Мук лабораторная диагностика легионеллеза
1.1 . Настоящие методические указания устанавливают методику проведения лабораторных исследований объектов окружающей среды по выявлению в них бактерий Legionella pneumophila - возбудителя болезни легионеров.
Проведение мониторинга объектов окружающей среды на наличие Legionella pneumophila позволит определить степень их контаминации возбудителем и дать оценку эффективности принимаемых мер в целях профилактики болезни легионеров и обеспечения безопасности здоровья населения.
1.2 . Методические указания предназначены для применения в лабораториях учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации, осуществляющих контроль за объектами окружающей среды; в лабораториях других организаций, аккредитованных в установленном порядке на право осуществления контроля безопасности объектов окружающей среды на наличие возбудителя болезни легионеров.
1.3 . Методические указания являются обязательными:
• в ходе проведения противоэпидемических мероприятий и при эпидемиологическом расследовании возможных эпидемических вспышек и спорадических случаев болезни легионеров.
2.10 . European Guidelines for Control and Prevention of Travel associated Legionnaires Disease, 2002.
2.11 . ISO 1998.ISO 11731:1998 Water Quality-detection and enumeration of Legionella.
2.12 . Legionella and the prevention of Legionellosis. - WHO guidelines. 2006.
L egionella pneumophila - грамотрицательная бактерия, возбудитель острых тяжелых пневмоний с высоким процентом летальных исходов (5 - 10 %) и респираторных заболеваний. В природных условиях легионеллы обитают повсеместно в пресноводных водоемах, преимущественно в некультивируемой форме, и паразитируют в амебах и других простейших, не представляя серьезной опасности для человека. Размножение легионелл активно идет в теплой воде в диапазоне температур 25 - 45 °С, хотя их выделяют и из холодной воды.
Высокие адаптивные способности легионелл позволяют им успешно колонизировать искусственные водные системы - системы охлаждения и кондиционирования, градирни, компрессорные устройства, джакузи, фонтаны, медицинское оборудование и др. Условия для размножения легионелл в искусственных водных системах более благоприятны, чем в естественных, что приводит к накоплению в них возбудителя в высокой концентрации. Легионеллы активно колонизируют синтетические и резиновые поверхности промышленного, водопроводного, медицинского оборудования с образованием биопленок, в которых легионеллы значительно более устойчивы к действию дезинфицирующих веществ. В состав естественных биопленок помимо легионелл входят бактерии рода Pseudomonas , Klebsiella , Acinetobacter и др. Важная роль в персистенции легионелл в биопленках принадлежит амебам в которых легионеллы активно размножаются перед образованием сложных биопленок в ассоциации с другими микроорганизмами.
Эпидемические вспышки и спорадические случаи болезни легионеров преимущественно выявляют в местах общественного назначения: у посетителей и персонала гостиниц; торговых, спортивных и выставочных комплексов; промышленных предприятий, больниц, учреждений; круизных судов и др. Фактором передачи служит водный мелкодисперсный аэрозоль, содержащий возбудителя и генерируемый системами водных коммуникаций.
Сочетание высокой концентрации легионелл в водной среде с источниками мелкодисперсного аэрозоля позволяет возбудителю инфекции вследствие ингаляции микробного аэрозоля попадать в нижнюю часть респираторного тракта и легкие человека, где происходит контакт с альвеолярными макрофагами, в которых вирулентные штаммы возбудителя активно размножаются.
При спорадическом легионеллезе и отдельных нозокомиальных вспышках заболевания возможна аспирация воды, контаминированной легионеллами без образования аэрозоля (бассейны, емкости для хранения и транспортирования воды и др.). Это обусловлено возрастанием восприимчивости к легионеллезу лиц со сниженной иммунологической реактивностью на фоне сопутствующих заболеваний, иммунодепрессивной терапии и др.
Эпидемические вспышки и спорадические случаи легионеллеза выявляют повсеместно. Особое значение в последние годы уделяется случаям болезни легионеров, возникающим во время поездок, путешествий и диагностируемым после возвращения из них. Инкубационный период составляет от 2 до 10 дней. Более 30 % случаев спорадического легионеллеза, многочисленные эпидемические вспышки в гостиницах, на круизных судах послужили причиной создания международной системы эпидемиологического надзора за случаями легионеллеза, связанного с поездками.
В настоящее время известно около 50 видов легионелл, преимущественно выделенных из окружающей среды, из которых собственно болезнь легионеров вызывает вид Legionella pneumophila , насчитывающий 16 серогрупп. Причем более 80 % случаев заболевания вызывают штаммы 1-й серогруппы. Среди других представителей рода Legionella в качестве микробов-оппортунистов, вызывающих заболевание при нарушении клеточного иммунитета и\или на коморбидном фоне, следует отметить L . micdadei, L . longbeachae , L . dumqffii и L . bozemanii. Остальные виды Legionella spp . не патогенны для человека.
рН метр - рН 410; диапазон рН от - 1 до 14, точность 0,01 рН, температура анализируемой среды от - 10 до 100 °С (Белоруссия)
Весы Adventurer ™ - прецизионные одночашечковые электронные цифровые с функцией обнуления тары и другими вспомогательными функциями, стандартного уровня, максимальная загрузка - 210 г, погрешность при измерении - 0,001 г ( OHAUS , США)
Весы ScoutPro - портативные одночашечковые электронные цифровые с функцией обнуления тары, максимальная нагрузка - 2000 г, погрешность при измерении - 0,1 г ( OHAUS , США)
Шкаф сушильный стерилизационный ШСС-80П, поддерживающий температуру плюс (160 ± 5) °С (Россия)
Термостат суховоздушный ТС-1/80, объем 80 л с температурой до 60 °С (Россия)
СО2 инкубатор МСО 5АС, персональный, объем 49 л, тепловая рубашка, ТС-датчик СО2 (Sanyo) или анаэростат GasPak 100 (на 11 чашек), GasPak 150 (на 36 чашек)
Стерилизатор паровой ВК-30 с вертикальной камерой, объем 150 л
Дистиллятор, обеспечивающий качество дистиллированной воды
Облучатель бактерицидный настенный УФИК 1 ´ 30
Холодильник бытовой электрический с температурой в камере плюс 4 - 6 °С
Морозильная камера с температурой в камере до -20 °С
* Указанное оборудование и расходные материалы могут быть заменены на аналогичные по характеристикам производства других фирм.
Водяная баня TW 2.03, автоматическое регулирование температуры до 85/90 °С, объем 8,5 л, внутренняя и внешняя циркуляция ( Elmi , Латвия)
Батометр Молчанова ГР-18, предназначенный для взятия проб воды с различной глубины водоемов, с одновременным измерением температуры воды исследуемого слоя, при температуре окружающей среды от 1 до 40 °С (Россия)
Прибор для мембранной фильтрации под вакуумом с диаметром фильтрующей поверхности 35 или 47 мм и устройство для создания разрежения 0,5 - 1,0 атм. (САРТОГОСМ, Россия)
Прибор для подсчета колоний бактерий ( Schuett )
Мешалка магнитная BioMMS -3000, без подогрева, максимальный объем 2 л, скорость вращения 0 - 3000 об./мин, размер платформы 150 ´ 150 мм
Микроцентрифуга/встряхиватель ТЭТА 2 (Биоком, Россия)
Твердотельный термостат Термо 24-15 с диапазоном рабочих температур от 0 до 120 °С (Биоком, Россия)
Охладитель проб ОП-1 с диапазоном температур от -4 до 30 °С (Биоком, Россия)
Амплификатор Терцик МС-2 (ДНК-Технология, Россия)
Амплификатор iCycler для проведения ПЦР с учетом результатов в режиме реального времени, оптический и реакционный модули, комплект фильтров iQ 5 Optical System ( BIORAD , США)
Источник тока Эльф-4 (ДНК-технология, Россия)
Камера для горизонтального электрофореза SE -2 (Хеликон, Россия)
Фотодокументирующая система GelDoc 2000 ( BIORAD , США)
4.3. Вспомогательные изделия и расходные материалы
Пинцет для работы с мембранными фильтрами
Скальпель хирургический, 15 см
Термометр ртутный с диапазоном измерений от 0 до 100 °С
Часы механические сигнальные
Пробки различных размеров: силиконовые, резиновые и другие, выдерживающие стерилизацию сухим жаром или автоклавированием
Тампоны (свабы) в полипропиленовой пробирке в упаковке с аппликатором-палочкой
Вата хлопковая медицинская гигроскопическая
Бумага плотная для упаковки посуды
Пленка Parafilm A
Газогенераторные пакеты CampyPak для факультативных анаэробов, 10 шт./уп.
Индикаторные полоски СО2, 50 шт./уп.
Мембранные фильтры на основе ацетата целлюлозы для микробиологических целей с диаметром пор не более 0,45 мкм и размером диска 35 или 47 мм или другие фильтрующие мембраны с аналогичной способностью фильтрации, имеющие сертификат качества
Мембранные фильтры поликарбонатные с диаметром пор не более 0,45 мкм и размером диска 35 или 47 мм
Чашки Петри пластиковые микробиологические, стерильные (Россия)
Стекла предметные для микропрепаратов
Пробирки типов П1, П2
Бутыли стеклянные градуированные с крышкой автоклавируемые или пластиковые флаконы (одноразовые), емкостью 500 и 1000 мл ( Wheaton , США)
Центрифужные пробирки, объемом 50 и 15 мл
Микроцетрифужные пробирки, объемом 0,2, 0,6 и 1,5 мл ( QSP, США)
Автоматические пипетки переменного объема Eppendorf 500 - 5000, 1000 - 10000 мкл
Наконечники до 10 мкл (QSP, США)
Наконечники до 200 мкл с фаской ( QSP , США)
Наконечники до 1000 мкл ( QSP , США)
Наконечники до 5000 мкл ( Eppendorf , Германия)
Наконечники до 10000 мкл ( Eppendorf , Германия)
Наконечники с фильтром до: 10, 100, 200, 1000 мкл ( QSP, США)
Штативы для центрифужных пробирок, объемом 50 и 15 мл (Германия)
Штатив для пипеток переменного объема (Ленпипет, Россия)
Штатив для хранения микропробирок, объемом1,5 мл (Хеликон, Россия)
Штативы для наконечников до: 10, 200, 1000 мкл (Россия)
4.4. Реагенты, реактивы и питательные среды
Читайте также:
|
Легионеллы относятся к отделу Gracilicutes, семейству Legionellaceae, роду Legionella, который представлен 9 видами: L.pneumophila, L.bozemanii, L.micdadei, L.dumoffii, L gormanii,L.longbeachae, L.jordanis, L.wadsworthii, L.oakridgensis.
Легионеллы представляют собой мелкие грамотрицательные палочки длиной 2-3 мкм ( иногда выделяются более крупные формы до 20-50 мкм) с выраженной тенденцией к полиморфизму. Бактерии хорошо окрашиваются по Романовскому-Гимзе, содержат жировые включения, окрашиваемые суданом черным; по Граму окрашиваются отрицательно. Легионеллы подвижны, спор не образуют..
Бактериальная клетка легионелл обладает целым набором факторов патогенности (эндотоксин, цитотоксин, гемолизин, протеаза, действующая на белки сыворотки крови).
Легионеллы являются аэробами, хорошо растут в присутствии СО2, весьма пребовательны к условиям культивирования; растут только на специальных сложных средах. Для культивирования требуются максимально обогащенные среды со специальными добавками, такими как L-цистеин, пирофосфат железа. Наиболее оптимальной средой является угольно-дрожжевой агар (УДА). В целом для всей группы легионелл наиболее надежным методом считается культивирование в куриных эмбрионах.
Материал для исследований может быть представлен плевральной жидкостью, реже мокротой, кровью, мочой. Для исследований также используют транстрахеальный аспират, бронхоскопический. легочный биопсийный и аутопсийный материалы.
В диагностике применяют бактериологический, биологический (более надежный), серологический методы.
Микроскопический метод. Бактерии окрашиваются по Романовскому-Гимзе и Хименсу(исключение –нативный материал из мокроты).
Для экспресс диагностики можно мазки импрегнировать серебром или люминесцентной сывороткой.
Бактериологический метод. Первичный посев производят на забуференный УДА со всеми добавками и рН 6.9.первичный материал растет медленно, поэтому чашки инкубируют в течение 2-14 дней при 35°С во влажной атмосфере. Выросшие колонии обычно менее 2 мм в диаметре, полупрозрачные, бесцветные либо с сероватым оттенком, гладкие блестящие с приподнятым краем. На средах с тирозином образуют колонии с коричневым пигментом. Некоторые виды легионелл обладают аутофлюоресценцией – УФ лучи возбуждают бело-голубое свечение. Культуру, выросшую на УДА подвергают идентификации МФА (метод флюоресцирующих антител) с использованием люминисцирующих сывороток к основным серогруппам легионелл. В спорных случаях используют анализ жирных кислот, ДНК-гомологии, иммунологическое тестирование с набором поли- и моновалентных сывороток.
Определение чувствительности к антибиотикам не рекомендуется, так как результаты исследований in vitro могут не совпадать с клинической эффективностью.
Серологическая диагностика. Наиболее распространен непрямой вариант МФА и РНГА. Также используется ИФА. Четырехкратное нарастание титров антител (сероконверсия) свидетельствует о наличии активного инфекционного процесса и позволяет с высокой степенью надежности устанавливать или подтверждать диагноз. Недостатком этих методов следует считать ретроспективный анализ диагностики, так как выраженную сероконверсию можно выявить лишь на 2-3 неделе заболевания.
Непрямой метод флюоресцирующих антител. Убитую кипячением культуру легионелл наносят на предметное стекло и фиксируют. На препарат наносят сыворотку больного с разведением 1:32 и более. После 15 минут инкубации наносят люминесцирующий иммуноглобулин против глобулинов человека, повторно инкубируют, промывают в фосфатном буфере и микроскопируют. Максимальное разведение сыворотки, в котором обнаруживается специфическое свечение, является титром специфических антител (диагностический титр-1:64).
ИФА. Применяют непрямой вариант метода.
Иммунологические экспресс методы по выявлению антигенов.
Наибольшее распространение получил прямой метод МФА, который используется для ранней диагностики легионеллеза и при проведении моторинга за различными водными системами и сооружениями на наличие легионелл. По чувствительности не уступает культуральному методу и позволяет обнаружить возбудителей в нативном материале (за исключением мочи) независимо от их жизнеспособности. На приготовленный из нативного материала и фиксированный в ацетоне мазок наносят каплю легионеллезной люминесцирующей сыворотки и инкубируют во влажной камере 15-20 минут при 37°С. После промывки в фосфатном буфере мазок просматривают в люминесцентном микроскопе. В положительных случаях обнаруживается изумрудно-зеленое свечение легионеллезных бактерий.
ИФА позволяет выявить легионеллезный антиген в клиническом материале, включая мочу, и представляет собой прямой вариант реакции.
Реакция коагглютинации является специфическим и чувствительным методом определения легионелл в материале различного происхождения. В реакции используются золотистые стафилококки, меченные легионеллезными иммуноглобулинами.
Существуют пять основных лабораторных методик, используемых в диагностике легионеллеза:
1. Выделение культуры возбудителя — золотой стандарт.
2. Определение уровня антител в сыворотке крови.
3. Определение растворимого антигена в моче.
4. Выявление возбудителя в клиническом материале методом иммунофлюоресценции.
5. Выявление возбудителя при помощи ПЦР.
Опыт применения разных методов в последние годы, данные о чувствительности и специфичности различных методов (табл. 29.3), позволил ВОЗ рекомендовать для лабораторной диагностики болезни легионеров три группы методов. Диагноз легионеллеза в случае острой инфекции нижних дыхательных путей (клинически и рентгенологически подтвержденной пневмонии) считается установленным:
а) при выделении легионелл из отделяемого респираторного тракта или легочной ткани;
б) при 4-кратном или более нарастании титра специфических антител к L. pneumophila в реакции непрямой иммунофлюоресценции;
в) при определении специфического растворимого антигена легионелл в моче иммуноферементным или иммунохроматографическим методом.
При отсутствии первой сыворотки крови, взятой в ранние сроки болезни, выявление высокого уровня антител к L. pneumophila (1:128 и выше) в одиночной сыворотке методом непрямой иммунофлюоресценции позволяет считать диагноз легионеллеза предположительно установленным. Остальные методы используются как дополнительные и имеют вспомогательное значение.
Для выделения легионелл используют материал бронхоскопии, плевральный экссудат, материал биопсии или аутопсии легкого. Плевральный экссудат, материал бронхоскопии, полученный стерильно до 7-го дня болезни в количестве 1-2 мл помещают в стерильную пробирку, плотно закрытую резиновой пробкой, и хранят при +4°С не более суток. Материал биопсии или аутопсии помещают в стерильные флаконы, плотно закрытые пробками, и хранят или транспортируют при +4°С в течение суток (не дольше). Длительное хранение материала (до 1 года) возможно лишь при температуре -70°С.
Рост колоний на клиническом материале наблюдается не ранее, чем через 4-5 сут. Максимальное количество видимых колоний вырастает на 8-10-е сутки. При подозрении на рост Legionella колонии пересевают на ту же среду и на среду, не поддерживающую рост возбудителя — контрольную среду. В качестве контрольной среды обычно используют аналогичную среду BCYEα без добавления L-цисте-ина и пирофосфата железа или соответствующей ростовой добавки фирмы-производителя. Роста во втором пассаже на среде BCYEα при отсутствии роста на контрольной среде обычно достаточно для подтверждения выделения культуры рода Legionella. Если культура растет на контрольной среде, то это не Legionella.
Легочная ткань часто контаминирована микрофлорой, быстрый рост которой при высеве на питательные среды не позволяет выделить культуру легионелл. Для ингибирования роста посторонней микрофлоры в среду добавляют 4 мкг/мл цефамандола, 80ЕД/мл полимиксина В и 8 мкг/мл анизомицина. Цефамандол можно заменить ванкомицином (0,5мкг/мл). Следует отметить, что цефамандол, в отличие от ванкомицина, подавляет рост некоторых видов легионелл, не продуцирующих β-лактамазы, включая L.micdadei.
В отличие от стандартной ростовой добавки, обязательно содержащей L-цистеин и пирофосфат железа, антимикробная добавка, подавляющая рост посторонней микрофлоры, может различаться по составу у различных фирм-нроизводителей, а также в зависимости от степени контаминации исследуемого материала.
Существуют также два других метода подавления роста посторонней микрофлоры в клиническом материале при исследовании на легионеллез: прогревание в водяной бане в течение 30 мин при температуре 50°С или 5-минутная экспозиция HCl-KCl-буфером при pH 2,2 (используется для выделения легионелл из сильно контаминированных образцов).
Поскольку морфология легионелл типична для грамотрицательных бактерий, а методы окраски не являются специфичными, то окраска по Граму или Романовскому-Гимзе малоинформативна.
Выпускается несколько вариантов наборов, позволяющих выявлять колонии L. pneumophila серогруппы 1; L. pneumophila серогруппы 2-14 — родоспецифический антиген, характерный для колоний других родов легионелл, позволяющий быстро идентифицировать возбудитель в лаборатории клинической микробиологии. Постановка реакции на стекле с суспензией предполагаемой колонии легионелл занимает не более 15 мин.
а) Серологическая диагностика. Помимо бактериологических методов для диагностики легионеллеза широко применяют серологические методы. Антигенная структура легионелл представляется достаточно сложной. Специфичность серо-групп обусловлена липополисахаридным антигеном. Разработанные в настоящее время методы иммунодиагностики основаны на определении в сыворотке крови больных специфических антител или обнаружении самого антигена в моче либо отделяемом респираторного тракта.
Наиболее распространенный и доступный практическим лабораториям метод лабораторной диагностики — выявление специфических антител в сыворотке крови больных методом непрямой иммунофлюоресценции. Сыворотку крови больных, подозреваемых на легионеллез, берут в первые дни и на 14-21-й день болезни. Кровь из вены в количестве 3-5 мл помещают в стерильную пробирку. После свертывания крови сгусток отслаивают от стекла пастеровской пипеткой и оставляют на 5-6 ч при комнатной температуре. Отделившуюся сыворотку отсасывают в стерильную пробирку и хранят при +4°С.
Для постановки реакции каплю антигена наносят на предметное стекло, высушивают на воздухе в течение 30 мин, погружают в ацетон на 15 мин и вновь высушивают на воздухе. Сыворотку крови больного разводят в соотношении 1:16 0,15М фосфатным буфером (pH 7,2). Далее производят двукратные разведения от 1:32 до 1:512 в том же фосфатном буфере. На препараты с антигеном наносят разведения сыворотки, инкубируют в течение 30 мин при 37°С во влажной камере, промывают 5 мин фосфатным буфером и дистиллированной водой, высушивают на воздухе.
Далее на препараты наносят меченную флюоресцирующим изотиоционатом кроличью сыворотку против глобулинов человека, инкубируют в течение 30 мин при 37°С, промывают 5 мин, ополаскивают дистиллированной водой и высушивают. Препарат покрывают забуференной глицериновой средой и просматривают в люминисцентном микроскопе. Титры антител определяют по интенсивности свечения образующегося иммунного комплекса по 4-балльной шкале.
Результат считается положительным при не менее, чем 4-кратном нарастании титров антител в реконвалесцентных сыворотках по сравнению с первой, взятой в острый период заболевания. В случаях, когда проанализировать динамику изменения не представляется возможным, диагноз ставится по уровню специфических антител (1:128) в одиночной сыворотке (предварительный диагноз). При постановке реакции в качестве контроля используют положительную (титр не менее 1:256) и отрицательную (титр 1:16) сыворотки крови человека. Качество антигена может быть проверено в реакции непрямой иммунофлюоресценции с разведениями сыворотки крови кролика, иммунизированного антигеном L. pneumophila.
К сожалению, применение данного метода связано с необходимостью проведения инвазивных манипуляций для сбора материала, так как в мокроте возбудитель легионеллеза выявляют редко. Кроме того, моноклональные антитела к видоспецифическому антигену L. pneumophila дороги для рутинной диагностики, а тест-системы на основе поликлональных антител могут давать перекрестные реакции с Pseudomonas spp., Flavobacterium spp. и Bacteroides spp., и специфичность метода значительно понижается. Поэтому на практике в последние годы метод прямой иммунофлюоресценции используется, как правило, наряду с латекс-агглютинацией, для идентификации выросших на чашках колоний легионелл.
Изумрудно-зеленое специфическое свечение не менее чем 3-5 клеток в поле зрения микроскопа свидетельствует о присутствии в исследуемом материале L. pneumophila.
С конца 90-х годов прошлого века для экспресс-диагностики легионеллеза стали использовать ИФА, позволяющий выявлять растворимый антиген легионелл в моче в острый период заболевания (первые 10 дней). Международные испытания, проводившиеся в 1998-1999 гг. под эгидой Европейской рабочей группы по легионеллезу показали высокую чувствительность и специфичность этого метода в обнаружении L. pneumophila серогруппы 1 в моче. В настоящее время во всем мире в 80% случаев первичный диагноз легионеллеза ставится на основе обнаружения легионеллезного антигена в моче.
Для постановки ПЦР с целью диагностики легионеллеза обычно используют праймеры фрагмента гена mip или 16S rPHK L.pneumophila. В ряде работ указывают на возможность перекрестных реакций с бактериями рода Pseudomonas. Необходимость инвазивных процедур для получения клинического материала для исследований также ограничивает применение данного метода, поэтому в настоящее время ПЦР для диагностики легионеллеза используется лишь как дополнительный тест.
Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 14.2.2020
Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование
Российской Федерации
4.2. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Выявление антигена бактерий
Legionella pneumophila серогруппы 1 в
клиническом материале
иммунохроматографическим методом
2. Рекомендованы к утверждению Лабораторным советом Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 23.09.08).
3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 9 декабря 2008 г.
4. Введены впервые.
Руководитель Федеральной службы
по надзору в сфере защиты прав
потребителей и благополучия человека,
Главный государственный санитарный
врач Российской Федерации
9 декабря 2008 г.
4.2. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Выявление антигена бактерий Legionella pneumophila
серогруппы 1 в клиническом материале
иммунохроматографическим методом
1. Область применения
1.1. Настоящие методические рекомендации предлагают методику проведения лабораторной диагностики легионеллеза на основе выявления антигена легионелл иммунохроматографическим методом.
1.2. Методические рекомендации предназначены для применения в лабораториях учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации, в лабораториях других организаций, осуществляющих лабораторную диагностику заболеваний верхних и нижних дыхательных путей.
1.3. Предлагаемый метод выявления бактерий Legionella pneumophila серогруппы 1 в клиническом материале согласуется с международными стандартами ВОЗ и Европейской рабочей группы по легионеллезу.
2. Термины и сокращения
ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения.
ПЦР - полимеразная цепная реакция.
Нозокомиальный легионеллез - инфекционное заболевание легионеллезной этиологии, возникшее в период пребывания в лечебно-профилактической организации (ЛПО) или в течение 10-ти дней после выписки из него, а также связанное с процедурами, проводимыми в ЛПО любого типа.
Спорадический легионеллез - случаи легионеллеза, не связанные с пребыванием или получением процедур в лечебно-профилактической организации, а также с поездками и путешествиями.
3. Общие положения
По данным официальной статистики, среди населения Российской Федерации ежегодно регистрируется до 20 случаев легионеллезной инфекции. Однако современные исследования показывают, что удельный вес этой нозологической формы в общей структуре внебольничных пневмоний занимает порядка 6 - 14 %. Время диктует необходимость более подробного изучения эпидемического процесса заболевания, которое уже приобрело определенное социальное значение, поражая людей во время путешествий, общественных мероприятий, дома и на работе.
В клинической картине заболевания отсутствуют патогномоничные симптомы. Подозрение на легионеллезную этиологию инфекции возникает в случаях тяжелого течения внебольничной пневмонии при наличии следующих факторов риска: теплое время года, возраст старше 40 лет, мужской пол, путешествие (отдых с выездом, командировка) внутри страны или за рубеж, совпадающее со сроком инкубационного периода (от 2 до 10 дней до начала заболевания), работа в туристических или гостиничных комплексах, занятость на строительных или земляных работах, наличие вредных привычек (курение, алкоголь, наркомания), наличие сопутствующих заболеваний, в первую очередь: диабет, сердечно-сосудистые заболевания, заболевания, сопровождаемые курсом гормональной или (и) интенсивной иммуносупрессивной терапии.
Легионеллез является серьезной инфекцией, часто приводящей к инвалидизации. Летальность в случаях позднего и неадекватного лечения может достигать 20 %. Поэтому своевременная диагностика патологии приобретает особое значение, как для выбора соответствующей терапии и прогноза течения заболевания, так и для определения причинно-следственной связи формирования эпидемических очагов, организации адекватных санитарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий.
4. Сущность метода
Метод выявления антигена легионелл в клиническом материале является иммунохроматографическим тестом для быстрого и достоверного подтверждения диагноза легионеллезной инфекции, вызванной Legionella pneumophila серогруппы 1. Растворимый антиген выявляется в моче больных начиная с третьего для болезни и может быть обнаружен в течение нескольких последующих месяцев (до 1 года).
Метод основан на взаимодействии кроличьих антител к Legionella pneumophila серогруппы 1, нанесенных на нитроцеллюлозную мембрану с растворимым антигеном возбудителя, выявляемым в достаточно высокой концентрации во время заболевания в моче больного. Кроличьи антитела связаны с красителем, обеспечивающим визуализацию реакции в течении 15 - 30 мин после нанесения образцов мочи на нитроцеллюлозную мембрану.
Метод входит в международный стандарт (стандарт ВОЗ) диагностики легионеллеза и является базовым. В настоящее время в более 90 % случаев окончательный диагноз внебольничной легионеллезной инфекции в мире устанавливается данным методом. Положительные результаты могут быть дополнены с помощью бактериологического или серологических методов.
Указанный тест используется только для исследования образцов мочи. Для других образцов (сыворотка крови, другие биологические жидкости), которые могут содержать антиген легионелл, метод не является достоверным. Метод в данной модификации также не может быть использован для исследования образцов окружающей среды.
5. Техническое оснащение
Техническое оснащение для диагностики легионеллеза иммунохроматографическим методом включает:
1) набор реагентов (стандартные, зарегистрированные в установленном порядке в Российской Федерации):
- тест-кассеты, содержащие мембрану с нанесенными иммобилизованными в виде отдельных полосок кроличьими антителами к антигену Legionella pneumophila серогруппы 1 и козьими антителами против IgG кролика в комбинации с конъюгатом, содержащим кроличьи антитела к антигену Legionella pneumophila серогруппы 1, конъюгированные с окрашенными частицами;
- реагент А - на основе цитратно-фосфатного буфера с Твином-20 и азидом натрия;
- тампоны на палочке для отбора образца мочи пациента;
- положительный контрольный тампон, содержащий термоинактивированные L. pneumophila, высушенные на тампоне;
- отрицательный контрольный тампон, не содержащий L. pneumophila;
2) часы или таймер;
3) стандартный пластиковый контейнер для забора образцов мочи.
6. Отбор, хранение и транспортирование материала
для исследования
Образцы мочи для исследования помещают в стандартные пластиковые контейнеры и хранят при комнатной температуре (15 - 30 °С) не более 24 ч после забора перед постановкой реакции. В случае необходимости образцы могут храниться при температуре 2 - 8 °С до 14 дней или при -20 °С в течение длительного времени для первичного или повторного исследования. В качестве консерванта может быть использована борная кислота.
Образцы мочи можно пересылать в герметично упакованных контейнерах при температуре 2 - 8 °С или замороженными. Перед постановкой реакции с использованием быстрых тестов для выявления антигена легионелл в моче охлажденные или замороженные образцы мочи оставляют в лаборатории до достижения комнатной температуры.
7. Проведение исследования
Для проведения теста тампон на палочке погружают в образец исследуемой мочи, вынимают и помещают в тест-устройство. Затем добавляют реагент А из прилагающейся пластиковой капельницы. Устройство закрывают, с тем чтобы привести исследуемый образец в контакт с тест-полоской.
Результаты учитываются спустя 15 мин и интерпретируются по наличию или отсутствию визуально различимых окрашенных линий от розового до пурпурного цвета.
Положительный результат включает выявление двух окрашенных линий в зоне чтения как результата тестирования пациента, так и контрольной линии, в то время как отрицательный результат дает только одну окрашенную контрольную линию. Отсутствие окрашенной контрольной линии вне зависимости от наличия или отсутствия окрашенной линии в зоне чтения результата пациента свидетельствует о недействительности теста.
Контроль качества постановки реакции
Появление окрашенной линии от розового до пурпурного цвета в зоне контрольной линии может рассматриваться в качестве внутреннего контроля надлежащей постановки (проведения) теста. В случае наличия капиллярного потока эта линия всегда проявляется на полоске.
Исчезновение фоновой окраски конъюгата в зоне чтения результата анализа пациента предоставляет возможность осуществления отрицательного контроля процедуры постановки теста. Цвет фона в зоне чтения результата теста должен стать от слабо розового до белого в течение 15 мин после постановки и не должен мешать чтению результата теста.
Негативный (отрицательный) образец дает одну окрашенную линию от розового до пурпурного цвета. Эта контрольная окрашенная линия расположена в верхней половине окна чтения результатов, указывая Образец на предположительно отрицательный результат. Наличие этой контрольной линии свидетельствует о том, что процедура постановки теста прошла корректно (правильно), но антиген L. pneumophila серогруппы 1 не был обнаружен.
Положительный образец дает две окрашенные линии от розового до пурпурного цвета. Это значит, что антиген был выявлен. Исследуемые образцы с низкими уровнями антигена могут давать слабо окрашенную линию в области чтения результата образца. Любая видимая линия в этой зоне свидетельствует о положительном результате теста.
В случае отсутствия видимых линий или при наличии одной видимой линии в зоне чтения результата образца результат теста считается недействительным. Недействительный тест должен быть повторен.
8. Обработка результатов
Рекомендуемое заключение по результату.
Положительный результат на наличие антигена L. pneumophila серогруппы 1 в моче позволяет сделать вывод о наличии текущей или недавно перенесенной инфекции, вызванной данным возбудителем.
Отрицательный результат на наличие антигена L. pneumophila серогруппы 1 в моче позволяет сделать вывод об отсутствии недавней или текущей инфекции, вызванной L. pneumophila серогруппы 1.
Отрицательный результат теста не исключает возможность инфекции, вызванной другими серогруппами L. pneumophila или другими видами Legionella species. Хотя практически все крупные эпидемические вспышки внебольничных пневмоний легионеллезной этиологии и около 90 % спорадических случаев легионеллеза вызваны Legionella pneumophila серогруппы 1, при отрицательных результатах теста следует применить бактериологический метод или ПЦР для исследования отделяемого респираторного тракта, бронхоскопии или биопсии больных. При нозокомиальном (внутрибольничном) легионеллезе вероятность этиологической роли других серогрупп Legionella pneumophila и других видов Legionella species повышается.
9. Требования безопасности
10. Нормативные ссылки
2. Постановление Правительства Российской Федерации от 24 июня 2000 г. № 554 «Об утверждении положения о государственной санитарно-эпидемиологической службе Российской Федерации и Положения о государственном санитарно-эпидемиологическом нормированию).
7. European Guidelines for Control and Prevention of Travel associated Legionnaires Disease, 2002.
8. Legionella and the prevention of Legionellosis. WHO guidelines. 2007.
Читайте также:
