Экспресс тест на криптоспоридиоз
На: Тест для выявления Cryptosporidium parvum в кале
Краткая информация
Криптоспоридиоз – это кишечное заболевание, вызываемое одноклеточными простейшими Cryptosporidium parvum. Криптоспоридиоз передается фекально-оральным путем. Основные симптомы криптоспоридиоза – водянистая диарея, острые желудочные боли, потеря веса, тошнота, иногда жар. Симптомы обычно появляются в течение первой недели после инфицирования.
Принцип метода
Определение основано на принципе иммунохроматографического анализа. Анализируемый образец жидкого биологического материала абсорбируется поглощающим участком тест-полоски. При наличии в образце клеток Cryptosporidium parvum они вступают в реакцию с нанесенными на стартовую зону специфическими моноклональными антителами против Cryptosporidium parvum, меченными окрашенными частицами, и продолжают движение с током жидкости. В аналитической зоне тест-полоски происходит взаимодействие со специфическими моноклональными антителами, иммобилизованными на поверхности мембраны, с образованием окрашенного иммунного комплекса.
В контрольной зоне тест-полоски специфический окрашенный иммунный комплекс образуется независимо от наличия в тестируемом биологическом материале клеток Cryptosporidium.
В том случае, если в анализируемом образце присутствуют клетки Cryptosporidium, на тест-полоске образуются две параллельные линии (красная аналитическая, обозначенная буквой Т, и зеленая контрольная, обозначенная буквой С), что указывает на положительный результат анализа. В случае отсутствия в анализируемом образце клеток Cryptosporidium на тест-полоске образуется одна зеленая контрольная линия (С), что указывает на отрицательный результат анализа.
Состав
Кассеты с тест-полосками упакованы в индивидуальные вакуумные упаковки из фольги алюминиевой, содержащие пакетики с силикагелем.
Необходимые оборудование и материалы, не входящие в состав набора
- контейнеры для сбора образцов кала;
- одноразовые резиновые или пластиковые перчатки;
- часы или таймер.
Аналитические характеристики
Меры предосторожности
При проведении определения следует надевать одноразовые резиновые или пластиковые перчатки, т.к. исследуемые образцы биологического материала следует рассматривать как потенциально инфицированные.
Использованные тесты и остатки биологического материала должны быть помещены в специальный контейнер для санитарных отходов.
Анализируемые образцы
Свежесобранный биологический материал (кал), не содержащий консерванты.
Образцы кала должны быть собраны в чистый контейнер. Следует отбирать образцы кала для анализа в течение первой недели после появления симптомов заболевания, т.к. спустя неделю после инфицирования количество клеток Cryptosporidium значительно уменьшается.
Образцы кала до определения можно хранить при температуре 2–4°С не более 2 сут., при необходимости более длительного (до 1 года) хранения – при температуре –20°С и ниже.
Перед анализом образцы кала должны быть полностью разморожены и доведены до комнатной температуры.
Повторное замораживание и оттаивание образцов недопустимо.
Подготовка образцов
1. Снять крышку-капельницу с пробирки и с помощью стержня на крышке взять небольшое количество анализируемого образца. Для этого ввести стержень в 3 разные зоны образца, собрав примерно 150 мг кала (рис. 1-1). Если образец жидкий, отобрать 150 мкл с помощью пипетки. Ввести стержень с образцом в пробирку с буфером для растворения образца и плотно завинтить крышку-капельницу (рис. 1-2).
2. Несколько раз встряхнуть пробирку, чтобы облегчить растворение образца (рис. 2-1).
Проведение анализа
3. Встряхнуть пробирку с раствором образца. Отрезать или отломить кончик крышки-капельницы (рис. 2-1).
6. Через 10 мин визуально оценить результат реакции.
Интерпретация результатов
Выявление в тестовом окошке кассеты одной зеленой контрольной линии (С) свидетельствует об отрицательном результате анализа, т.е. указывает на отсутствие в анализируемом образце кала клеток Cryptosporidium (рис. 3-1).
Выявление в тестовом окошке кассеты двух параллельных окрашенных линий (С и Т) свидетельствует о положительном результате анализа, т.е. указывает на наличие в анализируемом образце кала клеток Cryptosporidium (рис. 3-2). Интенсивность красной аналитической линии (Т) в тестовом окошке кассеты может меняться в зависимости от концентрации клеток Cryptosporidium в образце.
Условия хранения и эксплуатации
Экспресс-тест - метод диагностики на основе иммунохроматографического теста для обнаружения антигенов Lamblia intestinalis и Cryptosporidium parvum в пробах кала.
Экспресс-тесты выпускаются как для раздельного, так и одновременного определения антигенов лямблий и/или криптоспоридий в образцах кала, что позволяет идентифицировать наиболее важные инфекции кишечника. Тест не требует от персонала владения микроскопическими методами, быстр и прост в исполнении. Однако при его проведении используется только свежий образец кала.
RIDA-Quick - тест на криптоспоридии и лямблии (Cryptosporidium/Giardia Combi) является одностадийным тестом, основанным на иммунохроматографическом принципе, в котором используются специфичные к каждому паразитическому организму моноклональные антитела, фиксированные на мембране тест-кассеты и окрашенные латексными частицами: красные для лямблий и голубые для криптоспоридий. Образец кала суспендируют в буфере для экстракции, Аликвоту супернатанта без примеси нерастворенных частиц образца вносят в окошко тест-кассеты. Если образец содержит выявляемые антигены, то происходит образование комплекса "антиген-антителолатексная частица". В зависимости от вида паразита, присутствующего в образце, могут образовываться красная (для лямблий) и/или голубая (для криптоспоридий) тестовые полосы.
Материалы и реагенты
Набор включает реагенты, достаточные для выполнения 20 определений
Тест-кассеты (каждая в индивидуальной упаковке)
Буфер для экстракции (содержит азид натрия 0,1%)
Инструкция по применению
Оборудование и материалы, не входящие в набор
Пробирки для суспензии образцов кала; вортекс
Микропипетка на 200-1000 мкл
Контейнер для утилизации и обеззараживания отходов
Сбор и хранение проб
Пробы кала необходимо собирать в чистые контейнеры. Исследования проводятся в день доставки материала в лабораторию или пробы замораживают и хранят при -20 °С. Перед проведением анализа образцы необходимо разморозить.
Подготовка к исследованию
1) Довести реагенты до комнатной температуры 20 °С.
2) Внести 1 мл буфера для экстракции в маркированную пробирку.
4) Провести 3-минутную экспозицию для осаждения частиц.
5) Извлечь тест-кассету из упаковки и внести 200 мкл прозрачного супернатанта в круглое окошко кассеты. Следить за тем, чтобы с жидкостью не попадали твердые частицы, которые мешают ей проходить через реакционную зону - белый фон центрального окна кассеты.
6) Считать результаты теста через 5 мин.
При постановке теста обязательно должна быть видна контрольная полоса. Если она не появилась, следует повторить исследование, проверив предварительно следующие моменты: срок годности используемых реагентов; точность выполнения процедуры исследования.
А. Положительный тест на криптоспоридии: в реакционной зоне кассеты в дополнение к зеленой контрольной полосе (С) появляется СИНЯЯ тестовая полоса (Т).
B. Положительный тест на лямблии: в реакционной зоне кассеты в дополнение к зеленой контрольной полосе (С) появляется КРАСНАЯ тестовая полоса (Т).
C. Положительный тест на лямблии и криптоспоридии: в реакционной зоне кассеты в дополнение к зеленой полосе (С) появляется СИНЯЯ и КРАСНАЯ тестовые полосы. Интенсивность окраски полос может быть разной, так как она зависит от концентрации антигенов в образце кала.
D. Отрицательный результат. На белом фоне реакционной зоны центрального окошка кассеты появляется только ЗЕЛЕНАЯ контрольная полоса рядом с буквой "С".
Е. Неверный результат. На белом фоне реакционной зоны кассеты рядом с буквой "С" отсутствует ЗЕЛЕНАЯ контрольная полоса. Исследование необходимо повторить на новой кассете. Если контрольная полоса не появляется и при повторном исследовании, то тест-система непригодна к использованию.
Любые окрашенные линии, которые появляются спустя 10 мин после внесения супернатанта в реакционную зону, не имеют диагностического значения. Такой результат может быть при использовании избыточного количества пробы кала.
Аналитические характеристики экспресс-теста
Одноступенчатый иммунохроматографический тест с использованием моноклональных специфических антител, фиксированных на мембране к каждому из определяемых паразитов, обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Тест прост в исполнении, не требует много времени.
Дата добавления: 2019-02-12 ; просмотров: 348 ;
Экспресс-тест Криптоспоридиум парвум (Cryptosporidium parvum)
Принцип теста: иммунохроматографический, цветовая кодировка результатов.
Полоски контрольной и аналитической зоны имеют окраску разного цвета.
Чувствительность не менее 99%, специфичность – не менее 99%.
- Тип тестового устройства: тест-кассеты в индивидуальной упаковке в комплекте с силикагелем
- Тип измерения: качественный
- Время анализа: не более 10 минут
- Тип образца: кал – объем образца: не более 125 мкл жидкого кала
- Количество тестов в наборе: 10 тестов.
- Условия хранения: 2-30 град.
(наименование теста, номер партии, срок годности), в комплекте с пластиковым флаконом-капельницей
с однокомпонентным буфером с консервантом, объединенным с пипеткой и шпателем
для забора образца – 10 шт.
Флакон-капельница должен обладать закручивающимися крышками с обеих сторон.
С верхней стороны – крышка с отламываемым концом для нанесение раствора образца на тест-систему.
С нижней стороны крышка снабжена пластиковым аппликатором (длинной не менее 40 мм и рифлёной
частью не менее 20 мм), а горлышко содержит прорезиненную вставку-отсекатель избыточного
количества образца (для забора в емкость фиксированного количества образца).
Для обеспечения герметичности, между каждой крышкой и флаконом гибкая прокладка.
Этикетки с пустыми полями под подписи для наклейки на флаконы-капельницы с буфером – 10 шт.
Цветная инструкция для пользователя на русском языке.
Коробка содержит полную маркировку на русском языке и заклеена пломбой с контролем первого вскрытия.
Срок годности набора – не менее 24 месяцев.
Остаточный срок годности на момент поставки набора – не менее 80%.
Криптоспоридиоз – инфекция, вызываемая простейшими класса криптоспоридий, безжгутиковыми организмами,
содержащими споры (спорозоиты) внутри ооцист. Они инфицируют желудочно-кишечный тракт людей и животных,
в особенности телят, вызывая развитие энтерита.
В различных странах эту инфекцию человека можно наблюдать чаще, чем думали ранее. Паразит вызывает эндемическую
и эпидемическую диарею, в особенности у детей, живущих в тропических районах развивающихся стран.
Наиболее обычной клинической картиной криптоспоридоза является диарея. Течение заболевания напрямую связано
с иммунокомпетентностью хозяина. У иммунокомпетентных людей эта болезнь обычно самокупируется.
Симптомами заболевания являются обильная холеро-подобная водянистая диарея и схватки в брюшной полости,
тошнота и рвота. Диарея продолжается от 3 до 10 дней. У пациентов с нарушениями в иммунной системе наблюдается
бoльшая продолжительность и более тяжелые симптомы заболевания. Как и в случае холеры, инфекция приводит
к угрожающему жизни обезвоживанию организма. Описаны случаи, когда потеря жидкости составляла от 3 до 12 л в день.
Инфекция криптоспоридиями передается через загрязненную воду от животных к человеку, а также от человека к человеку.
Особенно подвержены опасности дети в детских учреждениях, мужчины- гомосексуалисты и ВИЧ-инфицированные,
а также пациенты госпиталей и больниц, работники здравоохранения и путешественники.
Эквивалентный метод диагностики – иммунохроматографический тест для обнаружения антигенов Cryptosporidium parvum
в образцах кала. Метод демонстрирует ту же чувствительность, что и микроскопия, не нуждается в опытном лабораторном
персонале микробиологов и специалистов иммуноферментных тестов, он легок в исполнении, не требует много времени,
и не нуждается в том, чтобы в образцах стула присутствовали интактные организмы (ооцисты).
N1123 RIDA Quick Криптоспоридии/Лямблии - Комби, экспресс-тест, опред. в кале (R-Biopharm), пипетки
N1123 RIDA Quick Криптоспоридии/Лямблии - Комби, экспресс-тест, опред. в кале (R-Biopharm), тестовые устройства
N1123 RIDA Quick Криптоспоридии/Лямблии - Комби, экспресс-тест, опред. в кале (R-Biopharm), буфер для экстракции
Назначение и особенности
Тест предназначен для быстрого качественного определения антигенов Cryptosporidium parvum и Giardia lamblia в образцах кала человека с целью одновременной дифференциальной диагностики криптоспоридоза и лямблиоза.
Введение
Криптоспоридоз – инфекция, вызываемая простейшими класса криптоспоридий, безжгутиковыми организмами, содержащими споры (спорозоиты) внутри ооцист. Они инфицируют желудочно-кишечный тракт людей и животных, в особенности телят, вызывая развитие энтерита. В различных странах эту инфекцию человека можно наблюдать чаще, чем думали ранее. Паразит вызывает эндемическую и эпидемическую диарею, в особенности у детей, живущих в тропических районах развивающихся стран. Обычной клинической картиной криптоспоридиоза является диарея. Течение заболевания напрямую связано с иммунокомпетентностью хозяина. У иммунокомпетентных людей эта болезнь обычно самокупируется. Симптомами заболевания являются обильная холеро-подобная водянистая диарея и схватки в брюшной полости, тошнота и рвота. Диарея продолжается от 3 до 10 дней. У пациентов с нарушениями в иммунной системе наблюдается бoльшая продолжительность и более тяжелые симптомы заболевания. Как и в случае холеры, инфекция приводит к угрожающему жизни обезвоживанию организма. Описаны случаи, когда потеря жидкости составляла от 3 до 12 л в день. Инфекция криптоспоридиями передается через загрязненную воду от животных к человеку, а также от человека к человеку. Особенно подвержены опасности дети в детских учреждениях, мужчины- гомосексуалисты и ВИЧ-инфицированные, а также пациенты госпиталей и больниц, работники здравоохранения и путешественники. Giardia lamblia относится к жгутиковым простейшим организмам; проглатывание цист лямблий, приводит к инфицированию, главным образом, тонкого кишечника. Из-за повсеместного распространения этот организм имеет решающее значение в развитии хронической ослабляющей диареи, а также диареи путешественников. Инфицирование происходит путем заглатывания цист Giardia lamblia с водой или пищей, загрязненными фекалиями. В Соединенных Штатах Giardia lamblia – наиболее распространенный инфицирующий агент, обнаруживаемый во время вспышек диареи, вызываемой загрязненной водой. В развивающихся странах Giardia стоит на первом месте среди кишечных патогенов, инфицирующих детей моложе 10 лет, с частотой заболеваний около 15-20%. Обычно лямблиозы распространены в слоях населения c низким уровнем личной гигиены и антисанитарными условиями приема пищи и посещения туалета. Лямблиозы передаются от человека к человеку. Такие пути передачи инфекции наблюдают среди детей в центрах медицинской помощи, среди сексуально активных мужчин-гомосексуалистов (до 19%), а также среди людей, живущих в учреждениях закрытого типа (больница, тюрьма). У многих инфицированных маленьких детей есть симптомы заболевания, которое распространяется внутри семьи и среди лиц, их окружающих. Дети более старшего возраста иногда инфицируются цистами простейших без видимых симптомов заболевания, при этом они являются носителями цист, периодически выделяя их и оставаясь источником инфекции для других людей. Лямблиозы можно характеризовать как острую или хроническую диарею. Инкубационный период длится от 3 до 42 дней. Клиническим проявлением симптомов острой инфекции является внезапный водянистый кал, спазмы в брюшной полости и вздутие живота. У пациентов возникает чувство недомогания, тошнота и потеря аппетита, реже бывает рвота и лихорадка; кровь, гной и слизь обычно отсутствуют. В прошлом наиболее обычным способом диагностики криптоспоридийного энтерита было исследование кала на наличие ооцист, а лямблиоза – на наличие трофозоитов или цист. Исследование кала проводилось методами микроскопии и окрашивания, требующими наличия квалифицированного опытного лабораторного персонала. Кроме того, такое исследование необходимо проводить в течение всего времени, когда может происходить периодическое выделение паразита. Эквивалентный метод диагностики – иммунохроматографический тест для обнаружения антигенов Cryptosporidium parvum и Giardia lamblia в образцах кала. Метод демонстрирует ту же чувствительность, что и микроскопия, не нуждается в опытном лабораторном персонале микробиологов и специалистовиммуноферментных тестов, он легок в исполнении, не требует много времени и не требует, чтобы в образцах кала присутствовали интактные организмы (ооцисты, трофозоиты или цисты).
Принцип метода
RIDA®Quick Cryptosporidium/Giardia Combi является одностадийным тестом, основанным на иммунохроматографическом принципе. Для определения подходят только свежеприготовленные образцы кала.
Регистрационное удостоверение
Реклама
Тест-системы для экспресс-диагностики без использования приборов - обзорный буклет (наборы экспресс-тестов Human, R-Biopharm, Standard Diagnostics, Veda.Lab)
Инструкция
(За версией инструкции для конкретного лота диагностического набора/реагента обращайтесь в отдел продукции ЗАО " Аналитика " )
Сергей Куторов, ветеринарный врач (медицина рептилий и амфибий)
В. Что такое криптоспоридиоз?
О. Заболевание, вызываемое криптоспоридиями (простейшие паразиты), проявляющееся, как правило, расстройствами в желудочно-кишечном тракте.
В. Кто болеет?
О. Это актуально для змей и ящериц, в первую очередь.
В. Откуда он взялся у моего животного?
О. Логично предположить, что паразит, локализирующийся в желудочно-кишечном тракте, должен туда попасть так же, как туда попадает всё остальное - через рот. Соответственно, речь идет в первую очередь о корме и воде, содержащих ооцисты криптоспоридий. Также немаловажное значение имеет гигиена, поскольку ооцисты криптоспоридий весьма выносливы и могут находиться в самом террариуме, что обусловливает загрязнение даже "чистого" корма уже на месте. Также от террариума к террариуму их могут переносить насекомые (тараканы, бегающие по помещению и заползающие в террариумы - не есть хорошо). То есть необходимо понимать, что криптоспоридиоз - это, в первую очередь, болезнь грязных террариумов (пусть и любители чистоты также от него не застрахованы).
В. Как он проявляется?
О. Есть три формы его проявления: желудочная, кишечная и ауральная. Желудочная форма характерна для змей: патология заставляет просвет желудка уменьшиться или вовсе закрыться, ход КО по ЖКТ таким образом блокирован и здесь ничего не остается, кроме как эвакуировать КО обратно (срыги). Кишечная форма характерна для ящериц: диарея (быстрое исхудание и обезвоживание, поскольку при любая диарея подразумевает потерю жидкости). Ауральная форма проявляется в виде абсцессов в ушной области (описана только у игуан). Соответственно, с такими проблемами, животное себя не будет нормально чувствовать, поэтому плохой аппетит или его отсутствие вкупе с общей слабостью также ожидаемы.
В. Как узнать, что у моего животного "крипто"?
О. Для начала нужно понимать, что есть непосредственно заболевание, а есть, так называемое, носительство. Потенциальный носитель - животное, пролеченное в прошлом от проблем, которыми страдало из-за паразита. Рептилия вполне может жить дальше, но будет выделять ооцисты, которые будут заражать восприимчивых животных. Сама по себе диагностика сводится к нахождению паразита или его следов при анализах: смыв с желудка (если речь о змее) или анализ кала (если речь о ящерицах). Далее проводят исследование окрашенных мазков (окраска по Цилю-Нильсену) на месте. Кроме того, могут назначаться дополнительные исследования: экспресс-тест на криптоспоридиоз (быстро) или отправка материала на ПЦР (дольше). Мы используем в своей практике экспресс-тесты, но только для того, чтобы в сомнительных случаях проверить результат исследования окрашенного мазка. Следует отметить вероятность нахождения транзитных ооцист криптоспоридий (опасных для других видов животных). При необходимости назначаются и другие методы диагностики (гистологическое исследование).
В. Змея срыгнула! Криптоспоридиоз?!
О. Массовая истерия по этому поводу бессмысленна и как минимум забавна. Змей с рвотой проверяют на криптоспоридиоз не потому, что он там обязательно есть, а потому, что из болезней, подразумевающих рвоту, исключить/подтвердить криптоспоридиоз проще всего, на месте сделав мазок, а потом приступить к остальной диагностике. Так или иначе, лишним это точно не будет. Прежде чем впадать в истерику и судорожно искать "великий и ужасный" там, где вообще не факт, что он есть, нужно перепроверить наличие погрешностей в работе самого кипера (перепад температур, слишком большой КО, привычка тревожить поевшую змею), пока животное транспортируется к ветеринарному врачу. Еще раз: криптоспоридиоз у змей, как правило, подразумевает рвоту, но не любая рвота у змеи подразумевает криптоспоридиоз. То же самое и с диареей. Нужно просто перепроверить себя и посетить врача.
В. И как теперь относиться к этой болезни [паника]?
В. Как лечить криптоспоридиоз?
О. Походами к врачу и выполнением соответствующих назначений. Скажем так, существует ряд схем лечения животных с криптоспоридиозом, но ни одна из них не гарантирует излечение по ряду причин, а препараты - не из дешевых. Кроме того, необходима также и дополнительная терапия по ситуации, в зависимости от состояния. Животных с запущенными случаями эвтаназируют. Мониторинг состояния животных и эффективности терапии проводят путем систематических анализов (в среднем каждые 3 недели).
В. Что делать с трупами?
О. В морозильной камере криптоспоридий не обезвредить, поэтому специально хранить их там нецелесообразно. От трупов нужно избавляться; полезно будет доставить их ветеринарному врачу для проведения вскрытия и дополнительного взятия материала на исследования. Это нередко оказывается весьма полезно.
В. Моя ящерица/змея больна криптоспоридиозом, лечение расписал врач, но каковы конкретно мои действия, как владельца?
О. Нужно изолировать больных и подозрительных животных. Ооцисты криптоспоридий устойчивы к основной массе доступных дезинфектантов. По литературным данным рабочим методом является применение аммиака или формалина с экспозицией на сутки (самим только не стоит экспериментировать с этими веществами — это очень опасно для здоровья и жизни человека; предварительно проконсультируйтесь со своим ветеринарным врачом — он расскажет о применении этих веществ предметно), затем отмывание террариумов, прокаливание инструментов и предметов декора. От всего, что не получилось прокалить, предпочтительнее избавиться вовсе. После всех мероприятий лучше оставить террариумы пустыми и не заселять туда никого хотя бы пару-тройку месяцев. Если же речь идет не о коллекции, а об одиночно содержащихся особях, то тогда, раз нет других восприимчивых животных, можно посоветовать все отмыть, что возможно - прокалить, и не подселять к пролеченному животному никого во избежание возможности заражения новоприбывших (пролеченные нередко остаются носителями - см.выше). И пересмотрите свой подход к вашей коллекции с точки зрения гигиены: быть может, дело в ней.
В. У меня в коллекции все хорошо, но очень боюсь что-то проглядеть и допустить возникновение криптоспоридиоза, как быть?
О. Гигиена, карантин новоприбывших, анализ кала. У нас, к примеру, "стандартный пакет" для новоприбывших исследование кала методом флотации и исследования мазков кала - нативного и окрашенных по Цилю-Нильсену и Diff-Quick (модификация по Романовскому).
В. Что делать с носителями?
О. Содержать отдельно — вне коллекции, не допуская пересечения с любыми восприимчивыми животными. Больные ящерицы вряд ли заразят змей, а больные змеи вряд ли заразят ящериц, но вероятность этого всё равно есть. Самый идеальный вариант, альтернативный крайнему (эвтаназии) — любитель, содержащий лишь одну особь и о коллекции не задумывающийся.
В. Это опасно для людей?
О. Опасность возможна, но ее вероятность мала. Есть некоторые виды криптоспоридий, поражающие людей с иммунодефицитом, но не о них, как правило, стоит вопрос при заболевании у рептилий. Не стоит забывать о гигиене.
и 'МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХС-ШЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРПЦИИ САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ВЕТЕРИНАРПНЯ ИНСТИТУТ
На правах рукописи УДК 619:818.093.192.1:816-053.2
АЛИЕВ А*и Абакаровяч
полно этот вопрос изучен при криптоспоридиозе с разными формами иммунной недостаточности (¿ayer.Ungar R.L., 1988;Шибалова Г.А.1907, Алиев А.А. и др.1992).
Несмотря на некоторые успехи в изучении криптоспоридиоза.он продолжает оставаться значительной актуальной проблемой ветеринарии и медицины.Особенно слабой стороной в изучении ?-гой проблемы явля--е'. :я лечение и профилактика криптоспоридиоза.
Исследователями испытаны с лечебной и профилактической целью многочнеле.нные химические и химико-терапевтические средства.включая кокцидиостатики,антипаразитарные препараты,антибиотики широкого спектра действия.Однако,надёжных средств.полностью удовлетворяющие требованиям терапии и профилактики криптоспоридиоза,пока не найдено
Трудности борьбы с криптоспоридиозом усложняются репродуктивной способностью возбудителя.В 1г фекалий больные криптоспоридиозом телята выделяют во внешнюю среду до 74 млн.ооцист,устойчивых к большинству дезинфицирующих средств и сохраняющих свою инвазиоь ■ ность до года и более (Stein Б.,1983).
Отсутствие надёжных медикаментозных средств,способных воздействовать на развивающиеся эндогенные стадии паразита в организме хозяина,а также на ооцисты криптоспоридий во внешней среде,обуглов-ливлют стимул и большую необходимость поиска новых средств и системы борьбы с криптоспоридиозом.Решение этиt проблем з значительной степени может быть облегчено путём использования модельной системы клеточной культуры,с целью изучения биологии возбудителя, пар,тзп-то-хозяинных отношений,предварительной экспресс-оценки фармакологических средств и механизма их дейстгия в отношении криптоснорндмл.
Актуальность проблемы криптоспооридиоза млекопитающих определила цель и задачи наших исследований. Цедь п. задачи исследований..
Провести изучение методов диагностики криптоспооридиоза,культивирование Cryptosporidium parvum в клетках культуры тканей,получение модельь,й системы (тест-объекта) и проведение экспресс-оценки фармакологических средств in vivo и in vitro.Изучение ультраструктурнсй организации эндогенных стадий С.parvus,пара-зито-хозяинных отношений на лабораторной модели и механизма действия препаратов.
Б соответствии с реализацией поставленной цели были включены для решения следующие задачи:
1.Провести сравнительное изучение методов диагностики крип-тоспоридиоза с использованием лабораторных моделей.модельных систем и спонтанно больных животных.
2.Отработать и усовершенствовать методы получения биомассы возбудителя крилтиспоридиоза млекопитающих о.parvum.
3.Провести отработку методических приёмов эксцистирования споро-титов из слорулированкых ооцист С,parvus) in vitro.
4.Отработать и усовершенствовать в клетках культуры тканей культивирование С.parvum со стадии спорозоитов,эксцистированных in vitro.
5.Изучить ультраструктурную организацию эндогенных стадий C.parvun с помощью методов сканирующей и трансмиссионной электронной микроскопии.
6.Разработать методы и методические приёмы экспресс-опенки Фармакологических средств в отношении инвазионных стадий эндогенного развития С.parvum на экспериментальной модели in vWo и in vitro.
7.Изучить влияние иммуностимулятора,а также сочетание" имму-. ¿ла и паразито-хоэяинных 'отношений у i^иптоспоридий.способности паразита развиваться не только ьа лове гности клетки,но и внутриклет!>чно .
.'..чип характеристики ультраструкгу fiioi! организации эндогенных ■мадин С .<••>)• VJ« с помощью методов сканируют"' и электронной микроско -
пии и ультратонких срезов,а также показаны паразито-хозяинные отношения на лабораторной модели.
Получены новые данные по использовании модельной системы для экспресс-оценки высокоэффективного антикокцидийного препарата с полным спектром действия-стенерола (гсэллофугннона) в отношении эндогенных стадий С.рагуит и показан механизм его действия на лабораторной модели.
Получены новые данные по испытанию иммуностимулятора - лак-толена,а также сочетание иммуностимулятора с кокцидиоцидннм , препаратом при экспериментальном и спонтанном криптоспоридиозе животных.
Предложены в неблагоприятных хозяйствах по криптоспоридиозу новорождённых телят лечебно-профилактические мероприятия с применением иммуиостимулятора-дактолена и сочетанного использования иммуностимулятора с кокцидиостатическими препаратами (стереролом и хи-миркоком),позволившие определить один из реальных путей в системе борьбы с криптоспоридиозом-зоонозом.с учетом вете[инарно-меди-цинского значения.
Отработаны и усовершгнствованы методы получения биомассы возбудителя криптоспоридиоза млекопитающих на примере Cryptosporidium parvum,a также эксцистирования спорозоитов из спорулированнг'х . ооцист in vitro,их обезвреживание от кишечной микробной контамнна-ции; биомасса инвазионных стадий возбудителя может использоваться для культивирования в модельных системах-клетках культуры тканей ,эмбрионах,в биотехнологии,генной инженерии,для получения диагностических и профилактических средств.
Разработанный метод культивирования криптостпоридий в клетках культуры«позволили получить удобную модельную систему-тест объект для экспресс-оценки различных веществ,с целью поиска антикриптоспо-ридийных средств.
Модельная система-культура клеток позволила проведение экспериментов в стерильных условиях.контролировать степень экспериментальных параметров,а также иметь экономически выгодные условия использования небольшой дозы испытываемых средств,минимального числа экспериментальных 'животных,экономию времени в 2-3 раза.Устраняются ошибки влияния факторов кормления экспериментальных животных,сезона года,внешней среды и других факторов.
Полученные данные характеристики ультраструктурной организации эндогенных и экзогенных стадий" Cryptosporidium parvum и экспресс-оценка кокцидийного препарата стенорола найдут применение в курсах лекций,лабораторно-практич?ских занятиях и будут использованы в соответствующей научной и научно-практической литературе.
Материалы настоящих исследований подготовлены для представления в качестве методических наставлений и заявки ira изобретение.
Материалы диссертации были предстамены на заседании кафедры паразитологии им.проф.Якимова 1 слегка продолговатую форму.с диаметром 5-6 мкм.Иногда внутри окрашенной ооцисты удаётся рассмотреть очертания спорозоитов с тёмнь'чи включениями .Фон и сопутствующая микрофлора окрашены в зелёный цвет.
В то же время,в красноватый цвет могут быть окрашены капельки, жировых веществ или кусочки дебриса,содержащиеся в Фекалиях.
Однако,не все ооцисты приобретают ярко-пурпурный цвет.Часто в мазках наблюдали бледно-розовые или совершенно неокрашенные клетки возбудителя.При использовании качественных красителей данный метод является демонстративным и надёжным для выявления ооцист криптоспоридий.
Этот метод мы считаем также надёжным,позволяющим выявление эндогенных стадий развития паразита.
В препаратах из Фекалий,окрашенных указанным способом.ооцисты Приобретают вид неокрашенных или слабоокрашенных по периферии образований.При внимательном изучении в ооцистрк можно обнаружить спо-роэойты голубоватого цвета с небольшим розовым ядром.
В эндогенной стадии паразиты окрашиваются в голубой или бледно-голубой цвет с тёмными включениями и ярко-розовым (одним или пескол). ими,в зависимости от стадии развития) ядром,Данная окраска позволяет дифференцировать меронты,микрп-.иакрогамонты.созревающие и С1?ррртие ооцисты.Окраска препаратов занимает около одного
часа,исследование проводят в иммерсионной системе микроскопа. Исс ле лдддииа-ыахидыих. гшедзаатрз .дгигатд влек нш ад на ишгшиаи
Данный метод исследования может явиться весьма трудным для начинающих специалистов,т.к.отличить ооцисты криптоспоридий от других .сходных по морфологии клеток.содержащихся в фекалиях.бывает непросто.когда интенсивность выделения паразита не велика.
Ооцисты Cryptosporidium представляют собой небольшие округлые образования с тонкой оболочкой.внутри которых находятся 4 бледно-зелёных банановидных спорозоита.Исследование проводится без иммерсии (объектив*40,окуляр*10).
Обнаружение эндогенных стадий паразита в соскобах слизистой оболочки также может быть затруднено,т.к.в кишечном содержи.¡ом находится большое количество разнообразных микроорганизмов.остатков корма,элементов крови и других частиц.Но.поскольку,эндогенные стадии паразита находятся на поверхности эпителиальных клеток,то при высокой степени заражения,этот метод диагностики может быть довольно объективным.
Данный метод исследования нативного мазка является,по наисну мнению,одним из надёжных.точных и быстрых в выполнении.Благодаря флотационному свойству глицерина ооцисты поднимаются в верхние слои препарата,дебрис и микрофлора остаются в нижнем,что облегчает исследование.
При добавлении глицерина в каплю фекалий ооцисты криптоспоридий приобретают слегка розоватый цвет и становятся хорошо различимы.В ооцистах чётко выявляются спорозоиты.Другие простейшие и частицы не обладают свойством менять свой цвет под влиянием глицерина.
Такая окраска оогчст криптоспоридий может исчезнуть через 30-40 минут после приготовления нативного препарата.Однако,этого времени вполне достаточно для исследования,даже при высокой интенсивности выделения ооцист.В связи с этим,необходимо исследовать под микроскопом только свежеприготовленные препараты.Исследование проводится при увеличений микроскопа 40x10.
Данный метод чаде всего применяют для выделения я сбора ооцист из исследуемого материала.Было необходимо провести сравнительный анализ различных Флотационных растворов и отдать преимущество позволяющим получить наибольшее количество биомассы возбудителя.
Концентрированную массу спороооитов в мерной центрифужной пробирке разбавляли до необходимого объема стерильной питательной рос uvBC "i средой,той которая использовалась для гсотчетструклчик кле-ioV- гультуры,подсчитывали в камере Горясга и Н'*п р-му.Эгнм они отличаются от других кокпидий.Микрогаметы отпочковываются от остаточного тела.
Спорогония у криптоспоридий происходит при внутриклеточной локализации в паразитофорной вакуоли Сформированные четыре спорозо-ита имеют удлинённую форму и двухмембранную пелликулу.
Процесс формирования ооцист у экспериментально заражённых крысят наблюдал> на 4-5 .-утки лосле заражения.На 10-е сутки число ооцист значительно увеличивается,что совпадает с пиком выделения возбудителя во внешнюю cpt-ду.
Выраженные ультраструкгурные изменения кишечника у экспериментально заражённых животных отмечены на 7-10 сутки.Наблюдается полная атрофия микроворсинок;гликокаликс редуцирован или отсутствует,цитоплазма энтероцитов вакуолизирована.Помимо этого было заметно выражен внутри- и межклеточный отёк энтероцитов,набухание митохондрий, инфильрациЕ слизистого слоя макрофагами и лимфоцитами нейтрофи-лами,выход эритроцитов в просвет кишечника из поражённых сосудов .Наибольшему поражению была подвергнута подвздошная кишка у экспериментально заражённых животных.Структурных видовых отличий паразита на разных стадиях жизненного цикла у мышат или крысят не выявлено.Однако,у крысят паразит локализировался не только в подв-эдоиной кишке,но и в двенадцатиперстной и тощей кишкау. 2.9.Экспресс-оценка фармакологических средств в отношении Cryptosporidium в модельной сиситеме-клетках культуры тканей in vitro.
В серии проведённых экспериментов было показано,что клеточная культура является модельной системой для развития эндогенных стадий Criptosporidium,включая елорудирование ооцист.Эти данные позволили нам считать,что имеется удобная модель,которую можно использовать для проведения экспериментов в стерильных.строго контролируемых условиях,с целью экспресс-оценки различных фармакологических средств.
Анализ проведённых экспериментов по определению воздействия кокцидиоцидного препарата - стенорола на инвазиочные стадии паразита.ответственные за заражение хозяина-спорозоиты C.pacvun (эксцистированные in vitro) показал,что стенорол в котцентрации 0,02 мкг/мл в питательной среде ингибировал спорозоиты.Эти эксперименты выполнялись В определённых условиях-.первоначально свободные спорозоиты находились в течение 4-х часов в питательной среде,содержащей 0,02 мкг/мл стенорола,после непосредственного контакта -спорозоитов с препаратом, экспериментальный материал (спорозоиты со стеноролом в питательной культурной ср^де "Игла") были «нокулирова-ны на монослой клеток культуры тканей почки телёнка "ТАУ-РУС-1".Контроль за спорозоитами в клеточной культуре продолжался в течение 96 часов.Внедрившихся в клетки спорозоитов не наблюдали,да- • же в тех опытах где препарат был удалён из среды через 12 часов и проведена замена опытное питательной среды на контрольную.
Б серии экспериментов по оценке г.нтикриптоспоридиозного действия стенорола в той же концентрации (0,02 мкг/мл .среды) на развивающихся паразитов в клеточной культуре (на стадии троФоэои-тов.не сегментированных меронтов).Установили,что препарат не оказывал полного ингибирующего воздействия.Стенерол вносили в среду через 12-24 часа после инокуляции спорозоитов на выросший моносяой клеток почки телёнка "ТАУРУС-1".Через 48-72 часа в препаратах лэ экспериментальных клеточных культур наблюдали только меронты с сегментированными мерозоигами и' отдельные мерозоигм,внедрившиеся в клетки хозяина.Однако,через" 84-9S часов дальнейшего развития паразита не происходило.Не удалось обнаружить половых стадий криптоспо-
ридий.В контрольных клеточных культурах в этот период развивались все эндогенные стадии паразита,включая спорулироьанную ооцисту. 2.10.Изучение эффективности стенорола на течение экспериментального криптоспоридиоза у мышей.
Для изучения антикокцидийного препарата стенорола на течение экспериментального криптоспоридиоза у мышей,вызываемого С.рагуиш били подобраны следующие подопытные группы:
1 - мышатам давали стенорол за сутки до заражения и одновременно с заражением,с профилактической целью.
2 - животным этой группы вводили препарат на 3,4,5 сутки после заражения с лечебной целью.
3 - контрольные животные,заражение которых проводили одновременно с 1 и 2 группами.Препарат мышатам не задавали.
:■■:.; г л;! i: ' .v Je си'1--ргичсскую смесь .содержащую в сроем составе хим-
кокцид,ирамин и наполнитель.С лечебной целью хкмиркок использовали из расчёта 10 гр.хЮ кг корма,девятидневным курсом.
Исследования показали,что у кроликов контрольной (11-й группы, заражённых) на 5-6 сутки появилась диарея,а спустя 8-3 суток после заражения был выражен симптомокомплекс криптоспоридиозной инвазии, с максимальным выделением ооцист криптоспоридий до 20-25 в полз зрения микроскопа.
В этот же период и животные IIX-й группы не заболевали крип-тоспоридиозом,хотя единичные ооцисты криптоспоридий животные выделяли в течение 2-3 суток.
У подопытных животных IV и V групп получен высокий лечебно-профилактический эффект.В течение 3-5 суток наблюдали выздоровление животных и резкое снижение числа ооцист криптоспоридий до единичных.
При оценке иммунного статуса животных контрольных и подопытных групп на десятые сутки после заражения и лечения,выявляли достоверные различия ряда иммунологических показателей (Т- и в-лим-Фоцитов).
Полученные обнадёживающие результаты по профилактике лечения криптоспоридиоза в условиях эксперимента были с успохом использованы в производственных условиях.
В неблагополучных по криптоспоридиозу хозяйствах 1-2 суточным телятам,до проявления симптомокомплекса болезни,с целью иммуно корректирующей профилактики криптоспоридиоза применяли иммунномодуля-тор-лактолен.Одно- двукратное введение препарата,® зависимости or Физиологического состояния новорождённых телят позволяло предотвратить заболевание криптоспоридиоэом.У таких телят отсутствовали признаки диареи и они не выделяли ооцист криптоспоридий.
Во второй серии опытов телятам 5-6-10 суточного возраста с выраженным симптомокомплексом криптоспоридиозной инвазии и выделением ооцист криптоспоридий.применяли сочетании? препараты:лактолен и один из кокцидиостатических препаратов (стенорол или хикиркоч) по схеме.описанной в лабораторных экспериментах.Всего в неблагополучных по криптоспоридиозу хозяйствах Ленинградской и Псковской областей оказана реальная помощь 280 телятам.' •
1.Получены новые данные по сравнительное ' изучению методов лабораторной диагностики криптоспоридиоза,распространению,роз раст-ной динамике и симптомокомплексу болезни телят в некоторых районах Северо-Западной зоны Российской Федерации (Ленинградская,Псковская обл.).
2.Отработаны и усовершенствованы методы получения биомассы возбудителя криптоспоридиоза млекопитающих-Cryptosporidium parvus.а также эксцистирования спорозоитов из спорулированнных ооцист in vitro.
Эти методы позволяют получать биомассу инвазионных стадии возбудителя.которая может использоваться для культивирования в модельных системах-клетках культуры тканей,эмбрионах,в биотехн:до-гии,генной инженерии,для получения диагностических и профилактических средств.
З.Иолуч,эны новые данные оригинальных исследований по культик-poBiimw спорозоитов C.parvun и развитию их в клетках культ,vru тк-ч-Ной .которые имеют принципиальное значение для Сохез глуСоктг пом,: и;шня щ'.чч'нно^'гой течения гиэменного цикла кгинтг-опчп'Л''''' •т-т' "mw лечебно-профилактических мероприятий.
Полученные данные экспериментальной работы.включая ультра^т-гукт-,", itst«? характеристики простейшего, рекомендуем использовать в курсах лгкцкп , лабораторно-практических занятиях,а также при и?д;птии
соответствующей учебной и научно-практической литературы.
Материалы настоящих исследований .выполненных в диссергацион ной работе,подготовленны для представления в качестве методических рекомендаций и заявки на изобретение. Список работ,опубликованных по теме диссертации.
1.Перспективы использования оптического излучения для профилактики парзитоценоэов и повышения племенного промышленного птице -водетва.//Сборник научных трудов ЛВИ.1988(соав.Т.А.Шибалова,Е.С?Ма-зин,М.Н.Тагворян).
2.Возможные компоненты паразитоценоза.// Тезисы III всеюэ съезда парзитоценологов.Киев.1991 (соав.Т.А.Шибалова,Н.Ф.Павласек, Н.В.Касаткина).
3.Cryptosporidium кроликов.//Цитология,1992,т.34(соав.Т.А.Ши• балова, А.Е.Зацепин,(О.Ю.Розанов).
4.Перспективы использования иммуностимуляторов в сочетании с химическими препаратами при криптоспоридиозе.//Цитология,1992,т.34 (соав.Н.В.Касаткина,Т.А.Шибалова,И.Ф.Павласек).
5.Поиск экспериментальной модели-как основа для изучения жнэ ненного цикла возбудителей криптоспоридиозов.//Тезисы дсклалов XJ конференция Украинского общества паразитологов.Киев. 1993. (соав Т.А.Шибалова.И.Ф.Павласек.Н.В.Касткина).
Читайте также:
