Тест с желчью на стрептококк
Тема занятия:«Бактериологическая диагностика
Составила преподаватель Якимова Л.М.
Цель занятия: Дать понятие о правилах забора, хранения и транспортировке исследуемого материала при стрептококковых инфекциях, питательных средах, необходимых для выделения и идентификации стрептококков и научить их готовить. Обучить методике микробиологической диагностики стрептококковых инфекций.
1. Взятие слизистого отделяемого из зева стерильным тампоном и посев на КА.
2. Изучение характера роста культуры на КА, отбор подозрительных колоний
3. Приготовление мазков, окраска по Граму, микроскопирование.
4. Отсев подозрительных колоний на сахарный бульон для накопления чистой культуры.
5. Определение чувствительности к бацитрацину, оптохину, постановка теста с желчью.
Методические указания к практической работе
Исследование на стрептококки проводят с диагностической целью и по эпидпоказаниям. Идентификация стрептококков до вида сложна, но обязательна при скарлатине и вспышках стрептококковых инфекций в родильных домах. В остальных случаях достаточно определить серогруппу. Исследуемым материалом при стрептококковых инфекциях являются: слизистое отделяемое из зева, миндалин, влагалища, смывы с кожи, сосков молочных желез, гной, мокрота, кровь, СМЖ, отделяемое ран, ушей и др.
1 этап. Биологический материал засевают на кровяной агар. При этом тщательно наносят его на 1/6 поверхности (приблизительно 2×3 см) около края чашки с кровяным агаром. Затем стерильной петлей материал штрихом разносится через первый участок примерно на 1/4 поверхности чашки Петри, чашку поворачивают на 90º и стерильной петлей производят посев штрихом через участок вторичной инокуляции на третий квадрант. Чашку вновь поворачивают на 90º и стерильной петлей рассевают материал с третьего квадранта на четвертый, последними несколькими штрихами, не возвращаясь к третьему квадранту. Используют 3-4 серии штрихов для получения отдельных колоний. Следует сделать проколы вглубь агара в нескольких местах (как в засеянных, так и незасеянных участках чашки) без прожигания петли. Рост в толще кровяного агара сопровождается максимально выраженной гемолитической реакцией.
2 этап. Идентификация стрептококков начинается с изучения колоний в первичных посевах материала на чашках с кровяным агаром.
Из подозрительных колоний готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. В препаратах стрептококки располагаются парами, короткими цепочками, иногда образуют скопления, напоминающие гроздья стафилококков. Морфологические свойства стрептококков, особенно в первых генерациях, характеризуются выраженным полиморфизмом. Наряду с шарообразными формами в мазках содержатся вытянутые в длину грубые кокки разной величины, даже в пределах одной цепочки. Пневмококки представляют собой ланцетовидные диплококки с заостренными наружными концами, иногда располагаются в виде цепочки. При использовании специальных методов окраски у пневмококков выявляют капсулу, окружающую пару или несколько пар кокков. Из подозрительных колоний ставят тест на каталазу. Стрептококки дают отрицательную каталазную реакцию (не обладают ферментом каталаза).
При обнаружении стрептококков в препарате оставшийся от микроскопического исследования материал колоний снимают петлей и инокулируют в питательный бульон с сывороткой крупного рогатого скота (10%) или глюкозы (0,2%), или в питательный бульон для стрептококков и высевают на сектор кровяного агара, на который накладывают диск, содержащий 0,04 ЕД бацитрацина и диск с котримаксозолом, содержащий 23,75 мкг сульфаметоксазола и 1,25 мкг триметаприма. Инкубируют при 35-37 0 С, 5-10% СО2.На жидких питательных средах рост различных видов стрептококков имеет свои особенности. Характер роста определяется длиной цепочек: придонно-пристеночный рост, с образованием мелкозернистого осадка, с сохранением полной прозрачности среды (S. pyogenes); придонный рост в виде пушистого рыхлого осадка с сохранением прозрачности и равномерным более или менее интенсивным помутнением надосадочного слоя (S.pneumoniae); диффузный рост с интенсивным помутнением бульона и образованием небольшого гомогенного осадка (Е. faecalis, Е. faecium, некоторые штаммы S.pyogenes и S.agalactiae).
Результат бактериологического обследования, ограничивающийся только выделением β-гемолитических стрептококков недостаточен для постановки этиологического диагноза. Необходимо определение серогрупповой и видовой принадлежности. Серогруппирование опеределяют с помощью реакции преципитации, используя специфические антисыворотки, или с помощью слайд-агглютинации.
Большая часть стрептококков, выделенных от человека, относится к группам А, В, С, D и G. Наибольшее значение в этиологии стрептококковых инфекций имеют стрептококки группы А (S. pyogenes), группы В (S. agalactiae) и пневмококки (S. pneumoniae).
Читайте также:
|
Исследуемый материал засевают на селективные и неселективные питательные среды . Для выделения стрептококков групп А и В из смеси культур используют КМПА с неомицином, для выделения S. agalactiae - селективный бульон с налидиксовой кислотой и гентамицином, для выделения S.bovis - желчно-эскулиновый агар. Исследуемый материал обязательно засевается на 5 % кровяной агар, для приготовления которого используется кровь барана. Эта среда ингибирует рост Haemophilus haemolyticus, обладающего сходными с пиогенным стрептококком культуральными свойствами и являющегося постоянным обитателем "слизистой оболочки верхних дыхательных путей. В качестве среды обогащения используют бульон для стрептококков и среду для контроля стерильности (СКС). Культивирование стрептококков в условиях повышенной концентрации двуокиси углерода дает более пышный рост. Чашки с посевами помещают в эксикатор с плотно притертой крышкой или в анаэростат, на дно которых ставят зажженную свечу. Инкубирую посевы при температуре 37°С в течение 18-24 часов, изучают характер колоний и наличие вокруг них зон гемолиза. По характеру гемолиза на КМПА стрептококки делят на три группы: 1) негемолитические; 2) α-гемолитические, или зеленящие, образующие зеленоватую зону частичного гемолиза за счет образования метгемоглобина; 3). β-гемолитические, образующие вокруг колоний прозрачную зону полного гемолиза. Представители первой группы обладают слабой вирулентностью и в большинстве случаев не имеют практического значения. Зеленящие стрептококки вегетируют на слизистой оболочке полости рта (S.salivarius, S.mutans, S.oralis), являются возбудителями крупозной пневмонии (Streptococcus pneumoniae). Бета-гемолитические стрептококки чаще всего являются источником заболеваний. Они вызывают скарлатину, рожистое воспаление, ангину, эндокардит, менингит, гнойно-воспалительные заболевания кожи, подкожной клетчатки, сепсис и постстрептококковые заболевания (ревматизм, гломеролонефрит).
Из подозрительных в отношении стрептококков колоний готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. Для первых генераций стрептококков часто характерен полиморфизм: наряду с типичными шаровидными клетками встречаются вытянутые в длину кокки разной величины, распологающиеся парами, короткими цепочками и скоплениями неправильной формы.
На жидких питательных средах рост различных стрептококков имеет свои особенности. Для пиогенного стрептококка характерен придонно-пристеночный рост с образованием мелкозернистого осадка и сохранением полной прозрачности среды. Пневмококки дают придонный рост в виде пушистого рыхлого осадка с сохранением полной прозрачности или равномерным более или менее интенсивным помутнением бульона. S.pyogenes, S.bovis, S.agalactiae могут вызывать интенсивное помутнение бульона с образованием небольшого гомогенного осадка. В мазках приготовленных с жидкой среды стрептококки располагаются обычно в виде длинных цепочек (7-8 и более кокков). Для получения чистой культуры выросшие изолированные колонии пересевают на КМПА. колоний. Из флаконов с посевами крови делают высев на КМПА на вторые, четвертые девятые сутки для получения изолированных колоний.
Заключительным этапом бактериологического исследования является идентификация выделенной культуры по биохимическим, антигенным свойствам, чувствительности к антимикробным средствам.
Проба на каталазу. В каплю 3% раствора перекиси водорода на предметном стекле вносят с помощью стеклянной палочки изучаемую культуру. Положительный результат оценивается по выделению пузырьков газа. Стрептококки каталазной активностью не обладают.
Проба с бацитрацином и сульфаниламидами. Диски с названными препаратами, помещают на чашки с засеянной сплошным газоном культурой, инкубируют 18-24 часа в аэробных условиях. Большинство штаммов S.pyogenes (99%) чувствительны к бацитрацину, стрептококки групп С и G чувствительны к смеси сульфаметоксазола и триметоприма.
Гидролиз гиппурата натрия. В 0,4 мл 1% водного раствора гиппурата натрия вносят петлю чистой культуры, материал инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 2 часов. Затем добавляют 0,2 мл 3,5% раствора нингидрина в смеси бутанола и ацетона (1:1). Через 10 минут после повторной инкубации появляется пурпурное окрашивание. Этот тест основан на способности стрептококков группы В вызывать гидролиз гиппурата натрия.
Желчно - эскулиновый тест необходим для идентификации стрептококков группы Д (S.bovis), которые растут на желчно-эскулиновом агаре с образованием комплекса темно-коричневого или черного цвета. Исследуемую культуру засевают на агар, содержащий 40% желчи, 0,1%эскулина и 0,05% цитрата железа. Результат учитывается через 24-48 часов инкубации при температуре 37°С.
Рост в бульоне с 6,5% раствором NaCl. Стрептококки группыВ, в отличие от других стрептококков, устойчивы к высокой концентрации NaCl. Результат учитывается через 24-48 часов инкубации при температуре 37°С.
Тест лизиса желчью. 10% раствор желчи лизирует молодую культуру пневмококка. При лизисе в опытной пробирке отмечается просветление. (В контрольной пробирке с сывороточным бульоном пневмококк дает придонный рост в виде пушистого рыхлого осадка)
Оптохиновый тест. От зеленящих стрептококков пневмококки отличаются высокой чувствительностью к оптохину. Рост пневмококка ингибируется оптохином в концентрации не более 5 мкг/мл. Зона ингибирования роста пневмококка вокруг диска с оптохином значительно превышает зону задержки роста прочих стрептококков.
Антигенная дифференциация стрептококков. В настоящее время по антигенному составу полисахарида клеточной стенки (субстанция С) стрептококки разделяют на 20 серологических групп, обозначаемых заглавными буквами латинского алфавита от А до V. Выпускаемые в настоящее время диагностикумы обеспечивают идентификацию стрептококков групп А, В, С, F, G по реакции преципитации. Внутри серогрупп стрептококки разделяют на серовары по специфичности белковых антигенов М, Р и Т, которые выявляются в реакции агглютинации. Серовары обозначаются цифрами. Большинство возбудителей различных стрептококковых инфекций относится к серогруппе А. Антигенную структуру пневмококков изучают в реакции агглютинации на стекле или в реакции Нейффельда с использованием набора сывороток к капсульным полисахаридам.
Иммунологическая диагностика стрептококковых заболеваний нашла признание при подтверждении диагноза ревматизма и направлена на определение титра антител к стрептолизину, гиалуронидазе, стрептокиназе в парных сыворотках по реакции нейтрализации ферментов.
Микробиологическая диагностика стрептококковыхинфекцийотражена в схеме 2. Выполняются следующие методы исследования.
Бактериоскопический метод– выявление в мазке из гноя патогенных кокков, располагающихся в виде небольших цепочек. Типичное расположение в виде цепочек характерно для чистых культур стрептококка (рис. 2 цветная вкладка).
| Схема 2. Микробиологическая диагностика стрептококковых инфекций | |
| Материал: гной, раневое отделяемое, пунктаты из полостей и абсцессов, кровь, мокрота, моча, ликвор, рвотные массы, испражнения, остатки пищи. | |
| Микроскопический метод. Выявление грамположительных кокков в виде цепочек в мазках из материала от больного. Бактериологический метод. 1. день. Посев материала на чашки кровяным МПА, пробирки или флаконы с сахарным МПБ. 2 день -учет характера роста колоний (на кровяном МПА - зоны гемолиза, в МПБ –равномерное помутнение). В мазке из колоний в окраске по Граму – кокки в виде цепочек. Оставшуюся часть колонии пересевают на скошенный МПА для получения чистой культуры. Пересев с сахарного МПБ на кровяной МПА | 3 день - идентификация выделенной культуры стрептококка, дифференциация основных видов, определение чувствительности к антибиотикам. Выделение чистой культуры с кровяного МПА. 4 день.Заключение о виде стрептококка. Идентификация культуры, выделенной из сахарного МПБ 5 день.Заключение о виде стрептококка, выделенного из сахарного МПБ. Серологический метод Реакция нейтрализации (РН) для определения антистрептолизина-О (гемолизина) и антигиалуронидазы в сыворотке крови больных стрептококковыми инфекциями. |
Бактериологический метод.Исследуемый материал засевают на кровяной МПА в чашках Петри. После выращивания в термостате при 37 0 С в течение суток учитывают характер роста колоний (колонии очень мелкие, величиной с булавочную головку, круглые, мутноватые, матовые). Слизистые колонии типичны для свежевыделенных штаммов, стрептококка, матовые – для вирулентных стрептококков с высоким содержанием М-протеина, блестящие – для невирулентных штаммов. На кровяном МПА стрептококки вызывают α–гемолиз (зеленоватая зона вокруг колоний) или β-гемолиз (полностью прозрачная зона гемолиза). Негемолитические стрептококки обычно непатогенны. Из типичных для стрептококка колоний готовят мазок в окраске по Граму и после микроскопии (Streptococcus pyogenes окрашивается по Граму положительно, располагается в виде цепочек) делают пересев в пробирки с сахарным МПБ и кровяным МПА. На 3 день учитывают характер роста (на сахарном МПБ рост стрептококка в виде придонно-пристеночного осадка, сама среда прозрачна), готовят мазок в окраске по Граму и проводят идентификацию выделенной культуры стрептококка по антигенным свойствам. Серогруппу стрептококков определяют в реакциях преципитации, латекс-агглютинации или коагглютинации с целью выявления группоспецифического полисахаридного антигена А, используя группоспецифические сыворотки (обычно групп A, B, C, F, G). Большинство патогенных для человека стрептококков являются β-гемолитическими и относятся к группе A. Серовар выделенной культуры стрептококка выявляют с помощью реакции агглютинации (выявление типового протеинового антигена М, по которому выделяют около 100 сероваров) с типоспецифическими стрептококковыми сыворотками.
Для идентификации β-гемолитических стрептококков применяют PYR-тест (на пирролидониламидопептидазу), CAMP-тест (на белок синергидного гемолиза), тест Фогес-Проскауэра (на образование ацетоина), чувствительность к бацитрацину (0,04 ЕД на диск), галотолерантность (рост в присутствии 6,5% хлорида натрия), гидролиз гиппурата натрия, ферментацию трегалозы, сорбита и т.д. α -гемолитические стрептококки идентифицируют, используя тесты на чувствительность к желчи, оптохину, на гидролиз эскулина и т.д. (табл. 3).
PYR -mecm. В МПБ, содержащий 0,01 % L-пирролидонил- β –нафтиламин, вносят петлю агаровой культуры стрептококка, инкубируют при 37 0 С в течение 4 ч. Положительная реакция характеризуется появлением ярко-красного окрашивания после внесения 1 капли специального реактива.
Таблица 3 .Дифференциальные признаки стрептококков
| Свойства | Микроорганизмы | |||
| S. pyogenes | S. agalactiae | Стрептококки групп C и G | S. bovis | |
| Вид гемолиза | Β | β, α | β | α , |
| Гидролиз гиппурата натрия | - | + | - | - |
| CAMP-тест | - | + | - | - |
| PYR-тест | + | - | - | - |
| Желчно-эскулиновый тест | - | - | - | + |
| Рост в солевом МПБ | - | + | - | - |
| Чувствительность к бацитрацину | + | - | - | - |
| Чувствительность к сульфаметоксазолу и триметоприму | - | - | + | + |
Обозначения:(+) - постоянный признак, (-) – отсутствие признака
Исследование крови.Для выделения гемокультуры посев обычно производят в сахарный бульон. При наличии стрептококка на дне флакона появляется хлопьевидный придонный осадок, а в мазках обнаруживаются длинные цепочки стрептококков. Для выделения чистой культуры и определения характера гемолиза делают пересев в чашку с кровяным агаром. Через сутки (3-й день исследования) появляются типичные мелкие колонии, окруженные зоной гемолиза. Дальнейший ход исследования аналогичен описанному выше.
Генодиагностика. Разработан метод ДНК-ДНК-гибридизации для обнаружения специфических фрагментов ДНК стрептококка в исследуемом материале, что дает основание поставить предварительный диагноз стрептококковой инфекции.
Серодиагностика(определение антител к гемолизину – стрептолизину-О) проводится при подозрении на ревматизм. Сущность реакции заключается в нейтрализации антителами сыворотки крови больного гемолитической активности стрептококкового стрептолизина-О. Титр антистрептолизина-О у здоровых людей – до 250 АЕStO. При ревматизме с первых дней болезни титр антистрептолизина-О составляет 500 АЕStO и выше.
Обзор
Анализ на стрептококк (быстрый стрептококковый тест или экспресс-тест на стрептококк) - это тест, который позволяет определить, есть ли у вас в горле бактерия, которая называется "стрептококк группы А". Эта бактерия вызывает инфекцию, которая называется стрептококковый фарингит (ангина).
Использование
Стрептококковая инфекция встречается достаточно часто, особенно у детей в возрасте от 3 до 15 лет. Инфекция передается через контакт с инфицированной слизью или слюной.
Обычно врач назначает экспресс-тест на стрептококк, если у вас есть боли в горле и лихорадка. Другими признаками стрептококковой инфекции могут быть:
- затрудненное глотание;
- отсутствие аппетита;
- озноб;
- недостаток сил;
- болезненность или увеличение лимфатических узлов.
В некоторых случаях у людей, болеющих стрептококковой инфекцией, появляется розовая сыпь на коже, которая по ощущениям похожа на наждачную бумагу. Так как у взрослых стрептококковая инфекция встречается реже, врач не будет назначать быстрый стрептококковый тест, если у вас есть сочетание таких тяжелых или повторяющихся симптомов, как боли в горле, лихорадка, увеличение лимфатических узлов в горле.
Процедуры
Процедура быстрого стрептококкового теста проста, и он может проводиться в большинстве кабинетов врачей и медицинских клиник. Вам не нужно готовиться заранее. Перед тестом врач посмотрит в ваш рот и убедится в наличии красноты, отечности или других признаков инфекции. Врач попросит вас открыть рот и при помощи деревянного шпателя отодвинет язык вниз.
После этого врач возьмет ватный тампон и проведет им по задней стенке глотки (горла) для получения образца для анализа. Чтобы получить более точные результаты, он может сделать это дважды. Мазок будет протестирован при помощи специальных реактивов, которые позволяют подтвердить наличие стрептококка группы А.
Тест не болезненный, но может вызывать некоторый дискомфорт. Взятие мазка может вызвать рвотный рефлекс. Если быстрый стрептококковый тест требуется вашему ребенку, лучше взять его на руки или усадить к себе на колени, потому что, возможно, потребуется держать ребенка во время процедуры.
Результаты
Для получения результатов экспресс-теста требуется 15 минут. Если тест положительный, у вас в горле есть стрептококк группы А, который может быть причиной инфекции. Если он отрицательный, в вашем горле нет бактерий.
Быстрый стрептококковый тест является достаточно надежным. Тем не менее антибиотики и антисептики, которыми вы полощете рот, могут повлиять на результаты теста. Если вы принимаете антибиотики, не забудьте сообщить об этом своему врачу. Если вы знаете, что скоро вам будут делать тест, не используйте жидкость для полоскания рта, так как это может привести к ложному отрицательному результату.
В некоторых случаях, если у вас есть симптомы стрептококковой инфекции, но результат теста отрицательный, врач может назначить посев из горла. Посев из горла похож на экспресс-тест, но обработка образца более сложная. Кроме того, он более дорогой и требует больше времени для получения результатов, так как для роста бактерий необходимо определенное время. Посев из горла может подтвердить наличие стрептококка группы А.
Важно также отметить, что стрептококковый экспресс-тест позволяет обнаружить только один тип бактерий - стрептококк группы А. Это означает, что, если тест отрицательный, у вас может быть инфекция, вызванная другим типом бактерий или вирусов.
Реабилитация
Тест простой, быстрый и не имеет никаких побочных эффектов или рисков. Если результат теста на стрептококк положительный, врач, скорее всего, назначит антибиотики и порекомендует вам пить теплую жидкость и полоскать горло соленой водой.
Если результат теста на стрептококк отрицательный, но горло все равно болит, врач может проанализировать другие возможные причины, включая инфекции, вызванные другими бактериями или вирусами.
Если стрептококковую инфекцию не лечить, она может привести к более серьезным заболеваниям, таким как стрептококковая пневмония, ушные инфекции, менингит, воспаление почек и ревматизм. Если у вас появляются симптомы стрептококковой инфекции, своевременно обращайтесь к врачу.
Рефераты и конспекты лекций по географии, физике, химии, истории, биологии. Универсальная подготовка к ЕГЭ, ГИА, ЗНО и ДПА!
Микробиологическая диагностика стрептококковых заболеваний
Наиболее частыми возбудителями стрептококковых заболеваний являются: S.pyogenes, S. agalactiae, S. bovis, стрептококки
группы C и G, которые входят в семьи Streptococcaceae, рода Streptococcus.
Материалом для исследования навоз, отделяемое из зева и носа, ликвор, мокрота, кровь, моча, содержимое везикул, пустул.
Материал отбирают одноразовым шприцем или стерильным ватным тампоном, который помещают в пробирку с транспортным питательной средой (СКС- среда для контроля стерильности).
Кровь для бактериологического исследования в объеме 5-10 мл засевают в сахарный бульон непосредственно у постели больного таким образом, чтобы соотношение крови и питательной среды было бы не менее 1:10 - 1:20. Срок передачи патологического материала в бактериологическую лабораторию не должен превышать двух часов.
Микробиологическую диагностику стрептококковых заболеваний проводят микроскопическим, бактериологическим и серологическим методами.
Микроскопический метод. Из материала, который исследуется готовят мазок и красят его по Граму. При микроскопии в мазке обнаруживаются грамположительные кокки, которые располагаются короткими цепочками, иногда попарно или в виде единичных кокков. На основе изучения морфологических и тинкториальных свойств невозможно определить род выявленных в препарате микробов.
Для выявления патогенного стрептококка, в полученном от больного клиническом материале, используют реакцию имунофлюоресценциии (РИФ). В этом случае используют специфические сыворотки, в которых антитела против стрептококков замечены флюорохромом (см. Приложение).
Бактериологический метод является основным в диагностике стрептококковых заболеваний. Взят для исследования материал высевают в среду обогащения, в качестве которого используют среду для контроля стерильности (СКС). После инкубации в термостате материал, исследуется пересевают сахарным бульон и на 5% кровяной агар с целью выделения чистой культуры микробов, изучение культуральных свойств и характера его гемолиза. Посевы помещают в эксикатор с плотно притертой крышкой и зажженной внутри свечой, или в анаэростатах, где создают повышенную концентрацию двуокиси углерода. Инкубируют в термостате при температуре 37 ° С в течение 18-24 часов. На сахарном бульоне S. pyogenes дает придонно- пристеночный рост с образованием мелкозернистого осадка и сохранением полной прозрачности среды. S. bovis вызывает интенсивное помутнение бульона с образованием небольшого гомогенного осадка. В изготовленных из бульонной культуры мазках стрептококки располагаются обычно в виде типичных для них длинных цепочек.
На кровяном агаре стрептококки образуют мелкие (1-2 мм в диаметре) прозрачные или полупрозрачные колонии серовато-белого цвета. По типу гемолиза на кровяном агаре стрептококки разделяют на три группы.
Первая группа представлена β-гемолитическими стрептококками, способными вызвать полный лизис эритроцитов (полное просветление среды) вокруг колоний. Колонии прозрачные, слизистые, круглой формы, напоминают капли росы. Это характерно для свижовидилених штаммов S. pyogenes. Блестящие колонии характерны для многих штаммов S.agalactiae.
Вторая группа представлена α-гемолитическими стрептококками, которые вызывают на кровяном агаре неполный гемолиз в виде полупрозрачной зоны зеленоватого оттенка. Зеленящий стрептококки растут в виде мелких колоний серого цвета с гладкой или шероховатой поверхностью. Такой рост характерен для многих видов стрептококков, вегетирующих на слизистой оболочке полости рта (S.salivarius, S. mutans, S.oralis и др.)
Третья группа представлена негемолитическая γ-стрептококками. Они не вызывают изменений кровяного агара в процессе своего роста, имеют слабо выраженную вирулентность.
С подозрительных колоний готовят мазки, окрашивают по Граму и микро- вскапывают. Колонии, выросшие на кровяном агаре, пересевают на скошенный кровяной агар. Посевы инкубируют в термостате при температуре 37 ° С в течение 18-24 часов. С целью проверки чистоты выделенной культуры, с микробного налета, вырос на скошенном агаре готовят мазок, окрашивают по Граму, микроскопируют. В случае, когда культура микробов чистая, продолжают изучать их биохимические и антигенные свойства. Для установления видовой принадлежности стрептококков наибольшее значение имеют следующие тесты: тип гемолиза на кровяном агаре, проба на каталазу, чувствительность к бацитрацину и сульфаниламидов (сульфаметоксазола и триметоприма), желчно-ескулиновий тест, рост в бульоне с 6,5% NaCl, наличие пиролидонилариламидазы (PYR), гидролиз гипурату натрия.
Проба на каталазу. Тест основан на способности микроорганизмов, которые имеют этот фермент, расщеплять перекись водорода с образованием кислорода и воды. Для постановки этого теста чистую культуру помещают в каплю 3-10% раствора перекиси водорода на предметном стекле и растирают круговыми движениями. В положительном случае наблюдают выделение пузырьков газа. В отличие от стафилококков, стрептококки не имеют этого фермента.
Проба с бацитрацином и сульфаниламидами. Для предварительной идентификации S.pyogenes и β-гемолитических стрептококков групп C и G используют два бумажных диска, один из которых пропитан раствором антибиотика бацитрацином, а второй - смесью сульфаметоксазола и триметоприма. Диски помещают на чашку с кровяным агаром, усеянным культурой, которую испытывают и инкубировать 18-24 часа в аэробных условиях. Любая видимая зона задержки роста вокруг дисков интерпретируется как чувствительна к этим антимикробных препаратов. Абсолютное большинство штаммов S. pyogenes чувствительна к бацитрацину, а стрептококки групп С и G - к сульфаниламидов.
Желчно-ескулиновий тест. Используется для предварительной идентификации стрептококков S.bovis, которые растут на желчно-ескулиновому агаре с образованием колоний темно-коричневого или черного цвета.
Рост в бульоне с 6,5% раствором NaCl. S.agalactiae в отличие от других стрептококков устойчив к высокой концентрации хлористого натрия и дает рост в бульоне через 24-48 часа инкубации в термостате при температуре 37 ° С.
PYR - тест. В основе теста лежит выявление фермента пиролидониламидазы, которая у большинства штаммов S. pyogenes и не встречается в других стрептококков. Культуру, которую исследуют, петлей вносят в питательную бульон содержит 0,01% L-пиролидонил-β-нафтиламиду и инкубируют при температуре 37 ° С в течение 4:00. После добавления одной капли диметиламиноациннамальдегида в положительном случае появляется ярко-красную окраску.
Гидролиз гипурату натрия. В основе данного теста лежит способность S. agalactiae вызвать гидролиз гипурату натрия. Выделенную чистую культуру с помощью петли диспергируют в 1% водном растворе гипурату натрия. Через 2:00 инкубации при температуре 37 ° С добавляют 3,5% раствор нингидрина в смеси бутанола и ацетона (1: 1). При положительном результате после инкубации в течение 10 мин. появляется пурпурное окрашивание.
Дифференциация стрептококков по антигенной структуре. Основывается на выявлении полисахаридного антигена клеточной стенки стрептококка. Например применяют реакцию преципитации с группоспецифической сыворотками групп А, В, С, G. Эти сыворотки наливают в 4 узкие преципитацийни пробирки. Экстракт, полученный после обработки центрифугата чистой культуры стрептококка раствором хлористо-водородной кислоты, осторожно, не смещая жидкости, наслаивают на группоспецифические сыворотки. При положительной реакции на границе двух жидкостей появляется белое кольцо. Конечно реакция преципитации возникает через 5-30 мин.
Серологический метод диагностики стрептококковых заболеваний нашел применение в случае установления диагноза ревматизма. Для этого в сыворотке крови больного определяют титр антител к экстрацеллюлярного продуктов стрептококка - стрептолизина-О. Исследуют парные сыворотки больного с интервалом 7-10 дней. Препарат стрептолизина-О, который выпускают в сухом виде, растворяют и вносят в каждую пробирку с разбавленной сывороткой. В день постановки опыта готовят 5% взвесь эритроцитов дефибринированной крови кролика и также вносят в каждую пробирку.
Реакция базируется на нейтрализации способности стрептолизина-О растворять эритроциты in vitro в случае присутствия в сыворотке больного антител против стрептококка (Антистрептолизин-О). Максимально разведенная сыворотка в пробирке обеспечивает задержку гемолиза эритроцитов и указывает на соответствующее количество антистрептолизина-О.
Титр Антистрептолизин-О у практически здоровых лиц не превышает 250 международных единиц. При острых и хронических стрептококковых инфекциях он нарастает, причем при наличии ревматизма или нефрита с первых дней заболевания отмечается очень высокий титр антител (500 ед. И выше).
Читайте также:
