Лабораторная диагностика листериоза на современном уровне

Листериоз является инфекционным заболеванием, которое вызывает самые вирулентные пищевые инфекции. Листериоз распространен среди животных и людей. Характеризуется множеством источников инфекции, разнообразными путями и факторами ее передачи, множественными формами проявления и высокой летальностью. Листериозом в мире заболевает тысячи человек, от 20 до 30% из которых умирает. Смертность от тяжелых распространенных форм заболевания достигает 90 — 100%. Своевременная диагностика листериоза позволяет назначить адекватное лечение что, обеспечивает больному полное излечение.

Рис. 1. На фото больной с листериозным менингитом.

Полиморфизм клинических проявлений и невозможность выявления в ряде случаев источника инфекции создает исключительные трудности при установлении диагноза по клинико-эпидемиологическим данным. В связи с этим решающее значение приобретает лабораторная диагностика листериоза. Предварительный диагноз устанавливается на основании бактериоскопического исследования, окончательный диагноз требует бактериологического подтверждения или ПЦР.

Для исследования используются:

Образцы крови, носоглоточная слизь, отделяемое из глаз, пунктат из лимфатических узлов, фекалии.
У женщин, родивших мертвого ребенка или с признаками листериоза исследованию подлежат плацента, околоплодные воды, отделяемое родовых путей.
У новорожденных исследуется меконий.
У больных с подозрением на листериозный менингит исследуется спиномозговая жидкость.
От трупов берется разнообразный биологический материал.
Фекалии и мазки из ротоглотки берутся для установления бактерионосительства.

Диагностика листериоза с помощью простой и люминесцентной микроскопии

Рис. 2. Вид листерий под микроскопом. Бактерии располагаются поодиночке или парами, реже — короткими цепочками. При окраске по Граму листерии окрашиваются в розовый цвет.

Рис. 3. Листерии в свете микроскопа, дающего трехмерное увеличение, выглядят как цилиндры.

Рис. 4. Листерии в макрофагах.

Снижение работы клеточного иммунитета приводит к распространению инфекции по всему организму. В органах и тканях образуются специфические гранулемы — листериомы. Их специфический состав определяется при микроскопировании мазка или биопата.

Рис. 5. Гранулемы в печени (фото слева). Гранулема (листериомы) в головном мозге (фото справа).

Лабораторная диагностика листериоза с помощью бактериологического исследования

Листерии растут при комнатной температуре на обычных питательных средах — слабощелочных и нейтральных. Посевы рекомендуется делать в первые 7 — 10 суток заболевания. Инкубация продолжается 3 недели при температуре 37 °С. При посеве на глюкозно-кровяной агар отбирают типичные колонии (прозрачные или роговидные), дающие гемолиз.

Рис. 6. Колонии листерий при посеве на мясопептонном агаре напоминают капельки росы. В проходящем свете колонии приобретают перламутровый оттенок.

Рис. 7. При росте листерий на хромогенном агаре колонии приобретают синюю окраску.

Рис. 8. При росте на оксфордском агаре вокруг колоний образуется черный ореол.

Рис. 9. При росте листерий в мясопептонном бульоне образуется помутнение с легкой опалесценцией.

Диагностика листериоза с помощью биологических проб

Биологические пробы основаны на заражении лабораторных животных биологическим материалом, взятого от больного, с целью обнаружения бактерий. Заражению подвергают белых мышей, кроликов, морских свинок, степных пеструшек.

Рис. 10. На фото зараженные листериозом белые мыши. В центре здоровый мышонок. Справа и слева от него мыши-сосунки с параличом передних лапок.

Рис. 11. На фото слева листериоз у кролика, развившийся после внутривенного заражения. На фото справа воспалительная реакция, развившаяся на месте внутрикожного введения листерий.

Антитела к листериям

Антитела к листериям определяются с помощью серологических реакций: реакции агглютинации (РА), реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) и реакции связывания комплемента (РСК) с листериозным антигеном с постановкой в парных сыворотках. При наличии листериоза у больного нарастание титра регистрируется в 4 раза и более. Реакции проводятся дважды с 2-х недельным перерывом.

В связи с антигенным родством листерий и стафилококков, возможно получение ложноположительных результатов.

