Волютин в дифтерийной палочки

Материалом для исследования при дифтерии могут быть пленки и слизь из зева и носа, а при редких локализациях дифтеритических воспалений - из глаза, уха, с поверхности раны и кожи. Отделяемое забирают сухим ватным тампоном или смоченным 5% раствором глицерина в физиологическом растворе с рН-8.

До этого уровня его доводят 20% раствором однозамещенного фосфорно-кислого натрия (Na2HPO4).

Исследование осуществляют не позднее 3-4 часов после забора, с поэтапной выдачей ответов о подтверждении диагноза.

I. МИКРОСКОПИЧЕСКИЙ МЕТОД

Морфологические и тинкториальные признаки дифтерийных бактерий настолько своеобразны, что микроскопический метод может примениться как самостоятельный или предварительный к бактериологическому анализу. Кроме того, он дает представление и о сопутствующей микрофлоре.

Для выявления дифтерийных палочек могут быть использованы три метода окраски: Грама, Леффлера, Нейccера.

МЕТОД ГPAМA позволяет выявить способность дифтерийных бактерий вступить во взаимодействие с генцианвиолетом. Дифтерийные бактерии грампозитивиы, но это свойство непостоянно. При контакте с антибиотиками, при длительном пребывании в голодной среде резко изменяется обмен веществ и грамположительность микробов теряется. Поэтому ориентироваться на этот признак нельзя.

МЕТОД НЕЙССЕРА - наиболее ценный дифференциально-диагностический способ, позволяющий не только окрасить микроорганизмы, но и выявить полярно вкрапленные зерна волютина и характерное расположение бактериальных особей под углом.

РЕАКТИВЫ

  • УКСУСНОКИСЛАЯ СИНЬКА НЕЙСЕРА: метиленовая синька -0,1 г, спирт 96° -2 мл; 5% раствор ледяной уксусной кислоты в дистиллированной воде - 50 мл.
  • РАСТВОР ЛЮГОЛЯ: 2 г йодистого калия растворить в 10 г дистиллированной воды. Затем к этому раствору прибавить; 1 г кристаллического йода и добавить воды до 300 мл.
  • РАСТВОР ХРИЗОИДИНА: 2 г хризоидина на 300 мл горячей дистиллированной воды.

Вместо раствора хризоидина можно использовать раствор везувина (краситель бисмаркбраун): везувин-1 г; 96° cпирт-10 мл; кипящая дистиллированная вода-100 мл.

ТЕХНИКА ОКРАСКИ

  1. Синька Нейссора- 1 минута
  2. Раствор Люголя - 30 секунд.
  3. Ополаскивание дистиллированной водой.
  4. Докраска расвором хризоидина или везувина - 10-15 секунд.

Тело микробной клетки окрашивается в желтый или желто-коричневый цвет, зерна волютина - коричнево-черного цвета.

ОКРАСКА ПО СПОСОБУ ЛЕФФЛЕРА

Метод Леффлера прост, но по своим дифференциально-диагностическим возможностям он не уступает сложному способу Нейссера. Поэтому он применяется значительно чаще.

Для окраски нужен один реактив - щелочная метиленовая синька Леффлера следующего состава: Дистиллированная вода - 99 мл; 1% раствор едкого калия (КОН) - 1 мл; профильтрованный спиртовой раствор метиленовой синьки (0,5 г синьки на 30 мл спирта) - 30 мл.

Окраска осуществляется 1-2 минуты. При этом тело бактерий приобретает бледно-голубой цвет, зерна волютина - синий или cине-черный.

При выполнении микроскопического исследования важно отличить истинные дифтерийные бактерии от дифтериеподобных палочек Гоффмана и бактерий ксерозис.

Микроскопическая дифференциация дифтерийных бактерий и дифтероидов
Бактерии Взаимное расположение особей в препарате Наличие и количество зерен волютина
Дифтерии Под углом в виде римской цифры V или кисти рук с разведенными пальцами 2 зерна с полярной локализацией
Бактерии Гоффмана Параллельное, в виде часткола Зерен нет или единичные без типичной локализации
Бактерии Keepоза Хаотичное Зерен много, распределение беспорядочное

II. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД

Дифтерийные бактерии требовательны к питательным средам. Для их выделения и накопления используется комплекс специальных элективных и дифференциально-диагностических сред.

СВЕРНУТАЯ СЫВОРОТКА РУ: 3 мл стерилыной сыворотки лошади (быка или человека) вносят в пробирку, укладывают с наклоном в 45-50° в свертывателе Коха, предварительно нагретом до +50 °C. Затем температуру доводят до 80° и прогревают в течение 1 часа. Готовую среду охлаждают, ставят в термостат для проверки стерильности. В случае прорастания среды последнюю повторно прогревают при + 80 °C в течение 2 часов.

На этой среде бактерии дают шероховатые R-формы, напоминающие в комплексе шагреневую кожу.

ТЕЛЛУРИТОВЫЕ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫЕ СРЕДЫ

Дифтерийные бактерии обладают выраженной способностью восстанавливать теллуровокислый калий до металлического теллурита. Для выявления этой способности в среды добавляется дифференцирующий компонент-2% раствор теллурита калия следующего состава: дистиллированная вода-100 мл; теллурит калия (K2FeO4)-2 г. Раствор стерилизуют кипячением 30 минут. Для приготовления сред можно использовать также готовый 2% раствор теллурита калия в 40% глицерине, выпускаемый в ампулах для клинических теллуритовых проб.

СЫВОРОТОЧНО-ТЕЛЛУРИТОВЫИ АГАР: к 80 мл расплавленного и охлажденного до +50 °C 2% МПА добавляют 20 мл лошадиной или 30 мл бычьей сыворотки и 1 мл 2% раствора теллурита калия. Готовую среду разливают в стерильные чашки.

КРОВЯНО-ТЕЛЛУРИТОВЫЙ АГАР: к 100 мл расплавленного и охлажденного до +50 °C 2-3% МПА добавляют 5-10% дефибринированной крови человека (донорской, плацентарной) или животного (крупного рогатого окота, кролика, барана, морской свинки) и 1 мл 2% теллурита калия, смешивают и разливают в чашки.

СРЕДА КЛАУБЕРГА: 100 мл 3% МПА расплавляют, добавляют 3 мл 2% теллурита калия, 10 мл глицериновой смеси и 50 мл лаковой крови. Последнюю готовят следующим образом: к 34 мл дистиллированной стерильной воды добавляют 16 мл дефибринированной крови (любой). Состав глицериновой смеси: к 40 мл дефибринироваиной крови крупного рогатого скота или человека добавляют 20 мл химически чистого стерильного глицерина и выдерживают до употребления в холодильнике 3-6 недель.

По характеру роста на теллуритовых средах удается отдифференцировать дифтерийные бактерии как внутри вида, так и от других микроорганизмов.

Дифференциация дифтерийных палочек от других микробов на теллуритовых и хинозольной средах
Бактерии Характер роста на средах
теллуритовых хинозольной
Дифтерийные бактерии серые, розеткообразные синие
тип гравис с радиальностью
тип митис черные, матовые, гладкие
тип интермедиус серо-черные, гладкие
Ложнодифтерийные бактерии Гофмана серые, блестящие, выпуклые, конусовидные голубоватые
Дифтериоиды Ксероза серо-черные, как истинные дифтерийные бесцветные
Стафилококки черные, влажные, блестящие -

ХИНОЗОЛЬНУЮ СРЕДУ БУЧИНА готовят по следующей прописи: на 100 мл воды добавляют 3 г хлористого натрия, 1,5 г, глюкозы, 1 мл 3% раствора цистина в 1% растворе соды, 2 мл водного раствора хинозола (1:1000), 0,08 г индикатора водноголубого, 4,0 сухого питательного агара. Смесь растворяют при нагревании. Устанавливают pH = 7,4-7,6. Охлаждают до +50 °C, добавляют 5 мл дефибринированной крови и, соблюдая стерильность, разливают в чашки Петри.

СРЕДА ТИНСДАЛЯ-САДЫКОВОЙ является селективной средой для дифтерийных бактерий. Посторонняя микрофлора на ней не растет или развивается очень скудно. Другим преимуществом среды является то, что она не нуждается в добавлении крови. Ее состав следующий: 100 мл мартеновского или обычного мясопептонного агара, 15-20 мл нормальной лошадиной сыворотки, 12 мл 1% раствора цистина (сначала растворить в 0,1 N р-ре NaOH, потом в воде), 11-12 мл 0,1N HCl (для нейтрализации NaOH); 1,8 мл 2% раствора теллуристого калия и 1,8 мл 2,5% раствора гипосульфита натрия.


Дифтерийные бактерии обладают рядом характерных биохимических признаков. Они хорошо ферментируют глюкозу и крахмал, высвобождают значительные количества активной цистиназы, выявляемой в пробе Пизу. Вместе с тем, названные микроорганизмы инертны в отношении сахарозы и не имеют фермента уреазы, обнаруживая отрицательную пробу Закса. Очень важным видовым признаком этих микробов является токсигенность. С эпидемиологической точки зрения, весьма существенное значение имеет серологическая неоднородность дифтерийных бактерий и наиболее широкое участие в распространении инфекции I и VI серологических типов. Это необходимо учитывать при диагностике дифтерии.


ОПРЕДЕЛЕНИЕ УГЛЕВОДОЛИТИЧЕСКОИ АКТИВНОСТИ дифтерийных бактерий производится на комплексе углеводных сред, состоящих из 1% пептонной воды с pH-7,6, в которую добавляют различные углеводы: 0,5% сахарозы, 0,5% глюкозы, 0,2% крахмала. В качестве индикатора используется реактив Андреде (кислый фуксин, обесцвеченный щелочью).

Среды разливают по 2 мл и стерилизуют текучим паром 3 дня подряд :по 30 минут. До работы они бесцветны, при ферментации углеводов - краснеют.

На углеводных сывороточно-водных средах, основа которых состоит из дистиллированной воды (80 мл) и сыворотки (20 мл), углеводолитические свойства культур проявляются плохо и ферментация углеводов идет очень медленно.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

ПРОБА ПИЗУ - ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФЕРМЕНТА ЦИСТИНАЗЫ

К 90 мл расплавленного 2% МПА с pH -7,6 добавляют 2 мл раствора цистина (1% раствор цистина в 0,1N растворе NaOH). Среду стерилизуют при +112 °C 30 минут. K расплавленной и охлажденной до +50 °C среде добавляют 1 мл 10% уксуснокислого свинца (простерилизованного дважды текучим паром) перемешивают и добавляют 9 мл нормальной лошадиной сыворотки. Среду стерильно разливают в маленькие пробирки по 2 мл. Посев производится уколом.

Вместо МПА с цистином можно использовать 2% МПА, приготовленный на переваре Хоттингера, с содержанием аминного азота в 250 мг%.

Дифтерийные бактерии активно перерабатывают белки и цистин с высвобождением сероводорода, который, соединяясь с уксусным свинцом, переходит в сернистый свинец коричнево-черного цвета. Дифтероиды подобных изменений не дают.

ПРОБА ЗАКСА - ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФЕРМЕНТА УРЕAЗЫ

Проба Закса служит для отличия дифтериеподобных бактерий, обладающих уреазной активностью, от истинных дифтерийных палочек, не имеющих этого фермента.

  • 1. ВАРИАНТ СРЕДЫ: к 100 мл МПБ или Хоттингеровского бульона добавляют 1 г мочевины и 0,2 мл 1,6% спиртового раствора крезолрот, разливают по 2-3 млв пробирки и стерилизуют текучим паром 10 минут. Результаты учитывают через 20-24 часа после посева. Покраснение среды свидетельствует о наличии уреазы.
  • 2. ВАРИАНТ СРЕДЫ: готовят два реактива: А и В.

Реактив А: мочевина - 1 г, спирт 96°- 2 мл, дистиллированная вода - 4 мл.

Реактив В: 0,2% раствор фенолрота-1 мл, однозамещенный фосфат калия (КН2Р04)-0,1 г, двузамещенный фосфат калия (К2НРО4)-0,1 г, хлористый натрий - 0,5 г, дистиллированная вода - 100 мл.

Реактив А стерилизуют фильтрованием и хранят при + 4 °C, реактив В - в автоклаве текучим паром.

Перед работой оба реактива смешивают ex tempore из расчета 1 часть раствора А и 19 частей раствора В, смесь разливают по 0,1 мл в узкие пробирки. Испытуемые культуры вносят в количестве 2-6 капель, помещают в термостат на 30 минут. При положительной реакции смесь краснеет.

Дифференциация дифтерийных бактерий и дифтероидов по биохимическим признакам приведена ниже.

В отдельных случаях после определения биохимических свойств дифтерийных бактерий выясняется серотип штамма. Для этой цели используется ориентировочная агглютинация. Последнюю проводят на стекле с чистыми культурами, которые смывают со среды 1 мл солевого раствора и осторожно набирают стерильной пастеровской пипеткой. Агглютинирующие монотииовые сыворотки (I, II, III, IV, VI серотипы) разводят 1:25 солевым раствором с pH-7,6 (к 100 мл дистиллированной воды прибавляют 3,0 NaOH и устанавливают pH-7,6, доливая 5% раствор Na2HPO4). Для контроля испытуемой культуры ставят реакцию с выше указанным солевым раствором без сыворотки.

Положительная реакция характеризуется быстрым появлением хлопьев агглютината (2-3 минуты), особенно заметных при учете реакции над вотеутым зеркалом.

Неиспользованную сыворотку запаивают в ампулу или переливают в стерильную пробирку.

Агглютинирующие сыворотки хранятся в сухом месте при температуре от +4° до +10 °C.

При использовании высушенных сывороток последние перед употреблением растворяют в стерильной дистиллированной воде (1 мл на ампулу). Срок годности сухой сыворотки не ограничен.

УСКОРЕННЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ

ТЕЛЛУРНТОВАЯ ПРОБА - КЛИНИЧЕСКАЯ

Тампоном, смоченным 2% раствором теллуровокислого калия в 40% глицерине (выпускается в ампулах), смазывают пораженные миндалины и слизистую. При наличии дифтерийных бактерий тампон чернеет сразу или после 2-4-часовой инкубации в термостате.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТОКСИГЕННОСТИ ДИФТЕРИЙНЫХ БАКТЕРИИ

Определение токсигенности дифтерийных бактерий осуществляется биологическим (в специализированных лабораториях) и диффузионным (на плотных средах) методами.

Рекомендуемая литература:

  1. Профилактика дифтерии. Методические материалы для практических работников. М., 1961, стр. 37.
  2. Сборник официальных материалов по лабораторному делу. Книга первая. Медгиз, 1961, стр. 331-337.
  3. Сборник схем бактериологического исследования при некоторых инфекционных заболеваниях. Методическое пособие для врачей-курсантов заочников, под ред. проф. П. Н. Кашкина, Л., 1965, стр. 17-20.
  4. Дяченко С. С. Микробиологические методы диагностики инфекционных заболеваний. Киев, 1962, стр. 224,
  5. Пяткин К. Д., Трофимова Н. Д., Маркова Н. С. Руководство к практическим занятиям по медицинской микробиологии, 1962, стр. 219.
  6. Руководство по микробиологии, клинике и эпидемиологии инфекционных заболеваний, 1964, т. VI, стр. 375.
  7. Руководство по микробиологической диагностике инфекционных болезней под ред. Матвеева К. И. и Соколова М. И. 1964, стр. 422-430.

Источник: Мотавкина Н.С., Пьянова Р.Е. Микробиологическая диагностика некоторых капельных инфекций и токсоплазмоза. Методическая разработка для студентов. ВГМУ, 1973

Дифтерия - острое инфекционное заболевание, вызываемое дифтерийной палочкой (Corynebacterium diphtheriae), характеризующеесяместным фибринозным поражением слизистых оболочек рото- и носоглотки (diphthera – пленка), а также тяжелой интоксикацией с поражением сердечно-сосудистой, нервной системы и надпочечников. Лабораторная диагностика дифтерии осуществляется в соответствии со схемой 14.

Микроскопический метод в настоящее время фактически не применяется из-за его низкой информативности в связи с субъективизмом учета и выполняется только по требованию лечащего врача. Микроскопии подвергают мазки, окрашенные по Граму, метиленовым синим, по Нейссеру (для выявления включений волютина). Дифтерийные палочки (Corynebacteriumdiphtheriae) при окраске по Нейссеру содержат полярно расположенные темно-синие, почти черные, включения волютина и располагаются в виде римских цифр V или Х, тогда как сходные с ними дифтероиды и ложнодифтерийные бактерии (Corynebacteriumpseudodiphtheriae) зерен волютина не имеют и располагаются в виде частокола. Разработан также метод прямого флюорохромирования дифтерийных палочек корифосфином, окрашивающим включения волютина в красно-коричневый цвет, а цитоплазму в зеленый или желтый цвет, что позволяет повысить эффективность бактериоскопического метода.

Бактериологический метод-основной метод диагностики дифтерии. Исследуемый материал засевают на одну из специальных питательных сред для культивирования дифтерийных палочек, наиболее часто на среду Клауберга (МПА с гли­церином, дефибринированной кровью и теллуритом натрия, задерживающим рост сопутствующей непатогенной микрофлоры). На среде Клауберга Corynebacterium diphtheriae образует 2 типа колоний:

а) серовато-черного цвета с радиальной исчерченностью поверхности, напоминающие цве­ток маргаритки или розетку (биовар gravis);

б) черные, круглые, выпуклые колонии колонии за счет восстановления теллурита (биовар mitis).

В мазке из типичной для дифтерийной палочки колонии обнаруживают грамположительные палочки булавовидной формы, расположенные в виде римских цифр V или Х, содержащие зерна волютина (рис. 16). Оставшуюся часть колонии пересевают на кровяной МПА для выделения чистой культуры.


Рис. 16. Возбудитель дифтерии - Corynebacteriumdiphtheriae. Окраска по Нейссеру. Расположение в виде римских цифр V или Х, включения волютина по полюсам. х900

Цистиназу у выделенных культур (проба Пизу) определяют путем посева методом укола петли исследуемой культуры на цистиновый МПА с азотнокислым свинцом. Посевы помещают на сутки в термостат при 37 0 С. При наличии цистиназы в среде образуется почернение (образование сульфида свинца) по ходу укола, вокруг которого появляется коричневое облачко.

Выделенную культуру идентифицируют и дифференцируют от сходных с ней непатогенных коринебактерий по биологическим свойствам (табл. 16). Для определения уреазы петлю исследуемой культуры вносят в пробирку, содержащую спиртовый раствор мочевины и индикатор феноловый красный. Пробирку выдерживают 30 минут в термостате при 37 0 С, при наличии уреазы содержимое пробирки окрашивается в красный цвет.

При выделении нетоксигенной культуры ставят реакцию агглютинации с противодифтерийной сывороткой для выявления видового антигена Corynebacterium diphtheriae.

Серологический метод –РА, РНГА с целью определения антител в парных сыворотках крови больных дифтерией.

Таблица 16.Биологические свойства коринебактерий

Вид Волютин Гемолиз ферментация токсин цистиназа уреаза РА с ПДС
сахарозы глюкозы крахмала
C. diphtheriae биовар биовар + + - + - + + + - ± ± + + - - + +
C.xerosis ± - + + - - - - -
C. pseudodiphtheriae ± - - - - - - + -

Самостоятельная работа студентов

1. Морфологические свойства возбудителя дифтерии – Corynebacterium diphtheriae (мазок из чистой культуры, окраска по Нейссеру). Дифтерийные коринебактерии в препарате расположены в виде римской цифры V или X, по полюсам содержат темно-синие включения волютина.

2. Бактериологический метод. Изучение культуральных, ферментативных и антигенных свойств дифтерийной культуры:

· учет роста дифтерийной палочки на среде Клауберга (МПА с теллуритом натрия, глицерином и дефибринированной кровью). Колонии мелкие, круглые с уп­лотнением в центре, при сплошном росте поверхность культуры выглядит в виде шагреневой кожи. Колонии биовара gravis серые, радиально исчерчены, напоминающие розетку, колонии биовара mitis - черные, круглые, выпуклые. Де­монстрацию описать, зарисовать;

· биохимические свойства коринебактерий представлены де­монстрацией в соответствии с таблицей. Описать, зарисовать;

· определение токсигенности культур дифтерийных бактерий с помощью реакции преципитации в геле. На цистиновый МПА в чашке Петри нанесена полоска фильтровальной бумаги, пропитанной антитоксической про­тиводифтерийной сывороткой, перепендикулярно которой засеяны исследуемые культуры. Если культура токсигенна, в мес­тах соединения токсина с антитоксином образуется преципитат в виде белых линий (усы);

· цистиназная активность (проба Пизу) на столбике МПА с цистином посевом в виде укола. При наличии фермента отмечается почернение среды по ходу укола (образование сульфида свинца) и коричневое облако вокруг. Учесть демонстрационную реакцию;

· наличие уреазы определяют в растворе с мочевиной и индикатором феноловым красным. При наличии фермента сре­да приобретает красный цвет. Учесть демонстрацию.

3. Серологический метод. Учесть демонстрационную РНГА для определения напряженности антитоксического иммунитета при дифтерии.

ВНИМАНИЕ! САЙТ ЛЕКЦИИ.ОРГ проводит недельный опрос. ПРИМИТЕ УЧАСТИЕ. ВСЕГО 1 МИНУТА.

1. Выявление включений волютина у дифтерийной палочки –Corynebacterium diphtheriae(окраска по Нейссеру–рис.14, см. приложение).Микробные клетки желто-зеленого цвета, на полюсах видны включения волютина темно-синего, почти черного цвета; расположение микроорганизмов в виде пальцев растопыренной кисти, римских цифр V и X.

2. Изучение клеточной стенки у дрожжей (Saccharomyces сerevisiae - демонстрационный препарат). Окраске мазка дрожжей концентрированным раствором генциан-фиолетового красителя предшествовал плазмолиз клеток в гипертоническом растворе NaCl и протрава танином. Клеточная стенка выглядит темным двуконтурным розовато-сиреневым ободком вокруг светлой цитоплазмы (рис. 15, см. приложение).

З. Бактериальный нуклеоид у сенной палочки (Bacillus subtilis - демонстрационный препарат – рис. 16, см. приложение). Окраска по Романовскому - Гимза. Зернышки хроматина полиморфные, рубиново-красного цвета; цитоплазма - лилово-синего цвета.

4. Выявление капсул уKlebsiella pneumonae. Окраска препарата по Гинсу-Бурри (рис. 17, см. приложение). Видны окрашенные в красный цвет диплококки, окруженные прозрачной зоной неокрасившейся цитоплазмы.

5. Окраска кислотоустойчивых бактерий (возбудитель туберкулеза – Mycobacterium tuberculosis). Окраска по Цилю-Нильсену (рис. 18, см. приложение). На голубоватом фоне препарата видны ядра клеток и микобактерии, окрашенные в рубиново-красный цвет.

6. Окраска спорBacillus cereus. Окраска модифицированным методом Ауески. Выполняется окраска по методу Циля-Нильсена, однако обесцвечивание проводится 0,5% HCl. Необходимо избегать грубой фиксации мазка над пламенем. Вегетативные клетки бактерий окрашиваются в голубой цвет, споры - в ярко-малиновый (рис. 19, см. приложение ).

Тема 3. МОРФОЛОГИЯ И КЛАССИФИКАЦИЯ БАКТЕРИЙ, СПИРОХЕТ, РИККЕТСИЙ, ХЛАМИДИЙ, МИКОПЛАЗМ И АКТИНОМИЦЕТОВ.

Цель занятия:знакомство со специальными методами микроскопии, структурой жгутиков и пилей, методами окраски жгутиков и выявления подвижности у бактерий, использованием бактериоскопического метода в диагностике инфекций

Перечень конкретных учебно-целевых вопросов

1. Жгутики и пили. Их структура и функции. Способы изучения подвижности бактерий. Методы окраски жгутиков.

2. Сущность методов темнопольной и фазово-контрастной микрос­копии. Их использование в микробиологии.

3. Сущность методов люминесцентной и электронной микроскопии. Их применение в микробиологии.

4. Морфология и классификация спирохет, риккетсий, хлами­дий, микоплазм и актиномицетов. Методы их окраски.

5. Бактериоскопический метод исследования в микробиологии и его использование в диагностике инфекционных заболеваний.

ИНФОРМАЦИЯ К ЗАНЯТИЮ

Жгутики являются органами движения у многих бактерий, представляя собой очень тонкие (0,02—0,05 мкм) невидимые в обычный световой микроскоп нити, состоящие из сократительного белка флагеллина. По количеству и расположению жгутиков все подвижные бактерии подразделяются на следующие типы: а) монотрихи — имеют один жгутик на одном из концов клетки; б) амфитрихи - по одному жгутику на концах палочки; в) лофотрихи - пучок жгутиков на одном конце и г) перитрихи - большое количество жгутиков по периметру клетки. Диаметр жгутиков намного меньше разрешающей способности светового микроскопа, поэтому для их обнаружения пользуются или специальными методами окраски (предварительное протравливание мазка танином для того, чтобы вызвать набухание жгутиков, с последующей импрегнацией препарата), или изучают их при помощи электронного микроскопа жгутиков.

Наличие или отсутствие жгутиков у ряда бактерий является дифференциально-диагностическим признаком. Однако в связи со значительными трудностями обнаружения жгутиков и низкой воспроизводимостью метода их окраски, в практической работе наличие жгутиков оценивают путем изучения активной подвижности бактерий в живых неокрашенных препаратах.

У некоторых бактерий поверхность покрыта нежными ворсинками – пилями или фимбриями, которые могут быть обнаружены лишь при электронной микроскопии. Пили обеспечивают прилипание бактерий к питательным веществам или клеткам хозяина, а также принимают участие в половом процессе у бактерий – конъюгации.

Спирохеты в морфологическом отношении представляют собой тонкие извитые ни­ти, обладающие активной подвижностью, размеры которых колеблются в широких пределах в зависимости от вида (длина 10-50 мкм, диаметр 0,1-0,6 мкм, патогенные виды имеют длину 3-20 мкм). Цитоплазма спирохет покрыта цитоплазматической мембраной, снаружи которой имеется нежная оболочка из тонкого пептидогликана. Между клеточной стенкой и цитоплазматической мембраной располагаются закрученные вокруг тела спирохеты фибриллы, придающие ей извитую форму и обеспечивающие движение. Различные виды спирохет отличаются друг от друга по форме, размерам, характеру подвижности и другим признакам.

Патогенные спирохеты (рис. 20) относятся к родам Treponema (9-12 равномерных завитков), Borrelia (7-9 неравномерных завитков), Leptospira (тонкие первичные завитки, вторичные завитки при движении в виде букв С или S). Для окраски спирохет применяют метод Романовского— Гимзы (боррелии и лептоспиры – фиолетового цвета, трепонемы – бледно-розового).

Рис. 20. Спирохеты. а – трепонемы, б –боррелии в – лептоспиры

Актиномицеты - грамположительные бактерии, характеризующиеся наличием хорошо развитого ветвящегося мицелия, состоящего из одноклеточных нитей (гиф), шириной 0,3—0,8 мкм, длиной — до 600 мкм (рис. 21, см. приложение). Размножаются актиномицеты спорами или путем фрагментации мицелия. Актиномицеты имеют ряд признаков, общих с грибами. Выделяют низшие и высшие формы актиномицетов. Высшие формы образуют мицелий, врастающий в питательную среду (субстратный мицелий), развиваться над ней в виде рыхлого слоя -воздушного мицелия. На концах гиф воздушного мицелия (спороносцах), формируются споры, с помощью которых актиномицеты размножаются. К низшим актиномицетам относят кислотоустойчивые микобактерии (возбудители туберкулеза - Mycobacterium tuberculosis и проказы - М. leprae), а также микококки. К этой группе микроорганизмов близки коринебактерии - короткие, полиморфные палочки в форме булавы или гантелей (патогенный вид - Corynebacterium diphtheriae, возбудитель дифтерии).

Риккетсии (класс Rickettsias) - группа бактерий, основной особенностью которых является облигатный (безусловный) паразитизм. На обычных питательных средах эти микроорганизмы размножаться не способны, поэтому для их культивирования в лабораторных условиях используют куриные эмбрионы или культуры тканей млекопитающих. Риккетсии полиморфны (рис.22, см. приложение), имеют кокковидную, палочковидную и нитевидную формы, мелкие размеры (диаметр кокковидных форм - 0,2—0,5 мкм, палочковидных форм 1—1,5 или 3—4 мкм, нитевидных - 10—40 мкм). Риккетсии размножаются простым делением, неподвижны, не образуют спор, капсул, окрашивают их обычно по Романовскому — Гимзе и Здродовскому. Риккетсии могут вызывать различные заболевания человека и животных - риккетсиозы.

Хламидиитакже относятся к облигатным внутриклеточным паразитам. Имеют палочковидную или сфе­рическую форму, очень малые размеры (0,2—1,3 мкм). Размножаются делением, процессу деления предшествует образование вокруг частицы хламидий капсулы, напоминающей бактериальную. Хламидии окрашиваются по Граму отрицательно, чаще применяется метод Романовско­го-Гимза. Вызывают у человека трахому, паховый лимфогранулематоз, орнитоз, урогенитальную инфекцию.

Микоплазмы(класс Mollicutes)- мелкие (125-250 нм) полиморфные микроорга­низмы в виде сферических тел, бус или нитевидных ветвистых форм, характеризующиеся отсутствием оболочки, вследствие чего они не имеют постоянной формы, не чувствительны к пенициллину и другим антибиотикам, действующим на синтез оболочки. Микоплазмы размножаются делением, очень требовательны к питательным средам. Для изучения морфологии микоплазм пользуются фазово-контрастной микроскопией. Некоторые бактерии (кокки, микобактерии) под влиянием пенициллина и других веществ могут образовы­вать формы, лишенные оболочки - L-формы, которые по морфологическим и физиологическим свойствам близки к микоплазмам.

Теория по микробиологии. Тема: Морфология и состав бактерий, вирусов. Актиномицеты, спирохеты, риккетсии, хламидии, микоплазмы. Патогенные представители.

При создании данной страницы использовались труды: Бухарин О.В. — Медицинская микробиология; Д.В. Тапальский, Т.Н. Ильинская, Л.В. Шевцова, Л.В. Лагун — Курс лекций по микробиологии, иммунологии, вирусологии.

Редактор: Irina

Классификация микроорганизмов. Основные структуры бактериальной клетки

Клеточная стенка имеет два слоя:

  • наружный – пластичный;
  • внутренний – ригидный.

Пептидогликан представлен параллельно расположенными молекулами гликана, состоящего из повторяющихся остатков N-ацетилглюкозомина и N- ацетилмурамовой кислоты, соединённой гликозидной связью.

Функции:

  • защитная, осуществление фагоцитоза;
  • регуляция осмотического давления;
  • рецепторная;
  • принимает участие в процессах питания деления клетки;
  • антигенная (определяется продукцией эндотоксина– основного соматического антигена бактерий);
  • стабилизирует форму и размер бактерий;
  • обеспечивает систему коммуникаций с внешней средой;
  • косвенно участвует в регуляции роста и деления клетки.

Цитоплазматческая мембрана:

По структуре она похожа на плазмолемму клеток животных и состоит из двойного слоя липидов, главным образом фосфолипидов, с интегральными, полуинтегральными и поверхностными белками — жидкостно-мозаичная модель .

Она обладает избирательной проницаемостью , принимает участие в транспорте питательных веществ, выведении экзотоксинов, энергетическом обмене клетки , является осмотическим барьером, участвует в регуляции роста и деления, репликации ДНК, является стабилизатором рибосом.

Цитоплазма:

Имеет жидкую структуру, в которой находится её компоненты, представленные различными включениями в виде гранул гликогена , полисахаридов и полифосфатов .

Функции:

  • объединение всех компонентов клетки в единую среду,
  • среда для прохождения химических реакций,
  • среда для существования и функционирования органоидов.

Нуклеоид:

Нуклеоид — эквивалент ядра у бактерий. Он расположен в центральной зоне бактерий в виде двунитевой ДНК, замкнутой в кольцо и плотно уложенной в клубок. Участвует в делении клетки , а также хранит и передаёт наследственную информацию.

Плазмиды:

Внехромосомные факторы наследственности, представляющие собой ковалентно замкнутые кольца ДНК., расположенные в цитоплазме или интегрированные с хромосомой.

Рибосомы:

Рибосомы бактерий имеют размер около 20 нм и коэффициент седиментации 70S. Могут диссоциировать на 2 субъединицы 50S и 30S. На рибосомах происходит синтез белка и полипептидных молекул.

Споры и капсулы бактерий

Капсула

Слизистая структура толщиной более 0,2 мкм, прочно связанная с клеточной стенкой бактерий и имеющая четко очерченные внешние границы. Капсула гидрофильна , включает большое количество воды. Состоит из полисахаридов, полипептидов.

Капсула и слизь предохраняет бактерии от повреждений, высыхания, так как, являясь гидрофильными, хорошо связывают воду, препятствуют действию защитных факторов макроорганизмов гликокаликсом.

Споры

Форма спор может быть овальной, шаровидной , расположение – терминальное, субтерминальное и центральное .

Снаружи спора имеет тонкий экзоспориум, под которым расположена оболочка споры, а под ней кортекс, состоящий из пептидогликана. Внутри кортекса находится клеточная стенка спор.

Споры образуются при неблагоприятных условиях, УФ-облучении, дефиците питательных веществ.

Некоторые роды бактерий при неблагоприятных условиях образуют защитные формы — эндоспоры .

Споры представляют собой покоящиеся клетки с крайне низкой метаболической активностью . Они обладают высокой устойчивостью к высушиванию, действию повышенной температуры и различных химических веществ.

Включения и жгутики у бактерий

Включения

В цитоплазме имеются различные включения в виде г ранул гликогена, полисахаридов, бета-оксимасляной кислоты и полифосфатов (волютин). Они являются запасными веществами для питания и энергетических потребностей бактерий.

Волютин обладает сродством к основным красителям и легко выявляется с помощью специальных методов окраски (например, по Нейссеру) в виде метахроматических гранул. Характерное расположение гранул волютина выявляется у дифтерийной палочки в виде интенсивно прокрашивающихся полюсов клетки.

Включения имеют актиномицеты, риккетсии.

Жгутики

Жгутики — это особые выросты на поверхности бактериальной клетки, содержащие белок – флагелин.

Количество и расположение жгутиков может быть различным. Толщина 12-20 нм, длина 3-15 мкм.

Состоят из трёх частей:

  • спиралевидной нити,
  • крюка,
  • базального тельца, содержащего стержень со специальными дисками.

Дисками жгутики прикреплены к цитоплазматической мембране и клеточной стенке. Жгутики обеспечивают подвижность бактериальной клетки. Механизм вращения обеспечивает протонная АТФ-синтетаза.

По характеру расположения жгутиков и их количеству бактерии делят на следующие группы:

  • атрихи – не имеют жгутиков;
  • монотрихи — один полярно расположенный жгутик;
  • лофотрихи — пучок жгутиков на одном конце;
  • амфитрихи — пучки жгутиков на обоих концах клетки;
  • перитрихи — множество жгутиков, расположенных вокруг клетки.

Морфология актиномицетов, патогенные представители

Актиномицеты :

  • Грамм+ бактерии.
  • Нет капсулы, жгутиков, ворсинок.
  • Есть включения.
  • Имеют вид длинных и ветвящихся несептированных нитей (длина 500-600 мкм, толщина 0,2-1,2 мкм).
  • Встречаются палочковидные и кокковидные формы, они образуются при фрагментации мицелия.
  • Как и грибы, образуют мицелий – нитевидные переплетающиеся клетки (гифы).
  • Размножаются спорами, поперечным делением, почкованием.
  • 2 рода:
    • Actinomyces,
    • Nocardia.
  • Являются представителями нормальной микрофлоры организма человека.
  • Продуцируют антибиотики.
  • Для человека патогенны очень немногие виды актиномицетов ― возбудители актиномикоза и нокардиоза .

Морфология спирохет, патогенные представители

Спирохеты :

  • Грам- бактерии.
  • Это извитые, тонкие, обладающие активной подвижностью микроорганизмы.
  • Не образуют спор, нет капсулы.
  • Есть жгутики.
  • Наделенные чертами сходства с простейшими: образуют цисты, способны к движению.
  • Длина 3-20 мкм, толщина 0,1-0,5 мкм.
  • Состоят из наружной мембраны (клеточной стенки), окружающей протоплазматический цилиндр с цитоплазматической мембраной и аксиальной нитью (аксостиль). Аксиальная нить находится под наружной мембраной и как бы закручивается вокруг протоплазматического цилиндра спирохеты, придавая ей винтообразную форму.
  • Аксиальная нить состоит из фибрилл – аналогов жгутиков бактерий, а внутри сократительный белок флагеллин. Фибриллы участвуют в передвижении спирохет, придавая клеткам вращательное, сгибательное и поступательное движение.
  • 3 Рода:
    • Treponema,
    • Borrelia,
    • Leptospira.
  • Патогенные представители:
    • Treponema pallidum – возбудитель сифилиса,
    • Borrelia recurrentis – возбудитель возвратного тифа,
    • Leptospira interrogans – возбудитель лептоспироза.

Морфология риккетсий, патогенные представители

Риккетсии :

  • Грам- бактерии.
  • Прокариоты, наделенные чертами сходства с вирусами: абсолютный внутриклеточный паразитизм и невозможность культивирования на искусственных питательных средах. Риккетсии обладают независимым от клетки-хозяина метаболизмом, но они получают от него макроэргические соединения для размножения.
  • Мелкие, размеры от 0,5 до 3-4 мкм.
  • Нет капсулы, жгутиков, не образуют спор, могут иметь включения.
  • Обладают полиморфизмом : имеют кокковидную, палочковидную или нитевидную форму.
  • Размножаются простым делением, дроблением.
  • 3 Рода:
    • Rickettsia,
    • Orientia,
    • Bartonella.
  • У человека риккетсии вызывают:
    • эпидемический сыпной тиф (Rickettsia prowazekii),
    • клещевой риккетсиоз (R. sibirica),
    • лихорадку цуцугамуши (R. tsutsugamushi),
    • пятнистую лихорадку Скалистых гор (R. rickettsii),
    • Bartonella quintana ― возбудитель волынской лихорадки ,
    • Сoxiella burnetii ― возбудитель Q-лихорадки .

Морфология хламидий, патогенные представители

Хламидии :

  • Грам- бактерии.
  • Облигатные внутриклеточные паразиты.
  • 2 фазы в цикле развития:
    • элементарные тельца — внеклеточная, инфекционная форма
    • и ретикулярные тельца — внутриклеточные.
  • Полиморфные : имеют шаровидную, овоидную или палочковидную формы.
  • Размеры 0,2-1,5 мкм.
  • Капсул, спор, жгутиков не образуют.
  • Морфология зависит от стадии их внутриклеточного цикла развития, который характеризуется превращением небольшого шаровидного элементарного образования в крупное инициальное тельце с бинарным делением.
  • Рода:
    • Chlamydia,
    • Chlamydophila
  • Виды:
    • Chlamydia trachomatis ― возбудитель трахомы, паратрахомы, лимфогранулематоза,
    • Chlamydophila psittaci ― возбудитель орнитоза, пситтакоз,
    • Chlamydophila pneumoniae ― возбудитель пневмонии.

Морфология микоплазм, патогенные представители

Микоплазмы :

  • Грам- бактерии.
  • Отличаются от бактерий полным отсутствием клеточной стенки. Вместо нее содержат трехслойную липопротеидную цитоплазматическую мембрану.
  • Нет клеточной стенки, нет капсулы, не образуют спор. Образуют колонии в виде яичницы-глазуньи.
  • Делятся почкованием, нитевидная форма может образовывать псевдомицелий (грибы).
  • Амебоидное движение, могут быть псевдоподии или жгутики(простейшие).
  • Размеры 0,15-0,3 мкм, мелкие, проходят через бактериальный фильтр.
  • Полиморфны : имеют форму круглых, овальных или нитевидных образований.
  • Род:
    • Mycoplasma,
    • Ureaplasma,
    • Acholeoplasma.
  • Виды:
    • Mycoplasma pneumoniae ― возбудитель пневмонии,
    • Ureaplasma urealyticum, hominis – возбудитель урогенитальных воспалительных процессов, бесплодия,
    • Mycoplasma hominis ― условно-патогенный организм, могут вызывать артриты.

Морфология вирусов

Вирусы – это мельчайшие микроорганизмы, относящиеся к царству Vira, не имеющие клеточного строения, белоксинтезирующей системы, содержащие только один тип нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК).

Они отличаются особым разобщенным способом размножения (репродукции) : в клетке отдельно синтезируются нуклеиновые кислоты вирусов и их белки и затем происходит их сборка в вирусные частицы. Вирусы, являясь облигатными внутриклеточными паразитами, размножаются в цитоплазме или ядре клетки. Сформированная вирусная частица называется вирионом.

Вирусы имеют различную форму вирионов:

  • палочковидная (вирус табачной мозаики),
  • пулевидная (вирус бешенства),
  • сферическая (вирусы полиомиелита, ВИЧ),
  • в виде сперматозоида (многие бактериофаги).

Вирусы имеют разные размеры , которые определяют с помощью электронной микроскопии, методом ультрафильтрации через фильтры с известным диаметром пор, методом ультрацентрифугирования.

Одним из самых мелких вирусов является вирус полиомиелита (около 20 нм), наиболее крупным – натуральной оспы (около 350 нм).

Вирусы имеют уникальный геном , так как содержат либо ДНК, либо РНК. Поэтому различают ДНК-содержащие и РНК-содержащие вирусы. Они обычно гаплоидны , т.е. имеют один набор генов. Геном вирусов представлен различными видами нуклеиновых кислот : двунитчатыми, однонитчатыми, линейными, кольцевыми, фрагментированными.

Среди РНК-содержащих вирусов различают вирусы с положительным (плюс-нить РНК) геномом . Плюс-нить РНК этих вирусов выполняет наследственную функцию и функцию информационной РНК (иРНК). Имеются также РНК-содержащие вирусы с отрицательным (минус-нить РНК) геномом.

Минус-нить РНК этих вирусов выполняет только наследственную функцию. Геном вирусов способен включаться в состав генетического аппарата клетки в виде провируса, проявляя себя генетическим паразитом клетки. Нуклеиновые кислоты некоторых вирусов (вирусы герпеса и др.) могут находиться в цитоплазме инфицированных клеток, напоминая плазмиды.

Вирусы различают по строению:

  • просто устроенные (например, вирус полиомиелита),
  • сложно устроенные (например, вирусы гриппа, кори) вирусы.

У просто устроенных вирусов нуклеиновая кислота связана с белковой оболочкой, называемой капсидом (от лат. capsa – футляр). Капсид состоит из повторяющихся морфологических субъединиц – капсомеров. Нуклеиновая кислота и капсид, взаимодействуя друг с другом, образуют нуклеокапсид.

Вирусы различают по типу симметрии капсида:

  • спиральный – обусловлен винтообразной структурой нуклеокапсида,
  • кубический– обусловлен образованием изометрически полого тела из капсида, содержащего вирусную нуклеиновую кислоту,
  • сложный.

Капсид и суперкапсид защищают вирионы от влияния окружающей среды, обусловливают избирательное взаимодействие (адсорбцию) с клетками, определяют антигенные и иммуногенные свойства вирионов. Внутренние структуры вирусов называются сердцевиной.

Принципы классификации вирусов

Классификация вирусов основывается на данных признаках:

  • тип нуклеиновой кислоты,
  • сложность строения,
  • размер вириона,
  • тип симметрии,
  • чувствительные организмы,
  • антигенная структура.

Читайте также:

Пожалуйста, не занимайтесь самолечением!
При симпотмах заболевания - обратитесь к врачу.