Стафилококковый энтеротоксин tsst ige immunocap

Стафилококки, в частности S. aureus продуцируют ряд токсинов, которые классифицируются на три группы : 1) Цитолитические - гемолизины и лейкоцидины; 2) Энтеротоксины и 3) Эксфолиативный токсин.

Гемолизины - 4 антигенно- различных токсина: a, b, g, d. Из всех них альфа- лизин, или альфа- токсин наиболее клинически важен. В культуре он продуцируется только в аэробных условиях, и его продукция усиливается высокой концентрацией диоксида углерода. Это протеин, который инактивируется при 60 о С, но имеет парадоксальное свойства восстанавливать свою активность при дальнейшем нагревании между 80 о и 100 о С. Это связано с тем, что токсин комбинирован с термолабильным ингибитором. При повышении температуры ингибитор инактивируется, высвобождая токсин. Сам ингибитор инактивируется при 60 градусах. В большей степени активен по отношению к эритроцитам барана, в меньшей человека. Он разрушает лизосомы, при этом повреждаются макрофаги и тромбоциты. Это является причиной повреждения циркуляторной системы, мышечной ткани и коры надпочечников. Он является токсоидом и благодаря этому стимулирует иммунитет к стафилококкам.

Альфа-токсин S.aureus может рассматриваться в качестве прототипа олигомеризующих порообразующих цитотоксинов. Ген, кодирующий альфа-токсин, находится в виде единичной копии в хромосоме большинства патогенных штаммов S.aureus, и его экспрессия регулируется внешними факторами на уровне транскрипции дополнительным геном регулятором (agr). Токсин синтезируется в виде молекулы-предшественника, состоящей из 319 аминокислот и имеющей на N-конце сигнальную последовательность из 26 аминокислотных остатков. Выделяемый готовый токсин (протомер) представляет собой гидрофильную молекулу молекулярной массой около 33 кДа, в которой отсутствуют остатки цистеина.

В настоящее время изучена кристаллографическая структура завершенной поры, образованной альфа-токсином. На поверхности плазматической мембраны 7 протомеров токсина образуют грибовидный гептамер (232 кДа), содержащий 3 различных домена. Домены, формирующие "шляпку" и "край", расположены на внешней поверхности плазматической мембраны, а домен "ножки" служит трансмембранным каналом.

Альфа-токсин обладает цитолитическими свойствами в отношении различных типов клеток, включая моноциты, лимфоциты, эритроциты, тромбоциты и эндотелиоциты человека. Различают три последовательные стадии повреждения клеточной мембраны под действием альфа-токсина. Протомеры токсина сначала связываются с мембраной клетки-мишени при помощи не установленных рецепторов или не специфически абсорбируются фосфатидилхолином или холестеролом, входящими в состав билипидного слоя мембраны. Во-вторых, связанные с мембраной протомеры олигомеризуются в нелитический гептамерный комплекс. И в заключение, гептамер претерпевает ряд конформационных изменений, конечным результатом которых является формирование "ножки", которая проникает сквозь цитоплазматическую мембрану. Через образовавшуюся пору происходит вход и выход небольших молекул и ионов, что ведет к набуханию и гибели клеток, имеющих ядро, или осмотическому лизису эритроцитов.

Кроме того, отмечено, что при образовании пор запускаются вторичные процессы, которые также могут обусловить развитие патологических последствий. Эти процессы включают активацию эндонуклеаз, увеличение экзоцитоза тромбоцитов, высвобождение цитокинов и медиаторов воспаления. На примере нескольких экспериментальных моделей на животных было показано, что альфа-токсин является фактором вирулентности S.aureus, однако его точная роль в развитии стафилококковых заболеваний у человека остается неясной.

[Другими порообразующими токсинами являются RTX-токсины грамотрицательных бактерий (гемолизины E. coli) и стрептолизин O, выделяемый S.pyogenes].

Бетта-лизин S. aureus гемолитичен для бараньих эритроцитов, но не для человеческих и кроличьих. Он является сфингомиелиназой и разрушает клеточные мембраны. Продуцируется в аэробных и анаэробных условиях.

Гамма-лизины - наиболее слабые токсины, но действует на все типы эритроцитов от различных млекопитающих.

Дельта-лизин - литичен только для человеческих и нелитичен для бараньих и кроличьих эритроцитов. Действует как детергент, растворяя структурные липиды ЦПМ.

