Оттен т ф о микобактериозе

После открытия Р. Кохом возбудителя туберкулеза человека были предприняты активные бактериологические исследования предметов окружающей среды, животных, продуктов питания, воды и почвы с целью поиска единого источника микобактерий (МБ). Исследования завершились открытием большого числа различных видов кислотоупорных микробов, отличных от микобактерий туберкулеза (МВТ), но с медицинской точки зрения их рассматривали как курьезные находки. Только в 1954 г. Timpe и Runyon, собрав значительную коллекцию МБ, других, чем МВТ, выделенных из патологического материала от больных, сделали эпохальное научное открытие о важной этиологической роли нетуберкулезных микобактерий (НТМБ) в заболевании человека и животных. Эта работа послужила толчком к интенсивному изучению НТМБ и заболеваний, которые они вызывают, микробиологами, клиницистами и эпидемиологами.

Среди отечественных ученых, которые с энтузиазмом взялись за изучение НТМБ, необходимо отметить сотрудницу ЦНИИТ (Москва) Н.М. Макаревич, которая защитила в 1973 г. докторскую диссертацию на тему "Атипичные микобактерии: методы идентификации, источники выделения и значение в клинике туберкулеза". Профессор М.П. Зыков (Ленинград) в своей докторской диссертации "Микробиологические аспекты туберкулеза в странах тропической Африки" (1967 г.) также проводил исследования по идентификации и определению лекарственной чувствительности НТМБ. Основателем бактериологических исследований НТМБ в нашем институте является к.б.н. Т.Б. Ильина. Вот уже более 30 лет СПбНИИФ ведет работу по изучению НТМБ, разработке методов их идентификации, диагностике микобактериозов, обучению врачей-бактериологов ПТД методам идентификации МБ. За истекший период в лаборатории института идентифицировано более 3500 культур НТМБ, под наблюдением в клиниках института и городских стационарах находилось 269 больных микобактериозом легких. В последние годы институтом выпущен в свет ряд методических рекомендаций: "Бактериологическая и биохимическая идентификация микобактерий" (1994 г.), "Лечение туберкулеза и микобактериоза легких с применением беталактамных антибиотиков" (1995 г.), "Диагностика и прогнозирование клинического течения микобактериоза легких" (1997 г.).

Род микобактерий по определителю бактерий Берджи (1997 г.) насчитывает более 50 видов и подвидов микобактерий. По способности вызывать заболевания человека и животных микобактерий можно разделить на 3 группы. В одну группу входят безусловно патогенные (опасные) для человека и животных виды микобактерий М. tuberculosis и M. bovis, которые вызывают туберкулез человека и крупного рогатого скота, M. leprae - возбудитель заболевания проказы. В другую - сапрофитные микобактерии, которые свободно живут в окружающей среде и, как правило, не опасны для человека. К ним относятся M. terrae - выделенная из почвы (земли), M. phlei - найдена на траве тимофеевке, M. gordonae (M. aqual) - выделена из водопроводной воды. Промежуточное положение занимает группа условно (потенциально) патогенных микобактерий, которые при определенных условиях могут вызвать заболевания человека.

Термин "нетуберкулезные микобактерий" объединяет сапрофитные и потенциально-патогенные МБ и наиболее точно, с нашей точки зрения, характеризует ту разнообразную группу МБ, которые необходимо отделять от микобактерий туберкулезного комплекса. Заболевания человека, вызванные НТМБ, называются микобактериозами. Международная классификация болезней (десятый пересмотр) включает инфекции, вызванные НТМБ, в рубрику А 31.

В настоящее время повсеместно отмечается нарастание заболеваний микобактериозом, что, вероятно, связано с увеличением числа больных с поражением иммунной системы с хроническими неспецифическими заболеваниями легких, а также с возросшим числом исследований на НТМБ и улучшением их диагностики. Немаловажную роль в увеличении микобактериоза играет ухудшение экологической обстановки в отдельных регионах.

Фтизиатрическая служба, где лечатся и состоят на учете больные микобактериозом, уже хорошо знакома с этим заболеванием, однако врачи практического здравоохранения, как и население в целом, мало информированы об этом заболевании. В то же время трудности диагностики, высокая естественная резистентность НТМБ к антибактериальным препаратам приводит к развитию хронических деструктивных поражений легких или диссеменированным процессам. Заболевание имеет неблагоприятный прогноз, с частыми обострениями, постоянным бактериовыделением и высоким процентом летальных исходов.

НТМБ вызывают заболевания легких, лимфатических узлов, кожи, мягких и костных тканей. У нас в стране наиболее часто встречаются микобактериозы легких. Они наблюдаются главным образом у лиц старше 50 лет, имеющих предшествующие деструктивные или обструктивные поражения легких: хронические бронхиты, эмфиземы, бронхоэктазы, пневмоконеозы, силикозы, у больных, излеченных от хронических инфекций, таких как туберкулез и микоз. Лимфангоиты встречаются исключительно в детском возрасте от 1,5 до 10 лет. Поражаются подчелюстные и околоушные лимфатические узлы. Быстрорастущие микобактерии часто становятся причиной раневой инфекции, послеоперационных осложнений при трансплантации органов, перитональном диализе. В последнее время отмечается течение микобактериоза в виде диссеминированной инфекции. Заболевание развивается на фоне иммунодефицитного состояния организма, связанного с предшествующими заболеванием или применением лекарственных препаратов (иммунодепрессантов). Диссеминированные процессы развиваются также как позднее осложнение у больных с синдромом иммунодефицита.

Если главным источником МТБ является больной человек, то микобактериозы до настоящего времени расцениваются как неконтагиозные заболевания. Считается, что больной микобактериозом не представляет опасности для окружающих, так как НТМБ не передаются от человека к человеку. Эпидемиологиеское изучение источника НТМБ и путей передачи возбудителя показало высокий процент содержания НТМБ на различных объектах окружающей среды. Почва и вода являются естественным резервуаром обитания НТМБ, поэтому иногда их называют "микобактериями окружающей среды". Известно, что главным местом обитания M. avium intracellulare служат открытые водоемы. Из воды M. avium передается человеку воздушно-капельным путем, в результате естественного образования аэрозолей над поверхностью воды. Наши наблюдения показали, что часто источником заболевания микобактериозом становятся больные туберкулезом домашние птицы, выделяющие M. avium. M. kanssasii в большом количестве выделяются из водопроводной воды и от некоторых видов домашних животных. M. xenopi обнаруживаются исключительно в воде, особенно в системах горячего водоснабжения и питьевых бачках, где при оптимальной температуре роста (43-45°С) интенсивно размножаются. Быстрорастущие микобактерии - M. fortuitum и M. chelonai - выделяются из почвы и естественных водоемов. Таким образом, широкое растпространение M. avium в природе часто способствует инфицированию человека и обнаружению их при посеве патологического материала.

Выделение НТМБ из патологического материала не свидетельствует о безусловной этиологической значимости данного микроба, как это бывает в случае выявления МВТ. Выделение культуры НТМБ может происходить вследствие ряда причин:

1. Случайное загрязнение материала НТМБ из окружающей среды.

2. Носительство НТМБ, которые могут заселять (колонизировать) отдельные органы и системы человека (респираторный, желудочно-кишечный тракт, мочевыделительные пути), жить там и размножаться, не вызывая клинических проявлений.

3. Заболевание микобактериозом. Следовательно, выделение НТМБ требует от врача тщательного клинического разбора больного для определения этиологического значения выделенной культуры. НТМБ вызывают заболевания, по клиническим, рентгенологическим и патологическим признакам сходные с туберкулезом, поэтому главным критерием при постановке диагноза микобактериоза является бактериологическое исследование больного с выделением культуры микобактерии и их идентификацией.

За последние годы в Санкт-Петербурге и Ленинградской области ежегодно регистрируется от 11 до 15 случаев микобактериоза легких. В течение 1994-1998 гг. в регионе Северо-Запада как возбудители микобактериоза определяются пять видов НТМБ. M. avium-intracellulare считается основным возбудителем заболеваний человека, на их долю приходится 57% заболеваний. На втором месте по этиологической значимости новый для нашего региона возбудитель M. malmoense - 24,5%. Остальные заболевания вызваны M. xenopi, M. kanssasii и M. scrofulaceum.

Первую оценку этиологической значимости выделенной культуры НТМБ лечащий врач делает при получении результатов идентификации МБ, которая складывается из исследуемого патологического материала и вида выделенных НТМБ. Установлено, что для каждого патологического материала характерен свой видовой состав МБ, что дает возможность сделать предварительную оценку выделенных микроорганизмов и определить тактику ведения больного.

Из диагностического материала при заболевании бронхолегочной системы (мокрота, промывные воды бронхов), как правило, выделяются потенциально патогенные МБ - M. avium, M. xenopi, M. kanssasii, M. malmoense (таблица). Именно эти НТМБ являются главными этиологически значимыми микроорганизмами и вызывают почти 95% микобактериозов человека. Следовательно, при первом выделении этих НТМБ врачу следует подумать о возможности микобактериоза и провести целенаправленное многократное бактериологическое обследование больного. Однократное выделение сапрофитных МБ из респираторного тракта при заболевании легких носит случайный характер и может быть расценено как загрязнение или носительство. Исключение составляют быстрорастущие M. fortuitum и M. chelonai, которые также могут быть возбудителями микобактериозов, но в этом случае выделение носит многократный характер.

В 90% случаен из мочи выделяются сапрофитные МБ, что указывает на возможность значительного загрязнения (контаминации) материала при сборе анализов. В то же время наблюдаются случаи многократного (до 10 культур) выделения M. fortuitum из мочи, сопровождающегося массивным ростом культуры. У этих больных, как правило, отмечаются патологические изменения в почках, подтвержденные клинико-лабораторными исследованиями. Но ни в одном из клинических наблюдений диагноз микобактериоза мочевыделительной системы не был поставлен. У всех больных многократное выделение НТМБ из мочи было расценено как носительство. В операционном материале в 100% случаев выделяются потенциально патогенные МБ, что служит неоспоримым критерием для постановки диагноза микобактериоза. В некоторых случаях имеет место выделение НТМБ только в резецированной легочной ткани, что также указывает на большие трудности выделения этих видов МБ из патологического материала больных с заболеваниями легких.

Таблица. Группировка микобактерий по степени патогенности для человека (наиболее часто встречающиеся НТМБ в нашем регионе)

Патогенные	M. tuberculosis, M. bovis, M. leprae
Потенциально патогенные	M. avium, M.intracellulare, M. kanssasii, M. malmoense, M. xenopi, M. fortuitum, M. chelonai
Сапрофиты	M. gordonae, M. terrae, M. triviale, M. phlei, M. flavescens, M. gastri

Для постановки диагноза микобактериоза легких общепринятым критерием является многократное выделение одного и того же вида НТМБ с учетом соответствующей клинико-рентгенологической картины заболевания при условии отсутствия у больного МВТ. Безусловным диагностическим признаком считается выделение НТМБ из закрытого очага, из которого проба получена в стерильных условиях (абсцесс, биопсия, операционный материал). Однако, учитывая несовершенство бактериологических методов исследования, так же как и неудовлетворительное обследование больных, выделение НТМБ из патологического материала встречается крайне редко.

Детальный анализ историй болезни больных микобактериозом позволил сделать вывод о том, что в ряде случаев диагноз можно ставить и по однократному выделению НТМБ. За основу клинико-бактериологического критерия диагностики микобактериоза взята ОДНОВРЕМЕННОСТЬ появления клинико-рентгенолабораторных признаков заболевания, характерных для туберкулезного процесса, и выделение культуры НТМБ.

В 70% случаев заболевания микобактериозом легких выявляются в период профилактических осмотров или диспансерного наблюдения. В этих условиях симптоматика заболевания может быть стертой, но данные рентгенологического или флюорографического обследования свидетельствуют о появлении специфического процесса в легких или его активизации (свежие очаговые изменения, инфильтрат с распадом, зона деструкции и др.). Такой больной направляется для дообследования и лечения в противотуберкулезный диспансер, где он проходит первичное бактериологическое обследование методом бактериоскопии и посева на МБ. Если в диагностическом материале выделены потенциально патогенные микобактерии, то заболевание следует расценивать как микобактериоз, так как имеется тесная временная связь между выделением культуры НТМБ и наличием рентгено-флюорографических данных о патологическом процессе в легких. У 60% больных микобактериозом выделение НТМБ наблюдается в первые два месяца после обнаружения специфической патологии в легких и дает возможность правильно верифицировать заболевание.

В 30% случаев патологические изменения в легких диагностируются при обращении за медицинской помощью. Основным поводом для обращения к врачу является симптоматика острого респираторного заболевания или обострения хронического неспецифического процесса в легких, в некоторых случаях первым проявлением заболевания бывает кровохарканье. В связи с подобной патологией больных, как правило, направляют на бактериологическое обследование с посевом материала на МБ. В 64% наблюдений дата обращения за медицинской помощью и дата выделения первичной культуры НТМБ у больных микобактериозом укладывается в двухмесячный срок. Следовательно, одновременное появление клинико-рентгенолабораторных признаков заболевания и выделение культуры НТМБ является научно обоснованным критерием для постановки диагноза микобактериоза легких.

Таким образом, если появление выраженной клинико-лабораторной симптоматики (кашель с мокротой, одышка, катаральные явления в легких, повышение температуры, ускорение СОЭ) и рентгенологическое выявление картины специфического процесса в легких совпадают с датой выделения НТМБ из диагностического материала, диагноз микобактериоза легких впервые выявленным больным ставится по однократному (первичному) выделению НТМБ. Аналогичное сопоставление даты активизации процесса и даты выявления культуры НТМБ может иметь место и у больных, ранее перенесших туберкулез, которые в момент клинического прогрессирования процесса в легких на фоне интенсивной противотуберкулезной терапии выделяют культуру НТМБ. В этих случаях диагноз микобактериоза также можно ставить по однократному выделению НТМБ.

Следует еще раз подчеркнуть, что НТМБ вызывают у человека заболевания, сходные с туберкулезом, и для постановки диагноза необходимо пользоваться "Клинической классификацией туберкулеза" (приложение N8 к приказу МЗ РФ от 22.11.95 г. N324), заменив термин "туберкулез" на "микобактериоз", вместо "МБТ+" указывать вид НТМБ, выделенных у больного, как-то: M. avium, M. xenopi и др.

Во всех случаях выделения НТМБ одновременно с МБТ приоритет отдается классическим МВТ. Выделение НТМБ признается простым носительством и не требует специальной терапии в редких случаях, когда больные микобактериозом заражаются туберкулезом как вторичной инфекцией и выделяют два вида МБ, и туберкулезные и нетуберкулезные микобактерии оцениваются как этиологически значимые микроорганизмы.

сельскохозяйственные науки

Алексеева Наталья Викторовна , кандидат наук, доцент
Прокушенкова Елена Генналиевна , кандидат наук, доцент
Сосницкий Александр Иванович , доктор наук, профессор
Днепропетровский государственный аграрно-экономический университет

НЕМАНИФЕСТИРУЮЩАЯ ИНФЕКЦИЯ
МИКОБАКТЕРИИ
МОНИТОРИНГ МАС-ИНФЕКЦИИ
КУРЫ
ПОДВОРНОЕ СОДЕРЖАНИЕ
БИОБЕЗОПАСНОСТЬ

Похожие материалы

Актуальность. Неманифестирующие микобактериальные патологии сельскохозяйственной птицы в субклинической форме, содержащейся в индивидуальном пользовании граждан, могут представлять серьезную медико-биологическую и ветеринарно-санитарную проблему в области гуманной и ветеринарной медицины [5, 11]. Это обусловлено тем, что в силу специфики условий продуктивной эксплуатации и ветеринарного обслуживания, сельскохозяйственные животные и птица, находящиеся в пользовании граждан при подворном содержании, нередко являются носителями и резервентами возбудителей антропонозных микобактериальных возбудителей при невыраженном, неярком, часто атипичном и субклиническом течении инфекционного процесса. В результате жизнедеятельности, условно-здоровые инфицированные животные рассеивают возбудителя во внешней среде с нативными секретами и экскретами, а также распространяют его с продукцией животноводства, которая в рутинном сознании граждан ассоциируется с экологически безупречной и считается диетической, так как получена природными, экстенсивными методами, по традиционной для сельской местности технологии, без использования химических средств стимуляции продуктивности и мер современного контроля биобезопасности и потребительского качества сырья, животного происхождения [2, 6, 9].

Из многочисленных, потенциально возможных бактериозов, представляющих микробиальную опасность для здоровья человека, особенно детей, при потреблении такой диетической продукции птицеводства, как яйцо и мясо, является МАС-инфекция [3, 7, 10]. Микобактерии обуславливают длительное, в субклинической форме, резервирование носительство и выделение возбудителя в окружающую среду, без манифестирующих клинических и эпизоотических проявлений инфекционногенеза на чувствительном птицепоголовье. При этом микобактерии длительно, до 11 и более лет, сохраняют биологическую активность в объектах неживой природы и способны приживаться в организме птиц, млекопитающих животных и человека, вызывая микобактериозы [4, 8].

Цель работы - проведение эпизоотологического мониторинга микобактериальной инфекции с использованием комплексного метода исследований для определения санитарного состояния здоровья курей разного возраста и биобезопасности получаемой от них продукции, при их некоммерческом содержании небольшими группами по традиционной экстенсивной технологии в индивидуальных хозяйствах граждан, для удовлетворения личных потребностей в продукции птицеводства.

Материалы и методы исследования. Клинико-эпизоотологическое обследование на МАС-инфекцию птицепоголовья в индивидуальном пользовании населения Днепропетровской области проводили при подворном обходе и осмотре. Внутрикожную аллергическую пробу PPD-туберкулином для птиц производства Сумской биофабрики, проводили согласно наставления.

Предпосевную обработку биоматериала для индикации микобактериальной инфекции проводили по методу Аликаевой А.П. [ВИЭВ, 1940]. Детекцию культур микобактерий от исследуемых кур осуществляли на элективно-селективной среде Левенштейна-Йенсена [Харьков, Украина].

У выделенных культур микобактерий изучали скорость и характер роста на яичной питательной среде при температурах 25 °С, 37 °С и 45 °С, каталазную (Middlebrook С., 1954), никотинамидазную, пиразинамидазную (Bonike R., 1962) активность, фотохромогенность (Kubica G., 1973), реакцию с теллуритом калия (Kielburn J. е.а., 1969) и реакцию гидролиза Твин-80 (Wayne G., 1962), резистентность к 5 % хлористому натрию, а также рост на МПБ.

Для гистологического исследования материал отбирали от вынужденно забитой птицы непосредственно после вскрытия из органов и тканей, которые имели макроскопические изменения. Кусочки органов фиксировали в 10 % нейтральном забуференном формалине. Обезвоживание и уплотнение образцов проводили по общепринятой в гистологии методике [1]. Срезы с парафиновых блоков толщиной 3-5 мкм изготавливали на санном микротоме с последующей покраской гематоксилин-эозином. Анализ срезов проводили с помощью световых микроскопов Olimpus CH-20 и Leica DM 1000 Гистологические срезы фотографировали цифровой камерой Leica DFC 295 и сохраняли изображения в формате рисунков на электронных носителях.

Результаты исследований. Эпизоотологический мониторинг микобактериальной инфекции курей, при подворном содержащихся в личном пользовании населения Днепропетровской области, провели в нескольких небольших населенных пунктах пригородного и дачного типов, находящихся в непосредственной близости от города, что дает возможность собственникам животноводческой продукции реализовывать незначительные ее излишки на стихийных рынках или иным способом без надлежащего ветеринарно-санитарного контроля качества продукции и ее биобезопасности.

На первоначальном этапе мониторингового процесса провели внешний осмотр птицепоголовья и клинико-эпизоотологическое обследование условий содержания. При этом установили, что целенаправленных исследований на выявление микобактериальных инфекций раньше не проводилось и куры считались условно-здоровыми, так как острых инфекционных заболеваний не регистрировалось.

Всего было осмотрено 412 курей различного возрастного диапазона. Наибольшее количество составляли куры 6-36 месяцев, хотя изредка встречались 3-5 летние птицы (4 %). При клиническом осмотре у 6 курей (1,5 %) обнаружили снижение аппетита, загрязнения оперения, сухость слизистых оболочек, синюшность гребешка и сморщивание сережек, вялость при движении. Остальные куры 406 (98,5%) были клинически здоровы, активно питались, имели удовлетворительный внешний вид. При аллергическом исследования 412 кур содержащихся в личном пользовании населения Днепропетровской области было выделено 67 (16,3 %) реагирующих

При диагностическом убое 16 реагирующих на туберкулин кур в печени, селезенке, легких и кишечника наблюдали образование узелков желто-серого цвета разного размера, располагавшиеся на поверхности и в глубине тканей. Чаще поражалась печень, она содержала множественные милиарные очага.

При бактериологическом исследовании 16 проб патологического материала выделено 5 культур микобактерий.

При микроскопии мазков из первично-выделенных культур окрашенных по методу Цель-Нильсена в поле зрения было видно короткие и длинные с закругленными краями красного цвета палочки с незначительной зернистостью, которые располагались в поле зрения отдельно или группами.

При культуральном исследовании - первичный рост колоний микобактерий на яичном питательной среде отмечали на 17-33 сутки после посева. При пересеве выделенных культур на яичное среду в первой генерации, две культуры хорошо выросли на 12 и 15, три культуры 16-19 сутки при температуре 37 оС в виде гладких, блестящих округлой формы, маслянистой консистенции колоний светло-серого цвета. Все пять изолированных культур микобактерий хорошо суспензувались в физиологическом растворе, росли в S-форме и при температуре 45 °С, не образовывали пигмента в темноте и на свету, имели положительную реакцию с теллурита калия, никотинамидом и пиразинамидом. В пробирках с МПБ наблюдался придонный рост. На яичной среде с добавлением 5 % хлористого натрия не росли и имели отрицательную каталазную активность, реакцию с мочевиной и Твин-80.

При изучении аллергических свойств изолированных микобактерий, суспензию каждой культуры вводили подкожно 1 мг/см3 пяти морским свинкам. Через 30 суток проводили внутрикожную аллергическую пробу с использованием ППД-туберкулина для птиц. Животные реагировали на аллерген (покраснение, утолщение кожи, диаметр припухлости в среднем по группе составил 24 × 32 мм).

Биологические свойства изолированных культур микобактерий изучали при внутривенном заражении кроликов в дозе 1,0 мг/см3. У зараженных кроликов проявлялась септическая форма микобактериоза, их гибель наблюдалась на 16, 24, 26, 31 и 35 сутки.

При патолого-анатомическом вскрытии вынужденно убитой птицы установили наличие в паренхиме печени и селезенке участков воспаления и дистрофии. Кроме того, в печени, селезенке и легких, на поверхности и в глубине тканей находились небольшие узелки, серого цвета, размером с просяное зерно (множественные милиарные очажки).

Гистологическими исследованиями было выявлено характерное поражение участков печени - гранулематозное воспаление органов (рис. 1). В центре микобактериального узелка расположен тканевый детрит с зоной некроза вокруг которого формируется активная лимфоидно-макрофагальная реакция (рис. 2). В состав которой входили три типа клеток - лимфоциты, эпителиоидные и многоядерные гигантские клетки Пирогова-Лангхаанса. В центральной части гранулемы находились макрофаги и многоядерные гигантские клетки Пирогова-Лангхаанса. У активных макрофагов размер увеличивался и они принимали вид эпителиоидных клеток.

Рис.1. Гистопрепарат печени. Гематоксилин-эозин.

Рис. 2. Гистопрепарат селезенки. Гематоксилин-эозин.

Эти клетки имели большую розовую, мелкогранулированную цитоплазму, в которой располагались интактные микобактерии или их фрагменты.

Долевое строение печени нарушено, печеночные дольки без четких границ. Местами выявляли дискомплексацию гепатоцитов. Клетки паренхимы, со слабо выраженной зернистостью, были неплотно расположены. Некоторые клетки были умеренно набухшие и содержали базофильную непрозрачную цитоплазму. Отдельные ядра гепатоцитов имели признаки пикноза или рексиса. В печени наблюдались циркуляторные расстройства, проявляющиеся венозной гиперемией ацинусов.

Селезенка увеличена, на разрезе пульпа теряет упругость. Гистологическими исследованиями обнаружили гиперпластические процессы лимфоидной ткани, размножения клеток ретикуло-гистиоцитарной системы и формирование специфических гранулем.

На основании комплексного исследования изолированных культур, с учетом данных микроскопии, культурального, биохимического, аллергического, биологического, патолого-анатомического и гистологического исследований, они были отнесены к Мycobacterium avium complex.

Выводы

В результате эпизоотического мониторинга условно-здоровых кур, содержащихся в индивидуальном пользовании населения по традиционной сельской технологии, установили инфицирование микобактериями 1,2 % особей без наличия клинических признаков инфекционной патологии и развития у 16,3 % птиц изменения иммунореактивности организма в виде развития повышенной чувствительности замедленного типа к микобактериальным антигенам.
При патогистологическом исследовании биоматериала от реагирующей на PPD-туберкулин птицы установили развитие специфического пролиферативного, доброкачественно протекающего, воспаления микобактериальной этиологии в виде развития гранулем с деструктивно-казеозным некротическим центром, наличием гигантских многоядерных клеток Лангхаанса и лимфоцитарно-макрофагальной клеточно-опосредованной реакции макроорганизма в очаге интродукции возбудителя.
Теоретическое обобщение литературных источников и экспериментальные данные собственных исследований и наблюдений подтверждают правомерность официнального требования и эпизоотологическую необходимость перманентного мониторинга инфекционной ситуации по микобактериозам условно-здоровой птицы в индивидуальных хозяйствах населения.

Список литературы

Горальський Л.П. Основи гістологічної техніки і морфофункціональні методи досліджень у нормі та при патології. Навчальний посібник / Л.П. Горальський, В.Т. Хомич, О.І. Кононський. – Житомир: ”Полісся”, 2005. – 288 с.
Литвинов, В.И. Нетуберкулезные микобактерии [Текст] / В.И. Литвинов, Макаров М.В., Краснова М.А. // М.: МНПЦБТ. – 2008. – 256 с.
Макарова, М.В. Выделение и идентификация нетуберкулезных микобактерий у пациентов фтизиатрических учреждений: Автореф. дис. … д-ра биол. наук. – 2010. 48 с.
Новожилова, И.А. Микобактериозы: прошлое, настоящее и будущее [Текст] / И.А. Новожилова // Проблемы туберкулеза: журнал. – 2004. – №4. – С. 3-9.
Оттен, Т.Ф. Микобактериоз. [Текст] / Т.Ф. Оттен, А.В. Васильев // СПб.: Мед. пресса, 2005. – 224 с.
Bottger, E.C. Mycobacterium genavense sp. nov. [Text] / E.C. Bottger, B. Hirschel, M.B. Coyle // Int. J. Syst. Bacteriol. – 1993. – Vol. 43. – P. 841-843.
Cassidy, P. Nontuberculosous mycobacteral disease prevalence and risk factors: a changing epidemiology [Text] / P. Cassidy et al. // Clin. Infect. Dis. – 2009. – Vol. 49, №12. – P. 124-129.
Jarsembowski, J. Nontuberculosous mycobacteral infections [Text] / J. Jarsembowski, M. Young // Arch. Pathol. Lab. Med. – 2008. – Vol. 132, №8. – P. 1333-1341.
Kobashi, Y. A double-blend randomized study of aminoglycoside infusion with combined therapy for pulmonary [Text] / Y. Kobashi, T. Matsushima, M. Oka // Mycobacterium avium complex disease. Respire. Med. – 2007. – Vol. 101. – P. 130-138.
Kobashi, Y. Relationship between clinical efficacy of treatment of pulmonary Mycobacterium avium complex disease and drug-sensitivity testing of Mycobacterium avium complex isolates [Text] / Y. Kobashi, K, Yoshida, N. Miyashita et al. // J. Infect. Chemother. – 2006. Vol. 12. – P. 195-202.
Moran, J. Long-term results of pulmonary resection for atypical mycobacteial disease [Text] / J. Moran [et al.] // Am. Thorac. Surg. – 1983. – Vol. 35. – P. 597-604.

Электронное периодическое издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор), свидетельство о регистрации СМИ — ЭЛ № ФС77-41429 от 23.07.2010 г.

Соучредители СМИ: Долганов А.А., Майоров Е.В.

Рисунки к патенту РФ 2117045

Изобретение относится к медицине, а именно к биохимическим исследованиям в микробиологии, и может быть использовано в научных исследованиях и практической медицине для изучения микобактериальных ферментов.

С целью повышения эффективности химиотерапии туберкулеза и микобактериоза все шире используют нестандартные антибактериальные препараты. Однако микобактерии проявляют высокую устойчивость к антибиотикам пенициллинового и цефалоспоринового ряда. В основе устойчивости микобактерий к данным антибиотикам лежит продукция специфических ферментов - бета-лактамаз, гидролизующих бета-лактамное кольцо пенициллинов и цефалоспоринов, с образованием лишенных антибактериальной активности продуктов. Открытие ряда препаратов - ингибиторов бета-лактамазы - представляет возможность применения пенициллинов и цефалоспоринов при лечении туберкулеза и микобактериоза. Вместе с тем существуют и другие факторы устойчивости к бета-лактамным антибиотикам, не связанные с продукцией микобактериальных бета-лактамаз. Поэтому применение ингибиторов бета-лактамазы в клинике требует индивидуального подхода к возбудителю. Микобактерии, выделенные у больного туберкулезом или микобактериозом, необходимо проверить на наличие фермента бета-лактамазы и возможность его ингибирования с помощью ингибитора бета-лактамазы.

Существуют различные способы определения бета-лактамазы: микробиологический, потенциометрический, иодометрический, гидроксиламинный - в зависимости от характера исследуемого материала, типа и чистоты фермента. Известные способы определения бета-лактамазы либо не учитывают бактериологические и биохимические особенности рода микобактерий, либо требуют применения сложной аппаратуры и высококачественных реактивов. Микробиологический способ определения бета-лактамазы следует признать наиболее простым в техническом отношении при получении достоверных и воспроизводимых результатов исследования.

В основе микробиологического способа Lee, Komarmy [1] определения бета-лактамазы грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов лежит возможность микробной популяции инактивировать антибиотик, заключенный в диске. Стандартные диски с пенициллином помещают в 1 мл бульонной суспензии испытуемых бактерий. Пробирки с суспензией инкубируют 1 ч при 37 o C. После этого диски вынимают и помещают на мембранные фильтры, которые накладывают на поверхность агара, засеянного тест-культурой. Антибиотик диффундирует в агар в течение получаса при 37 o C, далее диски и фильтры удаляют, а чашки с агаром инкубируют до появления отчетливого роста тест-штамма. Достоинством метода является техническая простота исполнения, быстрота и наглядность полученных результатов. В то же время для определения микобактериальной бета-лактамазы способ Lee, Komarmy никем не применялся, так как род микобактерий характеризуется значительными отличиями культуральных и биохимических свойств от представителей грамположительной и грамотрицательной флоры. Одной из особенностей рода микобактерий является медленный и очень медленный рост, при котором видимые колонии образуются после 2 дней - 8 нед инкубации, в то время как максимальное образование колоний грамположительных и грамотрицательных микробов происходит за 2 ч. Отсюда исходят и отличия в ферментообразующей функции микробных клеток.

Наиболее близким к предлагаемому способу является определение бета-лактамазы микобактерий Dufour с соавторами [2], где определение остаточного пенициллина после реакции с микробной суспензией проводится методом вертикальной диффузии. К 5 мл суспензии испытуемых микобактерий прибавляют равный объем пенициллина (50 ед/мл в среде 7H9 твин-альбумин) и помещают в водяную баню при 37 o C. После 18 ч инкубации клетки осаждают центрифугированием. По 1 мл супернатанта вносят в 3 пробирки со скошенным питательным агаром. Диффундирование остаточного пенициллина проводят при комнатной температуре в течение 24 ч. На следующий день в каждую пробирку с питательным агаром и остаточным пенициллином вводят суспензию тест-культуры. Инкубация при 37 o C - 24 ч. После инкубации определяют зону подавления роста, вызванную остаточным пенициллином от основания скошенного агара до точки роста тест-культуры. Контролем служит пробирка, содержащая пенициллин без микробной суспензии.

Недостатком данного способа является сложная, кропотливая и длительная процедура приготовления скошенного питательного агара и диффундирование на его поверхности раствора пенициллина (24 ч). Дополнительные затраты времени требуются также на обязательное центрифугирование реагирующей смеси для осаждения микробных клеток. Кроме того, для каждого испытуемого штамма или нового антибиотика используются 3 пробирки со скошенным агаром, так как зона роста тест-штамма на поверхности скошенного агара не имеет четкой границы, и учет результатов затруднителен.

Целью изобретения является упрощение и ускорение способа определения микобактериальной бета-лактамазы. Целью является также определение инактивации микобактериальной бета-лактамазы.

Поставленная цель достигается путем контакта микобактериальной суспензии с антибиотиком, заключенным в стандартном диске, а при определении инактивации фермента и с ингибитором бета-лактамазы. Активность микобактериальной бета-лактамазы или ее ингибирование определяют по остаточному антибиотику в диске, выражающемуся в изменении зоны подавления роста тест-штамма на чашках Петри.

Отличием представленного способа определения микобактериальной бета-лактамазы является замена способа вертикальной диффузии способом диффузии с диска. Поэтому отпадает необходимость приготовления раствора антибиотика, титрования его в пробирки с последующим диффундированием на поверхность скошенного агара, что сокращает время определения фермента на 24 ч. Диски с антибиотиком после контакта с микобактериальной суспензией раскладывают на питательный агар в чашки Петри по 5 - 6 в каждую, что значительно сокращает использование лабораторной посуды и упрощает процесс работы. Зона задержки роста тест-штамма вокруг диска с антибиотиком имеет хорошо очерченную границу, что способствует получению достоверных результатов.

Таким образом, представленный способ дает возможность проводить определение бета-лактамазы одновременно у большого числа испытуемых культур микобактерий с использованием 8 - 10 дисков с различными антибиотиками. Существенным отличием представленного способа является то, что при расширении технических возможностей способа его можно использовать одновременно для определения микобактериальной бета-лактамазы и для определения ингибирования фермента. Для чего в параллельные пробирки наряду с микобактериальной суспензией и диском вносят раствор ингибитора в необходимой концентрации.

Предлагаемое время инкубации 22 - 24 ч является оптимальным для определения микобактериальной бета-лактамазы. Установлено, что длительность периода инкубации прямо пропорциональна скорости роста микобактерий. Быстрорастущие микобактерии осуществляли полный или почти полный гидролиз антибиотика за 6 ч инкубации. Активность медленнорастущих микобактерий за этот же период у различных видов составляет от 0 до 73% и достигает максимума к 22 - 24 ч (табл.1). Максимум выявления бета-лактамазы приходится на период 22-24 ч, когда 100% быстрорастущих и 69,3 - 72,7% медленнорастущих микобактерий гидролизуют антибиотик. Поэтому время инкубации 22 - 24 ч позволяет полностью выявить активность бета-лактамазы любой исследуемой культуры независимо от ее видовой принадлежности.

Для определения микобактериальной бета-лактамазы объем реагирующей смеси должен составить 0,2 - 0,3 мл, так как уменьшение диаметра зоны роста тест-штамма вокруг диска происходит не только из-за гидролиза бета-лактамных антибиотиков микобактериальными ферментами, но и за счет элиминации части антибиотика в реагирующую смесь. Известно, что диски с антибиотиками рассчитаны, как правило, на применение на плотной питательной среде, и в основе их использования лежит диффузия (элиминация) активного начала с поверхности диска. При использовании дисков в жидкой среде изменяется скорость диффузии антибиотика с диска. Кроме того, если для работы с грамотрицательными и грамположительными микробами требуется экспозиция в микробной суспензии в течение 1 ч, то для микобактериальных клеток срок инкубации составляет 22 - 24 ч. Определение изменения содержания антибиотика в диске в зависимости от объема реагирующей смеси и времени инкубации показало, что величина элиминации антибиотика с диска находится в прямой зависимости от объема реагирующей смеси и практически не зависит от времени инкубации. При объеме реагирующей смеси 1,0 и 5,0 мл с диска элиминирует от 40 до 60% антибиотика. Среда в объеме 0,1 мл практически высыхает за 24 ч инкубации. При объеме реагирующей смеси 0,2 и 0,3 мл наблюдается минимальное элиминирование антибиотика за 24 ч инкубации, что проявляется незначительным уменьшением зоны задержки тест-штамма (91,6 - 91,2%). Таким образом, для определения микобактериальной бета-лактамазы объем реагирующей смеси составляет 0,2 - 0,3 мл (табл.2). Контролем опыта является диск, заключенный в таком же объеме среды Сотона, как и объем бактериальной суспензии в опытной пробирке.

Исследования по определению микобактериальной бета-лактамазы проводятся при постоянном экспериментально отработанном числовом значении плотности суспензии - 10 мг влажного веса в 1 мл среды Сотона.

Для определения микобактериальной бета-лактамазы применяются диски как производства НТО им. Л. Я. Карпова, так и собственного изготовления. Концентрация антибиотика, нанесенная на диск, колеблется от 10 до 30 мкг. Несмотря на различия в дозе антибиотика, величина зоны задержки роста чувствительного тест-штамма вокруг контрольного диска колеблется незначительно и дает четкое представление о наличии фермента в испытанной культуре. Следовательно, можно сделать вывод, что различия в концентрации препаратов, нанесенных на диски, связаны с их индивидуальными антибактериальными свойствами. Для получения идентичных результатов необходимо иметь одинаковую эффективность воздействия на тест-культуру.

Способ определения микобактериальной бета-лактамазы применен на 469 культурах различных видов микобактерий. Установлено, что после 24 ч. контакта с пенициллином полный или частичный гидролиз антибиотика наблюдается у 90 - 100% испытанных культур всех видов микобактерий, за исключением M. avium. Необходимость последних инактивировать пенициллин при высокой резистентности к данному антибиотику позволяет предположить другой механизм устойчивости M. avium к бета-лактамным антибиотикам. Подобные результаты по определению бета-лактамазы различных видов микобактерий получены в работах Dufour с соавторами, способ которого послужил аналогом в нашей работе. С помощью предложенного способа проведено определение бета-лактамазы с последующим ингибированием фермента на культурах микобактерий туберкулеза. Установлено, что отечественный сульбактам способен подавлять микобактериальную бета-лактамазу по всей широте спектра действия (табл. 3). Незначительная активность фермента, оставшаяся в фильтрате культуры против пенициллина, была устранена увеличением дозы препарата.

В результате использования предложенного способа проведено углубленное исследование микобактериальной бета-лактамазы и установлено совпадение полученных результатов с работами зарубежных авторов:
микобактериальная бета-лактамаза характеризуется широким спектром действия и видовой специфичностью;
отечественный сульбактам ингибирует фермент в бактериальной суспензии микобактерий туберкулеза по всей широте спектра активности.

Способ определения микобактериальной бета-лакткамазы осуществляется следующим образом.

Материал:
1. Испытуемую культуру микобактерий выращивают на среде Левенштейна-Иенсена. Возраст культуры: быстрорастущие МБ 5 - 7 дней, медленнорастущие МБ 2 - 4 нед. Бактериальную суспензию МБ плотностью 10 мг влажного веса в 1 мл готовят на среде Сотона.

2. Стандартные диски с ампициллином, содержащие 10 мкг антибиотика, изготовленные в объединении НПО им. Л.Я. Карпова.

3. Индикаторный штамм St. aureus 209, высокочувствительный к антибиотикам пенициллинового ряда. Бактериальную суспензию индикаторного штамма готовили из суточной культуры в физиологическом растворе по стандарту мутности N 5 ГИСК им. Л.А. Тарасевича, с последующим разведением в 10 раз.

Последовательность определения фермента:
1-й день. Диски с ампициллином раскладывают в стерильные пробирки (120 х 16 мм). В пробирку вносят 0,2 мл суспензии испытуемой культуры МБ. Контролем опыта служит диск с ампициллином, помещенный в 0,2 мл среды Сотона без микобактериальной суспензии. Инкубация при 37 o C в течение 24 ч.

2-й день. Готовят суспензию индикаторного штамма. Для образования газона бактериальную суспензию индикаторного штамма в количестве 0,1 мл наносят на поверхность кровяного агара, растирают шпателем. Диски с ампициллином удаляют из микобактериальной суспензии испытуемой культуры с помощью петли, обсушивают на стерильной фильтровальной бумаге и раскладывают на засеянный индикаторным штаммом кровяной агар в каждую чашку Петри по 5 - 6 дисков. Инкубация при 37 o C в течение 24 ч.

3-й день. Оценка результатов опыта. Активность микобактериальной бета-лактамазы определяют по изменению диаметра зоны подавления роста индикаторного штамма вокруг диска с ампициллином. Действие микобактериального фермента оценивается по следующим критериям (фиг. 1):
1 - диаметр зоны подавления роста индикаторного штамма вокруг диска с ампициллином значительный - контроль;
2 - зона подавления роста индикаторного штамма вокруг диска с ампициллином отсутствует - высокая активность фермента;
3 - диаметр зоны подавления роста индикаторного штамма вокруг диска с ампициллином уменьшен на 50% и более по сравнению с ростом вокруг контрольного диска - умеренная активность фермента;
4 - диаметр зоны подавления роста индикаторного штамма вокруг диска с ампициллином равен контролю или уменьшен менее чем на 50% по сравнению с контролем - фермент, инактивирующий антибиотик, отсутствует.

Способ ингибирования микобактериальной бета-лактамазы осуществляется следующим образом.

Материал:
1. Культура микобактерий.

2. Стандартные диски с ампициллином.

3. Индикаторный штамм St. aureus 209.

Первые четыре компонента используют для способа ингибирования как в предыдущем исследовании.

5. Сульбактам - препарат, ингибирующий фермент бета-лактамазу, синтезирован ВНИИ антибиотиков АМН (г. Москва). Навеску сульбатама 25 мг растворяют в 100 мл стерильной дистиллированной воды, получают разведение 250 мкг в 1 мл.

Последовательность ингибирования фермента:
1-й день. Диски с ампициллином раскладывают в стерильные пробирки (120 х 16 мм). На каждую испытуемую культуру необходимо две пробирки: 1. определение активности фермента; 2. ингибирование фермента. Суспензию каждой испытуемой культуры МБ вносят по 0,2 мл в две пробирки с дисками. Во второй ряд пробирок вносят по 0,2 мл приготовленного раствора сульбактама. Контролем опыта служит диск с ампициллином, помещенный в среду Сотона без бактериальной суспензии. Инкубация при 37 o C в течение 24 ч.

2-й день. Как описано в предыдущем исследовании.

3-й день. Оценка результатов опыта. Ингибирующее действие сульбактама на микобактериальную бета-лактамазу определяют по изменению диаметра зоны роста индикаторного штамма вокруг диска с ампициллином. Действие ингибитора бета-лактамазы оценивают по следующим критериям (фиг. 2):
1 - диаметр зоны подавления роста индикаторного штамма вокруг диска с ампициллином значительный - контроль;
2 - зона подавления роста индикаторного штамма вокруг диска с ампициллином отсутствует - высокая активность фермента;
3 - диаметр зоны подавления роста индикаторного штамма равен контролю - фермент инактивирован сульбактамом.

Простота исполнения и доступность для бактериологических лабораторий противотуберкулезных учреждений описанного способа позволяет использовать его с целью рационального вывода химиотерапии больных туберкулезом и микобактериозом.

Источники информации
1. Lee W.S., Komarmy L. New method for detecting in vitro inactivation of penicillins by Haemophilus and Stafilococcus aureus // Abstrs. 79-th Ann. Meet. Amer.Soc.Microbiol. Los Angeles. Calif., 1979 Washington. 1979, p.12.

2. Dufour A.P., Knight R.A., Harris H.W. Mycobacterial penicillinase activity // Amer.Rev. Res.Dis. - 1966. - V.94, p.965-968.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ определения микобактериальной бета-лактамазы, включающий контактирование суспензии микобактерий с бета-лактамным антибиотиком и последующее выявление остаточного количества антибиотика по зоне задержки роста чувствительной к нему тесткультуры, отличающийся тем, что в 0,2 - 0,3 мл суспензии испытуемых микобактерий с плотностью 10 мг влажного веса на 1 мл, приготовленной на среде Сотона, помещают бумажный диск, содержащий примерно 10 мкг антибиотика, инкубируют образец в течение 22 - 24 ч, после чего диск переносят на чашки Петри с высеянной на них тест-культурой.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в инкубируемый образец дополнительно вводят эффективную концентрацию ингибитора бета-лактамазы.

Читайте также:

Пожалуйста, не занимайтесь самолечением!
При симпотмах заболевания - обратитесь к врачу.

Классы МПК:	C12Q1/02 использующие жизнеспособные микроорганизмы C12Q1/34 использующие гидролазу C12N9/86 действующие на амидные связи в циклических амидах, например пенициллиназа C12N9/14 гидролазы (3)
Автор(ы):	Оттен Т.Ф.
Патентообладатель(и):	Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии
Приоритеты: