Исследование отделяемого мочеполовых путей на трихомонады

Статья посвящена диагностике и терапии урогенитального трихомониаза. Выделены основные преимущества и недостатки каждого метода. Отмечена необходимость проведения расширенного диагностического маршрута и лабораторного обследования на всех этапах инфекцион

Одно из первых мест в структуре инфекций, передающихся половым путем, во всех странах мира занимает урогенитальный трихомониаз (УГТ). По данным ВОЗ ежегодно в мире регистрируется более 333 млн новых случаев инфекций, передающихся половым путем, из них на мочеполовой трихомониаз приходится более 170 млн случаев [1, 2]. В Российской Федерации заболеваемость УГТ в последние годы составляет около 200 случаев на 100 тыс. населения [3, 4]. Среди женщин, обратившихся к врачу по поводу выделений из влагалища, УГТ диагностируют по данным различных авторов в 18–50%, а иногда и 80% случаев, у мужчин с негонококковыми уретритами трихомонадные поражения составляют до 20–34,8% [2, 5–7].

Возбудителем урогенитального трихомониаза является простейший одноклеточный микроорганизм — Trichomonas vaginalis, которая в процессе эволюции приспособилась паразитировать в органах мочеполовой системы человека [8].

Характерными клиническими характеристиками для УГТ являются: полиморфизм, многоочаговость поражения, нередко хроническое течение с рецидивами, возможность транзиторного и асимптомного носительства. Малосимптомные, хронические, вялотекущие формы заболевания, а также трихомонадоносительство, которое составляет 10–35% среди женщин и 2–41% среди мужчин, имеют большое значение в эпидемиологическом плане, способствуя распространению возбудителя среди половых партнеров [7]. Вследствие возможного развития осложнений воспалительного характера УГТ представляет серьезную угрозу репродуктивному здоровью человека [9]. Трихомониаз рассматривается фактором риска заражения ИППП, в том числе ВИЧ-инфицирования. Ряд исследователей отмечают, что инфицирование T. vaginalis, особенно длительно существующая, персистирующая трихомонадная инфекция, может быть фактором риска развития рака шейки матки [10].

Диагностика УГТ основывается на выявлении клинических признаков заболевания и обнаружении T. vaginalis в исследуемом материале.

Таким образом, поскольку симптомы трихомониаза, как и большинства других ИППП, непатогномоничны и не являются надежными критериями, в обязательном порядке с целью диагностики трихомонадной инфекции необходимо применение лабораторных методов исследования.

В России основными методами, используемыми для выявления трихомонад в биологическом материале, долгое время оставались только микроскопия нативного, окрашенного препаратов и культуральное исследование.

Микроскопия нативного препарата — это определение трихомонад в нативном препарате (метод исследования неокрашенного свежего препарата впервые предложен Донне в 1836 г.), который готовят путем смешивания исследуемого материала с каплей теплого изотонического раствора хлорида натрия (лучше раствора Рингера–Локка), затем накрывают покровным стеклом и микроскопируют при увеличении объектива 40 и окуляра 7 или 10. Для исследования берется отделяемое уретры, цервикального канала, влагалища, центрифугат мочи, эякулят, секрет предстательной железы и др. При изучении нативного препарата особое внимание обращается на размеры и форму трихомонад, характер их движения, внутреннее содержимое клеток. Необходимо найти овальное или грушевидное тело, чуть больше лейкоцита (размеры в среднем от 13 до 17 мкм), имеющее жгутики и совершающее характерные толчко­образные поступательные движения. Иногда можно заметить движение свободных жгутиков. Цитоплазма трихомонад обычно зернистая, чаще вакуолизирована. Ядра плохо различимы или чаще вообще не обнаруживаются. Более четко видеть движения и структуру трихомонад позволяет фазово-контрастная микроскопия (с окраской нативного препарата 0,01% раствором сафранина). Однако оценка жизнеспособных, но неподвижных, атипичных форм (без жгутиков, ундулирующей мембраны, атипично делящихся (почкующихся) клеток) методом микроскопии нативного препарата крайне проблематична. В целом чувствительность этого метода варьирует в широких пределах и зависит, прежде всего, от формы заболевания, локализации трихомонад, а также от квалификации персонала, проводящего исследование. Необходимо помнить, что при отсутствии типичных форм трихомонад диагноз трихомониаза может считаться лишь предположительным и должен подтверждаться другими методами.

Микроскопия окрашенных препаратов несколько повышает процент выявления трихомонад по сравнению с нативными препаратами, так как при этом учитываются все, а не только подвижные особи. Кроме того, окрашенные препараты можно использовать для оценки воспалительного процесса (на наличие воспалительного процесса косвенно указывают скопление лейкоцитов на клетках плоского эпителия или вокруг них, большое количество слизи в мазках и др.), выявления гонореи, мицелия грибов, микрофлоры: кокков, палочек и т. д. Методика включает в себя поиск известной формы трихомонады с правильно очерченным, эксцентрично расположенным ядром на фоне нежно-ячеистой структуры цитоплазмы. Для выявления жгутиков и ундулирующей мембраны препарат следует изучать методами окраски по Романовскому–Гимзе, Лейшману.

Однако в течение последних десятилетий у больных УГТ все чаще стали определяться атипичные, амастиготные (метаболически малоактивные особи паразита, лишенные органоидов движения — блефаропласта, жгутиков и ундулирующей мембраны) формы влагалищных трихомонад, что значительно усложнило диагностику инфекции, так как морфология и подвижность — основные критерии выявления простейших.

Необходимо отметить, что эффективность микроскопического метода исследования в целом недостаточная. Относительно других методов лабораторной диагностики, являясь определенно экономически наиболее целесообразным, он имеет низкую чувствительность — от 50% до 64,9% (для культурального — 73–89,2%; для метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) — 93–98,7%) [8, 11, 12]. Интерпретация результата субъективная и во многом зависит от опыта специалиста, качества мазка и соблюдения условий забора материала. Ошибки при проведении микроскопических исследований, прежде всего, обусловлены:

• потерей влагалищными трихомонадами характерной подвижности после того, как они извлечены из среды человеческого организма;
• принятием эпителиальных клеток, макрофагов и других клеточных элементов за трихомонады;
• существованием различных форм трихомонад (округлые, безжгутиковые (амастиготные) формы, со сниженной метаболической активностью — разночтения при оценке результатов);
• низкотитражными препаратами (концентрация трихомонад ниже 10 5 КОЕ/мл с помощью микроскопии уже не определяется [8]) или препаратами, содержащими огромное количество клеток эпителия, лейкоцитов и различного деструктивного материала из очага поражения;
• нередкой потерей типичных морфологических признаков во время фиксации и окрашивания, что создает трудности для этиологической идентификации.

Отмечается снижение чувствительности микроскопического метода при бессимптомных формах заболевания, а также при исследовании недостаточного количества полей зрения [8].

Вместе с этим следует особо подчеркнуть нередкость и ложноположительных результатов микроскопического исследования, которые обусловлены чаще всего принятием за трихомонады эпителиальных клеток или других клеточных элементов. Однако необходимо помнить, что диагноз урогенитального трихомониаза, как и других заболеваний, обусловленных ИППП, ведет за собой целый ряд не только медицинских, но и этических проблем, и ценой диагностической ошибки могут стать недоверие и ухудшение взаимоотношений в супружеской паре, развод, суицидальные последствия и т. п. Поэтому необходимо быть крайне требовательными к верификации диагноза и при малейших сомнениях подтверждать более чувствительными методами исследования.

Несмотря на все недостатки микроскопического метода, он, благодаря относительно низкой стоимости и быстроте исполнения, остается в нашей стране преобладающим в диагностике урогенитального трихомониаза [8].

Культуральные исследования хоть и повышают эффективность диагностики урогенитального трихомониаза в сравнении с микроскопическими методами, однако существенно уступают методам амплификации нуклеиновых кислот. Вместе с тем существенным недостатком культуральной диагностики трихомониаза является и ее длительность: регламентированная процедура предусматривает культивирование до 17 дней с изучением культуры для идентификации простейших на 3–5 день, при отрицательных результатах на 7–9, 11–17 дни после посева.