Альфа- и дельта- лизины найдены только у штаммов из клинического материала от человека, тогда как бета- лизины найдены и у штаммов других животных.

Лейкоцидины - токсины состоящие из двух фракций S и F, токсичны только в присутствии обеих фракций, но не по одиночке. Являются летальнымы для лейкоцитов многих животных. Мишенью для них является трифосфоинозитид в мембранах лейкоцитов.

Стафилококковые энтеротоксины (SEA, SEB, SECn, SED, SEE, SEG, SEH, и SEI) отвечают за манифестацию стафилококковой пищевой токсикоинфекции, проявляющейся в рвоте, тошноте, диарее в течение 6 часов после употребления контаминированной пищи. Токсин резистентен к пищеварительным ферментам, термостабилен. Инактивируется медленно (10-40 минут) только при 100 о , что зависит от его концентрации или источника (среды) нахождения. Молоко и молочные продукты наиболее частые источники отравления. Идентифицировано 8 типов токсинов A, B, C1, C2, D, E, G, H и I. Тип, который ранее назывался F типом, в настоящее время называется TSST-1 (токсин синдрома токсического шока).

Энтеротоксины могут иметь другие биологические эффекты - пирогенный, митогенный, тромбоцитопенический, гипотензивный и цитотоксический.

Пищевые токсикоинфекции, вызванные приемом пищи, которая была ранее контаминирована Staphytlococcus aureus, являются одной из форм гастроэнтеритов, клинически проявляющихся рвотой /с/ или /без/ диареи. Это состояние называется стафилококковым пищевым отравлением (СПО) и следует за приемом пищи, которая была предварительно загрязнена S. aureus, и в которой таким образом произошло накопление SЕs (стафилококковые энтеротоксины). Признаки системной токсичности (лихорадка и низкое давление) редко наблюдаются в случаях СПО. Кроме того, СПО – обычно разрешается за короткое время (в пределах от 24 до 48 часов от появления первых симптомов). Не ясно, развивается ли долговременная устойчивость к СПО у людей. Однако, антитела к одному типу SE не обязательно обуславливают устойчивость к СПО вызванными другими серотипами токсинов. В некоторых случаях, антитела, против одного SE могут перекрестно реагировать против другого SE. Например, антитела к SEB могут защищать против SEC, потому что эти два SEs имеют перекрестные антитело-связывающее эпитопы.

Все SEs вызывают рвоту у приматов при оральном введении. Проникшие с пищей SEs не приводят к выраженной энтеротоксэмии, если не использованы чрезвычайно высокие дозы токсинов. В отличие от SEs, оральное введение TSST-1 не вызывает рвоты у обезьян, но с другой стороны возникают системные признаки TSS (стафилококкового токсического шока) когда токсин вводится per or кроликам. Несмотря на его оральную токсичность, TSST-1 не был признан с медицинской точки зрения энтеротоксином. Это связано с тем что TSST-1 восприимчив к действию пепсина и может поэтому быть менее устойчив в кишке по сравнению с SEs. С другой стороны в кишечнике рецепторы для SEs и TSST различаются. Альтернативная гипотеза заключается в том, что весь орально вводимый TSST-1 быстро входит в системное кровообращение не достигая таким образом нижних отделов пищеварительного тракта.

Гастроэнтериты, спровоцированные SEs, ассоциированы с характерными гистологическими нарушениями в различных областях гастроинтестинального трактата, но наиболее серьезные повреждения появляются в желудке и верхней части тонкой кишки. В этих областях наблюдается гиперемия слизистой с проникновением нейтрофилов в эпителиальный слой и lamina propria. В просвете 12-перстной кишки наблюдается накопление слизистогнойного экссудата. В тощей кишке наблюдается расширение крипт и разрушение или исчезновение границы щеточной каймы. В lamina propria тощей кишки появляются обширные нейтрофильные и макрофагальные инфильтраты.

Известно, что цель для SЕs, связь с которой токсинов приводит к появлению рвотного эффекта расположена в брюшной полости, где существуют предполагаемые клеточные рецепторы для SEs. Так как эти рецепторы еще не идентифицированы, остается много неясного относительно ранних событий в патогенезе СПО. Ведущая гипотеза – заключается в том, что рвота возникает в ответ на SE-обусловленное воспаление. Признаки СПО высоко коррелируют с генерированием множества провоспалительных медиаторов, включая простагландин E2, лейкотриен B4, и 5-гидроксиэйкозатетраеноевой кислоты. Цистеиниловые лейкотриены, типа лейкотриена E4, также вовлечены как критические посредники в СПО. Неясно, синтезируются ли эти посредники непосредственно или косвенно в ответ на SEs. В конечном счете, рвотная реакция в ответ на SEs зависит от активации медуллярного рвотного центра, который стимулируется импульсами, переданными через блуждающий нерв (n. vagus) и симпатическую нервную систему.

Несколько групп исследователей считают, что первичными источниками воспалительных медиаторов, синтезируемых и секретируемых в течение СПО, являются тучные клетки. Одна текущая гипотеза заключается в том, что SEs вызывают дегрануляцию тучных клеток после прямой адгезии токсина на рецепторах этих клеток, а не через типичный IgE - опосредованный процесс активации тучных клеток. С другой стороны есть результаты, которые указывают, на то что активация тучных клеток in vivo требует, совместной адгезии на них SEs в комплексе с некими костимулирующими сигналами. Альтернативно, существует нейрогенная модель, в которой тучные клетки стимулируются нейропептидами, которые секретируются сенсорными нервами. Одним из предполагаемых пептидов активирующий тучные клетки и который, как показано, вовлечен в SEB-обусловленную токсичность, была субстанция P. Однако в других исследованиях не было обнаружено адгезии SEA к нервной ткани в гастроинтестинальном тракте у крыс. Этот результат подвергает сомнению теорию о нейропептидном механизме действия SEs. В заключении можно отметить, что роль тучных клеток в СПО подтверждена, однако механизмы, через которые SEs вызывают дегрануляцию тучных клеток, остаются пока не выясненными. Однако понятно, что механизмы действия энтеротоксинов у S. aureus значительно отличается от механизма действия экзоэнтеротоксинов, например, у энтеротоксигенных кишечных палочек и у холерного вибриона.

Эксфолиативные токсины (ETA и ETB) - вызывают эксфолиативные повреждения, при которых внешний слой эпидермиса отделяется от ниже лежащих тканей. Разрушает межклеточные связи (десмосомы) и способствует инвазии ткани без повреждения клетки. При этом образуются межтканевые щели, заполненные жидкостью. Проявляется образованием пузырей. (Болезнь новорожденных или детей младше 5 лет - болезнь Ritter). В настоящее время известно два типа токсинов - термостабильный, синтез которого контролируется хромосомными генами и термолабильный - плазмидами.

TSST (токсин синдрома токсического шока у S. aureus) - синдром токсического шока - мультисистемное заболевание, которое проявляется лихорадкой, гипотензией, миалгией, рвотой, диареей, гиперемией слизистых и эритематозной сыпью с отшелушиванием (десквамацией). Все эти симптомы ассоциированы с инфекцией слизистой, вызванной штаммами S.aureus. В основном возникает у молодых женщин детородного периода при использовании определенного типа высоко адсорбирующих тампонов. TSST член семейства суперантигенов, которые обладают способностью стимулировать Т-клетки, фактор некроза опухоли и кроме этого индуцируют цитокин интерлейкин-1.

Некоторые бактериальные токсины действуют непосредственно на Т-клетки и антигенпрезентирующие клетки иммунной системы. При нарушении функций этих клеток, вызванных токсином, развиваются заболевания. Одна из больших групп этой категории токсинов - пирогенные токсины, обладающие свойствами суперантигенов (PTSAg). Их отличительная особенность - мощное стимулирующее действие на клетки иммунной системы, пирогенность и усиление эндотоксического шока. Эти термостабильные токсины с молекулярной массой от 22 до 30 кДа включают стафилококковые энтеротоксины серотипов от A до E, G и H, стафилококковый TSST-1, пирогенные экзотоксины стрептококков группы А (серотипы от А до C и F), суперантиген стрептококков группы А.

Все токсины, относящиеся к PTSAg, имеют сходную биологическую активность, при этом среди членов данного семейства выделяется TSST-1, имеющий менее 30% гомологии по аминокислотному составу с другими токсинами данного семейства. Ген, кодирующий TSST-1, локализован на хромосоме и в тоже время у штаммов S.aureus ген tst входит в состав различных мобильных генетических элементов. Токсин синтезируется в виде молекулы-предшественника, состоящей из 234 аминокислотных остатков, причем первые 40 остатков являются сигнальной последовательностью, которая отщепляется в процессе образования зрелого токсина массой 22 кДа.

Экспрессия TSST-1 зависит от концентрации кислорода, температуры, pH и уровня глюкозы и регулируется agp локусом S.aureus. По данным кристаллографического анализа, TSST-1 так же, как и ряд других токсинов, относящихся к PTSAg, состоит из двух различных доменов, но в отличие от других членов семейства TSST-1 не нуждается в ионах цинка в качестве кофактора.

В целом мощное иммуностимулирующее свойство PSTAg является прямым результатом связывания токсина с различными участками снаружи от пептидсвязывающего участка молекул главного комплекса гистосовместимости второго класса (расположенных на поверхности антигенпрезентирующих клеток) и специфических участков на рецепторах Т-клеток. В частности, В домен TSST-1 сначала связывается с a-цепью молекул человеческого лейкоцитарного антигена DR1, в то время как А домен специфически связывается с V-b2-элементами рецепторов Т клеток.

Связывание TSST-1 с V-b-2 элементами рецепторов Т-клеток приводит к массивной пролиферации (до 20%) периферических Т-клеток - явление, которое радикально изменяет набор V-b- у Т-клеток. Т-клетки, образовавшиеся в результате пролиферации, могут существовать в состоянии анергии или подвергаются апоптозу. Пролиферация Т-клеток сопровождается массивным высвобождением лимфоцитарных (интерлейкин [ИЛ]-2, a-фактор некроза опухолей, g-интерферон) и моноцитарных (ИЛ-1, ИЛ-6, a-фактор некроза опухолей) цитокинов. Они вызывают гипотензию, высокую температуру тела и диффузную эритематозную сыпь, которые характерны для синдрома токсического шока. На протяжении длительного времени TSST-1 рассматривают как ключевую субстанцию в развитии синдрома стафилококкового токсического шока, однако в последние годы его стали связывать и с развитием синдрома Кавасаки - ведущей причины приобретенных пороков сердца у детей в США.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии и аллергологии. Изобретение обеспечивает тест-систему ИФА для определения специфических IgE-антител к стафилококку в сыворотке крови больного аллергическими заболеваниями, имеющего гиперчувствительность к аллергенам стафилококка; способ определения специфических IgE-антител к стафилококку в сыворотке крови больного аллергическими заболеваниями, имеющего гиперчувствительность к аллергенам стафилококка, с применением указанной тест-системы; и способ диагностики стафилококковой аллергии. Применение заявленного изобретения позволяет выявить аллергию на стафилококк. 4 н. и 8 з.п. ф-лы, 1 ил., 2 табл.

Рисунки к патенту РФ 2436100

Изобретение относится к области медицины, а именно к аллергологии, иммунологии и клинической лабораторной диагностике.

В России аллергическими заболеваниями страдает от 10 до 30% населения [1]. Инфекционно-зависимые формы в структуре аллергических болезней составляют до 75% всех аллергопатологий, в числе которых следует отметить тяжело протекающие болезни: бронхиальную астму, хронические бронхиты, риниты, аллергодерматозы, осложненные инфекцией, нередко приводящие больных к инвалидности [2]. Экономический ущерб от аллергических заболеваний, осложненных инфекцией, чрезвычайно высок из-за многократных ежегодных обострений хронических инфекций у больных.

В основе инфекционно-зависимых форм аллергии лежит гиперреактивность сенсибилизированного организма больного к аллергенам микробов, обитающих на коже и слизистых оболочках носа, зева, бронхов больных [3, 4, 5, 6, 7]. Аллергенные свойства микроба зависят от природы его метаболитов, путей их трансформации внутри организма человека, от специфики взаимосвязей живой микробной клетки с организмом хозяина.

Многообразие способов воздействия микроба на макроорганизм обусловливает сложность решения проблемы аллергенности бактерий и их метаболитов [8]. Ранее исследованиями многочисленных авторов [9, 10], в частности сотрудниками ГНЦ-Института иммунологии ФМБА А.Д.Адо, В.Н.Федосеевой и соавт. 1997-2003 гг., было показано, что стафилококки играют важную роль в патогенезе инфекционно-зависимых форм аллергии. Была доказана возможность формирования гиперчувствительности немедленного типа у больных респираторно-аллергическими заболеваниями, атопическими дерматитами на аллергены стафилококка. Последнее является важным критерием назначения больным аллерген-специфической иммунотерапии аллерговакцинами из стафилококка [11] и последующей тактики ведения больных с немедленным типом аллергии к стафилококку.

Авторы не обнаружили в уровне техники аналог-прототип, наиболее близкий к заявленному изобретению, поскольку нами впервые была поставлена задача разработки технологии получения тест-системы ИФА для определения специфических IgE-антител к стафилококку в сыворотках крови больных аллергическими заболеваниями, имеющих гиперчувствительность к аллергенам стафилококка, и диагностики аллергии к стафилококку с использованием указанной тест-системы.

Использование настоящего изобретения позволяет определить специфические IgE-антитела к стафилококку в сыворотке крови больного аллергическими заболеваниями с помощью заявляемой тест-системы, обладающей высокой чувствительностью, и повысить эффективность диагностики аллергии к стафилококку.

В соответствии с настоящим изобретением тест-система ИФА для определения специфических IgE-антител к стафилококку в сыворотке крови больного аллергическими заболеваниями, имеющего гиперчувствительность к аллергенам стафилококка, включает планшеты одноразового применения с иммобилизованной активной аллергенной субстанцией (AAC), выделенной из стафилококка, на стрипах; AAC St. aureus; положительный и отрицательный контроли (сыворотки); конъюгат анти-IgE-антител; твин-20; буфер с добавлением Твина (pH 7,0-7,2) для приготовления раствора для отмывок; цитратный буфер (pH 4,7) для приготовления рабочего раствора; ортофенилендиамин (ОФД) в виде таблеток 0,0002 г и пергидроль H 2 O 2 - 37% - для приготовления красящего раствора; H 2 SO 4 в качестве стоп-раствора; и инструкцию по использованию набора. При этом AAC состоит из трех активных фракций с молекулярными массами 50, 130 и 170 кДа.

Вторым объектом изобретения является способ определения специфических IgE-антител к стафилококку в сыворотке крови больного аллергическими заболеваниями, имеющего гиперчувствительность к аллергенам стафилококка. Указанный способ включает следующие стадии: подготовку твердой фазы (планшет) для сорбции AAC с использованием КББ - карбонатно-бикарбонатного буфера (pH 9,5); нанесение раствора AAC в лунки планшета; инкубацию AAC на твердой фазе в холоде при 2-4°C в течение 2 суток; отмывание буфером (pH 7,0-7,2) трижды, подсушивание; нанесение контрольных и испытуемых сывороток в лунки соответствующих стрипов с 50 мкл буфера (pH 7,0-7,2); инкубацию в термостате при 37°C в течение 2,5 часов; отмывание буфером (pH 7,0-7,2) трижды, подсушивание стрипов; нанесение раствора конъюгата во все лунки стрипов; инкубацию в холоде при 2-4°C в течение 18-20 часов; нанесение красителя ОФД в цитратном буфере (pH 4,7) во все лунки стрипов; нанесение во все лунки стоп-раствора; контроль реакции ИФА по оптической плотности во всех образцах при длине волны 492 нм на Мультискане.

Следующим объектом изобретения является способ диагностики стафилококковой аллергии, включающий определение специфических IgE-антител к стафилококку в сыворотке крови больного с использованием вышеуказанного способа, причем позитивная реакция оценивается 2-4 классом.

1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Подбор и паспортизация опытных штаммов стафилококка для получения аллергенной субстанции осуществлялась на основе идентификации видовых признаков штаммов стафилококка, выделенных от больных бронхиальной астмой и атопическим дерматитом стафилококкового генеза, на базе бактериологической лаборатории ГФБУ Институт иммунологии ФМБА, Отдела живых культур ГИСКа им Л.А.Тарасевича Роспотребнадзора с учетом морфологических, культуральных и биохимических характеристик.

1.2 Создание банка специфических сывороток с высокой IgE-связывающей активностью с аллергенами стафилококка осуществлялось на основе клинико-лабораторного обследования больных респираторно-аллергическими заболеваниями и атопическим дерматитом (АД), осложненными стафилококковой инфекцией отделения НКО (зав. проф. Л.В.Лусс) и отд. аллергологии и иммунопатологии кожи (зав. проф. Феденко Е.С.). Обследовано 47 больных с бронхиальной астмой и 12 чел. с АД, осложненными стафилококковой инфекцией (всего 59 чел.). Банк специфических сывороток составил 15 образцов с интенсивностью ИФА в специфическом IgE-связывании со стафилококковым аллергеном 2-4 класса.

Из таблицы 1 видно, что образец AAC St. aureus, полученный в Институте иммунологии, обладает специфической активностью.

Уровни связывания специфических IgE-антител в сыворотках крови больных с гиперчувствительностью к Staphylococcus aureus с испытуемой AAC из Staphylococcus aureus составили 3,2±0,2 (класс ИФА), что подтверждает специфическую активность AAC. Препарат Рузам - менее активен.

2.5 Разработка экспериментального технологического процесса изготовления на основе ЛАС тест-системы ИФА для определения IgE-антител в сыворотках крови больных с гиперчувствительностью к аллергенам стафилококка

Были выявлены оптимальные условия связывания AAC Staphylococcus aureus на планшетах разной степени сорбции аллергенов. Найдены критерии оптимальной фиксации препарата и максимальной интенсивности специфического IgE-связывания, что использовано на разных этапах выполнения работ.

Проведена оценка специфической активности разработанной тест-системы ИФА.

Сформулированы требования к тест-системе ИФА на основе AAC:

- AAC должна обладать способностью взаимодействовать со специфическими к St. aureus IgE -антителами контрольной положительной сыворотки (положительный контроль). Образуемый комплекс выявляется пероксидазным конъюгатом моноклональных анти-IgE-антител, образующих цветное окрашивание с субстратной смесью. Определение проводят твердофазным иммуноферментным анализом (ИФА) [23].

Определение считают удовлетворительным, если положительная контрольная сыворотка при взаимодействии с испытуемыми образцами Staphylococcus aureus дает цветное окрашивание, оптическая плотность которого выше оптической плотности контрольной отрицательной сыворотки

Пример технологического процесса (ТП)

ТП-1 - подготовка твердой фазы (планшет) для сорбции AAC с использованием КББ (pH - 9,25);

ТП-2 - нанесение раствора AAC в лунки планшета;

ТП-3 - инкубация AAC на твердой фазе в холоде при 2-4°C в течение 2 суток;

ТП-4 - отмывание буфером (pH 7,0-7,2), подсушивание;

ТП-5 - нанесение контрольных и испытуемых сывороток в лунки соответствующих стрипов с 50 мкл буфера (pH 7,0-7,2);

ТП-6 - инкубация в термостате при 37°C в течение 2,5 часов;

ТП-7 - отмывание буфером (pH 7,0-7,2), подсушивание стрипов;

ТП-8 - нанесение раствора конъюгата во все лунки стрипов;

ТП-9 - инкубация в холоде при 2-4°C в течение 18-20 часов;

ТП-10 - отмывание буфером (pH 7,0-7,2), подсушивание стрипов;

ТП-11 - нанесение красителя ОФД в цитратном буфере (pH 4,7) во все лунки стрипов;

ТП-12 - нанесение во все лунки стоп-раствора;

ТП-13 - контроль реакции ИФА по оптической плотности во всех образцах при длине волны 492 в Мультискане.

2.6 Апробация разработанной тест-системы ИФА в клинико-лабораторных исследованиях

Было собрано 26 сывороток крови больных с респираторно-аллергическими заболеваниями и атопическим дерматитом, осложненными стафилококковой инфекцией. Показано, что сыворотки 81% пациентов с гиперчувствительностью к St.aureus показали положительную реакцию с AAC в тест-системе ИФА (2-4 класс реакции) при сравнении с позитивным и негативным контролями.

На основании проведенной работы разработана Инструкция по применению тест-системы ИФА для диагностики аллергии к стафилококку и макет тест-системы (см. иллюстрации).

ИНСТРУКЦИЯ ПО ПРИМЕНЕНИЮ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ИФА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ АЛЛЕРГИИ К СТАФИЛОКОККУ

Назначение: тест-система ИФА на основе AAC St.aureus предназначена для выявления специфических к стафилококку IgE-антител в сыворотках крови больных аллергическими заболеваниями, осложненными стафилококковой инфекцией.

Область применения: данная диагностическая система может быть использована для выявления аллергии к стафилококку.

Принцип определения: на основе активной аллергенной субстанции стафилококка (AAC) проводится скрининговый ИФА для выявления специфических IgE-антител к стафилококку у больных аллергическими заболеваниями, осложненными стафилококковой инфекцией.

Комплект тест-системы включает:

- положительный контроль (сыворотка),

- отрицательный контроль (сыворотка),

- буфер с добавлением Твина (pH 7,2) (для отмывания, рабочий раствор),

- цитратный буфер (pH 4,7) - рабочий раствор,

- ортофенилендиамин (ОФД), таблетки 0,002 г,

- пергидроль H 2 O 2 - 37%,

- H 2 SO 4 - 50% (стоп-раствор),

- Инструкция по использованию набора.

2. Холодильник с морозильной камерой на -20°C.

3. Стерильные наконечники.

5. Центрифуга ЦЛ1/3.

6. Мультискан (Multiskan EX, Thermo Labsystems).

7. Термостат TC-80M-2.

8. Мешалка Titertek.

9. Иономер универсальный ЭВ-74.

- В лунки планшета вносят по 100 мкл карбонатного буфера.

- В каждую лунку добавляют 20 мкл AAC.

- Планшет помещают на 2 суток в холодильник.

- Отмывание несвязавшегося AAC проводят 3 раза буфером (pH 7,2).

- Во все лунки стрипов вносят по 50 мкл буфера pH 7,2, а затем:

- в стрип № 1 - 50 мкл положительного контроля - позитивная сыворотка, содержащая IgE-антитела к стафилококку, с реакцией в ИФА - 2-4 класса.

- В стрип № 2 - 50 мкл исследуемых сывороток крови, содержащих IgE-антитела к стафилококку.

- В стрип № 3 - 50 мкл сывороток крови, не содержащих IgE-антитела к стафилококку,

- отрицательный контроль, на 2-3 часа все стрипы, прикрыв крышкой, помещают в термостат при t=37°C.

- Планшет вынимают, отмывают буфером (pH=7,2) 3 раза.

- Заливают во все лунки каждого стрипа по 100 мкл рабочего раствора конъюгата и выдерживают в холодильнике 18-20 часов.

- Вынимают из холодильника и отмывают 3-4 раза буфером (pH 7,2), просушивают.

- Добавляют во все лунки стрипов по 100 мкл краски ОФД (рабочий субстрат), выдерживают в темноте 10-15 минут.

- Реакцию останавливают добавлением во все лунки стрипов по 100 мкл 50% р-ра H 2 SO 4 .

- Результаты считывают на Мультискане (при длине волны 492 нм).

Результаты измерений сравнивают с показателями в позитивном и негативном контролях, позитивная реакция оценивается 2-4 классом.

Примеры осуществления способа диагностики

1. Пациентка Максимова И.В., 33 г. На протяжении 4 лет принимает противоаллергическую терапию без эффекта. Пациентке провели определение специфических IgE-антител к стафилококку в сыворотке крови заявленным способом. Определился 4 класс реакции, что явилось показанием к назначению специфической иммунотерапии стафилококковой иммуновакциной.

2. Пациентка Худуева Е.Ю., 47 л. Практически всю жизнь страдает от аллергии. Принимает лечение, часто без эффекта. Заявленным способом определили 4 класс реакции, что явилось показанием к назначению специфической иммунотерапии стафилококковой иммуновакциной.

3. Пациент Кларк М., 13 лет. Определили 3 класс реакции, что явилось показанием к назначению специфической иммунотерапии стафилококковой иммуновакциной.

4. Пациент Киреев C., 2 года. Определили 2 класс реакции, что явилось показанием к назначению специфической иммунотерапии стафилококковой иммуновакциной.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ.

4. Елисютина О.Г., Феденко Е.С.Staphylococcus aureus в патогенезе атопического дерматита. Рос., аллергологический ж., 2004, № 1, с.17-21.

7. Хутуева С.Х. Бронхиальная астма. Нальчик, 1988, с.127.

8. Государственная Фармакопея СССР, XI, 1, 2, М., 1998.

14. Taskapan M.J., Kumar P. «Role о staphylococcal superantigens in atopic dermatitis, Ann Allergy Asthma Immunol, 2000, V. 84(1) p 3-10; p.11-2.

18. Правила доклинической оценки безопасности фармакологических средств (GLP), Москва, 1992 г.

19. Siegel LM., Monty K J. Determination of molecular weights and frictional ration of proteins in impure systems by use of gel filtration and dtnsity gradient centrifugation. Application to crude preparations of sulfite and hidroxylamine reductases. Biochim. et biophis. acta, 1966, 112, p.346-362.

23. Федосеева В.Н., Кудрина Г.П.(ред). Методические рекомендации по оценке аллергенных свойств фармакологических средств. М.: МЗ, 1988, 22 с.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Тест-система ИФА для определения специфических IgE-антител к стафилококку в сыворотке крови больного аллергическими заболеваниями, имеющего гиперчувствительность к аллергенам стафилококка, включающая планшеты одноразового применения с иммобилизованной активной аллергенной субстанцией (ААС), выделенной из стафилококка, на стрипах; ААС St. aureus; положительный и отрицательный контроли (сыворотки); конъюгат анти-IgE-антител; твин-20; буфер с добавлением Твина (рН 7,0-7,2) для приготовления раствора для отмывок; цтратный бефер (рН 4,7) для приготовления рабочего раствора; ортофенилендиамин (ОФД) в виде таблеток 0,0002 г и пергидроль H 2 O 2 - 37% - для приготовления красящего раствора; H 2 SO 4 в качестве стоп-раствора; и инструкцию по использованию набора.

2. Активная аллергенная субстанция (ААС), выделенная из стафилококка, которая состоит из трех активных фракций с молекулярными массами 50, 130 и 170 кДа.

3. Способ определения специфических IgE-антител к стафилококку в сыворотке крови больного аллергическими заболеваниями, имеющего гиперчувствительность к аллергенам стафилококка, с применением тест-системы по п.1, включающий подготовку твердой фазы (планшет) для сорбции ААС с использованием КББ (рН 9,5); нанесение раствора ААС в лунки планшета; инкубацию ААС на твердой фазе в холоде при 2-4°С в течение 2 суток; отмывание буфером (рН 7,0-7,2) трижды, подсушивание; нанесение контрольных и испытуемых сывороток в лунки соответствующих стрипов с 50 мкл буфера (рН 7,0-7,2); инкубацию в термостате при 37°С в течение 2,5 ч; отмывание буфером (рН 7,0-7,2) трижды, подсушивание стрипов; нанесение раствора конъюгата во все лунки стрипов; инкубацию в холоде при 2-4°С в течение 18-20 ч; нанесение красителя ОФД в цитратном буфере (рН 4,7) во все лунки стрипов; нанесение во все лунки стоп-раствора; контроль реакции ИФА по оптической плотности во всех образцах при длине волны 492 нм на Мультискане.

4. Способ по п.3, в котором планшетом является одноразовый планшет с высокой сорбцией.

5. Способ по п.3, в котором ААС является AAC St. aureus.

6. Способ по п.3, в котором промывочный раствор содержит натрия хлорид, Твин 20, дистиллированную воду.

7. Способ по п.3, в котором раствор конъюгата получают путем помещения конъюгата, представляющего собой моноклональные антитела против эпсилон-цепи IgE человека, в буфер натриевой соли - Твин 20.

8. Способ по п.3, в котором цитратный буфер содержит лимонную кислоту 0,1 М, натрий фосфорнокислый однозамещенный 0,2 М, натрий фосфорнокислый двузамещенный 0,2 М, дистиллированную воду.

9. Способ по п.3, в котором красящий раствор получают путем растворения в цитратном буфере 1 таблетки ортофенилендиамина, с последующим внесением пергидроля 37%.

10. Способ по п.3, в котором стоп раствором является серная кислота (H 2 SO 4 ) 50%.

11. Способ диагностики стафилококковой аллергии, включающий определение специфических IgE-антител к стафилококку в сыворотке крови больного с использованием способа по п.2, причем позитивная реакция оценивается 2-4 классом.

12. Способ по п.11, в котором стафилококковой аллергией является аллергия немедленного типа.

Читайте также:

• Прививка полиомиелит непривитый ребенок
• Прививка полиомиелит за и против червонская
• Стафилококковый фолликулит у собаки
• Можно ли заниматься сексом при лечении золотистого стафилококка
• Как я вылечился от дизентерии

Классы МПК:	G01N33/53 иммунологический анализ, анализ биоспецифического связывания, материалы для этого A61P37/08 противоаллергические средства
Автор(ы):	Федосеева Вера Николаевна (RU) , Камышева Валерия Алексеевна (RU) , Миславский Олег Владимирович (RU) , Федоскова Татьяна Германовна (RU) , Лункина Елена Владимировна (RU) , Мартынов Александр Игоревич (RU)
Патентообладатель(и):	Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр "Институт иммунологии" Федерального медико-биологического агентства (ФГБУ "Институт иммунологии" ФМБА России) (RU), Федосеева Вера Николаевна (RU), Мартынов Александр Игоревич (RU), Камышева Валерия Алексеевна (RU)
Приоритеты: