологического процесса их производства, включая разработку эффективных способов очистки, конструирование поликомпонентных препаратов и создание новых лекарственных форм. В настоящее время при выпуске сальмонеллезных бактериофагов предпочтение отдается жидким препаратам. Однако, кислая среда желудка оказывает инактивирующее действие на бактериофаг при его пероральном приеме. Сохранение исходной активности фага, уменьшение объемов препаратов при их транспортировке и хранении диктует необходимость выпуска таблетированных и капсульных лекарственных форм.

Таким образом, обеспечение высокой литической активности фага и придание препарату качественно новых потребительских свойств, ставят задачу создания новой желудочно-резистентной таблетированной композиции сальмонеллезного бактериофага на основе совершенствования технологии его производства.

Цель настоящего исследования - совершенствование технологии производства жидкого очищенного препарата сальмонеллезного бактериофага и создание на его основе желудочно-резистентных таблеток без оболочки.

Основные задачи исследования

1. Создать производственную коллекцию штаммов сальмонелл - продуцентов сальмонеллезного бактериофага с включением в ее состав штаммов серологических вариантов сальмонелл, циркулирующих в Пермском крае.

2. Усовершенствовать процесс культивирования и разработать способ очистки жидкого сальмонеллезного бактериофага.

3. Оценить эффективность разработанного способа очистки сальмонеллезного бактериофага, изучить стабильность и антибактериальную активность экспериментально-производственных серий препарата.

4. Разработать состав и оптимизировать технологию изготовления и параметры таблетирования сальмонеллезного бактериофага.

5. Провести оценку качества желудочно-резистентных таблеток сальмонеллезного бактериофага без оболочки, изучить их стабильность в процессе хранения.

Научная новизна работы. На основе разработанных принципов периодического обновления качественного и количественного состава культур сальмонелл сформирована производственная коллекция из штаммов - продуцентов сальмонеллезного бактериофага, отражающая этиологическую структуру сальмонеллеза в Пермском крае.

Определены методические приемы по совершенствованию технологии производства сальмонеллезного бактериофага, включая процессы культивирования и очистки препарата от бактериальных клеток и балластных веществ.

Разработаны и признаны изобретением новые технологические подходы для получения таблетированной формы сальмонеллезного бактериофага без оболочки, обеспечивающие его устойчивость к кислому содержимому желудка (Патент РФ на изобретение № 000).

Практическая значимость работы. Разработанные эффективные микробиологические и технологические приемы позволяют адаптировать процессы изготовления сальмонеллезного бактериофага к условиям массового производства препарата, расширяющего арсенал отечественных антибактериальных средств.

Сформированная коллекция штаммов-продуцентов сальмонеллезного бактериофага, подвергаемая периодическому обновлению на основе штаммов сальмонелл, циркулирующих на территории Пермского края обеспечивает получение поливалентного препарата Бактериофаг сальмонеллезный групп А, В,С, D,Е.

Способ совместного культивирования штаммов-продуцентов сальмонеллезного бактериофага из разных серологических групп сальмонелл и разработанный способ очистки бактериофага от бактериальных клеток и балластных веществ, позволят получить стабильный очищенный препарат сальмонеллезного бактериофага с высокой литической активностью.

Внедрение результатов исследования. Результаты научной работы отражены в НД: Промышленный регламент № 000-09 на производство Бактериофага сальмонеллезного групп А, В,С, D,Е жидкого раствора для приема внутрь и местного применения, проект ФСП на Бактериофаг сальмонеллезный групп А, В,С, D,Е таблетки.

Разработан состав и технология производства желудочно-резистентных таблеток сальмонеллезного бактериофага без оболочки. В экспериментально-производственных условиях получены 3 серии желудочно-резистентных таблеток, соответствующих показателям качества нормативной документации.

Объём и структура диссертации. Работа изложена на 137 страницах машинописного текста, содержит 32 таблицы и иллюстрирована 16 рисунками. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав собственных экспериментальных исследований, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Список цитируемой литературы включает 146 источников, включая 119 отечественных и 27 зарубежных авторов.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Создание производственной коллекции штаммов сальмонелл - продуцентов сальмонеллезных бактериофагов, обеспечивает получение препарата Бактериофаг сальмонеллезный групп А, В,С, D,Е, обладающего высокой специфической литической активностью.

2. Использование способа совместного культивирования сальмонеллезного бактериофага и бактерий сальмонелл групп А, В,С, D,Е на казеиново-кислотной среде с последующей очисткой фаголизата методом ультрафильтрации позволяет оптимизировать технологию получения и повысить качество препарата.

3. Оптимизация технологических параметров производства таблетированной формы сальмонеллезного бактериофага (подбор композиции, выбор соотношения вспомогательных веществ и концентрата, метода сушки, формы и массы таблетки, давления прессования) обеспечивает создание желудочно-резистентных таблеток без оболочки, соответствующих требованиям нормативной документации.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В первой главе представлен обзор литературы по теме диссертации, включающий изучение эпидемиологических особенностей сальмонеллеза на современном этапе, характеристику биологических свойств сальмонелл. Представлен современный обзор о физиологии и экологии бактериофагов, описаны технологические процессы культивирования, способы очистки, приведены сведения по ассортименту выпускаемых лекарственных форм и технологические приемы их получения.

Во второй главе изложены материалы и методы, использованные при проведении работы.

Ретроспективный эпидемиологический анализ заболеваемости сальмонеллезами на территории России и Пермского края за 25 лет (гг.) с оценкой многолетней динамики проведен по данным официальной статистики Роспотребнадзора Пермского края. Оценку многолетней динамики заболеваемости сальмонеллезом с определением внутренней тенденции и темпов прироста (снижения) проводили по методике (1989г.).

Для формирования производственной коллекции штаммов-продуцентов сальмонеллезного бактериофага использовали штаммы сальмонелл S. paratyphi А, S. рaratyphi В, S. typhimurium, S. heidelberg, S. newport, S. choleraesuis, S. oranienburg, S. infantis, S. dublin, S.enteritidis, S. anatum, S. newlands, выделенные от пациентов с острыми кишечными инфекциями (ОКИ) из стационаров г. Перми и Пермского края (893штамма), а также полученные из ГИСК им. Тарасевича г. Москва (94 штамма). Идентификацию сальмонелл осуществляли по культуральным, тинкториальным, морфологическим, биохимическим, серологическим свойствам с использованием стандартных методик (МУ 4.2.2723-10). Оценку чувствительности штаммов сальмонелл к антибактериальным препаратам (ампициллин, амоксиклав, цефазолин, цефотаксим, гентамицин, доксициклин, ципрофлоксацин, левомицетин, нитрофурантоин) проводили согласно МУК 4.2.1890-04 диско-диффузионным методом.

Чувствительность сальмонелл к бактериофагу определяли путем диффузии фага в питательный агар и по методу Аппельмана. Чувствительность 924 штаммов сальмонелл к клонам вирулентных бактериофагов, лизируемость культур сальмонеллезным фагом определяли по методу Аппельмана в разведениях от 102 до 106. Для повышения литической активности маточного бактериофага проводили его адаптацию путем последовательных селектирующих пассажей на слаболизирующихся штаммах сальмонелл.

С целью получения суточной бульонной культуры 120 производственных штаммов сальмонелл групп А, В,С, D,Е засевали во флаконы со 100 мл казеиново-кислотной среды с последующей инкубацией в термостате в течение 20±4 часов при температуре 36,0±1,0°С.

Раздельное культивирование сальмонелл групп А, В,С, D,Е (стандартный режим) проводили в бутылях вместимостью 5 литров. В каждую емкость, содержащую 2 литра казеиново-кислотной среды, вносили по 100 мл суточной бульонной культуры каждой серологической группы сальмонелл с концентрацией микробных клеток 1х109 КОЕ/мл и добавляли 4,0 мл сальмонеллезного маточного бактериофага. Посевы инкубировали в термостате при температуре 36±10С в течение 18-20 часов.

При совместном культивировании посевной материал сальмонелл групп А, В,С, D,Е и маточный бактериофаг в питательную среду вносили одновременно в одну емкость. Суточную микробную культуру засевали из расчета 75±25 млн. клеток на 1мл среды, маточный бактериофаг - в количестве 0,2% от объема засеваемой среды. Культивирование компонентов вели при температуре 36±10С в течение 18±2 часов до полного лизиса культуры.

Очистку бактериофага от бактериальных клеток, эндотоксина и балластных веществ осуществляли методом мембранного разделения – ультрафильтрации в тангенциальном потоке. Для удаления бактериальных клеток, эндотоксинов и балластных веществ питательной среды первоначально полученый фаголизат сальмонелл в объеме 100,0 л подвергали осветляющей микрофильтрации через мембраны с размером пор 0,6 мкм. Последовательное концентрирование бактериофага в 2, 4 и 10 раз было проведено на ультрафильтрационной установке с волокнами на 100 кДа. В дальнейшем полученные фаголизаты разной степени концентрирования были доведены до первоначального объема (100,0 л) с использованием 0,9% раствора натрия хлорида и подвергались стерилизующей фильтрации через фильтр-капсулы Sartobran P с размером пор 0,2 мкм. В качестве восстанавливающих растворов использовали раствор 0,9% натрия хлорида, 0,9% раствор натрия хлорида с двухзамещенным магния хлоридом, фосфатно-буферный раствор. В роли стабилизирующей добавки применяли 30% раствор желатина.

При разработке таблеточной лекарственной композиции сальмонеллезного бактериофага использовали концентрированный в 100 раз жидкий препарат. В качестве вспомогательных веществ для таблетирования были выбраны: кальция глюконат, лактоза, магния стеарат, маннит, метилцеллюлоза марки 16 и 35, микрокристаллическая целлюлоза, натрия альгинат, пектин, полифепан (лигнин гидролизный), сорбит пищевой. Все используемые вспомогательные вещества разрешены к применению в медицине и отвечают требованиям НД.

Оценку качества полученных экспериментально-производственных серий жидкого бактериофага и таблеточной формы (по 3 серии каждой, всего 6 серий) осуществляли по параметрам, предусмотренным требованиями ФСП и ГФ XI в. 1, 2 (определение средней массы таблеток, прочности на истирание, распадаемости) и ГФ XII изд., часть 1 (определение стерильности, микробиологической чистоты, токсичности).

Специфическую активность жидкого бактериофага и его таблеточной формы определяли по методу Аппельмана, на 24 штаммах сальмонелл S. paratyphi А, S. рaratyphi В, S. typhimurium, S. heidelberg, S. newport, S. choleraesuis, S. oranienburg, S. infantis, S. dublin, S.enteritidis, S. anatum, S. newlands, результаты активности выражали в титрах, в баллах и в процентном соотношении к исходной концентрации бактериофага. Концентрацию фаговых частиц в препарате определяли на двухслойном агаре по методу А. Gratia.

Статистический анализ материалов диссертационного исследования проведен с использованием методов вариационной статистики (Гланц, 1999). Достоверность различий между показателями оценивали с использованием непарного t-критерия Стъюдента. Различия считали статистически значимыми при p 24.

Третья глава посвящена эпидемиологическим исследованиям и микробиологическим приемам, позволяющим сформировать производственную коллекцию штаммов-продуцентов сальмонеллезного бактериофага.