Через 2 недели от начала заболевания в крови больного выявляются антитела IgG, которые присутствуют в крови на протяжении всего периода заболевания. Длительное время антитела сохраняются в крови при хроническом течении листериоза.

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) — экспрессный и высокочувствительный метод диагностики листериоза. Существует прямой и непрямой метод РИФ. При определении антител прямым методом к взвеси микробов, зафиксированной на предметном стекле, добавляется сыворотка, меченная флуорохромом. При образовании комплекса антиген-антитело при освещении сине-фиолетовыми (ультрафиолетовыми) лучами бактерии светятся ярко-зеленым цветом в люминесцентном микроскопе.

Рис. 12. Свечение листерий при проведении реакции иммунофлюоресценции.

Кровь на листерии

Анализ крови на листерии является эффективным способом определения листериозной инфекции. При различных формах листериоза в организме больных, прежде всего, активизируется система мононуклеарных фагоцитов — макрофагов. Они захватывают и уничтожают бактерии и вирусы, живущие внутриклеточно, считывают информацию об их строении и передают ее Т-лимфоцитам. В дальнейшем В-лимфоциты начинают вырабатывать антитела, уничтожающие патоген. При заболевании количество моноцитов в периферической крови возрастает. При септической форме листериоза их количество достигает 70% (при норме 3 — 11%).

Рис. 13. На фото моноциты — самые крупные клетки периферической крови.

Внутрикожная проба на листериоз

Для диагностики листериоза используется внутрикожная (аллергическая) проба. Листериозный антиген вводится внутрикожно. Через 24 часа проводится изучение реакции. В случае наличия листерий в организме исследуемого на месте введения листериозного антигена коже появляется папула (инфильтрат) 10 и более миллиметров.

Внутрикожная проба ставиться на 6 — 9 день от момента заболевания.

В случае появления единичных случаев листериоза диагностика заболевания должна проводиться с использованием бактериологического метода и метода ПЦР.

Дифференциальная диагностика листериоза

Дифференциальная диагностика листериоза проводится с учетом развившейся клинической формы заболевания.

Листериозные ангины следует отличать от стрептококковых ангин.
Острые формы листериоза следует отличать от инфекционной эритемы, инфекционного мононуклеоза, острого токсоплазмоза, заболеваний крови.
Нервные формы листериоза следует отличать от бактериальных менингитов разной этиологии — пневмококковых, менингококковых, стафилококковых.
Листериоз беременных следует отличать от вялотекущих пиелоциститов и пиелонефритов.

Аннотация научной статьи по прочим медицинским наукам, автор научной работы — Арзымбетова Ж.Х., Ахметова А.Т., Нургалиева К.Ж.

В последние десятилетия повсеместно отмечается рост заболеваемости листериозом , что связано как с истинным подъемом заболеваемости, так и с улучшением лабораторной диагностики . С целью повышения высеваемости бактерий применяется использование селективных сред и метод холодового обогащения. Схема выделения листерий в зависимости от контаминации и количества листерий в исследуемом материале включаетлибо непосредственный высев на селективный агар, либо обогащение материала на селективных бульонах.

LABORATORY DIAGNOSTIC OF LISTERIOSIS

During the last 10 years incidence oflisteriosis is permanentlyincreasing everywhere. There are 2 reasons of this fact real growing of the incidence as well as the improvement of laboratory diagnostic . For increasing the quality of Listeria testing specialists recommend to use selective culture and method of cold inreaching. The scheme of Listerias' allocation depending on contamination and quantities of Listerias in an investigated material includes either direct seeding on a selective agar or enrichment of material on selective broths.

CEREBROVASCULAR PATHOLOGYAS A PERIOPERATIVE FACTOR OF EXTRACARDIAC SURGERY RISK

West Kazakhstan Marat Ospanov State Medical University, Department of Therapy Faculty of Postgraduate Education, Aktobe city

The article is regarded to the questions of the prevalence of cerebrovascular disease, options of its course andfeatures ofthe management of patientswith cerebrovasculardisease inthe perioperative period in notcardio-surgical operations.

Key words; cerebrovascularpathology, ischemic stroke, risk factor, perioperative risk.