Следует отметить, что существующие другие методы лабораторных исследований, в том числе прямую иммунофлюоресценцию (ПИФ) и иммуноферментный анализ (ИФА) для обнаружения антител T. vaginalis, на сегодняшний день не рекомендуется использовать для диагностики трихомонадной инфекции в связи с тем, что существующие наборы не обладают достаточной чувствительностью, позволяющей осуществлять качественную диагностику трихомониаза [8, 17].

К сожалению, ни один из имеющихся на сегодняшний день диагностических тестов не является в 100% случаев совершенным. Главной задачей современной диагностики любой ИППП и, в частности, урогенитального трихомониаза, с целью раннего и достоверного диагноза, является индивидуальный подход к конкретному пациенту с определением роли и места каждого метода и их комплексного применения при выявлении возбудителя.

При выборе диагностического метода необходимо учитывать также половые и возрастные особенности. У мужчин трихомонады обнаружить значительно труднее, чем у женщин, что связано, прежде всего, с тем, что T. vaginalis в отделяемом уретры часто находятся в малоподвижной форме, имеются в небольшом количестве. Поэтому для более достоверных данных обследования у мужчин нельзя ограничиваться анализом только уретрального отделяемого, надо исследовать также осадок свежевыпущенной мочи, секрет предстательной железы, сперму; необходимо проведение множественных лабораторных исследований с использованием различных методов и их комбинаций. У девочек (до наступления менархе) диагноз урогенитального трихомониаза устанавливается на основании микроскопического и/или культурального исследования, подтвержденного молекулярно-биологическим методом.

Необходимо отметить, что лабораторные обследования, как наиболее объективные, с помощью которых устанавливается достоверный диагноз и назначается адекватная терапия, надо проводить на всех этапах инфекционного процесса (первичное обследование, оценка динамики течения воспалительного процесса, определения эффективности лечения).

Особое внимание необходимо уделить также важному этапу обследования — топической диагностике, которая осуществляется с помощью не только тщательного осмотра, но и с применением инструментальных методов (кольпоскопии, трансвагинального ультразвукового исследования (УЗИ) у женщин, трансректального УЗИ у мужчин).

Показанием к проведению лечения является обнаружение T. vaginalis при микроскопическом и/или культуральном исследованиях и/или исследовании молекулярно-биологическими методами у пациента либо у его полового партнера. Одновременное лечение половых партнеров является обязательным.

Целями лечения являются эрадикация T. vaginalis, клиническое выздоровление, предотвращение развития осложнений и предупреждение инфицирования других лиц.

Во избежание развития тяжелых побочных реакций (дисульфирамоподобная реакция) пациентов следует предупреждать о необходимости избегать приема алкоголя и содержащих его продуктов как в ходе терапии метронидазолом и тинидазолом, так и в течение 24 часов после его окончания. При непереносимости перорального метронидазола его интравагинальное назначение также противопоказано.

При лечении трихомониаза рекомендуется применять метронидазол, орнидазол или тинидазол 500 мг внутрь 2 раза в сутки в течение 5 дней.

При лечении осложненного, рецидивирующего трихомониаза и трихомониаза других локализаций метронидазол применяют 500 мг внутрь 3 раза в сутки в течение 7 дней или 2,0 г внутрь 1 раз в сутки в течение 5 дней; орнидазол 500 мг внутрь 2 раза в сутки в течение 10 дней; тинидазол 2,0 г внутрь 1 раз в сутки в течение 3 дней.

При лечении осложненных форм урогенитального трихомониаза возможно одновременное применение местнодействующих протистоцидных препаратов, таких как вагинальная таблетка метронидазола 500 мг 1 раз в сутки в течение 6 дней, гель метронидазола 0,75% 5 г интравагинально 1 раз в сутки в течение 5 дней.

Лечение беременных осуществляется на любом сроке для предотвращения преждевременного разрыва плодных оболочек, преждевременных родов и низкой массы плода: метронидазол 2,0 г однократно.

При лечении детей используют метронидазол 10 мг/кг массы тела внутрь 3 раза в сутки в течение 5 дней или орнидазол 25 мг/кг массы тела 1 раз в сутки в течение 5 дней.