Проведенные исследования по изучению заболеваемости сальмонеллезом на территории Пермского края за 25 лет ( гг.) выявили ее высокий уровень, составляющий 87,6 случаев на 100 тыс. населения, что в 1,87 раза превысило средний показатель по Российской Федерации (46,8 на 100 тыс.). В 2011 году, относительно 2010 года, заболеваемость в Пермском регионе выросла на 17,9% (с 44,10 до 52,02 на 100 тыс.). Рост заболеваемости сальмонеллезом на территории Пермского края обусловил наши исследования по изучению видового состава возбудителей этой инфекции с целью обновления производственной коллекции сальмонелл, созданной нами в период с 2001 по 2009 гг.

Производственная коллекция сальмонелл серологических групп А, В, С, D, Е первоначально включала 924 культуры и состояла из 830 штаммов, выделенных от пациентов инфекционных больниц г. Перми и Пермского края и 94 штаммов, полученных из ГИСК им. (г. Москва). Исследование чувствительности штаммов сальмонелл производственной коллекции к клонам вирулентных бактериофагов показало, что резистентными к фагам оказались 27,6% изолятов, чувствительными - 8,4%, высокочувствительными - 64,0%. На основании анализа этих данных и с учетом серологической принадлежности сальмонелл к определенным группам нами было отобрано 362 фаголизабельных штамма. При первичном изучении многие штаммы лизировались маточным бактериофагом со средним титром , что свидетельствовало о низкой литической активности последнего. После осуществления трех пассажей маточного фага на слаболизирующихся культурах сальмонелл его литическая активность выросла до титра 10-5,6-10-7,0 .

В результате проведенной адаптации все 362 штамма сальмонелл различных серологических групп лизировались маточным бактериофагом в титре не ниже 10-6 для S.typhimurium и не ниже 10-5 для остальных групп, что соответствовало требованиям ФСП–ЛС 411.

а). Серологический пейзаж сальмонелл дополнительной музейной коллекции

б). Серологический пейзаж сальмонеллезов в Пермском крае (2010г.)

Рис. 1. Серологический пейзаж сальмонелл дополнительной музейной коллекции и сальмонеллезов в Пермском крае (2010г.)

На основе производственной коллекции, состоящей из 362 штаммов сальмонелл и дополнительно собранной в 2010г. музейной коллекции из 63 региональных штаммов сальмонелл, была создана обновленная производственная коллекция. В настоящее время эта коллекция, включающая 425 штаммов-продуцентов сальмонеллезного бактериофага и адаптированный маточный сальмонеллезный бактериофаг, являются основой для получения жидкого поливалентного препарата сальмонеллезного бактериофага.

Четвертая глава посвящена новым технологическим приемам, направленным на совершенствование метода культивирования бактериофага и разработку его оптимального способа очистки.

Культивирование бактериофагов является основной технологической стадией сложного производственного процесса получения их препаратов. Главная задача этой стадии заключается в создании оптимальных условий для развития штаммов-продуцентов сальмонеллезного бактериофага и обеспечение максимального выхода биомассы фаговых частиц. Известно, что оптимальной питательной средой для культивирования сальмонелл является казеиново-кислотная среда. Именно поэтому целью данного раздела работы явилась разработка условий получения препарата на этой питательной среде. Учитывая, что сальмонеллезный бактериофаг является поливалентным препаратом, первоначально процесс его репродукции проводили традиционным способом: каждую серогруппу сальмонелл засевали отдельно в бутыли вместимостью 5 литров. Одновременно с этим нами была изучена возможность совместного культивирования сальмонеллезных бактериофагов групп А, В,С, D,Е в одной емкости.

В ходе эксперимента было установлено, что специфическая активность сальмонеллезного бактериофага, полученного при совместном культивировании, была выше (титр фага соответствовал 10-5,3), чем при раздельном культивировании (титр 10-4,6) его отдельных компонентов (таб.1).

Специфическая активность экспериментальных серий сальмонеллезного

бактериофага, полученных методом раздельного и совместного

Специфическая активность фага, титр по Аппельману