| D-0196 |
РеалБест ВИЧ ПЦР (комплект 2)
Набор реагентов для выявления РНК вируса иммунодефицита человека методом ОТ-ПЦР в реальном времени. Не содержит реагентов для выделения РНК.
![]()
Россия готовится к тотальному тестированию, новые тест-системы позволяют быстро провести масштабную проверку на вирус. К массовому выпуску приступил один из разработчиков нового продукта, два других начинают производство. Олег Гусев, ведущий научный сотрудник Научно-клинического центра прецизионной и регенеративной медицины Казанского федерального университета и института физико-химических исследований RIKEN (Япония) помог РБК Тренды разобраться в том, как устроено тестирование на коронавирус в России и в мире.
Что предлагает ВОЗ
Глава Всемирной организации здравоохранения Тедрос Гебреисус еще в середине марта призвал страны проводить как можно больше тестов на вирус, который вызывает заболевание SARS-CoV-2, даже людям без симптомов. Согласно руководству ВОЗ, анализы на коронавирус COVID-19 должны проводиться методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с обратной транскрипцией. Как говорится в рекомендациях, на сегодня это самый точный и надежный метод диагностики вирусной инфекции. Он позволяет определить даже очень небольшое количество РНК вируса в биологическом материале человека. Это помогает выявить болезнь в инкубационном периоде.
Изобретенный в 1983 году метод и сейчас считается фундаментальным в молекулярной диагностике. Американский ученый, который придумал способ значительного увеличения малых концентраций фрагментов ДНК в биологической пробе, получил за него Нобелевскую премию. Выявление ДНК/РНК методом ПЦР позволяет диагностировать такие заболевания, как ВИЧ, вирусные гепатиты, инфекции, передающиеся половым путем, туберкулез, боррелиоз, энцефалит и многие другие. Метод используют в археологии, криминалистике, генетике.
Как работает ПЦР-тест
Для анализа из физиологических жидкостей извлекают одноцепочечную РНК, моделируют на ее основе двуцепочечную ДНК и многократно дублируют с помощью специального фермента (полимеразы). Увеличение числа копий ДНК называется амплификацией. В результате концентрация определенных фрагментов ДНК/РНК в биологическом образце, изначально минимальная, значительно увеличивается. При исследовании копируется только необходимый для теста участок ДНК. И, конечно, дублирование происходит только в том случае, если искомый участок вирусной ДНК или РНК присутствует в исследуемом биоматериале. В случае с коронавирусом мазок для анализа берут из ротоглотки или носоглотки, поскольку в крови или в кале вирус появляется на более продвинутой стадии болезни.
Тест-система EMG — продукт совместной разработки российских и японских разработчиков, проводившейся с 2016 года, рассказывает Олег Гусев. На данный момент эти тесты включены в систему обязательного медицинского страхования в Японии.
В ближайшее время планируется производить до 2,5 млн. тестов и 1 тыс. портативных лабораторий в неделю. Сами тесты, как и многие реагенты производятся в России. Планируется, что цена на тесты EMG будет в среднем в пять раз меньше, чем на стандартные ПЦР-тесты в Европе.
Российско-японские тесты основаны на методе изотермальной молекулярной диагностики SmartAmp, превосходящем метод ПЦР по скорости работы в восемь раз, а переносная лаборатория позволяет тестировать до 20 пациентов в час, говорит Гусев.
Ключевое отличие теста EMG в том, что многие тесты, которые производятся сейчас, это тесты ИФА (имунноферментный анализ), а не ПЦР. Данные системы определяют антитела, которые организм начинает вырабатывать не ранее, чем через неделю после заражения. Российско-японская разработка позволяет получать результат уже за 30 минут, с точностью, равной почти 100%. Кроме того, тест EMG позволяет определить наличие вируса уже на самых ранних стадиях, в то время как другие системы диагностики короновируса обладают меньшей чувствительностью и не могут выявлять вирус на ранней стадии инфицирования.
Принцип технологии российско-японского теста, по сути, не отличается от классической ПЦР — это наращивание количества целевых фрагментов ДНК и их детекция. Однако в изотермической амплификации, в отличие от классической ПЦР, где необходимы циклы нагрева и охлаждения, все происходит при одной температуре. Это позволяет многократно увеличивать скорость реакции. Метод SmartAmp был изобретен более 15 лет назад (как и LAMP — другая популярная технология изотермальной амплификации, предшествующая SmartAmp). Впервые для инфекционных заболеваний эту технологию применили в 2009 году для быстрого выявления пандемического гриппа (H1N1) в Японии.
Повторные тесты необходимы при любом методе. Отрицательный тест на COVID-19 не гарантирует, что человек не заразится этим вирусом на следующий день. Поэтому, например, в японских лабораториях персонал тестируют каждые несколько дней. Повторный тест нужен и для того, чтобы подтвердить, что человек излечился.
Эта тест-система будет использоваться для диагностики COVID-19 не только в России и Японии. 40 тыс. тестов закупила Австрия, поступили заказы из других стран Европы, Ближнего Востока, и Латинской Америки. Подана заявка в Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов США (FDA) для поставок в эту страну.
На данный момент в России прошли регистрацию еще три теста на коронавирус.
По некоторым данным, в Москве проводится около 700 тестов на коронавирус в сутки. В планах у московских властей увеличить этот показатель до 10 тыс. тестов в сутки, а затем довести его до 25—28 тыс. тестов ежедневно.
Новые разработки за рубежом
Компания Bosch выводит на рынок свой тест на коронавирус, который сначала будет доступен в Германии, а вскоре появится в других странах. В его основе лежит диагностический аппарат Vivalytic, который, по словам изготовителей, станет первым автоматизированным тестом на COVID-19. Тест распознает не только коронавирус, но еще шесть респираторных заболеваний, например, вирусы гриппа А и B. Во время лабораторных испытаний аппарата его точность составила 95%.
Как пишет издание ZME Science, анализ может проводиться прямо в стационаре или медицинском центре — не нужно отправлять образцы в лабораторию и ждать, пока придет ответ. Врачи смогут быстрее идентифицировать и изолировать зараженных, а пациентам не придется пребывать в неизвестности несколько дней. Тест прост в обслуживании и не требует специальной подготовки. Медперсоналу нужно только взять мазок из носа или горла пациента, нанести его на картридж, содержащий реагент, и вставить картридж в анализатор. Каждый аппарат может выполнять до десяти анализов за 24 часа.
Еще более оперативный тест на COVID-19 разработали в Великобритании. Он позволяет выявить COVID-19 всего за 30 минут. Чтобы провести его, достаточно портативного оборудования стоимостью около $120 и набора полосок для мазков из носа и горла по $5 каждая. Одновременно проходить тест могут до шести человек.
FDA в экстренном порядке одобрило сверхбыстрый тест на коронавирус, разработанный калифорнийской компанией Cepheid. С его помощью диагноз можно будет поставить всего за 45 минут. Как отмечает Business Insider, для обработки результатов теста не требуется специальное обучение. Нужен лишь доступ к системе Cepheid GeneXpert — в США их 5 тыс., а по всему миру — 23 тыс.
Начало тотального тестирования людей на COVID-19 во всем мире — хорошая новость как для людей, так и для национальных органов здравоохранения. До сих пор в мире нет четкого представления о том, сколько людей заражены коронавирусом и выявление тех, у кого он уже есть: их госпитализация или отправка на домашний карантин позволит быстрее оценить масштаб угрозы и вовремя принять правильные меры.
![]()
Фоновое изображение: Realstock | Shutterstock.com
Что должен включать набор для выявления РНК коронавируса в образцах? Три компонента: реагенты для экстракции РНК, реагенты для обратной транскрипции, то есть перевода РНК в ДНК, и реагенты для ПЦР. Последний компонент состоит из ферментов, буфера и праймеров — олигонуклеотидов, комплементарных каким-либо последовательностям генома коронавируса.
Однако обычно тест-системы включают еще и внутренний контрольный образец — молекулу РНК, защищенную от действия нуклеаз, которую при анализе добавляют в образец на первой стадии — стадии выделения, чтобы она вместе с мишенью проходила все этапы лабораторного исследования и в конце дала свой собственный сигнал, который покажет, что на всех этапах все было хорошо.
У уже зарегистрированного набора ЦСП чувствительность как раз 10 3 в мазках со слизистой (так указано в инструкции к набору, которая имеется в распоряжении редакции). По нашей информации, примерно такой же чувствительности добиваются в разработке НИЦ им. Н.Ф. Гамалеи.
Чем плоха низкая чувствительность? Возможна ситуация, когда пациент явно инфицирован, но концентрация вируса в пробе у него ниже, чем 10 5 . В этом случае результат тестирования будет отрицательным. Тест не выявит начало заболевания, либо слишком рано будет принято решение о том, что выздоравливающий пациент больше не выделяет вирусы и не может никого инфицировать. А он ходит по улице, и он заразен. (По данным китайских исследователей, выделение вируса может продолжаться до 37 дней.)
С ложноотрицательными результатами теста разобрались. Теперь о ложноположительных срабатываниях, то есть о специфичности. Любой тест может показывать у некоторого числа здоровых людей заболевание. В спокойной обстановке в этом нет ничего страшного, поскольку можно десять раз перепроверить анализы у каждого пациента. Совсем другое дело — ситуация эпидемии. В этом случае диагностика опять выдает управленческим структурам недостоверную информацию о количестве инфицированных, принимается решение о проведении клинических и лечебных мероприятий в отношении пациентов, которые вообще не болеют. Ресурсы здравоохранения направляются на ложные цели.
Однако это вопрос про праймеры для реакции амплификации. Если праймеры специфичны именно к этому вирусу, то все хорошо, если же праймеры могут отжигаться на нецелевую мишень, то получим ложнопозитивный результат. К сожалению, саму последовательность праймеров многие разработчики — не все — держат в секрете, поэтому редакция не располагает информацией, на гены каких именно белков и на какие участки этих генов они созданы.
С другой стороны, ВОЗ пишет, что в настоящее время известно о циркуляции среди населения четырех сезонных коронавирусов (HCoV-229E, -OC43, -NL63 и -HKU1), которые, как правило, вызывают заболевания верхних дыхательных путей — от легких до средней тяжести. Поэтому испытания теста должны проводиться на как можно более широкой панели, чтобы отсечь ложные срабатывания. Желательно, чтобы образцы были от пациентов, либо в панель должны быть включены вирусы, генетически наиболее близкие этому коронавирусу и достаточно широко распространенные.
Сколько именно неспецифичных срабатываний дает тест, сказать нельзя, но из общих соображений эксперты называют цифру до 10%.
По тест-системам, разрабатываемым другими группами, у редакции достоверной информации нет.
Теперь самый болезненный для общества вопрос: какие структуры могут диагностировать коронавирус SARS-CoV-2 в России? И вопрос, который следует из первого: будут ли использованы разработки тех организаций, которые мы перечислили выше?
Что это значит? Это значит, что СанПин позволяет работать с вирусами из II группы методом ПЦР в условиях III–IV группы. Так, например, работают по всей стране с ВИЧ, который тоже отнесен ко II группе. В том случае, если опасный патоген не собираются наращивать в культуре или инфицировать им лабораторных животных, а исследуют его генетический материал, пробирку с образцом открывают в ламинарном шкафу и добавляют в нее вещество, разрушающее вирус (например, гуанидинизотиоцианат). После этого фактически речь идет не о вирусе, а о его белках, ДНК или РНК.
Тем не менее сейчас круг лабораторий, которые могут диагностировать инфекцию SARS-CoV-2, ограничен Роспотребнадзором.
Понятно, что если коммерческие лаборатории в России захотят проводить тестирование на SARS-CoV-2, то они смогут воспользоваться любой тест-системой, которая получит регистрационное удостоверение. Однако неясно, как в этом случае будет выстраиваться взаимодействие с системой Роспотребнадзора.
Отсутствие конкуренции — это рай?
Когда в мире произошла вспышка атипичной пневмонии, в 2003 году четыре организации в России разработали ПЦР-тесты на выявление возбудителя — коронавируса SARS-CoV. Роспотребнадзор издал приказ о сравнительных испытаниях. Был очень быстро получен вирус, и все разработчики могли испытывать на нем свои системы. Сравнительные испытания проводились в 48 ЦНИИ МО РФ, панели контрольных образцов были зашифрованы. Затем результаты всех тестов вскрыли и сравнили.
Довольно большая разница с тем, что происходит сейчас, не так ли?
Все наши источники сходятся в том, что нужно дать возможность работать с клиническим материалом и применять свои тест-системы и государственным и коммерческим игрокам этого рынка. Но сейчас в условиях распространяющейся эпидемии только структуры Роспотребнадзора (и то не все) имеют эксклюзивное право на получение всех федеральных денег по этой тематике на исследования, разработку вакцин и тестирование препаратов, диагностику всех инфекционных материалов в сети своих организаций.
Как мы написали выше, мы не получили ответа от Роспотребнадзора на наш официальный запрос на информацию. В таком же положении находятся все СМИ в стране. Но мы открыты к сотрудничеству и с удовольствием опубликуем ответы на наши вопросы. Предварительно проверив, разумеется.
ВИЧ-1, РНК (HIV-1, ПЦР) плазма, кач.
Qualitative Detection of Human Immunodeficiency Virus type 1 RNA (PCR)
Информация об исследовании
Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) – это возбудитель хронической системной вирусной инфекции (ВИЧ-инфекции). Его относят к семейству ретровирусов, или Retroviridae. Вирусная частица представляет собой генетический материал (РНК), упакованный в белковую капсулу – капсид вируса, которая в свою очередь покрыта вирусной оболочкой, или суперкапсидом. На сегодняшний день известны два типа вируса – ВИЧ-1 и ВИЧ-2. ВИЧ-2 распространен преимущественно в западноафриканских странах.
ВИЧ-инфекция – медленно прогрессирующее заболевание, при котором происходит поражение иммунной системы с развитием синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИДа). СПИД – это терминальная стадия развития ВИЧ-инфекции, которая сопровождается широким спектром вторичных (оппортунистических) заболеваний. При СПИДе оппортунистические инфекции поражают все органы и системы ВИЧ-инфицированных.
После заражения вирус проникает в клетки, на поверхности которых представлен рецептор CD4 (кластер дифференцировки 4) – трансмембранная гликопротеиновая молекула. Такой рецептор есть только у одного типа клеток – Т-хелперов. Это популяция белых клеток крови (Т-лимфоцитов), которая играет ключевую роль в поддержании необходимого уровня адаптивного иммунного ответа, то есть реакции организма на чужеродные агенты. Это приводит к нарушению функции иммунной системы у ВИЧ-инфицированных.
Вакцины, предотвращающей заражение ВИЧ-инфекцией, не существует. Однако разработаны препараты для антиретровирусной терапии, которая позволяет остановить развитие ВИЧ-инфекции и предотвратить иммунодефицитное состояние.
Качественное определение РНК позволяет обнаружить ВИЧ-инфекцию до обнаружения антител к возбудителю ВИЧ-инфекции.
Анонимный анализ на ВИЧ
Согласно п.2, ст.8 ФЗ РФ № 38-ФЗ, пациент может анонимно сдать анализ на ВИЧ и получить результат по индивидуальному номеру заказа, не подлежащему разглашению. Тем, кто по каким-либо причинам не имеет возможности приехать на обследование в одно из отделений Лаборатории Гемотест, мы рекомендуем воспользоваться услугой по выезду медсестры для взятия крови с последующей регистрацией взятой пробы как анонимного заказа.
Обращаем Ваше внимание: результаты анонимных анализов на СПИД (ВИЧ) не могут быть использованы для профессиональных осмотров, госпитализации или предоставления лечащему врачу в поликлинике.
Результаты исследования на ВИЧ независимо от их результата выдаются только при личном обращении пациента в лабораторное отделение. При обследовании несовершеннолетних (до 14 лет) детей - законному представителю, указанному в заказе.
Результаты выдаются при предъявлении договора, сметы и документа, удостоверяющего личность самого пациента или представителя пациента, указанного в заказе.
По телефону и электронной почте результаты исследований не сообщаются.
ЕСЛИ АНАЛИЗ НА ВИЧ НАЗНАЧЕН В ЦЕЛЯХ ПОДГОТОВКИ К ГОСПИТАЛИЗАЦИИ ИЛИ ДЛЯ ПРЕДОСТАВЛЕНИЯ В ЛПУ, РЕГИСТРАЦИЯ ЗАЯВОК НА ЕГО ПРОВЕДЕНИЕ ОСУЩЕСТВЛЯЕТСЯ при обязательном предоставлении пациентом следующих данных:
1) Для жителей Москвы и Московской области
- Фамилия, имя, отчество
- День, месяц и год рождения
- Сведения о регистрации
- Паспорт
2) Для жителей других регионов РФ и иностранных граждан дополнительно – ксерокопию (скан) паспорта.
- Фамилия, имя, отчество
- День, месяц и год рождения
- Сведения о регистрации
- Ксерокопия (скан) паспорта
Сколько делают анализы на ВИЧ?
Результаты теста ИФА можно получить через 1 рабочий день, но не ранее 1,5-3 месяцев с момента предполагаемого заражения, результат ПЦР-диагностики можно узнать уже через 10 дней с момента предполагаемого заражения. Срок исполнения теста по методу Real-Time ПЦР составляет 3 рабочих дней.
Первичный анализ на ВИЧ - ВИЧ (АТ и АГ к ВИЧ 1/2 скрининг) .
Показания к назначению исследования
- Планирование беременности.
- Незащищенный половой контакт (не ранее, чем через 10–12 дней).
- Планирование донорства.
- Обследование лиц, принимающих инъекционные формы психоактивных веществ.
Противопоказания и ограничения.
Абсолютных противопоказаний нет.
Подготовка к исследованию
Специальной подготовки не требуется. Необходимо соблюдать общие требования подготовки к исследованиям.
Материал для исследования.
Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени.
Тест-система: Реал ВИЧ ПЦР Вектор-Бест (Россия)
Адрес: г. Новосибирск.
Телефоны: (383) 332-81-34.
Тест-система Вектогеп В-HBs-антиген (комплект 2)
ФСП 42-0117-5337-04, Срок годности 9 месяцев.Тест-системы иммуноферментные для определения HBs-антигена с использованием рекомбинантного антигена и моноклональных антител с чувств. 0,1 нг/мл по ОСО ГИСК, 192 анализа
Тест-система ВектоТоксо-IgG-авидность
Тест-система иммуноферментная для определения индекса авидности иммуноглобулинов класса G к Toxoplasma gondii, 6х8 анализов
Тест-система РекомбиБест антипаллидум – суммарные антитела
ФСП 42-0117-1055-01, Тест-системы иммуноферментные для выявления суммарных антител к Treponema pallidum с использованием рекомбинантных белков (совместная инкубация — 1 час), 192 анализа
Тест-система РекомбиБест антипаллидум – суммарные антитела – стрип
ФСП 42-0117-1055-01, Тест-системы иммуноферментные для выявления суммарных антител к Treponema pallidum с использованием рекомбинантных белков (совместная инкубация — 1 час), 12х8 анализов
Тест-система РекомбиБест антипаллидум – стрип
ФСП 42-0117-0281-00, Тест-системы иммуноферментные для выявления антител класса G к Treponema pallidum с использованием рекомбинантных белков. Срок годности – 1 год, 12х8 анализов
Тест-система РекомбиБест антипаллидум
ФСП 42-0117-0281-00, Тест-системы иммуноферментные для выявления антител класса G к Treponema pallidum с использованием рекомбинантных белков. Срок годности – 1 год, 192 анализа
Тест-система РекомбиБест антипаллидум – суммарные антитела/авто
Для автоматических ИФА—анализаторов, ФСП 42-0117-1055-01, Тест-системы иммуноферментные для выявления суммарных антител к Treponema pallidum с использованием рекомбинантных белков (совместная инкубация — 1 час), 192 анализа
Тест-система ВектоВЭБ-ЕА-IgG-стрип
Тест-система иммуноферментная для выявления IgG к ранним белкам вируса Эпштейна-Барр. Предназначен для диагностики острых стадий инфекции, обусловленной ВЭБ, 12х8 анализов
Тест-система ВектоHHV-6–IgG–стрип
Тест-система иммуноферментная для выявления иммуноглобулинов класса G к человеческому герпес-вирусу 6 типа, 12х8 анализов
Тест-система ВектоВЭБ-NA-IgG-стрип
Тест-система иммуноферментная для выявления IgG к ядерному антигену (EBNA) вируса Эпштейна-Барр. Предназначен для диагностики паст-инфекции, обусловленной ВЭБ, 12х8 анализов
Тест-система РекомбиБест анти-ВГС/авто
ФСП 42-0117-5338-04, Тест-системы иммуноферментные для выявления антител к вирусу гепатита С с использованием рекомбинантных белков, 192 анализа
Стандартная панель сывороток, содержащих и не содержащих HBsAg
Лиофилизированные сыворотки, содержащие HBs-антиген разных субтипов в концентрациях от 0,5 до 0,1 нг/мл. Срок хранения 5 лет, 18 флаконовпо 0,5 мл
Контрольная панель сывороток, содержащих и не содержащих HBsAg
Лиофилизированные сыворотки и тестовое задание текущего цикла Программы Внешней Оценки Качества исследований на HBsAg. Дополнительно необходим набор D-0556.
Тест-система РекомбиБест анти-ВГС подтверждающий тест –стрип
ФСП 42-0117-5338-04, Тест-системы иммуноферментные для подтверждения наличия антител к вирусу гепатита С с использованием рекомбинантных белков, 48, включаяконтроли
Тест-система РекомбиБест анти-ВГС
ФСП 42-0117-5338-04, Тест-системы иммуноферментные для выявления антител к вирусу гепатита С с использованием рекомбинантных белков, 192 анализа
Тест-система РекомбиБест анти-ВГС – стрип
ФСП 42-0117-5338-04, Тест-системы иммуноферментные для выявления антител к вирусу гепатита С с использованием рекомбинантных белков, 12х8 анализов
Тест-система ВГС – Экспресс
ФСП 42-0117-4888-03, Тест-система для быстрого (10 мин) выявления антител к вирусу гепатита С методом дот-анализа, 10 анализов
Тест-система РекомбиБест анти-ВГС – спектр
ФСП 42-0117-1825-01, Тест-системы иммуноферментные для выявления антител к индивидуальным белкам вируса гепатита С (core, NS3, NS4 NS5), 6х4 анализа
Тест-система РекомбиБест анти-ВГС – IgM – стрип
ФСП 42-0117-0762-01, Тест-системы иммуноферментные для выявления иммуноглобулинов класса М к вирусу гепатита С, 12х8 анализов
Тест-система Анти-ВГС-контрольная панель сывороток
Контрольная панель лиофилизированных образцов сывороток, содержащих и не содержащихАнти-ВГС. Для внутрилабораторной оценки качества исследований на анти-ВГС, 6 флаконовпо 400 мкл
Тест-система Внутрилабораторный контроль анти-ВГС
Лиофилизированная сыворотка, содержащая антитела к вирусу гепатита С, для внутрилабороторного контроля качества исследований, 24 флаконапо 0,2 мл
Тест-система Вектогеп А – IgG – стрип
ФСП 42-0117-2420-02, Тест-системы иммуноферментные для выявления антител класса G к вирусу гепатита А (время инкубации - 1 час), 12х8 анализов
Тест-система УниБест ВИЧ-1,2 АТ (комплект 3)
ФСП 42-0117-5421-04, Тест-система иммуноферментная для выявления суммарных антител к ВИЧ-1,2. Двухстадийный вариант, 192 анализа
Тест-система УниБест ВИЧ-1,2 АТ (комплект 1)
ФСП 42-0117-5421-04, Тест-система иммуноферментная для выявления суммарных антител к ВИЧ-1,2. Двухстадийный вариант, 192 анализа
Тест-система УниБест ВИЧ-1,2 АТ (комплект 2)
ФСП 42-0117-5421-04, Тест-система иммуноферментная для выявления суммарных антител к ВИЧ-1,2. Двухстадийный вариант,12х8 анализов
Аннотация научной статьи по ветеринарным наукам, автор научной работы — Белова Оксана Андреевна, Буренкова Л. А., Карань Л. С., Колясникова Н. М., Топычканова Н. Г.
Согласно данным Роспотребнадзора, иммуноферментный анализ (ИФА) выявляет вирус клещевого энцефалита (ВКЭ) в клещах значительно чаще, чем полимеразная цепная реакция (ПЦР). Цель работы - сравнить эффективность обнаружения ВКЭ в иксодовых клещах разных видов с помощью коммерческих наборов на основе ИФА и ПЦР с детекцией в реальном времени (ПЦР-РВ). Материалы и методы. Клещи пяти видов были парентерально заражены ВКЭ европейского или сибирского подтипа. из зараженных и незараженных особей составляли зашифрованные серии и в слепом эксперименте анализировали их на наличие ВКЭ с использованием наборов реагентов на основе ИФА и ПЦР-РВ. Результаты. Эффективность детекции ВКЭ обоими методами не зависела от пола, вида клеща и его степени насыщенности кровью. наборы на основе ИФА оказались менее чувствительными, чем на основе ПЦР-РВ. Отмечена зависимость чувствительности ИФА от подтипа ВКЭ. наличие ложноположительных реакций и чувствительность ИФА зависели от протокола проведения анализа. заключение. вопрос о причинах расхождения данных по вирусофорности клещей из природы и снятых с людей, полученных разными методами, остается дискуссионным.
Похожие темы научных работ по ветеринарным наукам , автор научной работы — Белова Оксана Андреевна, Буренкова Л. А., Карань Л. С., Колясникова Н. М., Топычканова Н. Г.
The Tick-borne encephalitis virus detection efficiency in the ixodid ticks (Acari: Ixodidae) with elisa and real-time PCR
1. Ahmed R., Oldstone M.B., Palese P. Protective immunity and susceptibility to infectious diseases: lessons from the 1918 influenza pandemic. Nat. Immunol. 2007; 8: 1188-93.
2. Scholtissek C., Quack G., Klenk H.D., Webster R.G. How to overcome resistance of influenza A viruses against adamantane derivatives Antiviral Res. 1998; 37: 83-95.
3. Fiore A.E., Fry A., Shay D. et al. Antiviral agents for the treatment and chemoprophylaxis of influenza. MMWR Recomm. Rep. 2011; 60(1): 1-24.
4. Furuta Y., Takahashi K., Shiraki K. et al. T-705 (favipiravir) and related compounds: Novel broad-spectrum inhibitors of RNA viral infections. Antiviral Res. 2009; 82: 95-102.
5. Hauge S.H., Dudman S., Borgen K. et al. Oseltamivir-resistant influenza viruses A (H1N1), Norway, 2007-08. Emerg. Infect. Dis. 2009; 15: 155-62.
6. Samson M., Pizzorno A., Abed Y., Boivin G. Influenza virus resistance to neuraminidase inhibitors. Antiviral Res. 2013; 98: 174-85.
7. Tisoncik J.R., Korth M.J., Simmons C.P. et al. Into the eye of the cytokine storm. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2012; 76: 16-32.
8. Kumar A., Zarychanski R., Pinto R. et al. Critically ill patients with 2009 influenza A (H1N1) infection in Canada. JAMA. 2009; 302: 1872.
9. Perrone L.A., Plowden J.K., Garcia-Sastre A. et al. H5N1 and 1918 pandemic influenza virus infection results in early and excessive infiltration of macrophages and neutrophils in the lungs of mice. PLoS Pathog. 2008; 4: e1000115. doi: 10.1371/journal.ppat.1000115
10. Aoki F.Y., Macleod M.D., Paggiaro P. et al. Early administration of oral oseltamivir increases the benefits of influenza treatment. J. Anti-microb. Chemother. 2003; 51(1): 123-9.
11. Kandun I.N., Tresnaningsih E., Purba W.H. et al. Factors associated with case fatality of human H5N1 virus infections in Indonesia: a case series. Lancet. 2008; 372(9640): 744-9.
12. Darwish I., Mubareka S., Liles W.C. Immunomodulatory therapy for severe influenza. Expert Rev. Anti Infect. Ther. 2011; 9(7): 807-22.
13. Schrofelbauer B., Raffetseder J., Hauner M. et al. Glycyrrhizin, the main active compound in liquorice, attenuates pro-inflammatory re-
sponses by interfering with membrane-dependent receptor signaling. Biochem. J. 2009; 421: 473-82.
14. Tuvim M.J., Gilbert B.E., Dickey B.F., Evans S.E. Synergistic TLR2/6 and TLR9 activation protects mice against lethal influenza pneumonia. PLoS One. 2012; 7(1): e30596. doi: 10.1371/journal. pone.0030596.
15. Harada S. The broad anti-viral agent glycyrrhizin directly modulates the fluidity of plasma membrane and HIV-1 envelope. Biochem. J. 2005; 392: 191-9.
16. Utsunomiya T., Kobayashi M., Pollard R.B., Suzuki F. Glycyrrhizin, an active component of licorice roots, reduces morbidity and mortality of mice infected with lethal doses of influenza virus. Antimicrob. Agents Chemother. 1997; 41(3): 551-6.
17. Michaelis M., Geiler J., Naczk P. et al. Glycyrrhizin inhibits highly pathogenic H5N1 influenza A virus-induced pro-inflammatory cytokine and chemokine expression in human macrophages. Med. Microbiol. Immunol. 2010; 199 (4): 291-7.
18. Smirnov V.S., Zarubaev V.V., Anfimov P.M., Shtro A.A. Effect of a combination of glutamyl-tryptophan and glycyrrhizic acid on the course of acute infection caused by influenza (H3H2) virus in mice. Voprosy virusologii. 2012; 57(3): 23-7. (in Russian)
19. Reed L.J., Muench H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Hyg. 1938; 27: 493-7.
20. Alterovitz G., Tuthill C., Rios I., Modelska K., Sonis S. Personalized medicine for mucositis: Bayesian networks identify unique gene clusters which predict the response to gamma-D-glutamyl-L-trypto-phan (SCV-07) for the attenuation of chemoradiation-induced oral mucositis. Oral Oncol. 2011; 47(10): 951-5.
21. Rose W.A. 2nd, Tuthill C., Pyles R.B. An immunomodulating dipeptide, SCV-07, is a potential therapeutic for recurrent genital herpes simplex virus type 2 (HSV-2). Int. J. Antimicrob. Agents. 2008; 32: 262-6.
22. Smirnov V.S., Selivanov A.A. Bioregulators in prophylaxis and treatment of influenza. Sankt-Petersburg: Nauka; 1996. 69 p. (in Russian)
23. Smirnov V. S. Prophylaxis and treatment of influenza and acute respiratory viral infections. Sankt-Petersburg: AYSING; 2010. (in Russian)
Белова О.А.12, БуренковаЛ.А.1, Карань Л.С.3, Колясникова Н.М.1'3, Топычканова Н.Г.4, Кувшинова И.Н.4, Тимофеев Д.И.4, Рукавишников М.Ю.4, Гришаев М.П.4, Карганова Г.Г.12
Эффективность детекции вируса клещевого энцефалита в иксодовых клещах (Acari: 1хо№йаё) с помощью иммуноферментного анализа и полимеразной цепной реакции
в реальном времени
Согласно данным Роспотребнадзора, иммуноферментный анализ (иФА) выявляет вирус клещевого энцефалита (ВКЭ) в клещах значительно чаще, чем полимеразная цепная реакция (ПЦр). Цель работы -сравнить эффективность обнаружения ВКЭ в иксодовых клещах разных видов с помощью коммерческих наборов на основе ИФА и ПЦР с детекцией в реальном времени (ПЦР-РВ).
Материалы и методы. Клещи пяти видов были парентерально заражены ВКЭ европейского или сибирского подтипа. Из зараженных и незараженных особей составляли зашифрованные серии и в слепом эксперименте анализировали их на наличие ВКЭ с использованием наборов реагентов на основе ИФА и ПЦР-РВ. Результаты. Эффективность детекции ВКЭ обоими методами не зависела от пола, вида клеща и его степени насыщенности кровью. Наборы на основе ИФА оказались менее чувствительными, чем на основе ПЦР-РВ. Отмечена зависимость чувствительности ИФА от подтипа ВКЭ. Наличие ложноположительных реакций и чувствительность ИФА зависели от протокола проведения анализа.
Заключение. Вопрос о причинах расхождения данных по вирусофорности клещей из природы и снятых с людей, полученных разными методами, остается дискуссионным.
Ключевые слова: вирус клещевого энцефалита; иксодовые клещи; иммуноферментный анализ; полимеразная цепная реакция в реальном времени; вирусофорность клещей.
The Tick-borne encephalitis virus detection efficiency in the ixodid ticks (Acari: Ixodidae) with elisa and real-time POR
Belova O. A.1,2, Burenkova L. A.1, Karan L. S.3, Kolyasnikova N. M.13, Topychkanova N. G.4, Kuvshinova I. N.4, Timofeev D. 1.4, Rukavishnikov M. Yu.4, Grishaev M. P.4, Karganova G. G12
1Chumakov Institute of Poliomyelitis and Viral Encephalitides, Russian Academy of Medical Sciences, 142782, Moscow, Russia ; 2Lomonosov Moscow State University, 119234, Moscow, Russia; 3Central Research Institute of Epidemiology, Federal Service on Customers' Rights Protection and Human Well-being Surveillance, 111123, Moscow, Russia;
4Vector-Best JSC, 630117, Novosibirsk, Russia
Key words: tick-borne encephalitis virus; enzyme-linked immunosorbent assay; real-time polymerase chain reaction; virus prevalence in ticks.
Показатель зараженности клещей вирусом клещевого энцефалита (ВКЭ) имеет огромное значение при составлении эпидемиологической характеристики очага и определении необходимого объема и методов профилактики в эндемичных регионах, а также при определении стратегии индивидуального лечения или профилактики клещевого энцефалита (КЭ) после исследования клещей, снятых с людей. В настоящее время выявление ВКЭ в клещах проводят методами иммуноферментного анализа (ИФА), ОТ-ПЦР и ПЦР с детекцией в реальном времени (ПЦР-РВ). Показатели зараженности клещей, полученные разными методами, существенно различаются. Согласно данным Роспотребнадзора [1], доля вирусофорных клещей по РФ, собранных в апреле-августе 2011 г, составила 0,17% (136 из 78 995 проанализированных) при анализе клещей методом ПЦР и 5,38% (9308 из 172 919 проанализированных) при анализе клещей методом ИФА.
С помощью ИФА ВКЭ находят в клещах из районов, где никогда не регистрировались и не регистрируются случаи заболевания КЭ. В данной работе мы провели сравнительную оценку чувствительности и специфичности ИФА и ПЦР-РВ.
Материалы и методы
Клетки. Перевиваемую культуру клеток почек эмбриона свиньи (СПЭВ) поддерживали при температуре 37°С на среде 199 (ПИПВЭ, Москва) с 5% бычьей сыворотки (Фуро, Россия), как описано ранее [2].
Вирусы. В работе использовали ВКЭ - штамм Абсеттаров (GenBank: AF091005.1; [2]) европейского генотипа, выделенный от больного человека в Ленинградской области, где в основном встречается Ixodes nanus, а также штамм ЭК-328 (GenBank: DQ486861.1; [3]) сибирского генотипа, первоначально выделенный из пула клещей I. persulcatus в 1972 г в Эстонии.
Титрование вируса методом бляшек. Титры вируса определяли методом бляшек под агаровым покрытием в культуре клеток СПЭВ на пластиковых 6-луночных планшетах согласно описанной методике [2, 4]. Титр вируса выражали в количестве бляшкообразующих единиц (БОЕ) в 1 мл ви-руссодержащего материала.
на четыре инфекции (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора; АмплиСенс® TBEV, B. burgdorferi sl, A. phagocytophillum, E. chaffeensis/E. muris - FL) на основе ПЦР-РВ.
Заражение клещей. Заражение клещей проводили парентеральным методом, описанным ранее [4, 5]. Клещам вводили под коксу 4-й пары ног культуральную жидкость инфицированных ВКЭ клеток СПЭВ с разной концентрацией вируса. Штаммом Абсеттаров клещей заражали дозами 4 и 6 lg БОЕ/клещ, а штаммом ЭК-328 - в дозе 2 и 4 lg БОЕ/клещ. Самкам и самцам рода Ixodes вводили по 1 и 0,5 мкл вирусной суспензии соответственно, а клещам рода Dermacentor - по 1,5 мкл.
Получение клещевых суспензий. Приготовление клещевых суспензий для их дальнейшего исследования с помощью наборов на основе ИФА и ПЦР-РВ проводили согласно соответствующим инструкциям. Для проведения вирусологических исследований клещей промывали однократно в 70% этаноле и двукратно в физиологическом растворе с 0,1% ципрофлоксацином (Dr. Reddys'), индивидуально растирали пестиком в отдельной ступке, добавляли 600 мкл среды 199 на растворе Эрла (ФГУП ИПВЭ) с антибиотиками (смесь 100 ед/мл пенициллина и 0,0001 г/мл стрептомицина) и переносили в пробирки типа эппендорф. Таким образом, для голодных половозрелых клещей родов Ixodes и Dermacentor были получены 0,14 и 0,58% клещевые суспензии из расчета, что средняя масса особи составляет примерно 0,85 и 3,5 мг соответственно. Для полунапитавшихся клещей этих родов были получены суспензии 4,2 и 7,5% при средней массе клещей, питавшихся 3 дня, 25 и 45 мг соответственно.
Статистическая обработка. В ходе работы использовали непараметрические критерии Манна-Уитни, Колмогорова-Смирнова, а также угловой критерий Фишера и точный метод Фишера для малых выборок данных.
Приготовление материала для исследования. Для оценки эффективности выявления ВКЭ наборами на основе ИФА и ПЦР-РВ использовали наиболее распространенные на территории РФ виды клещей, в которых выявляют ВКЭ (табл. 1). Для парентерального заражения клещей использовали ВКЭ европейского (штамм Абсеттаров) подтипа, который чаще всего выявляют в клещах I. ricinus в юго-западной части РФ, а также штамм ЭК-328 сибирского подтипа, переносимый клещами I. persulcatus. Инфекционная доза штамма Абсет-таров составила 4 и 6 lg БОЕ/клещ, а штамма ЭК-328 - 2 и 4 lg БОЕ/клещ. На 5-е и 6-е сутки после заражения из зараженных и незараженных клещей формировали зашифрованные серии клещей и исследовали на наличие ВКЭ в слепом эксперименте коммерческими тест-системами на основе ИФА и ПЦР-РВ согласно инструкциям. Параллельно для определения титра ВКЭ в клещах на данные сутки после заражения проводили исследование клещевых суспензий из аналогичной серии клещей.
Ранее нами показано, что эффективность парентерального заражения клещей близка к 100% [4, 5]. В данном эксперименте при анализе клещевых суспензий методом бляшек эффективность лабораторного заражения клещей была также высокой и составила 96%. Титры вируса в индивидуально исследованных особях варьировали от 2 до 5,9 lg БОЕ/клещ (в одном клеще титр вируса составил 1,5 lg БОЕ). В целом как на 5-е, так и на 6-е сутки титры ВКЭ в клещах были достаточно высокими. При заражении каждым из штаммов разница между средними геометрическими титрами вируса на один срок в разных видах клещей не превышала 1 lg БОЕ, за исключением титра
Средний геометрический титр ВЕЭ в клещах разных видов на 5-е и 6-е сутки после парентерального заражения
Сутки со дня Средний геометрический титр ВКЭ в клещах, lg БОЕ/клещ
Вид клеща заражения штамм ВКЭ
I. ricinus 5-е 5,0 ± 0,2 4,6 ± 0,1
6-е 3,3 ± 0,4 3,6 ± 0,0
I. persulcatus 5-е 4,3 ± 0,1 4,4 ± 0,1
6-е 2,6 ± 0,5 4,3 ± 0,0
D. marginatus 5-е 4,5 ± 0,3 3,6 ± 0,6
6-е 3,6 ± 0,5 4,0 ± 0,3
D. nuttalli 5-е 4,9 ± 0,0 4,4 ± 0,3
6-е 3,0 ± 0,3 2,7 ± 0,8
D. reticulatus 5-е 4,9 ± 0,2 3,7 ± 0,5
6-е 4,3 ± 0,5 4,6 ± 0,1
Всего. 5-е 4,7 ± 0,1 4,1 ± 0,2
6-е 3,3 ± 0,2 3,6 ± 0,3
Примечание. Статистически достоверные различия получены между: титрами ВКЭ на 5-е и 6-е сутки после заражения (критерий Манна-Уитни; р Не можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
Всего 4,6 ± 0,1 4,9 ± 0,2 4,0 ± 0,5 4,2 ± 0,2
6-е Самки 3,3 ± 0,3 4,3 ± 0,6 2,9 ± 1,3 4,3 ± 0,2
Самцы 2,4 ± 0,3 4,1 ± 0,6 2,5 ± 1,1 3,8 ± 0,3
Всего 2,8 ± 0,2 4,2 ± 0,4 2,7 ± 0,8 4,0 ± 0,2
П р и м е ч а н и е . Статистически достоверные различия получены между: титрами вируса в клещах обоих полов на 5-е и 6-е сутки после заражения для штамма ЭК-328 в дозе 2 ^ БОЕ и для штамма Абсеттаров в дозе 4 ^ БОЕ (критерий Манна-Уитни; р Не можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
Существенное влияние на результат ИФА оказывал субтип использованного для заражения штамма ВКЭ. Так, при дозе обоих штаммов ВКЭ в инокуляте 4 ^ БОЕ/клещ доля отрицательных результатов в ИФА при анализе клещей, зараженных штаммом ЭК-328 (сибирский субтип), составила 5,9% (1/17), а среди клещей, зараженных штаммом Абсеттаров (европейский субтип), - 38,9% (7/18) (см. табл. 3). Разница статистически достоверна (точный метод Фишера; р Не можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
D.nuttalli 17 12 0 3 91,7 100,0
D.reticulatus 11 8 0 0 75,0 75,0
Итого. 112 82 0 3 87,5 89,0
Результаты выявления ВКЭ в клещах с помощью ПЦР-РВ. Для проведения анализа с помощью ПЦР-РВ использовали клещей через 6 дней после заражения. На момент проведения ПЦР-РВ титры ВКЭ в клещах были ниже, чем на момент проведения ИФА (р Не можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
• эффективность детекции ВКЭ обоими методами не зависит от пола, вида и степени насыщенности зараженного клеща;
• метод ИФА менее чувствительный, чем ПЦР-РВ;
• отмечена зависимость чувствительности ИФА от субтипа ВКЭ;
Исследования, представленные в работе, поддержаны грантом РФФИ № 14-04-31716-мол а.
2. Kozlovskaya L.I., Osolodkin D.I., Shevtsova A.S., Romanova L.Iu., Rogova Y.V., Dzhivanian T.I. et al. GAG-binding variants of tickborne encephalitis virus. Virology. 2010; 398: 262-72.
3. Romanova L.Iu., Gmyl A.P., Dzhivanian T.I., Bakhmutov D.V., Lukashev A.N., Gmyl L.V. et al. Microevolution of tick-borne encephalitis virus in course of host alternation. Virology. 2007; 362: 75-84.
4. Belova O.A., Burenkova L.A., Karganova G.G. Different tick-borne encephalitis virus (TBEV) prevalences in unfed versus partially en-
gorged ixodid ticks - Evidence of virus replication and changes in tick behavior. Ticks Tick Borne Dis. 2012; 3(4): 240-6.
5. Белова О.А., Козловская Л.И., Романова Л.Ю., Шевцова А.С., Буренкова Л.А. Сравнительный анализ эффективности различных методов заражения иксодовых клещей вирусом клещевого энцефалита. В кн.: Медицинская вирусология. Труды ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН. М.; 2008; т. 25: 47-52.
2. Kozlovskaya L.I., Osolodkin D.I., Shevtsova A.S., Romanova L.Iu., Rogova Y.V., Dzhivanian T.I. et al. GAG-binding variants of tickborne encephalitis virus. Virology. 2010; 398: 262-72.
3. Romanova L.Iu., Gmyl A.P., Dzhivanian T.I., Bakhmutov D.V., Lukashev A.N., Gmyl L.V. et al. Microevolution of tick-borne encephalitis virus in course of host alternation. Virology. 2007; 362: 75-84.
4. Belova O.A., Burenkova L.A., Karganova G.G. Different tick-borne encephalitis virus (TBEV) prevalences in unfed versus partially engorged ixodid ticks - Evidence of virus replication and changes in tick behavior. Ticks Tick Borne Dis. 2012; 3: 240-6.
5. Belova O.A., Kozlovskaya L.I., Romanova L.Yu., Shevtsova A.S., Burenkova L.A. Comparative analysis of the effectiveness of different ixodid ticks' infection methods with TBEV. In: Meditsinskaya virusologiya: Trudy IPVE imeni M.P. Chumakova. Moscow; 2008; vol. 25: 47-52. (in Russian)
В ПОМОЩЬ ВИРУСОЛОГУ
АмосоваИ.В., Соминина А.А., Смирнова Т.Д., СуховецкаяВ.Ф., БузицкаяЖ.В., Войцеховская Е.М.,
Новые моноклональные тест-системы для диагностики
Ключевые слова: аденовирус; моноклональные антитела; диагностические тест-системы.
New monoclonal kits for the diagnosis of the adenoviral infection
Amosova I. V., Sominina A. A., Smirnova T. D., Sukhovetskaya V. F., Buzitskaya Zh. V., Voitsehovskaya E. M.,| Sirotkin A. K. |
Research Institute of Influenza, Ministry of Health of the Russian Federation, 197376, St. Petersburg, Russia
Diagnostic properties of new monoclonal antibodies (MAbs) to hexon adenovirus antigen (AB) monoclonal ELiSA kit for early diagnosis of adenoviral infection were tested. Developed ELiSA kit and FiTC-conjugate of new monoclonal antibodies for immunofluorescent analysis were used for detection of different types of adenoviruses in clinical materials. The availability of their use in clinical and epidemiological practice was validated.
Key words: adenovirus; monoclonal antibodies; diagnostic kits.
Читайте также:
Пожалуйста, не занимайтесь самолечением!При симпотмах заболевания - обратитесь к врачу.