Требования к результатам лечения включают эрадикацию T. vaginalis, клиническое выздоровление. Установление излеченности трихомонадной инфекции на основании микроскопического, культурального метода исследования и методов амплификации РНК (NASBA) проводится через 14 дней после окончания лечения, на основании методов амплификации ДНК (ПЦР, ПЦР в реальном времени) — не ранее чем через месяц после окончания лечения. При отрицательных результатах обследования пациенты дальнейшему наблюдению не подлежат. При отсутствии эффекта от лечения исключают реинфекцию, назначают иные препараты или курсовые методики лечения [18].

В заключение хотелось бы еще раз отметить, что в связи с отсутствием четко специфических симптоматических проявлений клиническая дифференцировка урогенитального трихомониаза достаточно затруднительна и неточна без лабораторной диагностики, результативность которой, особенно для бессимптомных, хронических форм заболевания, будет во многом зависеть от выбранного метода. Полноценное обследование больных с расширением спектра диагностических и параклинических технологий позволит повысить качество диагностической помощи, что в последующем, несомненно, поможет в выборе оптимального объема, содержания и этапности лечебных технологий.

Литература

Е. И. Юнусова 1 , кандидат медицинских наук
Л. А. Юсупова, доктор медицинских наук, профессор
З. Ш. Гараева, кандидат медицинских наук
Г. И. Мавлютова, кандидат медицинских наук

ГБОУ ДПО КГМА МЗ РФ, Казань

Это исследование, называемое также "мазок на флору", позволяет определить состав микрофлоры мочеполовых органов женщины (уретры, влагалища и цервикального канала), количество лейкоцитов, эпителия и их соотношение, количество слизи и морфологический тип бактерий, а также выявить ряд специфических возбудителей, таких как грибы рода Candida, трихомонады и гонококки.

Исследование на микробиоценоз влагалища с микроскопией, урогенитальный мазок на микрофлору.

Синонимы английские

Gram's Stain. Bacterioscopic examination of smears (vaginal, cervical, urethral).

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Мазок из половых путей женщины.

Как правильно подготовиться к исследованию?

Женщинам рекомендуется сдавать анализ до менструации или через 2-3 дня после ее окончания.

Общая информация об исследовании

В состав нормальной микрофлоры мочеполовых органов женщины входит около 40 видов бактерий. Доминирующими микроорганизмами у женщин репродуктивного возраста являются молочнокислые бактерии (лактобактерии), которые составляют 95-98 % всей микрофлоры влагалища. За счет продукции перекиси водорода и молочной кислоты лактобактерии подавляют размножение патогенных микроорганизмов и создают кислую реакцию среды (pH = 3,8-4,5). Остальная часть нормальной микрофлоры представлена стафилококками, коринебактериями, клебсиеллами, кишечной палочкой, гарднереллами и анаэробами (бактероидами, превотеллами, микрококками, вибрионами рода Mobilincus, энтерококками, пептококками, пептострептококками, вейлонеллами, клостридиями, эубактериями, кампилобактером, фузобактериями и др.). В небольшом количестве могут встречаться дрожжеподобные грибы рода Candida. Если лактобацилл становится меньше, нарушается баланс микрофлоры и увеличивается количество условно-патогенных микроорганизмов (стрептококков, стафилококков, кишечной палочки и т. д.), что может приводить к дисбиозу. Дисбиоз влагалища грозит воспалением матки и ее придатков, бесплодием, внематочной беременностью, выкидышем, рождением недоношенного ребенка. К его развитию приводит несоблюдение правил личной гигиены, гормональные нарушения (недостаток эстрогенов), нарушение обмена веществ, прием антибиотиков широкого спектра действия.

Микроскопическое исследование мазка у женщин позволяет полуколичественно оценить общую микробную обсемененность, состояние эпителия влагалища, наличие и выраженность воспаления (по лейкоцитарной реакции), состав микрофлоры, а также выявить молочницу, трихомониаз и гонорею. Этот метод является "золотым стандартом" для диагностики бактериального вагиноза (чувствительность – 100 %). Норма мазка на флору определяется следующими показателями:

• должен присутствовать плоский эпителий, его отсутствие может быть связано с атрофией эпителиальных клеток, с недостатком эстрогенов или избытком мужских половых гормонов,
• количество лейкоцитов не должно превышать 15 в поле зрения, его увеличение указывает на воспалительный процесс,
• слизь,
• палочки (бациллы) в мазке составляют нормальную микрофлору влагалища,
• кокки и диплококки – выявление грамотрицательных диплококков в мазке свидетельствует о гонорее,
• "ключевые", или атипичные, клетки характерны для дисбактериоза влагалища,
• споры или мицелий грибов свидетельствует о кандидозе (молочнице),
• наличие подвижных бактерий в нативном мазке (трихомонад) характерно для трихомониаза,
• ­эритроциты выявляются при кровотечениях из матки, эрозиях или новообразованиях.

Для чего используется исследование?

• Чтобы оценить состав микрофлоры мочеполовой системы.
• Для диагностики бактериального вагиноза.
• Для выявления некоторых специфических инфекций, передающихся половым путем (кандидоза, трихомониаза, гонореи).

Когда назначается исследование?

• При симптомах дисбиоза или воспалительных заболеваний органов мочеполовой системы.
• При профилактических осмотрах.

Что означают результаты?

Референсные значения для различных видов микроорганизмов зависят от их локализации (точки взятия биологического материала).

На основании микроскопической картины выделяют 4 типа микробиоценоза влагалища.

Тип микробиоценоза

Общая информация об исследовании

Доминирование лактобацилл, отсутствие грамотрицательной микрофлоры, спор, мицелия и псевдогифов, наличие единичных лейкоцитов и "чистых" эпителиальных клеток. Такой тип мазка у женщин является вариантом нормы.

Умеренное или сниженное количество лактобацилл, наличие грамположительных кокков и грамотрицательных палочек, лейкоцитов, моноцитов, макрофагов, эпителиальных клеток. Этот тип мазка на флору часто наблюдается у здоровых женщин и редко сопровождается явными симптомами.

Незначительное количество или полное отсутствие лактобацилл, обильная полиморфная грамотрицательная и грамположительная палочковая и кокковая микрофлора, наличие "ключевых" клеток, вариабельное количество лейкоцитов, отсутствие или незавершенность фагоцитоза. Вместе с этим часто обнаруживаются гарднереллы, микоплазмы, уреаплазмы, вибрионы рода Mobiluncus, анаэробные кокки.

Полимикробная картина мазка с большим количеством лейкоцитов, макрофагов, эпителиальных клеток, с выраженным фагоцитозом и практически полным отсутствием лактобацилл. При обнаружении возбудителей специфических инфекций (гонококков, трихомонад, псевдогифов споры) можно предполагать наличие гонореи, трихомониаза или кандидозного вагинита.

Что может влиять на результат?

Местное применение антисептиков, антибактериальных, противогрибковых и противозачаточных препаратов.

• Микроскопия отделяемого мочеполовых органов (урогенитального мазка) является "ориентировочным" исследованием. Для точной идентификации возбудителя и определения его чувствительности к антимикробным препаратам выполняют бактериологическое исследование – посев материала с определением чувствительности к антибиотикам.
• В урогенитальном мазке не определяются вирусы, хламидии, микоплазмы и уреаплазмы, поэтому для диагностики инфекций, вызываемых этими микроорганизмами, используют другие методы – полимеразную цепную реакцию или иммуноферментный анализ.

Принципы лабораторной диагностики мочеполового трихомониаза

1. Лабораторные методы исследований

Материалом для паразитологических исследований у женщин служит отделяемое из цервикального канала, смыв из влагалища и осадок мочи; у мужчин — отделяемое из уретры, центрифугат свежевыпущенной мочи, секрет предстательной железы и эякулят.

Накануне обследования женщинам в течение суток не рекомендуется делать спринцеваний. Материал для анализа берется у них со слизистой заднего свода влагалища. В некоторых случаях исследуется отделяемое из цервикального канала.

Мужчинам перед обследованием предлагается в течение 3-4 ч воздерживаться от мочеиспусканий. Материал из уретры у них забирается с глубины 5-7 см специальным зондом или ложкой Фолькмана. Исследуется также секрет предстательной железы и эякулят. Если речь идет о хронической трихомонаднои инвазии, накануне исследования рекомендуется сделать провокацию гоновакциной, пирогеналом или неспецифическую (алкогольную).

1.1. Диагностика мочеполового трихомониаза

Диагностика мочеполового трихомониаза проводится путем микроскопии нативных препаратов, а также мазков, окрашенных метиленовым синим, по Романовскому-Гимзе и по модифицированному способу Грама. Для обнаружения трихомонад в нативных препаратах исследуется эякулят, секрет предстательной железы и осадок мочи у мужчин и смыв из влагалища у женщин.

Исследование нативных препаратов

Нативные препараты готовятся и исследуются сразу же после взятия материала. Если это невозможно, материал помещается в питательную среду, обеспечивающую кратковременное сохранение трихомонад, из расчета 1 мл исследуемого материала на 5 мл среды. Материал должен быть доставлен в лабораторию в теплом виде, сроки доставки материала не должны превышать 2 часов.

Для приготовления препарата на предметное стекло наносится капля теплого изотонического раствора хлорида натрия или раствора Рингера-Локка, с которой смешивается исследуемый материал. Взвесь накрывается покровным стеклом и микроскопируется при увеличении объектива 40 и окуляра 7 или 10.

При изучении нативного препарата особое внимание обращается на размеры и форму трихомонад, характер их движения, внутреннее содержимое клеток. В типичных случаях трихомонады обнаруживаются в виде подвижных образований грушевидной, реже овальной формы, размером в среднем от 13 до 17мкм. Характер их движений толчкообразный. Иногда удается заметить движение свободных жгутиков. Ядра трихомонад чаще не обнаруживаются или плохо различимы. Цитоплазма трихомонад обычно зернистая, чаще вакуолизирована.

Размеры лейкоцитов, имеющих округлую, реже овальную форму, как правило, не превышают 10 мкм. Цитоплазма лейкоцитов прозрачна, зернистость обычно не отмечается или слабо выражена. Сегментоядерные нейтрофилы обычно содержат хорошо различимое сегментированное ядро.

Голые ядра эпителиоцитов отличаются от трихомонад относительно толстой оболочкой (кариолеммой) и иным характером зернистости (отдельные глыбки хроматина). В клетках молодого эпителия, даже если они по размерам соответствуют трихомонадам и обладают зернистостью, всегда прослеживается четко различимое округлое или овальное ядро.

В некоторых случаях обнаруживаются амебоидные формы Т. vaginalis, длина тела которых достигала 30 мкм, а также атипично делящиеся (почкующиеся) клетки. Основными дифференциально-диагностическими критериями, отличающими атипичных трихомонад от клеток эпителия и лейкоцитов, служат наличие в цитоплазме этих простейших выраженной зернистости и вакуолей, а также отсутствие хорошо различимого ядра. Кроме того, они значительно крупнее, чем наиболее часто встречающиеся форменные элементы — сегментоядерные нейтрофилы. По размеру такие трихомонады могут быть сопоставимы с моноцитами, которые, в отличие от них, имеют четко выраженное ядро и никогда не встречаются в значительных концентрациях (несколько клеток в каждом поле зрения). При отсутствии типичных форм клеток трихомонад диагноз трихомониаза может считаться лишь предположительным и должен подтверждаться другими методами.

Окраска метиленовым синим

Готовится 1% водный раствор метиленового синего. Высушенный на воздухе мазок фиксируется в течение 3 мин 96% этиловым спиртом, высушивается, после чего на него наносили на 1 мин раствор метиленового синего. Оставшийся краситель осторожно смывается слабой струей холодной воды и мазок высушивается.

Трихомонады в препарате имеют округлую или овальную форму, с интенсивно окрашенными в синий цвет ядрами; цитоплазма клеток светло-синяя, с нежной сетчатой структурой, вакуоли — бесцветны.

Окраска по Романовскому-Гимзе

Высушенный на воздухе мазок фиксируется смесью Никифорова (абсолютный этиловый спирт и эфир в соотношении 1:1). Раствор краски Романовского (азур-эозин) перед употреблением разводится дистиллированной водой в соотношении 0,3 мл на 10 мл воды и пипеткой наносится на горизонтально расположенные препараты на 30-40 минут. Затем они быстро промываются водой и высушиваются.

В окрашенных препаратах трихомонады имеют эксцентрично расположенное овальное пурпурно-фиолетовое ядро. Цитоплазма клеток окрашивается в светло-синий цвет, вакуоли остаются бесцветными, оболочка клеток четко заметна.

Окраска по модифицированному способу Грама

Для окраски используются следующие реактивы:

1. 1% раствор генцианвиолета (1 г генцианвиолета растворяется в 100 мл кипящей дистиллированной воды, полученный раствор пропускается в горячем виде через бумажный фильтр).
2. Водный раствор Люголя (2 г калия йодида растворяется в 300 мл дистиллированной воды, к полученному раствору добавляется 1 г чистого йода, после чего раствор фильтруется через бумажный фильтр).
3. 3,96% этиловый спирт.
4. 1% водный раствор нейтрального красного (1 г нейтрального красного растворяется в 100 мл дистиллированной воды и пропускается через бумажный фильтр).

Препарат накрывается полоской фильтровальной бумаги и заливается раствором генцианвиолета на 1-2 мин, после чего бумага снимается, препарат осторожно промывается водопроводной водой и на несколько секунд заливается раствором Люголя (до почернения мазка). Остаток раствора смывается, препарат обесцвечивается в 96% этиловом спирте до тех пор, пока с тонких участков препарата перестают стекать фиолетовые струйки. После смывания спирта водой препарат сразу же докрашивается в течение 3 мин раствором нейтрального красного, затем тщательно промывается и высушивается.

При микроскопии окрашенных мазков ядра клеток Т. vaginalis окрашиваются в фиолетовый цвет, цитоплазма — в красно-оранжевый цвет разной интенсивности. Метод окраски по Граму позволяет также диагностировать гонорею. В некоторых случаях для подтверждения диагноза трихомониаза используется ПЦР и культуральный метод.

Культуральный метод

Нами Т. vaginalis выращивается на питательной среде СДС-199 М (Захаркив Ю. Ф. и др., 1998), которая имеет следующий состав:

1. 100 мл солевого раствора (натрия хлорида 6,5 г, калия хлорида 0,14 г, кальция хлорида 0,12 г, натрия бикарбоната 0,2 г, 0,5 мл 0,2% раствора метиленового синего, дистиллированной воды до 1 л);
2. 20 мл среды 199;
3. 450 мг солянокислого цистеина;
4. 30 мл сыворотки крови эмбрионов телят (без консерванта);
5. 10 мл 20% раствора мальтозы;
6. тиамина хлорида 5% и пиридоксина гидрохлорида 5% по 0,25 мл и аскорбиновой кислоты 5% — 0,5 мл на 100 мл среды;
7. ампициллина натриевой соли 125 000 ЕД и гентамицина 40 000 ЕД на 100 мл среды.

Солевой раствор автоклавируется при 120°С в течение 30 минут, остальные ингредиенты добавляются стерильно после охлаждения среды. Антибиотики и витамины добавляются в питательную среду непосредственно перед использованием. Среда должна быть светло-зеленого цвета, прозрачной; показатель рН среды должен составлять 5,5-6,0.

Питательная среда объемом 4,5 мл помещается в стерильные пробирки и заливается слоем стерильного вазелинового масла толщиной 5 мм для создания анаэробных условий культивирования трихомонад. Посев производится пастеровской пипеткой путем помещения 0,5-1,0 мл исследуемого материала на дно пробирок.

Микроскопическое исследование производится через 48 и 96 часов после посева. При положительных результатах трихомонады дают придонный рост в виде плотного беловатого осадка, из которого пастеровской пипеткой берется материал для микроскопического исследования.

2. Определение чувствительности Trichomonas vaginalis к метронидазолу

В 1962 году S. Squires and J. A. Fadzean для определения чувствительности Т. vaginalis предложили метод серийных разведений метронидазола в жидкой питательной среде в анаэробных условиях. В качестве критерия оценки чувствительности они использовали минимальную ингибирующую концентрацию (MIC), под которой понимали наименьшую концентрацию препарата, вызывающую иммобилизацию у 100% клеток трихомонад. С помощью указанной методики авторам удалось показать, что все изученные ими штаммы Т. vaginalis, выделенные от больных трихомониазом, были чувствительны к метронидазолу в диапазоне концентраций препарата от 0,25 до 1 мкг/мл.

В 90-х гг. появились работы, свидетельствующие о возникновении и распространении штаммов Т. vaginalis, устойчивых к значительно более высоким концентрациям метронидазола: 50 мкг/мл (Borchardt К. А. et al, 1995), 32 мкг/мл (Debbia E. A. et al., 1996) и даже 250 мкг/мл (Таги Meri I. Т. et al., 1999). Тогда же было обосновано положение о том, что чувствительными к действию метронидазола в анаэробных условиях штаммами Т. vaginalis следует считать лишь те, для которых паразитоцидный эффект препарата наблюдается в концентрации более чем 15 мкг/мл (Muller M. et al., 1986, 1988; Тага Meri I. Т. et al., 1999). Процент резистентных к метронидазолу штаммов Т. vaginalis, выделенных в эти годы от больных трихомониазом, колебался от 5% (Narcisi Е. М., Secor W. Е., 1996) до 20% (Du Bouchet L. et al., 1997).

2.1. Определение чувствительности Trichomonas vaginalis к антипротозойным препаратам in vitro при использовании критерия иммобилизации трихомонад

Чувствительность штаммов Т. vaginalis к метронидазолу определяется с помощью метода серийных разведений препарата в питательной среде СДС-199 М. При использовании критерия оценки чувствительности штаммы Т. vaginalis, используемые для исследования, должны содержать не менее 90% подвижных клеток.

Среда заливается по 4,0 мл в стерильные пробирки, затем в них вносится 0,5 мл раствора, содержащего разные концентрации метронидазола (или другого антипротозойного препарата): от 0,25 до 1000 мкг/мл (1 мг/мл).

После этого в пробирки вносится 0,5 мл культуры возбудителя с заранее определенной концентрацией клеток (кл./мл). Контролем служит среда без препарата. Затем для создания анаэробных условий, необходимых для культивирования Т. vaginalis, в пробирки со средой вносится вазелиновое масло (толщина слоя — 0,5 мм). Пробирки с исследуемым материалом инкубируются в термостате при t = 37°С. Учет результатов производится через 48 и 96 часов после посева.

Чувствительность трихомонад к метронидазолу оценивается путем определения минимальной ингибирующей концентрации (MIC), вызывающей иммобилизацию всех клеток Т. vaginalis. К лекарственно-устойчивым относятся штаммы, у которых иммобилизация обнаруживается при концентрациях метронидазола (или другого антипротозойного препарата), превышающих 15 мкг/мл.

2.2. Определение чувствительности Trichomonas vaginalis к антипротозойным средствам in vitro при использовании критерия лизиса трихомонад при терапевтически эффективных концентрациях препаратов

В связи с широким распространением штаммов Т. vaginalis, устойчивых к метронидазолу, особенно среди больных хроническим мочеполовым трихомониазом, а также высокой частотой встречаемости амастиготных клеток, мы предлагаем оценивать чувствительность трихомонад к широкому спектру антипротозойных препаратов (производным 5-нитроимидазола пролонгированного типа действия (тинидазол, ниморазол, орнидазол и секнидазол), 4-аминохинолина (хлорохин, син. делагил) и нитрофурана (нифуратель, син. макмирор)) на основе оценки лизиса клеток трихомонад.

К высокоустойчивым (RIII) относятся штаммы, концентрация клеток которых в опытных пробирках с антипротозойным препаратом составляла не менее 50% по сравнению с контролем; к умеренно устойчивым (RII) — от 25 до 50%, к низкоустойчивым (RI) — менее 25%. Воздействие препарата считается оптимальным при лизисе всех клеток трихомонад; в этом случае штамм относится к чувствительным (S). По нашему мнению, именно такой подход позволяет подобрать препарат или комбинацию препаратов для назначения рациональной схемы этиотропной терапии.

2.3. Определение чувствительности Trichomonas vaginalis к метронидазолу in vivo и текущий контроль эффективности этиотропной терапии

Определение чувствительности Т. vaginalis к метронидазолу in vivo проводится с помощью метода, основанного на установлении сроков исчезновения паразитов из исследуемого материала у больных трихомониазом на фоне этиотропной терапии. Паразитологические исследования материала проводят на 1,3, 5 и 7-й дни с момента начала лечения. Лекарственно-чувствительными считаются штаммы, которые перестают выделяться от больных на 2-5-е сутки с момента начала этиотропной терапии.