Фагоцитоз с культурой стафилококка сущность метода

27.1. Общее понятие
Под фагоцитозом понимают внутриклеточную цитотоксичность (внутриклеточный киллинг) микроорганизмов и биодеградацию других частиц диаметром более 0,1 мкм. Осуществляют фагоцитоз главным образом нейтрофилы и макрофаги/моноциты, хотя фагоцитирующей способностью обладают и другие клетки.

Рис. 27.2-1. Фагоцит (макрофаг) в зоне скопления объектов фагоцитоза – палочковидных бактерий

А. Первая стадия фагоцитоза (хемотаксис) – целенаправленное движение фагоцита к объекту фагоцитоза (рис. 27.2-1).
1. С одной стороны, миграцию фагоцитов к объекту фагоцитоза усиливают специальные цитокины – b-хемокины (их выделяют макрофаги, моноциты, лимфоциты, клетки эндотелия).
2. С другой стороны этот процесс обуславливают хемотаксические факторы (хемоаттрактанты), выделяемые объектами фагоцитоза: компоненты бактериальной клетки, пептиды и т.п.
Б. Вторая стадия фагоцитоза – адгезия объекта фагоцитоза на поверхности фагоцита.
1. Осуществляется эта стадия двумя возможными механизмами.
а. Неммунный механизм осуществляется за счет неспецифической адсорбции объекта фагоцитоза на поверхности фагоцита. Это так называемый доиммунный, или первичный, фагоцитоз.

Рис. 27.2-2. Иммунный механизм осуществления второй стадии фагоцитоза

а. Под опсонизацией (от лат. opsonin – усиливающий) понимают соединение объекта фагоцитоза (в частности, микроорганизма) с особым растворимым белком, обуславливающим более эффективные и адгезию объекта фагоцитоза на поверхности фагоцита и его дальнейшее поглощение. Такой белок имеет в своем составе две области.
1. Область А осуществляет связывание белка со специфическим к нему рецептором на поверхности микроба.
2. Область В осуществляет связывание этого белка с соответствующим рецептором на поверхности фагоцита.
б. Такие растворимые белки называются опсонинами. К ним можно отнести четыре вида белков человеческого организма.
1. С-реактивный белок.
2. Маннансвязывающий лектин.
3. Активную фракцию комплемента С3b.
4. Иммуноглобулины (антитела).
В. Третья стадия фагоцитоза – эндоцитоз – осуществляется в четыре последовательных этапа.
1. Сначала происходит инвагинация мембраны фагоцита в месте прикрепления объекта фагоцитоза.
2. Затем фагоцит обволакивает объект фагоцитоза большими псевдоподиями (рис. 27.2-4).

Рис. 27.2-4. Захватывание макрофагом бактерий

3. Образуется фагосома.
4. Фагосома сливается с лизосомами – образуется фаголизосома.
Г. На четвертой стадии фагоцитоза происходит резкая активация метаболизма фагоцита – активируются механизмы его внутриклеточного киллинга (внутриклеточной цитотоксичности).

27.4. Способы ухода микробов из-под действия механизмов внутриклеточного киллинга фагоцитов
Некоторые микроорганизмы способны сохранять свою жизнеспособность внутри фагоцита. Это может достигаться за счет трех основных способов.
А. Микроб препятствует слиянию лизосом с фагосомами (таким свойством обладают возбудители туберкулеза, токсоплазмы).
Б. Микробы могут вырабатывать устойчивость к действию лизосомальных ферментов (гонококки, стафилококки, стрептококки).
В. Микроорганизмы могут лизировать фаголизосомальную мембрану и переходить из фагосомы в цитоплазму фагоцита (так поступают риккетсии и хламидии).

Рис. 27.5-1. Последовательность событий при завершенном фагоцитозе
27.5. Виды фагоцитоза
Существует два вида фагоцитоза: завершенный и незавершенный.
А. При завершенном фагоцитозе осуществляются все четыре стадии, и объект фагоцитоза полностью уничтожается (рис. 27.5-1).
Б. При незавершенном фагоцитозе четвертая стадия или отсутствует или не завершается полным уничтожением объекта фагоцитоза.
1. Если четвертая стадия отсутствует, то микроб остается жизнеспособным (см. раздел 27.4).
2. Если четвертая стадия не завершается полным уничтожением объекта фагоцитоза, то происходит частичная деградация антигена для его презентации (представления) лимфоцитам. Фагоцитирующая клетка в этом случае исполняет роль антигенпредставляющей клетки (АПК).

27.6. Функции фагоцитов
Фагоциты выполняют три основные функции.
А. Уничтожают посредством завершенного фагоцитоза микроорганизмы и другие объекты, от которых следует очистить внутреннюю среду макроорганизма.
Б. Распознают и представляют лимфоцитам антигены в ходе развития иммунного ответа.
В. Секретируют медиаторные молекулы системы иммунитета – цитокины (в частности, цитокины, синтезируемые макрофагами, называются монокинами).
1. Основной регуляторный монокин (оказывающий иммуномодулирующие действие) – интерлейкин-1 (ИЛ-1).
2. Эффекторные монокины принимают участие в процессе внутриклеточного киллинга.

27.7. Рецепторы фагоцитов
Фагоциты имеют на своей поверхности макромолекулы, связывающие биологически активные вещества (т.е. рецепторы для этих веществ).
А. Рецептор для активной фракции комплемента С3b (один из рецепторов для белков комплемента на клетках макроорганизма – CR) принимает участие в процессах опсонизации.
Б. В этих же процессах принимают участие рецепторы для иммуноглобулинов.
В. Активация фагоцитов лимфоцитами осуществляется через рецепторы для цитокинов.

27.8. Оценка фагоцитоза
При оценке фагоцитоза изучают микрофаги (нейтрофилы) и макрофаги.
А. При изучении нейтрофилов определяют их количество и функциональную активность.
1. Количество нейтрофилов определяют, высчитывая формулу крови.
2. О функциональной активности нейтрофилов судят по активности фагоцитоза, миграционной активности фагоцитов и по степени завершенности фагоцитоза.
а. Активность фагоцитоза определяют, измеряя фагоцитарное число, фагоцитарный индекс, опсонофагоцитарный индекс.
1. Фагоцитарное число (ФЧ) или фагоцитарная активность определяется как доля (в процентах) профагоцитировавших клеток на 100 нейтрофилов.
2. Фагоцитарный индекс (ФИ) рассчитывается как среднее число бактерий, захваченных одним фагоцитом.
3. Опсонофагоцитарный индекс – это соотношение фагоцитарного индекса иммунной сыворотки к фагоцитарному индексу нормальной сыворотки.
б. Миграционная активность фагоцитов определяется в реакции направленного хемотаксиса и в реакции торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ), о которых можно прочитать в любом практическом руководстве по иммунологии.
в. Для оценки завершенности фагоцитоза используют метод подращивания бактериально-лейкоцитарной смеси и НСТ-тест.
1. Метод подращивания бактериально-лейкоцитарной смеси заключается в смешивании фагоцитов с бактериальной культурой и высевом ее на питательную среду. Количество выросших колоний будет обратно пропорционально степени завершенности фагоцитоза.
2. НСТ-тест позволяет судить о наличии в фагоцитах активных форм кислорода. Взвесь нейтрофилов смешивают с нитросиним тетразолием и подсчитывают затем, после кратковременной инкубации, нейтрофилы с синими гранулами – доля таких нейтрофилов служит показателем завершенности фагоцитоза.
Б. При изучении макрофагов также определяют их количество и функциональную активность.
1. Количество макрофагов определяют по их свойству прилипать к стеклу.
2. Функциональную активность макрофагов определяют по уровню синтеза ими ИЛ-1 или TNF (одного из цитокинов – фактора некроза опухолей) при стимуляции, например липополисахаридом.

Реактивы - пирогенал (стимулятор фагоцитоза), гепарин, суточная культура стафилококка, краситель Романовского-Гимзе. Этапы опыта:

1. Кровь из пальца 0,2 мл помещают в первую пробирку с гепарином и во вторую пробирку, куда добавляют 0,1 мл пирогенала для стимуляции фагоцитоза (стимулированный фагоцитоз - ФС). В каждую из пробирок добавляют суточную культуру стафилококка в объеме 0,05 мл (стандарт мутности -1 млрд).

2. Инкубируют пробирки в термостате 30 мин, центрифугируют, отбирают надосадочную жидкость.

3. Из осадка делают мазок, высушивают, фиксируют этиловым спиртом, окрашивают по Романовскому-Гимзе.

4. Учет результатов при иммерсионной микроскопии (увеличение 630).

1 пробирка:

Спонтанный фагоцитоз - учет результатов через 30 мин. Определяется фагоцитарный показатель и фагоцитарный индекс.

Завершенный фагоцитоз-учет результатов через 120 мин. Определяется фагоцитарный показатель и фагоцитарный индекс.

Индекс завершенности фагоцитоза (ИЗФ) определяется как отношение фагоцитарного индекса 30 мин к фагоцитарному индексу120 мин (ИЗФ= ФИ 30 мин/ФИ 120 мин )

Если ИЗФ более 1, то это указывает на завершенный характер фагоцитоза.

Если ИЗФ менее 1, это указывает на незавершенный характер фагоцитоза.

2 пробирка:

Стимулированный фагоцитоз (в присутствии пирогенала). После инкубации и центрифугирования из осадка готовят мазки, которые высушивают, фиксируют и окрашивают аналогичным способом. В мазках подсчитывают фагоцитарный показатель, фагоцитарный индекс и индекс завершенности фагоцитоза через 120 мин.

Стимуляция пирогеналом может привести к завершенности фагоцитоза. Эти данные необходимо учитывать при коррекции иммунодефицитных состояний.

Изучение функционального состояния фагоцитов по кислородному метаболизму (метод хемилюминесценценции)

1. Из периферической крови выделяют взвесь лейкоцитов (нейтрофилов).

2. Во флаконы для сцинтилляционного счета добавляют раствор Хенкса и люминол (люминол обладает свойством окисляться под влиянием кислородных метаболитов и генерировать квант света (длина волны 425 пт).

3. Во флаконы вносят суспензию нейтрофилов, перемешивают и помещают в счетную камеру для регистрации фонового показателя хеми-люминесценции.

4. Через 45 - 60 мин во флаконы вносят суспензию зимозана или латекса и снова измеряют хемилюминесценцию, фиксируя число импульсов в минуту на протяжении 60 мин. Далее делают пересчет импульсов на 1 клетку и выражают хемилюминесценцию условно в импульс/минута/ клетка. Результат хемилюминесценции оценивается по максимальному значению (пик А) на кинетической кривой.

Для постановки опыта нужен жидкостный сцинтилляционный -спектрометр (хемилюминометр) и специальные стеклянные флаконы для сцинтилляционного счета.

1. Гемолитическая активность стафилококков на кровяном агаре.

2. Лецитиназная активность стафилакокков на ЖСА.

3. Реакция плазмокоагуляции.

4. ДНК-азная активность микробов.

5. Реакция титрования лизоцима слюны с тест - микробом Micrococcus lysodeikticus

6. Мазки гноя с незавершенным фагоцитозом (от больных острой гонореей).

7. Мазки из культуры Klebsiella pneumaniae с капсулой (окраска по Бури - Гинсу).

1. Освоение методов экспериментального заражения животных.

2. Приготовить мазки-отпечатки из органов мышей, окрасить их по Граму промикроскопировать, обнаружить в мазках-отпечатках возбудителя, сделать выводы.

4. Изучить по готовым демонстрациям факторы патогенности микробов.

5. Микроскопия готовых мазков с фагоцитозом латекса.

6. Микроскопия мазков гноя от больных с гонореей.

7. Определение титра лизоцима в слюне в реакции титрования.

1. Понятие "инфекция", "инфекционное заболевание". Условия возникновения. Формы проявления: местная, генерализованная инфекция.

2. Что такое рецидив, реинфекция, суперинфекция?

3. Что такое смешанная инфекция, вторичная инфекция?

4. Что такое бактериемия, септицемия, септикопиемия, токсинемия?

5. Что такое бактерионосительство?

6. Понятие "патогенность" и "вирулентность". Единица измерения вирулентности, методы определения.

7. Периоды динамики инфекционного процесса.

8. Токсины микробов. Экзо - и эндотоксины, их природа, характеристика, отличия.

9. Факторы патогенности у микробов: инвазивность, ее материальная основа; адгезия. Защита от фагоцитоза.

10. Экспериментальная инфекция: цели и задачи, способы заражения животных.

11. Защитные механизмы и факторы естественной резистентности: барьерные и бактерицидные свойства кожи, слизистых оболочек, значение нормальной микрофлоры.

12. Лизоцим, комплемент, свойства, роль в естественной резистентности.

13. Бактерицидность сыворотки крови и факторы ее обеспечивающие:

В-лизины, система пропердина, нормальные антитела.

14. Фагоцитоз как клеточный неспецифический защитный фактор. Виды фагоцитов, стадии фагоцитоза. Незавершенный фагоцитоз.

15. Постановка опыта фагоцитоза, определение активности и завершенности реакции. Опсоно - фагоцитарная реакция.

16. Вскрытие и бактериологическое исследование трупа животного,

погибшего от экспериментальной инфекции.

17. Реактивность новорожденных и детей первых месяцев жизни, отличие от реактивности взрослых.

18. Состояние факторов естественной резистентности у детей раннего возраста.

Фагоцитоз — поглощение клеткой крупных частиц, видимых в микроскоп (например, микроорганизмов, крупных вирусов, повреждённых тел клеток и т.д.). Процесс фагоцитоза можно подразделить на две фазы. В первой фазе частицы связываются на поверхности мембраны. Во второй фазе происходят собственно поглощение частицы и её дальнейшее разрушение. Различают две основные группы клеток фагоцитов — моно-нуклеарные и полинуклеарные. Полинуклеарные нейтрофилы составляют

первую линию защиты от проникновения в организм разнообразных бактерий, грибов и простейших. Они уничтожают повреждённые и погибшие клетки, участвуют в процессе удаления старых эритроцитов и очистки раневой поверхности.

Изучение показателей фагоцитоза имеет значение в комплексном анализе и диагностике иммунодефицитных состояний: часто рецидивирующих гнойно-воспалительных процессах, длительно не заживающих ран, склонности к послеоперационным осложнениям. Исследование системы фагоцитоза помогает в диагностике вторичных иммунодефицитных состояний, вызванных лекарственной терапией. Наиболее информативным для оценки активности фагоцитоза считают фагоцитарное число, количество активных фагоцитов и индекс завершённости фагоцитоза.

Фагоцитарная активность нейтрофилов

Параметры, характеризующие состояние фагоцитоза.

■ Фагоцитарное число : норма — 5-10 микробных частиц. Фагоцитарное число — среднее количество микробов, поглощённых одним нейтрофи-лом крови. Характеризует поглотительную способность нейтрофилов.

■ Фагоцитарная ёмкость крови: норма — 12,5-25х10 9 на 1 л крови. Фагоцитарная ёмкость крови — количество микробов, которое могут поглотить нейтрофилы 1 л крови.

■ Фагоцитарный показатель: норма 65-95%. Фагоцитарный показатель — относительное количество нейтрофилов (выраженное в процентах), участвующих в фагоцитозе.

■ Количество активных фагоцитов: норма — 1,6-5,0х10 9 в 1 л крови. Количество активных фагоцитов — абсолютное количество фагоцитирующих нейтрофилов в 1 л крови.

■ Индекс завершённости фагоцитоза: норма — более 1. Индекс завершенности фагоцитоза отражает переваривающую способность фагоцитов.

Фагоцитарная активность нейтрофилов обычно повышается в начале развития воспалительного процесса. Её снижение ведёт к хронизации воспалительного процесса и поддержанию аутоиммунного процесса, так как при этом нарушается функция разрушения и выведения иммунных комплексов из организма.

Заболевания и состояния, при которых изменяется фагоцитарная активность нейтрофилов, представлены в табл..

Таблица Заболевания и состояния, при которых изменяется фагоцитарная активность нейтрофилов

Таблица Заболевания и состояния, при которых изменяется фагоцитарная активность нейтрофилов

Спонтанный тест с НСТ

В норме у взрослых количество НСТ-положительных нейтрофилов составляет до 10%.

Спонтанный тест с НСТ (нитросиний тетразолий) позволяет оценить состояние кислородзависимого механизма бактерицидности фагоцитов (гранулоцитов) крови in vitro. Он характеризует состояние и степень активации внутриклеточной НАДФ-Н-оксидазной антибактериальной системы. Принцип метода основан на восстановлении поглощённого фагоцитом растворимого красителя НСТ в нерастворимый диформазан под влиянием супероксиданиона (предназначен для внутриклеточного уничтожения инфекционного агента после его поглощения), образующегося в НАДФ-Н-оксидазной реакции. Показатели НСТ-теста повышаются в начальный период острых бактериальных инфекций, тогда как при подос-тром и хроническом течении инфекционного процесса они снижаются. Санация организма от возбудителя сопровождается нормализацией показателя. Резкое снижение свидетельствует о декомпенсации противо-инфекционной защиты и считается прогностически неблагоприятным признаком.

Тест с НСТ играет важную роль в диагностике хронических грануле-матозных заболеваний, которые характеризуются наличием дефектов в НАДФ-Н-оксидазном комплексе. Для пациентов с хроническими гра-нулематозными заболеваниями характерно наличие рецидивирующих инфекций (пневмония, лимфаденит, абсцессы лёгких, печени, кожи), вызываемых Staphylococcus aureus, Klebsiella spp., Candida albicans, Salmonella spp., Escherichia coli, Aspergillus spp., Pseudomonas cepacia, Mycobacterium spp. и Pneumocystis carinii.

Нейтрофилы у пациентов с хроническими гранулематозными заболеваниями имеют нормальную фагоцитарную функцию, но вследствие дефекта в НАДФ-Н-оксидазном комплексе не способны уничтожать микроорганизмы. Наследственные дефекты НАДФ-Н-оксидазного комплекса в большинстве случаев сцеплены с хромосомой X, реже аутосомно-ре-цессивные.

Спонтанный тест с НСТ

Снижение спонтанного теста с НСТ характерно для хронизации воспалительного процесса, врождённых дефектов фагоцитарной системы, вторичных и первичных иммунодефицитов, ВИЧ-инфекции, злокачественных новообразований, тяжёлых ожогов, травм, стрессов, недостаточности питания, лечения цитостатиками и иммунодепрессантами, воздействия ионизирующего излучения.

Повышение спонтанного теста с НСТ отмечают при антигенном раздражении вследствие бактериального воспаления (продромальный период, период острого проявления инфекции при нормальной активности фагоцитоза), хроническом гранулематозе, лейкоцитозе, усилении антите-лозависимой цитотоксичности фагоцитов, аутоаллергических заболеваниях, аллергии.

Активированный тест с НСТ

В норме у взрослых количество НСТ-положительных нейтрофилов составляет 40-80%.

Активированный тест с НСТ позволяет оценить функциональный резерв кислородзависимого механизма бактерицидности фагоцитов. Тест используют для выявления резервных возможностей внутриклеточных систем фагоцитов. При сохранённой внутриклеточной антибактериальной активности в фагоцитах происходит резкое возрастание количества формазан-положительных нейтрофилов после их стимуляции латексом. Снижение показателей активированного НСТ-теста нейтрофилов ниже 40% и моноцитов ниже 87% свидетельствует о недостаточности фагоцитоза.

ми микробами, выраженное в процентах. /272-53/

Фагоцитарную активность можно определять в условиях in vitro

и в условиях in vivo.

- Методы оценки экспрессии С3- и Fс-рецепторов по тесту РОК;

- Радиометрические методы изучения стадии захвата.

- Тест восстановления нитросинего тетразолия. По реакции

восстановления нитросинего тетразолия судят об стимуляции гек-

созомонофосфатного шунта. /1583-4/

Белым мышам вводят в/бр. 2мл стерильного МПБ, чем вызывают-

локальный лейкоцитоз. Через 4 часа в/бр. вводят 1мл 2млрд-ой

культуры Staphylococcus albus. Через 10-15 минут из перитоне-

альной жидкости готовят мазки (можно из осадка после центрифу-

гирования), окрашивают метиленовым синим.

2Незавершенный фагоцитоз 0 (наблюдается при поглощении туберку-

лезных палочек, возбудителей лепры, лейшманиоза, гонореи, ме-

нингококков, вирусов, риккетсий) :

Рис. "Незавершенный фагоцитоз гонококков (мазок in vivo)"

Показатель завершенности фагоцитоза (ПЗФ) - процентное отно-

шение умерщвленных и всех поглощенных микробов (примерно равно

0,80). Выделяют 5 степеней завершенности фагоцитоза (ЗФ):

- высокая ЗФ (1,0-0,82);

- очень слабая (0,31-0,29)

- ЗФ отсутствует (0,28-0,25)

Реакцию осуществляли по методу Н.В.Васильева и соавт.

(1972). Для постановки реакции в лунки иммунологического план-

шета вносили по 15 мкл гепарина в концентрации 10 ед/мл, 50 мкл

цельной крови, взятой с пальца натощак, и добавляли 25 мкл 2 х

10 59 0 микробных тел/мл суточной агаровой культуры Staphylococcus

aureus разведенных на 0,1 М фосфатном буфере рН 7,2. В опытные

лунки вводили по 10 мкл расстворов изучаемых полипептидов, в

контрольные - 10 мкл фосфатного буфера. Лейкоцитарно-микробную

взвесь перемешивали и инкубировали при температуре 37С в тече-

ние 30 минут, повторно встряхивая каждые 5 минут. После инкуба-

ции взвесь ресуспендировали, готовили мазки, фиксировали 10 ми-

нут метанолом и окрашивали по Романовскому-Гимза.

Готовые препараты микроскопировали с использованием масляной

иммерсии и вели подсчет в 200 нейтрофилах. Поглотительную спо-

собность фагоцитов оценивали по следующим показателям:

1) фагоцитарный показатель - процент фагоцитировавших кле-

ток из числа сосчитанных нейтрофилов;

2) фагоцитарный индекс - среднее число микробов, поглощен-

ных одним активным нейтрофилом.

Для оценки переваривающей функции нейтрофилов определяли

показатель завершенности фагоцитоза (ПЗФ) по формуле:

общее количество переваренных микробов

общее количество поглощенных микробов

Чувствительным методом оценки функциональной активности фа-

гоцитов является метод определения хемилюминесценции крови.

- Приготовить кровяно-микробную взвесь (0,05мл 2% цитрата

натрия, 0,1мл крови и 0,05мл 2 млрд-ой взвеси микробов - микро-

- для определения опсонического индекса в опытную пробу до-

полнительно добавляетя антисыворотка к микробам или сыворотка

больного для определения функциональной активности антител к

- выдержать в термостате 30 мин. при 37 50 0С.

- приготовить мазок из кровяно-микробной взвеси;

- высушить мазок, окрасить по методу Филлипсон: краситель

Романовского развести этиловым спиртом 1:3. На высушенный пре-

парат наносят 5 капель красителя и выдерживают 5 минут (однов-

ременная фиксация и окраска). Не сливая краску, добавляют во-

допроводную воду, 5 капель на 5 минут. Промывают водой, высуши-

вают, микроскопируют с иммерсией.

- В мазке определяют

а) фагоцитарный показатель - процент фагоцитирующих лейко-

цитов (среди полиморфоядерных лейкоцитов). Подсчитывают

100 гранулоцитов и, например, если 35 из них водержат

микробы, то фагоцитарный индекс равен 35%.

б) фагоцитарное число или индекс (количество микроорганиз-

мов, поглощенных одним нейтрофилом); считают суммарное

количество микроорганизмов, например, 567 во всех фаго-

цитирующих гранулоцитах /80/ и делят на число фагоци-

тов. Частное от деления (567:80=7) отражает сруднюю

поглотительную способность одного фагоцита.

в) определяют опсоно-фагоцитарный индекс (ОФИ). Для этого

либо рассчитывают частное от деления ФЧ (фагоцитарного

числа) больного на ФЧ здорового донора (при этом ОФИ

должен быть больше единицы; либо ОФИ определяют эмпири-

ческим методом, с помощью которого анализируют состоя-

ние 25 нейтрофилов по следующей схеме:

Количество микро-│Оценка фагоцитоза│Количество нейт- │ ОФИ

бов, фагоцитиро- │ │рофилов с данной │

ванный одним │ │степенью фагоци- │

гранулоцитом │ │тарной активности│

от 1 до 20 + (один) 5 1х5=5

от 20 до 40 ++ (два) 10 2х10=20

от 40 и более +++ (три) 8 3х8+24

Максимальное значение ОФИ - 75, т.е. во всех 25 нейтрофилах

фагоцитировано от 40 и более микробов. У здоровых людей ОФИ ра-

ОФИ от 10 до 24 - слабо положительный (+);

от 25 до 49 - ясно выраженная реакция (++);

от 50 до 75 - резко положительная реакция (+++).

Полученые результаты внести в протокол.

Фагоцитарный показатель у здорового человека - 70-84%.

Фагоцитарное число у здорового человека - 4-?.

Фагоцитарное число после обработки микробов антителами (им-

мунной сывороткой) или комплементом -

Опсонический индекс - больше 1.

Фагоцитоз культуры стафилококка или микрококков в отсутствие

антител идет плохо, при наличии антител в сыворотке или плазме

фагоцитоз ускоряется, при добавлении комплемента или активации

комплемента в крови исследуемого фагоцитоз резко ускоряется,

т.к. происходит как через Fc-, так и через С3в-рецепторы.

2Оценка степени перекисного и радикального окисления

2по НСТ-тесту 0 (NBT-тест)

1Тест восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест)

Тест бессубстратного восстановления нитросинего тетразолия

основан на способности фагоцитов утилизировать кислород с обра-

зованием высокореактогенных свободных радикалов. НСТ является

индикатором респираторного взрыва. Сущность метода заключается

в образовании нерастворимых окрашенных зерен формазана при

восстановлении НСТ супероксидным радикалом.

- для оценки функциональной активности фагоцитов,

- прогнозирования тяжести заоблевания,

- контроля за эффективностью антибактериального лечения,

- дифференциальной диагностики вирусных и бактериальных за-

болеваний и пр. /2291к/

- Получены доказательства высокого уровня корреляции между

образованием активных форм кислорода и киллингом.

Метод Н.Е.Виксмана, А.Н.Маянского (1979). Изучаемые образцы

веществ в количестве 20 мкл вносили в лунки иммунологического

планшета, в контрольные лунки - 20 мкл среды 199. В каждую из

лунок вносили по 20 мкл цельной крови, взятой из пальца здоро-

вых людей пипеткой, предварительно промытой раствором гепарина

250 ед/мл и добавляли 20 мкл 0,15% суспензии нитросинего тетра-

золия (Reanal, Венгрия) на 0,1 М фосфатном буферном растворе,

рН 7,2. Содержимое лунок осторожно перемешивали и инкубировали

при температуре 37 5о 0С в течение 30 минут, встряхивая планшеты

каждые 10 минут. После инкубации содержимое перемешивали, гото-

вили мазки и высушивали на воздухе. Готовые мазки фиксировали

метанолом 10 минут, высушивали и докрашивали 0,5% раствором

В качестве активаторов фагоцитов рекомендуется использовать

опсонизированный зимозан или акктиватор протеинкиназы С - фор-

болмиристат ацетат. /2291к/

Об интенсивности радикалообразования судят по количеству ди-

формазана, который откладывается в виде грубодисперсных темно-

синих гранул внутри или на поверхности активированного нейтро-

Реферат опубликован: 16/06/2005 (10376 прочтено)

Стафилококки

[Рис. 1] Золотистый стафилококк

[Рис. 2] Золотистый стафилококк

Организм здорового человека обладает значительной устойчивостью к стафилококкам. После перенесенной стафилококковой инфекции в крови появляются антитоксины. Обнаружение антитоксина свидетельствует о напряженности иммунитета к стафилококкам. Наличие в крови человека а-антитоксина в титре больше 2 ME указывает на недавно перенесенное заболевание стафилококковой этиологии.

При контакте с широко распространенными в окружающей среде стафилококками, а также в результате перенесенных заболеваний индуцируется гуморальный иммунный ответ, в результате которого образуются антитела на антигены микробных клеток, токсины и ферменты. Клеточный иммунный ответ проявляется в подавлении фагоцитоза. Устойчивость к фагоцитозу у вирулентных штаммов S. aureus, возможно, связана с их способностью образовывать капсулу in vivo, а также с продукцией коагулазы, образующей вокруг бактерий фибрин. Белок А препятствует фагоцитозу, связываясь с Fc-участками IgG. В ряде случаев наблюдается специфическая сенсибилизация организмов. Определенное значение при стафилококковых инфекциях имеют секреторные IgA, обеспечивающие местный иммунитет слизистых оболочек. Экология и эпидемиология. Стафилококки широко распространены в природе. Они обнаруживаются на коже и слизистых оболочках человека, встречаются у животных. Каждый вид стафилококка подразделяется на экологические варианты (эковары). Вид S. aureus включает 6 эковаров: А, В, С, D, Е и F. Основными хозяевами этих эковаров являются соответственно человек, свинья, домашняя птица, крупный рогатый скот, овцы, зайцы, собаки и голуби. Резервуаром золотистого стафилококка служат здоровые носители и больные с различными стафилококковыми поражениями. Наибольшую опасность в смысле распространения стафилококков представляют бактерионосители, у которых патогенные стафилококки обнаруживают на слизистой верхних дыхательных путей, особенно передних отделов носовых ходов, а также больные люди с кожными поражениями. Стафилококки достаточно резистентны к факторам окружающей среды. Они хорошо переносят высушивание, длительное время остаются жизнеспособными в пыли.

Стафилококковые инфекции

Род Staphylococcus включает шаровидные неподвижные аспорогенные грамположительные факультативно-анаэробные бактерии, принадлежащие к семейству Mисrососсасеае. В определителе бактерий Д.Берги приведены дифференциальные признаки 29 видов стафилококков. Они делятся на две группы - коагулазоположительные и коагулазоотрицательные. К первой группе относятся S. aureus, S. intermedius и S. hyicus. их роль в инфекционной патологии равнозначна. Чаще различные заболевания у людей и животных вызывает S.aureus, реже - S. hyicus. S. intermedius патогенный только для животных. На протяжении многих лет коагулазоотрицательные стафилококки считали непатогенными. Но теперь эта точка зрения изменилась. В связи с ухудшением экологической ситуации в большинстве стран и связанным с ней снижением естественного иммунитета участились случаи гнойно-септических поражений тканей и органов, вызванных коагулазоотрицательные видами, которые встречаются на коже и слизистых оболочках человека (S. epidermidis, S.auricularis , S.capitis, S.cohnii, S.haemolyticus, S.hominis, S.lentus, S.saprophyticus, S.schleiferi, S.simulans, S.wameri, S.xylosus ma in.).

Среди эпидемиологов, микробиологов и клиницистов довольно распространенное убеждение, что сегодня непатогенных стафилококков не существует. Все учащаются случаи выделения из крови, тканей и органов культур стафилококков без каких-либо маркеров патогенности. Однако, при элиминации их из организма исчезают все симптомы заболевания. Все это необходимо учитывать при проведении лабораторной диагностики стафилококковых инфекций. К сожалению, в рутинных бактериологических лабораториях нашей страны пока возможна идентификация лишь S. aureus, S. epidermidis и S.saprophyticus.

Стафилококки чаще поражают кожу, ее придатки и подкожную клетчатку. Они вызывают фурункулы, карбункулы, панариции, паронихии, абсцессы, флегмоны, маститы, лимфадениты, нагноения ран, в том числе операционных. У детей стафилококки являются возбудителями стафилодермий, эпидемических пухирчаток, импетиго. их выделяют при плевритах, бронхитах, пневмониях, перитонитах. Они могут вызвать ангины, тонзиллиты, гаймориты, отиты, конъюнктивиты, несколько реже - менингиты, абсцессы мозга, миокардиты, эндокардиты, артриты, инфекции сосудистых протезов. Очень опасные пищевые токсикоинфекции, энтероколиты, холециститы, циститы, пиелит, пиелонефрит. При проникновении в кровь или костный мозг вызывают сепсис, остеомиелит, синдром токсического шока. Однако все заболевания стафилококковой этиологии не рассматриваются как острозаразное.

При стафилококковых инфекциях исследуют гной, кровь (при сепсисе), выделения слизистых оболочек, мокроты, воспалительный экссудат, ликвор, раневое содержание, плевральный выпот, желчь, мочу. В случае подозрения на токсикоинфекцию - рвотные массы, промывные воды желудка, испражнения, остатки пищи (особенно творог, молоко, пирожные, торты, кремы, мороженое и др.).. При санитарно-бактериологическом контроле исследуют смывы с рук, столов и других предметов. В бактерионосителей материал забирают тампоном отдельно из глотки и носовых ходов.

Из открытых гнойных поражений материал берут стерильным ватным тампоном после удаления раневого налета, в котором может быть сапрофитная микрофлора из воздуха, кожи и т.д.. При закрытых нарыва делают пункцию шприцем. Слизь из рото-и носоглотки берут стерильным тампоном. Мокроту и мочу забирают в стерильные пробирки, банки. Кровь (10 мл), взятую из локтевой вены, и ликвор - при пункции спинномозгового канала, с соблюдением асептики сеют у постели больного в 100 мл сахарного бульона. Кровь рекомендуют быстро (к ее свертыванию) вносить прямо из шприца во флакон с бульоном, тщательно перемешать, предотвращая образование сгустка. Пробы крови нельзя замораживать. В 25% случаев при стафилококковом сепсисе количество бактерий в крови (КОЕ) может быть меньше 1 / мл. При подозрении на такое положение необходимо сеять 25-30 мл крови.

Почти со всех исследуемых материалов (навоз, раневой содержание, экссудат, мокроты, осадок мочи и т.д.) с помощью бактериологической петли изготавливают мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. Только из крови и смывов мазки не делают так в них малое количество микроорганизмов. В типичных случаях стафилококки имеют шарообразную форму, фиолетовый цвет, располагаются несимметричными гроздьями, но встречаются и одинокие клетки, пары или тетради.

В последнее время в связи с широким использованием антибиотиков морфология стафилококков изменилась и типового их расположения в мазках из гноя часто не наблюдают. В связи с этим отличить стафилококки от стрептококков по их морфологии и взаимным расположением часто практически невозможно. Поэтому нужно делать посев, выделять чистую культуру и идентифицировать ее.

[Рис. 3] Золотистый стафилококк в чаше Петри

Материал от больных и бактерионосителей засевают немедленно или не позднее 3-4 ч после взятия при условии хранения его на холоде.В первый день петлей, шпателем или непосредственно тампоном делают посевы на кровяной агар и элективные для стафилококков среды (желтково-солевой (ЖСА) или молочно-желтково-солевой агар (МЖСА). Чашки с посевами инкубируют при 37 ° С в течение 48 часов , или сутки в термостате и дополнительно 24 ч при комнатной температуре при хорошем освещении. Если в исследуемом материале бактерий мало (данные микроскопии) - занял для обогащения делают еще в тиогликолевой среду.На второй день производят высев из сахарного бульона на указанные элективные среды, исследуют массивность роста и характер колоний после посевов других материалов. На кровяном агаре стафилококки образуют непрозрачные, слегка выпуклые колонии средних размеров с гладкой, блестящей, словно полированной поверхностью, четко очерченным краем, маслянистой консистенции. Патогенные штаммы образуют вокруг колоний прозрачные зоны гемолиза. На элективные-дифференциальных средах, как правило, вырастают только колонии стафилококков. В частности, на желтково-солевом агаре они образуют колонии с зоной помутнения вокруг них и характерным радужным венчиком по периферии (лецитовителазна реакция). На молочно-желтково-солевом агаре выявляют наличие пигмента, который может быть золотистым, палевым, белым, желтым, оранжевым и др..

Из всех типов колоний изготовляют мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют, проявляя типичные грамположительные стафилококки. Не менее двух типичных или подозрительных в отношении стафилококков колоний пересевают на скошенный агар. В первую очередь отсеивают колонии с гемолизом и те, которые дали положительную лецитовителазную реакцию. При отсутствии таких колоний исследуют не менее двух пигментированных колоний, при микроскопии которых выявили типичные стафилококки. Пробирки с посевами помещают в термостат при 37 ° С на 18-20 час.
В последующие дни проводят идентификацию выделенных чистых культур, для чего проверяют их морфологические и тинкториальные свойства (окраска по Граму), плазмокоагулюючу активность и другие свойственные стафилококков тесты.

Плазмокоагулазу выявляют путем внесения выделенной культуры в пробирку с цитратной плазмы кролика. Ее можно приготовить в любой лаборатории. У кролика из сердца берут 8 мл крови, вносят в пробирку с 2 мл 5% лимонно-кислого натрия и ставят в холодильник. После полной осадки форменных элементов плазму отсасывают в стерильную пробирку. Она может храниться в холодильнике 8-10 дней. Перед использованием ее разводят 1:5 (1 мл плазмы и 4 мл изотонического раствора хлорида натрия) и разливают в аглютинацийни стерильные пробирки по 0,5 мл. Полную петлю культуры стафилококков эмульгируют в плазме и помещают в термостат на 3 часа, затем оставляют при комнатной температуре на 18-20 часов. Предварительный учет свертывания плазмы проводят через 3 ч, окончательный - на второй день. Очень удобно пользоваться стандартной сухой цитратной плазмы кролика. Перед употреблением в ампулу добавляют 1 мл изотонического раствора хлорида натрия и после полного растворения ее разводят 1:5. Плазма человека малопригодна для постановки реакции плазмокоагуляции, поскольку в ней могут быть консерванты, лекарственные вещества, антитела, которые могут подавлять образование плазмокоагулаза.

Если выделена культура вызывает гемолиз, коагулирует плазму и дает положительную лецитовителазну реакцию, уже на третий день можно выдать результат на наличие S. aureus. Если культура обладает только плазмокоагулаза или только вителазну активность, для окончательного установления вида стафилококка необходимо определить дополнительные критерии патогенности: ферментацию маннита в анаэробных условиях, ДНК-азную активность, продукцию лизоцима, фосфатазы, а также определить чувствительность к новобиоцин.

Исследование на бактерионосительство среди медицинского персонала проводится дважды в год. При плановых бактериологических обследованиях обязательно исследуют слизь из носа. Исследования слизи из ротоглогки проводят выборочно, при наличии воспалительных процессов в зеве. Материал берут из передних отделов носа стерильным ватным тампоном и им же сеют на ЖСА не позднее, чем через 2 ч после взятия. Выделение и идентификацию S.aureus проводят так же, как и при исследовании других материалов.

При определении массивности обсеменения стафилококками слизистой носа тампон с исследуемым слизью вносят в пробирку с 0,5 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия, прополаскивают его в жидкости встряхиванием в течение 10 мин, отжимают о стенки и удаляют. Жидкость многократно перемешивают пипеткой. Отдельно пипеткой наносят 0,1 мл смыва на чашку с ЖСА и тщательно растирают шпателем. Чашки с посевами инкубируют при 37 ° С в течение 48 ч, после чего подсчитывают количество колоний. Если с 50 колонийS.aureus, выросшие, две отнесены к одному и тому же фаготип, правомерно считать, что и все остальные колонии, идентичные по морфологии и пигментом, относятся к S. aureus аналогичного фаготип.
Пример для расчета: после посева 0,1 мл смыва выросло 50 колоний S.aureus. Так, в 0,5 мл будет 50 * 5 = 250 колоний или 2,5 * 10В2.Массивность стафилококкового обсеменения, которое выражается числом 102 микробных клеток, является умеренной, при ней возбудитель в окружающую среду не выделяется. При выделении> 10в3 бактериальных клеток уровень обсемененности определяют как высокий, при котором возбудитель выделяется во внешнюю среду не только при кашле и чихании, а при спокойном дыхании. При таких обстоятельствах нужно обязательно проводить санацию бактерионосителей.

Профилактика заболеваний, вызываемых стафилококками, включает несколько направлений. К ним относятся меры борьбы с источником инфекции, которыми являются люди, страдающие гнойно-воспалительными процессами и бактерионосители, при лечении которых возникают определенные трудности. Особенно важно в комплексе профилактических мероприятий предупреждение стафилококковых заболеваний в лечебных учреждениях. Это прежде всего организация режима работы отделений больниц. Отделения, в которых находятся больные с открытыми гнойно-воспалительными процессами, должны обслуживаться отдельным персоналом. Для предупреждения возникновения стафилококковых заболеваний у лиц, подвергающихся риску травматизма или инфицирования, рекомендуется использовать метод иммунизации сорбированным анатоксином или введение иммуноглобулина.

Особая проблема - профилактика стафилококковых заболеваний у новорожденных. У них еще до настоящего времени стафилококк является одним из главных возбудителей инфекции. В данном случае в профилактику включают иммунизацию рожениц стафилококковым анатоксином, а также проведение количественного и качественного анализа обсемененности молока родильниц с целью более строго подхода к переводу новорожденного на вскармливание кипяченым грудным молоком. В норме в женском молоке содержится три класса иммуноглобулинов - IgG, IgM и IgA, которые разрушаются при кипячении.

Для лечения стафилококковых инфекций применяют антибиотики, выбор которых определяется чувствительностью выделенной культуры к определенным препаратам. Из них наибольшее значение имеют р-лактамные препараты (оксициллин, метициллин и др.). В последние годы появились метициллиноустойчивые штаммы. Их устойчивость в отличие от других штаммов не контролируется R-плазмидами, а объясняется хромосомными мутациями. Для лечения таких больных применяют ванкомицин и фторхинолоны.Кроме того, для лечения стафилококковых инфекций используют цефалоспорины 1 и 2 поколении, реже тетрациклины. При сепсисе наряду с антибиотиками вводят противостафилококковый Ig. Для лечения хронических стафилококковых инфекций (хронический сепсис, фурункулез и др.) используют анатоксин, аутовакцину, стимулирующие синтез антитоксических и антимикробных антител.