Ж.Х. АРЗЫМБЕТОВА А.Т. АХМЕТОВА, К.Ж. НУРГАЛИЕВА

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ЛИСТЕРИОЗА

Актюбинская противочумная станция, г.Актобе

В последние десятилетия повсеместно отмечается рост заболеваемости листериозом, что связано как с истинным подъемом заболеваемости, так и с улучшением лабораторной диагностики. С целью повышения высеваемости бактерий применяется использование селективных сред и метод холодового обогащения. Схема выделения листерий в зависимости от контаминации и количества листерий в исследуемом материале включаетлибо непосредственный высев на селективный агар, либо обогащение материала на селективных бульонах.

Ключевые слова: лабораторная диагностика, листериоз.

Структура инфекционной патологии человека за последние десятилетия ХХ века претерпела существенную эволюцию, обусловленную какоткрытием целого ряда неизвестных ранее инфекционных агентов, так и изменением роли удельного веса хорошо известных ранее возбудителей. Ко второй группе в полной мере можно отнести и листериоз. Хотя упомянутые микроорганизмы давно известны эпидемиологам, бактериологам и инфекционистам, в последние годы заметно расширился удельный вес вызываемых ими инфекций, равно как и спектр их клинических проявлений. Этому способствовали, с одной стороны, существенный прогресс в области лабораторной и клинической диагностики, с другой, антропогенная трансформация внешней среды, повлиявшая на условия репродукции возбудителя, пути передачи инфекции и восприимчивость к ним групп риска человеческой популяции, прежде всего, с различными видами иммунодефицитов [1,2,3]. Несмотря на прогресс в лабораторной диагностике инфекционных болезней, проблема диагностики листериоза заслуживает пристального внимания и дальнейшего изучения. Нашей задачей явилось ознакомление широкого круга практических врачей, прежде всего, бактериологов и инфекционистов с современными методамидиагностики этой инфекции.

До начала 80-х годов выделение культур на питательных средах, окраска мазков из клинического материала в сочетании с серологическими методами диагностики являлись основными компонентами лабораторной диагностики листериоза. Однако рост числа спорадических случаев и эпидемиологических вспышекспособствовал выявлениюмногочисленныхуязвимыхместтрадиционнойдиагностики [4,5,6].

12 Батыс Казахстан медицина журналы №2 (30) 2011 ж. / ' '

__/ Медицинский журнал Западного Казахстана №2 (30) 2011 г.

Однако, как справедливо отмечают органы санитарно-эпидемиологического надзора стран СНГ, методы лабораторной диагностики листериоза за последние 30 лет практически не изменились, тогда как эпидемиологическаязначимость инфекции продолжает возрастать[8,9].

Тем не менее, серологические методы полностью сохраняют своё значение для выяснения эпизоотологической и эпидемиологической ситуации, так как результаты серологических исследований несут определённую информацию о контакте различных групп населения или групп риска с возбудителем, но не позволяют с высокой степенью точности диагностировать листериоз даже при применении нескольких серологических методов.

Основным методомдиагностики инфекционного процесса является бактериологическаядиагностика и идентификация возбудителя. За последние годы бактериологическая диагностика листериоза претерпела существенную эволюцию. Значительный прогресс в области методов обогащения исследуемого материала и конструирования питательных сред для выделения листерий позволяет сделать процедуру выделения и идентификации листерий доступной для широкого круга практических микробиологическихлабораторий.

При подозрении на листериоз исследованию подвергают, в первую очередь, кровь и ликвор при септической форме, менингитах и менигоэнцефалитах, меконий при заболеваниях новорожденных, околоплодную жидкость, плаценту, отделяемое родовых путей женщин, разрешившихся мёртвым плодом. При отягощённом акушерском анамнезе, патологическом течении беременности, воспалении яичников, шейки матки обследование на наличие листерий является обязательным компонентом расширенного исследованиягенитальноготракта.

При менее распространённыхклиническихформахлистериоза исследованиюподлежатсодержимое абсцесса, экссудат, отделяемое носоглотки. Биологический материал для микробиологического исследования листериоза следует брать в максимально стерильных условиях, тщательно соблюдая правила асептики и антисептики, по возможности избегая контаминации образцов с микроорганизмами из окружающей среды [10,11].

Для успешного выделения листерий из клинического материала, а также из продуктов питания существенное значение имеет процедура обогащения. За исключением спинномозговой жидкости клинический материал, а тем более продукты питания сильно контаминированы сопутствующей микрофлорой. На общем микробном фоне количество листерий в исследуемом материале может быть невелико, скорость роста листерий уступает многим условно патогенным бактериям, поэтому процедура обогащения, грамотное использование селективных факторов зачастую является необходимым условием выделения культурлистерий из исследуемого материала [11,12].

Еще в 40-е годы ХХ века для выделения листерий стали использовать процедуру холодового обогащения и добавления в средутелурита калия [13,14,15].

Метод холодового обогащения основан на присхрофильной природе листерий, их способности размножаться при низкихтемпературах. Методика предполагает, помимо обычного высева исследуемого образца на питательные среды, хранение части исследуемого материала в холодильнике при температуре + 4°С в течение 2 месяцев. Еженедельный посев хранящегося на холоде материала на стандартные питательные среды зачастую приводил к положительному результату при отрицательном результате первичного высева материала, подозрительного на наличиелистерий. Хотя инкубация при 4°С

„ , _I I „„ _______ ^^ Батыс Казахстан медицина журналы №2 (30) 2011 ж. 13

Медицинский журнал Западного Казахстана №2 (30) 2011 г. \ _____!_

ингибируетбольшуючастьпосторонней микрофлоры, скорость росталистерий в начале процедуры также снижается. Поэтому в настоящее время этот метод не находит широкого практического применения в лабораторнойдиагностике.

Поскольку метод холодового обогащения из-за необходимости длительной экспозиции неприменим в практике лабораторной диагностики, процедура обогащения включает заражение исследуемого материала с селективными агентами и инкубацию при 30°С в течение 24 часов с последующим высевом на селективный агар [4,15].

Телурит калия рекомендовали добавлять в различные питательные среды (мясо-пептонный агар, кровяной агар) для выделения листерий в качестве фактора, подавляющего рост многих грамотрицательных бактерий. В дальнейшем в качестве селективных агентов для выделения использовали широкий спектр химических соединений, солей металлов, антибиотиков и красителей. Наибольшее практическое значение из них получил хлорид лития, акрифлавин, налидиксовая кислота, циклогексимид, входящие в состав наиболее распространенных питательных сред и обогатительных бульонов [7].

В последнее время широкое распространение для диагностики и типирования получили методы, основанные на анализе ДНК. Это связано с их высокой специфичностью, а также относительной технической простотой идоступностью.

Сегодня наиболее распространенным и перспективным методом молекулярно-генетической диагностики является полимеразная цепная реакция (ПЦР). ПЦР основана на искусственном синтезе фрагмента ДНК, в качестве матрицы которого используется ДНК исследуемого микроорганизма. Метод очень чувствительный и специфичный. При исследовании клинического материала налистериоз в нашей лаборатории от 73 человек, при отрицательных серологических реакциях, в 40 % случаев методом ПЦР выявлен положительный результатнаданнуюинфекцию. Списоклитературы:

1. Инструкция по эпидемиологии, эпизоотологии, профилактике, клинике и лечению листериоза человека и животных. Приложение к Приказу МЗ РК №946/326 от 17 октября 2002.

3 . Карликанова Н . Р. , Куваева И . Б . ,Карликанова Н . С . Листериоз в молоке и молочных продуктах - Москва

4. Тартаковский И.С. Листерии: роль в инфекционной патологии человека и лабораторная диагностики // КМАХ-2000- Том2-№2-С. 1-15.

5. Карпова Т.И., Ермолаева С.А., Лопырев И.В. Новые методы диагностики идентификации Listeria monocytogenes/Жлиническая микробиология-2001 -№3-С. 266-273.

6 . КарповаТ. И . , Шустрова Н. М . , СнегирёваА. Е . Размножениелистерий в молочных продуктах//Журнал микробиологии - 2001 - №1- С. 80-81

10. Литвин В.Ю., Емельяненко Е.Н., Пушкарева В.И. Патогенные бактерии, общие для человека и растений: проблемы и факты //Журнал микробиологии -1996- №2-С. 101-104

11. Тартаковский И.С., Трофимова О.Д. Этиология и микробиологический контроль ВБИ //Справочник госпитальногоэпидемиолога.- М.-1999-19-29.

- Вып. 1 - частьП-М-2001 С. 92-94.

14. Бакулов И.А., Васильев Д.А. Листериоз как пищевая токсикоинфекция.// Вопросы диагностики и профилактики - Ульяновск-1991.-45c.

14 Батыс Казахстан медицина журналы №2 (30) 2011 ж. / ' '

__/ Медицинскии журнал Западного Казахстана №2 (30) 2011 г.

Ж.Х. АРЗЫМБЕТОВА, А.Т. АХМЕТОВА, К.Ж. НУРГАЛИЕВА ЛИСТЕРИОЗДЫН ЛАБОРАТОРИЯЛЬЩ ДИАГНОСТИКАСЫ

Актебе обага карсы станциясы, Актебе каласы

Соцгы он жылда жаппай листериозбен аурушачдылыктыч ecyi байкалады, ол аурушачдылыктыч шынайы кeтерiлуiмен катар, лабораториялыкдиагностиканычжаксаруымен де байланысты бактерияныч eсiмдiлiгiн жаксарту максатында селективтi ортаны жэне салкындатып каныктыру эдiсiн колдану усынылады. Листерияны бeлiп алу сулбесше, листерия санына жэне контаминациясына тэуелдi зерттеу материялында агарга себу немесе материалды селективтi сорпада каныктыру болады.

Нег'зг'! свздер: лабораториялык диагностика, листериоз.

ZH. H. ARZYMBETOVA, A.T. AXMETOVA, K.ZH. NURGALIYEVA LABORATORY DIAGNOSTIC OF LISTERIOSIS

Antipplague station ofAktobe, Aktobe city

During the last 10 years incidence oflisteriosis is permanentlyincreasing everywhere. There are 2 reasons of this fact - real growing of the incidence as well as the improvement of laboratory diagnostic. For increasing the quality of Listeria testing specialists recommend to use selective culture and method of cold inreaching. The scheme of Listerias' allocation depending on contamination and quantities of Listerias in an investigated material includes either direct seeding on a selective agar or enrichment of material on selective broths.

Keywords: laboratory diagnostic, listeriosis.

„ , _I I „„ _______ ^^ Батыс Казахстан медицина журналы №2 (30) 2011

Медицинскии журнал Западного Казахстана №2 (30) 2011 г. \ ___

Лабораторная диагностика листериоза (Литературный обзор)

Листериоз (Listeriosis) – антропозооноз, характеризующийся поражением центральной нервной системы, лихорадкой, абортами, развитием врожденных пороков плода, сепсисом и пневмонией у новорожденных [3]

Диагностика листериоза основывается на основании комплекса эпизоотологических данных и результатов лабораторного исследования. При этом наиболее важное значение имеет бактериологическое исследование - выделению культуры листерий. Серологические методы (в основном РА) применяются для определения эпизоотической ситуации в хозяйствах, где в результате комплексного исследования с выделением культуры возбудителя, был обнаружен листериоз [1]

В лабораторию направляются целые трупы мелких животных. От крупных животных направляется голова, часть печени, почки, селезенка и пораженные участки легких. При наличии абортированных плодов – отправляют их вместе с околоплодными оболочками.

Прижизненно направляются истечения из влагалища абортировавших самок, при наличии воспалений молочной железы – молоко из пораженных долей. Так же направляется сыворотка крови.

Материал в консервированном (в 30 %-ном водном растворе глицерина) виде упаковывают в полиэтиленовые пакеты, помещают в контейнер, опечатывают и вместе с сопроводительным документом и нарочным направляют в лабораторию. В сопроводительном документе отмечаются наименование и адрес отправителя, опись проб, эпизоотологические (эпидемиологические) данные [2].

Бактериологическая диагностика при листериозе представляет собой комплекс, состоящий из микроскопического исследования, посевов на питательные среды, идентификацию полученных культур, а также постановку биопробы на лабораторных животных [1].

Микроскопическое исследование. Микроскопическому исследованию подвергают мазки-отпечатки из головного мозга, внутренних органов и тканей. Мазки окрашивают по Граму. Возбудитель листериоза - Listeria monocytogenes – обнаруживается в мазках как грамположительная подвижная неспорообразующая полиморфная, чаще палочковидная бактерия длиной 0,5 - 2,0 мкм.

Так же рекомендуется воспользоваться методами окраски флюоресцирующих антител (прямой метод и непрямой). При визуализации возбудителя с характерной морфологией и свечением с интенсивностью не ниже чем на три креста, ставят положительный результат [2, 3].

Посевы на питательные среды. Из патологического материала готовят суспензию на физиологическом растворе (1:5) и производят посевы. Используют обычные среды с добавлением 1 % глюкозы и 23 % глицерина, печеночный агар и бульон (pH среды 7,2 - 7,4). Посевы инкубируют в термостате при 37° с контролем в первые 3 - 4 дня. При отсутствии роста наблюдение за посевами проводят в течение двух недель.

Весьма характерным для колоний листериоза является легкое помутнение бульона и появление небольших росинчатых колоний на агаре, наличие бета-гемолиза на кровяном агаре. Колонии листерий в проходящем свете имеют мелкозернистую структуру и голубую окраску с зеленоватым оттенком.

Из выделенной культуры делают мазки, окрашивая их по Граму, а также для люминесцентной микроскопии с применением прямого и непрямого метода флюоресцирующих антител. Подвижность определяется методом раздавленной капли. Листерии крайне подвижны.

Ферментативные свойства определяются пересеванием чистой культуры на пестрый ряд - при 37 °C в течение 10 дней. Листерии разлагают глюкозу, мальтозу, трегалозу, салицин с образованием кислоты, без газа. Но не разлагают дульцит, инулин, раффинозу, манит [2].

Биопроба. Биопробу производят на 2 - 3 белых мышах (масса 14 - 16 г). Заражение проводят внутрибрюшинно, подкожно суспензией или культурой в дозе 0,3 - 0,5 мл. При положительной биопробе животные погибают через 2 - 6 суток после заражения. При вскрытии отмечают множественные некротические очажки в печени, селезенке, почках. При наблюдении более 10 дней рекомендуется дополнительно делать посев из головного мозга. Очень чувствительны к подкожному заражению 5 - 6-дневные мыши-сосуны, которые гибнут через 18 - 36 часов [2].

Из внутренних органов (печень, селезенка, почки, сердце) павших животных делают мазки-отпечатки и высевы на питательные среды [3].

Серологическая диагностика. Поливалентная листериозная агглютинирующая сыворотка представляет собой смесь кроличьих листериозных агглютинирующих сывороток и содержит факторы Н-АВ и 0 - II, V, VI, VII, IX. Поливалентная сыворотка в капельной реакции агглютинации на стекле агглютинирует все известные серовары листерий.

Реакцию агглютинации ставят на чистых обезжиренных предметных стеклах. На предметное стекло наносят две капли: каплю поливалентной сыворотки и каплю физиологического раствора. К обеим каплям на стекле добавляют по одной капле смыва культуры, смесь тщательно и быстро перемешивают бактериологической петлей или запаянным концом пастеровской пипетки, после чего стекла плавно покачивают круговыми движениями. Одновременно для контроля один раз в день исследуют на стекле каплю сыворотки с добавлением капли физиологического раствора.

Учет результатов РА проводят в течение 3-х минут. Реакция считается положительной при появлении четкой агглютинации (образование хлопьев) в капле с сывороткой при ее отсутствии в контроле. Запоздалые реакции не учитывают [1, 2].

В результате проведения комплексной лабораторной диагностики диагноз на листериоз считается установленным при обнаружении листерий в патматериале иммунофлюоресцентным методом, а также при выделении грамположительной полиморфной подвижной палочки, образующей каталазу и разлагающей с образованием кислоты глюкозу, мальтозу, трегалозу и салицин; дающей положительную РА с листериозной сывороткой; обладающей патогенностью для лабораторных животных (вирулентные штаммы) [3].

Список использованных источников

Методические рекомендации по лабораторной диагностике листериоза животных и людей от 13 февраля 1987 г. // утв. Министерством здравоохранения СССР и Госагропромом СССР – 1987. – 15с.

докторант 1 курса КазНАУ,