Проба розбенгала при бруцеллезе
Бруцеллез (Brucellosis) — инфекционная, хронически протекающая болезнь домашних, некоторые виды диких животных и человека, характеризующаяся поражением многих систем жизнеобеспечения, нарушением функций сосудистой, пищеварительной, мочеполовой систем и системы воспроизводства.
Изучая причины мальтийской лихорадки, английский врач Д. Брюс в 1886 – 1887 гг. установил, что виновником ее является специфический микрококк, названный им Micrococcus melitensis. Дальнейшие исследования показали, что источником возбудителя мальтийской лихорадки являются козы, пораженные инфекцией, а причиной заражения людей — потребление молока от таких коз. Несколько позже Micrococcus melitensis был выделен у овец.
В1897 г. датские ученые Банг и Стриболд установили, что массовые аборты у коров вызывает микроорганизм, названные B. abortus bovis. В 1914 г. Траум обнаружил очень сходный микроорганизм, названный Br. abortus suis, при массовых абортах у свиней.
Для диагностики бруцеллеза в 1897 г. Райтом была предложена серологическая реакция агглютинации, а в 1922 г. Берне разработал внутрикожную аллергическую пробу, облегчающую распознавание болезни.
Долгое время мальтийская лихорадка у людей и массовые аборты у домашних животных считались самостоятельными заболеваниями. В 1918 – 1920 гг. Ивенс, Мейер и Фезье, изучая биологические свойства возбудителя мальтийской лихорадки и массовых абортов у крупного рогатого скота, обнаружили их чрезвычайную близость. Эти исследования явились основанием объединить указанных возбудителей, в том числе и возбудителя массовых абортов у свиней, в одну родовую группу под наименованием Brucella (в честь Брюса), а вызываемые ими заболевания именовать бруцеллезом.
В России начало изучения бруцеллеза было положено работами Е. И. Марциновского (1911), но детальному изучению заболевание подверглось в различных местностях СССР лишь с 1935 г. Большой вклад в изучение бруцеллеза сельскохозяйственных животных внесли отечественные ученые: С. Н. Вышелесский, П. Ф. Здродовский, П. А. Вершилова, М. К. Юсковец, Е. С. Орлов, Р. А. Цион, А. П. Бессонов и др. Были всесторонне изучены биологические свойства возбудителя, усовершенствованы методы диагностики, показаны значение в борьбе с бруцеллезом вакцинальной профилактики и пути ее совершенствования.
Клинические признаки бруцеллеза у крупного рогатого скота
Длительность инкубационного периода 2 – 3 недели. Первым показателем развившегося инфекционного процесса служит появление в крови инфицированных животных агглютининов в постепенно нарастающих титрах.
У коров основным клиническим признаком бруцеллеза является аборт и реже рождение нежизнеспособного приплода. Коровы, заразившиеся до покрытия, в большинстве случаев приносят нормальный приплод. Аборт чаще всего происходит на 5 – 8-м месяце. За 1 – 2 дня до наступления аборта у коров отмечается припухание наружных половых органов, выделение из влагалища бесцветной или буроватой жидкости и набухание вымени. После аборта происходит задержка последа и развивается эндометрит, сопровождающийся обильными слизисто-гнойными или гнойно-фибринозными выделениями. При тяжело протекающем эндометрите повышается температура тела, снижаются удои, отмечается потеря веса, убыстряется СОЭ; умеренный лейкоцитоз. Эндометритам нередко сопутствуют серозные или серозно-катаральные маститы. В процессе могут вовлекаться яичники и фаллопиевы трубы, что приводит к нарушению полового цикла и временному или стойкому бесплодию.
У отдельных животных в связи с абортом или независимо от него можно наблюдать развитие серозных бурситов или серофибринозных артритов. Последние в большинстве случаев возникают в суставах передних конечностей — запястном, путовом, коленном, локтевом. У быков бруцеллез, хотя и редко, сопровождается развитием орхитов и эпидидимитов.
Лабораторная диагностика бруцеллеза основана на результатах бактериологического и серологического исследований. Бактериологическое исследование в основном применяют при первичной постановке диагноза на бруцеллез в ранее благополучных хозяйствах.
В лабораторию направляются пробы крови (сыворотки) для серологического исследования, абортивный плод с плодными оболочками, околоплодную жидкость, истечения из родовых путей или желудок плода, кусочки печени, селезенки, пробы молока (последние порции). При убое животных берут паренхиматозные органы, лимфатические узлы, пораженные суставы, у самцов — семенники. Объектом исследования могут быть молочные продукты (брынза, сыр, масло), объекты внешней среды.
При массовых диагностических исследованиях ставят пробирочную РА, роз бенгал пробу (РА на стекле), РСК, РДСК, кольцевую реакцию с молоком (КР). Диагностикумы для этих исследований, а также бруцеллин ВИЭВ для аллергической диагностики готовятся на Щелковском биокомбинате.
По данным К. В. Шумилова до 1952 года борьба с бруцеллезом крупного рогатого скота в нашей стране сводилась к проведению диагностических исследований и удалению из стад больных животных, без применения противобруцеллезных вакцин. В связи с осложнением эпизоотической ситуации в 1953 году в систему противобруцеллезных мероприятий была включена иммунизация животных вакциной из штамма B. abortus 19.
Вакцину из штамма B. abortus 19 применяли до 1970 года. За 20 лет применения вакцины многие хозяйства, даже области, были оздоровлены от болезни. Однако в регионах с широким распространением бруцеллеза эффективность оздоровительных мероприятий оказалась низкой. В первую очередь, это было обусловлено высокой агглютиногенностью вакцины. Агглютинины и комплементсвязывающие антитела, вырабатывающиеся в ответ на введение вакцины, сохраняются в организме животных до 5 – 8 лет и затрудняют дифференциацию иммунизированных животных от больных бруцеллезом.
С 1971 по 1974 год вакцину из штамма B. abortus 19 использовали только на телках 5 – 8 месячного возраста. С 1974 года и по настоящее время в России в комплексе противобруцеллезных мероприятий применяются вакцины из штаммов B. abortus 82 и 19. Живая сухая вакцина против бруцеллеза из слабоагглютиногенного штамма № 82 отличается от вакцины из штамма 19 слабым серологическим ответом с быстрым снижением уровня гуморальных антител, что позволяет при помощи серологических реакций дифференцировать вакцинированных животных.
За 30 лет работы с применением вакцины из штамма B. abortus 82 и смены пяти поколений коров к 2004 году (К. В. Шумилов) количество неблагополучных по бруцеллезу пунктов и заболевших животных значительно сократилось.
Сухая живая вакцина против бруцеллеза крупного рогатого скота из штамма B. abortus 75/79-АВ разработана сотрудниками ВГНКИ и Алтайской НИВС с использованием культуры штамма 75/79, выделенного от коровы, ранее иммунизированной вакциной из штамма B. abortus 82. После многократных пассажей выделенного штамма через организм морских свинок и телок и целенаправленной селекции на питательных средах, был получен новый вакцинный штамм 75/79-АВ. Вакцины не обладает абортогенными свойствами, что дает возможность проводить иммунизацию маточного поголовья независимо от сроков стельности. Вакцина является слабоагглютиногенной; агглютинины и комплементсвязывающие антитела регистрируются у привитых животных в течение трех месяцев после иммунизации, что делает возможным их исследование по истечении указанного срока. У животных, иммунизированных вакциной, выраженный иммунитет сохраняется в течение года, что позволяет за указанный срок оздоравливать неблагополучные хозяйства от бруцеллеза.
Штамм B. abortus КВ 17/100, находящийся в R-форме, получен путем целенаправленной селекции по культуральным, морфологическим, биохимическим и антигенным свойствам из вакцинного штамма B. abortus 104М, находящегося в S-форме. Адъювант-вакцина не индуцирует синтез S-бруцеллезных антител в диагностических титрах у животных, не сенсибилизированных бруцеллами. Адъювант-вакцина индуцирует синтез S-бруцеллезных антител у крупного рогатого скота с латентной формой бруцеллеза, что позволяет за счет быстрого удаления из стад таких животных, ускорить оздоровление хозяйств, неблагополучных по бруцеллезу.
Адъювант-вакцина не абортогенна и может быть использована для иммунизации маточного поголовья крупного рогатого скота независимо от сроков стельности.
4.1. Серологическая диагностика бруцеллеза заключается в обнаружении специфических
антител в сыворотке крови животных с помощью реакции агглютинации в пробирках (РА), реакции
связывания комплемента (РСК), реакции длительного связывания комплемента на холоде (РДСК),
пластинчатой реакции агглютинации с роз бенгал антигеном (роз бенгал проба - РБП) и в молоке
коров - кольцевой реакции (КР).
4.2. Постановка и учет результатов реакции агглютинации в пробирках (РА).
4.2.1. Реакцию агглютинации в пробирках с бруцеллезным антигеном применяют при
диагностике бруцеллеза у крупного рогатого скота, овец, коз, лошадей, буйволов, верблюдов, оленей,
собак, пушных зверей и животных других видов.
4.2.2. Компоненты реакции агглютинации:
испытуемые сыворотки крови (см. подпункт 2.3.1);
позитивная бруцеллезная сыворотка, изготовленная биопредприятием или полученная от
больного бруцеллезом животного. На этикетке флакона с такими сыворотками указывают титры в РА
и РСК и дату изготовления;
негативная сыворотка (сыворотка крови здоровых животных), изготовленная биопредприятием
или полученная в лаборатории;
антиген бруцеллезный единый для РА, РСК и РДСК (см. Приложение N 2, п. 6);
раствор хлорида натрия. При исследовании сывороток крови крупного рогатого скота, лошадей,
верблюдов, собак, пушных зверей и морских свинок для разведения испытуемых сывороток и
антигена используют фенолизированный (0,5-процентный) физиологический раствор хлорида
натрия (0,85-процентный), при исследовании сывороток крови овец, коз, буйволов - 5-процентный
и оленей - 10-процентный фенолизированный раствор хлорида натрия (см. Приложение N 2, п. 1).
4.2.3. Постановка реакции агглютинации.
Реакцию агглютинации проводят в объеме 1 мл в четырех разведениях:
при исследовании сывороток крови овец, коз, буйволов, оленей и собак - 1:25, 1:50, 1:100 и
крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов - 1:50, 1:100, 1:200 и 1:400;
пушных зверей и морских свинок - 1:10, 1:20, 1:40 и 1:80.
При массовых исследованиях допускается постановка реакции в первых двух разведениях.
Разлив компонентов реакции проводят индивидуальными мерными пипетками или
групповыми дозаторами Флоринского.
Для исследования каждой испытуемой сыворотки крови требуется 5 пробирок. В пробирках
первого ряда делают основное разведение. Для этого сыворотку крови крупного рогатого скота,
лошадей и верблюдов берут в дозе 0,1 мл, вносят в пробирки и добавляют к ней 2,4 мл
соответствующего раствора хлорида натрия, получают разведение сыворотки 1:25. Сыворотку крови
овец, коз, буйволов, оленей и собак берут в дозе 0,2 мл и добавляют 2,3 мл соответствующего
раствора хлорида натрия (разведение 1:12,5), а сыворотку крови пушных зверей и морских свинок
берут в дозе 0,3 мл и добавляют 1,2 мл соответствующего раствора хлорида натрия (разведение 1:5).
Таким образом делают основное разведение испытуемых сывороток в пробирках первого ряда
штатива (по 10 проб в ряду).
После приготовления основного разведения сывороток в первом ряду в пробирки третьего,
четвертого и пятого рядов вливают по 0,5 мл соответствующего раствора хлорида натрия. Затем из
пробирок первого ряда при помощи группового дозатора Флоринского переносят в пробирки второго
и третьего рядов по 0,5 мл основного разведения сывороток (1:25, 1:12,5 или 1:5). В пробирках
третьего ряда сыворотки смешивают с раствором хлорида натрия, по 0,5 мл этого разбавления
переносят в пробирки четвертого ряда и так же из пробирок четвертого ряда - в пятый. Из пробирок
пятого ряда по 0,5 мл жидкости удаляют. Таким образом делают последовательные двукратные
разведения одновременно 10 сывороток.
После этого в каждую пробирку второго, третьего, четвертого и пятого рядов с разведенными
сыворотками вносят при помощи группового дозатора Флоринского или другого дозирующего
устройства по 0,5 мл антигена, предварительно разбавленного в соотношении 1:10 соответствующим
раствором хлорида натрия. После добавления антигена разведение сывороток в каждой пробирке
удваивается и в зависимости от вида исследуемых животных будет составлять соотношения: 1:50,
1:100, 1:200 и 1:400; 1:25, 1:50, 1:100 и 1:200 или 1:10, 1:20, 1:40 и 1:80.
В пробирки первого ряда бруцеллезный антиген не вносят, и они служат контролем качества
сыворотки. При наличии хлопьев, фибрина, эритроцитов и посторонних примесей результаты
реакции агглютинации не учитывают.
При массовых исследованиях сыворотки разливают индивидуальной микропипеткой (с грушей)
или групповыми дозаторами Флоринского в две пробирки в дозах 0,02 и 0,01 мл (сыворотки
крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов) или 0,04 и 0,02 мл (при исследовании сывороток
овец, коз, буйволов, оленей и собак). Затем в каждую пробирку добавляют по 1,0 мл антигена,
разведенного соответствующим раствором хлорида натрия в соотношении 1:20. При этом разведения
сывороток будут соответствовать соотношениям 1:50 и 1:100 или 1:25 и 1:50.
При постановке реакции агглютинации одновременно с испытуемыми сыворотками ставят
с негативной сывороткой в тех же разведениях, как с испытуемыми;
с позитивной бруцеллезной сывороткой в разведениях до ее предельного титра.
После добавления к испытуемым и контрольным сывороткам антигена штативы с пробирками
осторожно встряхивают и помещают в термостат при 37 - 38 °С на 16 - 20 часов, затем выдерживают
при комнатной температуре в течение 1 часа, после чего проводят учет реакции.
4.2.4. Учет реакции агглютинации. Результаты реакции учитывают визуально и определяют в
крестах по следующей схеме:
++++ (4 креста) - полное просветление жидкости, микробные тела
осели на дно пробирки в виде "зонтика", при легком
встряхивании "зонтик" разбивается на хлопья и
а жидкость остается прозрачной (100% агглютинации);
+++ (3 креста) - неполное просветление жидкости и хорошо выраженный
"зонтик" (75% агглютинации);
++ (2 креста) - просветление жидкости, "зонтик" умеренно выражен
+ (1 крест) - едва заметное просветление жидкости, "зонтик"
слабо, при встряхивании заметно небольшое
хлопьев или комочков (25% агглютинации);
- (знак минус) - просветления жидкости и образования "зонтика" не
наступило, на дне пробирки виден "пунктик" осевших
микробов антигена, при легком встряхивании
За титр антител принимают последнее разведение сыворотки, в котором произошла
агглютинация не менее чем на 2 креста (++), что соответствует количеству международных единиц
(ME) антител в 1 мл сыворотки (например, сыворотка с конечным титром РА 1:100 содержит 100 ME,
1:200 - 200 ME и т.п.).
Для более объективной оценки результатов РА в крестах готовят стандарты мутности,
соответствующие 0 (нулю), 25, 50 и 75% просветления жидкости.
В четыре пробирки последовательно наливают 1, 2, 3 и 4 мл антигена, разведенного 1:10. Затем
в том же порядке в три первые пробирки добавляют 3, 2 и 1 мл фенолизированного
физиологического раствора. В четвертую пробирку раствор не добавляют. После встряхивания
пробирок жидкость из каждой из них переносят по 0,5 мл в серологические пробирки и добавляют по
0,5 мл фенолизированного физиологического раствора. Полученные стандарты соответствуют 75, 50
и 25% просветления жидкости. В последней, четвертой пробирке просветление отсутствует.
Стандарты мутности готовят каждый раз при постановке РА и выдерживают в термостате
одновременно с основной реакцией.
Степень просветления в пробирках с исследуемыми сыворотками определяют визуально путем
сравнения со стандартами и результаты реакции выражают в крестах.
При массовых исследованиях сывороток в двух разведениях все сыворотки, давшие
агглютинацию с оценкой не менее чем на 2 креста (++) в каком-либо из указанных разведений,
исследуют повторно в четырех разведениях.
4.2.5. Диагностическая оценка реакции агглютинации.
Реакцию считают положительной при наличии агглютинации с сыворотками крови крупного
рогатого скота, лошадей и верблюдов начиная с разведения 1:100 (100 ME - международных единиц
антител), коз, овец, буйволов, оленей и собак - с разведения 1:50 (50 ME), пушных зверей и морских
свинок - с разведения 1:10 (10 ME) с оценкой не менее чем на 2 креста.
Реакцию считают сомнительной при наличии агглютинации только в разведении 1:50 (50 ME) с
сыворотками крови крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов и в разведении 1:25 (25 ME) с
сыворотками овец, коз, буйволов, оленей и собак с оценкой не менее чем на 2 креста.
При получении сомнительного результата реакции сыворотку крови данного животного
исследуют повторно через 3 - 4 недели.
На неблагополучных по бруцеллезу фермах животных, при исследовании которых будет
получена дважды сомнительная РА, относят к положительно реагирующим.
В заключении лаборатории о результатах исследования должна быть сообщена диагностическая
оценка каждой пробы (положительная, сомнительная, отрицательная) и конечное разведение (титр)
сыворотки, в котором получен соответствующий результат, выраженное в международных единицах
(например: конечный титр сыворотки крови крупного рогатого скота 1:100 с оценкой 2 креста или
более - "положительная 100 ME"; конечный титр сыворотки 1:50 с оценкой 2 креста или более -
"сомнительная 50 ME").
Суммарные результаты исследования испытуемых сывороток, серию антигена, срок его
годности, а также предельный титр позитивной сыворотки записывают в журнал серологических
4.3. Постановка и учет реакции связывания комплемента (РСК) и реакция длительного
связывания комплемента на холоде (РДСК).
4.3.1. Реакцию связывания комплемента применяют при диагностике бруцеллеза у крупного
рогатого скота, овец, коз, свиней, лошадей, оленей, собак, пушных зверей и животных других видов.
Реакцию длительного связывания комплемента, как более чувствительную, применяют вместо
РСК при исследовании на бруцеллез сывороток животных указанных видов, а также при диагностике
инфекционного эпидидимита баранов.
4.3.2. Компоненты реакций и их подготовка к работе:
испытуемые сыворотки крови (см. подпункт 2.3.1);
позитивная бруцеллезная или овисная сыворотка, изготовленная на биофабрике или полученная
от больного животного. На этикетках флаконов с сыворотками указывают титр в РСК (РДСК) и дату
негативная сыворотка (сыворотка крови здоровых животных), изготовленная на биофабрике
или полученная в лаборатории.
Испытуемые и контрольные (позитивную и негативную) сыворотки инактивируют в водяной
бане в день постановки реакции: для РСК - при 60 - 62 °С в течение 30 мин. (сыворотки крови ослов
и мулов - при 64 - 65 °С, буйволов - при 62 - 64 °С в течение 30 мин., свиней - при 60 - 62° в течение
50 мин.); для РДСК сыворотки крови животных всех видов - при 63 - 64 °С в течение 30 мин.;
антиген бруцеллезный единый для РА, РСК и РДСК или овисный для РДСК в рабочем титре,
указанном предприятием, его изготовившим (см. Приложение N 2, п. 6);
комплемент - сыворотка крови морской свинки (свежая, консервированная добавлением 4%
борной кислоты или лиофильно высушенная). При использовании в качестве комплемента свежей
или консервированной сыворотки и при получении каждой новой серии сухого комплемента
проводят титрование его в гемолитической системе для определения активности (см. Приложение N
Сухой биофабричный комплемент растворяют в физиологическом растворе, как указано на
этикетке. Берут такое количество ампул (флаконов), в которых содержится необходимое для
проведения всего опыта количество комплемента. Содержимое ампул (флаконов) сливают в одну
пробирку, осторожно смешивают, берут 0,5 мл и разводят физиологическим раствором 1:20 для
титрования. Остальное количество комплемента хранят в холодильнике при плюс 2 - 4 °С;
гемолитическая сыворотка (гемолизин) - для РСК в удвоенном титре, для РДСК - в утроенном.
Титрование гемолизина проводят периодически один раз в 3 месяца и при использовании каждой
новой серии (см. Приложение N 2, п. 5);
эритроциты барана - 2,5-процентная от осадка взвесь эритроцитов в физиологическом растворе
для РСК и 3-процентная для РДСК (см. Приложение N 2, п. 3).
Для приготовления гемолитической системы соответствующую взвесь эритроцитов и
гемолитическую сыворотку в рабочем разведении смешивают в равных объемах и выдерживают в
термостате при 37 °С в течение 15 - 20 мин. При смешивании гемолизин вливают во взвесь
физиологический раствор - 0,85-процентный раствор химически чистого хлорида натрия в
дистиллированной воде рН = 7,3 - 7,4 или физиологический раствор, содержащий ионы магния и
кальция (см. Приложение N 2, п. 2).
Рабочие разведения всех компонентов для РСК или РДСК готовят перед постановкой реакции
и проверяют их на антикомплементарность и гемотоксичность по следующей схеме:
¦ Комплемент в разведении ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ - ¦ - ¦ -
¦ Гемолизин в рабочем титре ¦ 0,2 ¦ - ¦ 0,2 ¦ - ¦ -
¦ Антиген в рабочем титре ¦ 0,4 ¦ - ¦ - ¦ 0,4 ¦ -
¦ Эритроциты (2,5% или 3%) ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2
¦ Физиологический раствор ¦ - ¦ 0,6 ¦ 0,6 ¦ 0,2
¦ водяная баня 10 минут при 37 -
¦ Результат: гемолиз полная задержка
В реакциях используют компоненты, не обладающие антикомплементарными и
4.3.3. Постановка реакции связывания комплемента.
Реакцию проводят в водяной бане при 37 - 38 °С в объеме 1 мл (по 0,2 мл каждого компонента -
сыворотки, антигена, комплемента, гемолизина и эритроцитов).
Перед постановкой главного опыта проводят титрование комплемента в бактериолитической
системе на позитивной (бруцеллезной) сыворотке, негативной сыворотке крови того вида животных,
которых исследуют, и одной сыворотке, взятой из исследуемой партии.
Каждую сыворотку разводят 1:5 физиологическим раствором (1 мл сыворотки + 4 мл
физиологического раствора), инактивируют, как указано в подпункте 4.3.2, и разливают по 0,2 мл в
два ряда по 10 пробирок. Затем в пробирки каждого ряда вносят комплемент (разведенный 1:20) в
возрастающих дозах от 0,02 мл до 0,2 мл с интервалом 0,02 мл и недостающее до 0,2 мл (в каждой
пробирке) количество физиологического раствора.
После разлива комплемента в первый ряд пробирок с каждой сывороткой вносят по 0,2 мл
антигена в рабочем разведении, а во второй ряд - по 0,2 мл физиологического раствора. Пробирки
ставят в водяную баню при 37 - 38 °С на 20 мин. Затем во все пробирки добавляют по 0,4 мл
гемолитической системы, встряхивают их и вновь ставят в водяную баню на 20 мин., после чего
Схема титрования комплемента в бактериолитической системе (на примере негативной
Реакция Хеддльсона (пластинчатый метод)
Преимущество этого метода заключается в простоте постановки реакции, быстром получении результатов и чувствительности реакции. В качестве антигена для постановки реакции Хеддлсона и Райта применяют единый бруцеллезный диагностикум. Реакцию ставят на обычном оконном, тщательно вымытом, обезжиренном стекле, расчерченном на квадраты величиной 4 x 4 см каждый, по горизонтали должно быть 5 квадратов. На первом квадрате с левой стороны записывается номер испытуемой сыворотки, в последующие квадраты слева направо разливают (микропипеткой или 1 мл градуированной пипеткой) испытуемую сыворотку в следующих дозах: 0,04, 0,02, 0,01 и 0,03 (контроль сыворотки). К первым трем дозам сыворотки добавляют по 0,03 мл антигена. К последней дозе сыворотки (0,03) добавляют 0,03 мл физиологического раствора. Сыворотку осторожно смешивают с антигеном палочкой, начиная с минимальной дозы сыворотки. Контроль антигена ставят, добавляя 0,03 мл физиологического раствора к 0,03 мл антигена. Затем стекло слегка подогревают над пламенем спиртовки так, чтобы происходило равномерное нагревание всей поверхности стекла.
В случае положительной реакции в первые же минуты в каплях сыворотки с антигеном появляются хлопья (агглютинат). Максимальный срок наблюдения 8 минут. Контроль сыворотки ставят с каждой испытуемой сывороткой для исключения спонтанной агглютинации; контроль антигена ставят один (при любом числе испытуемых сывороток) для исключения спонтанной агглютинации применяемого антигена. Учет реакции проводят невооруженным глазом по следующей схеме: а) полное просветление жидкости с крупными и мелкими хлопьями, т.е. 100 % агглютинации (4+); б) почти полное просветление жидкости с ясно заметными хлопьями, т.е. 75 % агглютинации (3+); в) незначительное просветление жидкости с заметными хлопьями, т.е. 50 % агглютинации (2+); г) мутная жидкость с едва заметной зернистостью (+); д) равномерная мутная жидкость (-).
Для оценки результатов рекомендуется следующая схема: а) агглютинация на 4+ во всех дозах сыворотки - результат "резко положительный"; б) агглютинация не менее 2+ во всех дозах сыворотки - результат "положительный"; в) агглютинация только в первой или в первой и второй дозах сыворотки - результат "сомнительный"; г) отсутствие агглютинации во всех дозах сыворотки - реакция "отрицательная".
Для диагностики бруцеллеза имеет значение только положительный результат реакции. При сомнительном или отрицательном результатах реакции и наличии эпидемических и эпизоотических показаний, а также в стационаре и при обследовании доноров, где необходимо определение титра агглютининов и их динамики, следует применять реакции Райта и Кумбса, РПГА и ИФА.
Роз-Бенгал проба (РБП)
Роз-Бенгал проба, по сравнению с другими методами серологической диагностики бруцеллеза, обладает следующими преимуществами: большой чувствительностью, способностью в короткие сроки после заражения выявлять специфические бруцеллезные антитела и, благодаря кислой реакции антигена, ингибировать проявления неспецифических антител, а также стабильностью показаний, технической простотой постановки, требующей небольшой затраты труда и времени, четкостью и быстротой получаемых результатов.
Сыворотки крови, подлежащие исследованию, должны быть прозрачные, без примеси эритроцитов. Их исследуют не позднее, чем через 4 дня хранения при температуре плюс 4-8 °С.
Допускается исследовать сыворотки, консервированные сухой борной кислотой (2 % борной кислоты к объему сыворотки). Консервированные сыворотки пригодны для исследования в течение 14 дней.
Антиген представляет собой суспензию инактивированных нагреванием и фенолом бруцелл в буферном растворе, окрашенных бенгальским розовым в розовый цвет. Расфасован во флаконы из темного стекла, подлежит хранению в темном сухом месте при температуре плюс 4-12 °С. Срок годности антигена при соблюдении условий хранения 18 месяцев со дня его изготовления.
Антиген во флаконах без этикетки (надписи) или с трещинами, содержащий постороннюю примесь, неразвивающиеся хлопья, плесень, с истекшим сроком годности или подвергавшиеся замораживанию, для применения не годен.
Перед употреблением антиген выдерживают 30-40 мин. при комнатной температуре и затем тщательно встряхивают.
Техника постановки Роз-Бенгал пробы: реакцию проводят на чистых сухих металлических эмалированных пластинках или изразцовых плитках с лунками при комнатной температуре (плюс 18-30 °С).
Исследуемые сыворотки крови в дозе 0,03 мл вносят на дно лунки шприцем-полуавтоматом или микропипеткой, которые трижды промывают фенолизированным (карболизированным) физиологическим раствором и подсушивают фильтровальной бумагой.
В каждую лунку рядом с сывороткой пипеткой-капельницей вносят равное количество (0,03 мл антигена) и тщательно смешивают активным движением ручного полисмесителя на 5 или 25 проб для получения однородной смеси, распределяя ее при этом по всей поверхности лунки.
Пластину с внесенными на нее сыворотками и антигеном покачивают в течение 4 мин осторожными вращательными движениями вручную или при помощи автоматического прибора, предназначенного для этой цели. При положительной реакции появляются хлопья агглютината розового цвета.
В начале работы ставят контроль антигена с нормальной (отрицательной) и положительной агглютинирующей сыворотками в тех же дозах, а также контроль антигена на спонтанную агглютинацию (к 0,03 мл антигена добавляют 0,03 мл физиологического раствора).
Учет реакции проводят невооруженным глазом в течение 4 мин. после смешивания сыворотки с антигеном при слегка наклонном положении пластинки.
Агглютинацию, которая наступает позже, чем через 4 мин - не учитывают.
Реакцию считают положительной при наличии выраженной агглютинации в виде мелких или крупных хлопьев розового цвета.
При отсутствии агглютинации (смесь гомогенна, равномерно окрашена) реакцию считают отрицательной.
После учета реакции пластинки дезинфицируют погружением на 5 мин в 3 % раствор фенола или 1 %-ный раствор хлорамина, затем тщательно промывают водопроводной водой, высушивают и используют повторно. Для этих целей можно применять кассеты и штативы сушилки.
При нечетко выраженной агглютинации проводят повторное исследование.
По результатам повторного исследования дают окончательную оценку реакции (положительная или отрицательная).
Сыворотки, с которыми получена положительная РБП, исследуют в РА и РСК (РДСК) для установления титра агглютининов и наличия комплементсвязывающих антител. Сыворотки, с которыми получена отрицательная РБП, дополнительно в РА и РСК (РДСК) не исследуют.
Кольцевая реакция с молоком
Кольцевая реакция применяется с целью ориентировочной проверки благополучных по бруцеллезу молочных стад и для проверки молока на рынках.
Сущность кольцевой реакции заключается в том, что в молоке бруцеллезных животных при добавлении антигена образуется комплекс антитела с антигеном, который адсорбируется жировыми частицами молока. Жировые частицы вследствие своего малого удельного веса поднимаются наверх, увлекая адсорбированный агглютинат, который в зависимости от цвета антигена образует на поверхности жидкости окрашенное кольцо.
Для кольцевой реакции применяют цветной антиген Триленко, представляющий взвесь убитых, окрашенных бруцеллезных микробов.
Для исследования необходимо брать цельное, лучше свежее, молоко или консервированное формалином (из расчета 0,1 мл 10 % раствора формалина на 10 мл молока).
В пробирку берут 2 мл молока и добавляют 0,1 мл (2 капли) концентрированного антигена, тщательно встряхивают и помещают в водяную баню или термостат на 45-50 мин при температуре 37-39 °С.
Учет реакции: а) если в верхней части столбика молока (в слое сливок) четко выражено синее кольцо, а остальная часть молока белая, реакция оценивается положительной - 100 или 75 % агглютинации (+ + + + и + + +); б) при наличии достаточно выраженного синего кольца в слое сливок, а остальная часть молока синеватого цвета, реакция оценивается положительной – 50 % агглютинации (+ +); в) если синее кольцо в слое сливок слабо выражено и весь столбик молока имеет синий цвет, реакция считается сомнительной - 25 % агглютинации (+ и ±); г) если столбик молока равномерно окрашен в синий цвет, а слой сливок остается белым или слегка желтоватым, реакция отрицательная (-).
Молоко от коров с сомнительной реакцией исследуют повторно через 10-15 суток. При получении отрицательного или снова сомнительного результата животных считают благополучными по бруцеллезу.
Пластинчатая реакция агглютинации (исследование молока)
Данная реакция применяется для исследования только свежего молока и молочной сыворотки. Не подлежит исследованию пастеризованное, кипяченое и замороженное молоко (в таком молоке антибруцеллезные агглютинины разрушаются), а также молоко, имеющее кислотность выше 30 °С по Тернеру (во избежание получения неспецифических результатов).
Реакцией агглютинации можно исследовать молоко жирное (цельное), обезжиренное (снятое) и молозиво. Жирное молоко предварительно обезжиривают отстаиванием или центрифугированием, затем из-под слоя сливок забирают молоко для исследования. Обезжиренное молоко и молозиво исследуют без предварительной подготовки, но так, чтобы сливок попало минимальное количество.
Обезжиренное молоко наносят на стекло (чашку Петри) в количестве 0,1 мл (или двух капель) и 0,05 мл (или одной капли). К каждой дозе испытуемого молока добавляют по одной капле бруцеллезного диагностикума. Реакция сопровождается двумя контролями: к 0,05 мл диагностикума добавляют 0,1 мл физиологического раствора и 0,1 мл испытуемого молока смешивают с 0,05 мл 12 % раствора хлористого натрия. Путем покачивания стекла смешивают ингредиенты. Учет реакции производят в первые 3-5 мин.
Положительная реакция агглютинации характеризуется выпадением хлопьев с большим или меньшим обесцвечиванием молока. При отрицательном результате молоко остается равномерно окрашенным в голубой цвет (цвет антигена).
Исследование молочной сыворотки
Перед получением молочной сыворотки жирное молоко обезжиривают путем центрифугирования или отстаивания. Молочную сыворотку получают при створаживании молока сычужным ферментом. Для этого к 5 мл молока добавляют 1-2 капли 10 % сычужного фермента на физиологическом растворе хлористого натрия. Пробирки помещают при температуре 37 °С на 20-30 мин (до свертывания молока). Молочную сыворотку можно получить также путем помещения молока при 37 °С на сутки. Молочную сыворотку сразу отделяют путем фильтрования через бумажный фильтр. Дальнейшие манипуляции: постановка реакции и учет результатов аналогично постановке и учету реакции агглютинации с цельным молоком.
При оценке результатов исследования молока на бруцеллез при помощи пластинчатой реакции агглютинации необходимо учесть возможность образования мелкохлопчатого агглютината, который из-за мутности молока может быть не отмечен и результаты реакции могут быть приняты за отрицательные. В отрицательных реакциях рекомендуется молоко исследовать в реакции агглютинации с молочной сывороткой.
Последнее изменение этой страницы: 2016-12-30; Нарушение авторского права страницы
Читайте также:
