Как исследуют материал на сибирскую язву

Цель занятия: изучить методы диагностики сибирской язвы. Материалы и оборудование: световой микроскоп, вакцина против сибирской язвы.

Место проведения занятия: лаборатория кафедры эпизоотологии.

Сибирская язва — остропротекающая болезнь сельскохозяйственных животных многих видов. Болеет и человек. Возбудитель — Bacillus anthracis.

При постановке диагноза на сибирскую язву используют весь комплекс диагностических методов — эпизоотологический анализ, клинические, патологоанатомические и лабораторные исследования.

Общий принцип эпизоотологического анализа, или обследовав ния, хозяйства изложен в занятии 6. Возбудитель сибирской язвы может распространяться через секреты и экскреты больных животных, продукты убоя, трупы, а также посредством кровососущих насекомых. Особенно опасны места захоронения трупов животных и стоячие водоемы.

Если болезнь возникла в период стойлового содержания животных, выясняют условия их кормления и происхождение кормов (споры сибирской язвы могут быть занесены с корнеплодами, сеном и мясокостной мукой); если в пастбищный период — обследуют участки, где паслись животные. Необходимо выяснить, велись ли вблизи фермы или пастбищ земляные работы, и собрать сведения за предельно большой срок о случаях появления сибирской язвы в данной местности.

Клиническое обследование животных начинают с измерения температуры тела (при сибирской язве она повышена). Болезнь выражается также отказом от корма, резким припуханием лимфатических узлов, отеком подчелюстного пространства, у дойных коров — Маститом. У свиней обнаруживают разлитую отечность тестоватой Консистенции в подчелюстном пространстве.

При патологоанатомическом исследовании отмечают характерные для сибирской язвы признаки: отсутствие трупного окоченения, сильное вздутие трупа, отеки в подкожной клетчатке, пенисто-кровянистые истечения из естественных отверстий, синюшную окраску видимых слизистых оболочек и кровоизлияния на них. Однако следует иметь в виду, что весь комплекс указанных изменений наблюдают не всегда, поэтому окончательный диагноз устанавливают только после лабораторного исследования.

Лабораторная диагностика при сибирской язве включает в себя микроскопию мазков из исходного патологического материала, выделение чистой культуры посевом на питательные среды, биопробу. При необходимости ставят реакцию преципитации, идентифицируют выделенные культуры культурально-биохимическими методами.

Для исследования на сибирскую язву в лабораторию направляют ухо, перевязанное у основания, или мазок крови, взятой из надреза уха; от трупов свиней — участки отечной соединительной ткани и заглоточные, а также другие лимфатические узлы с характерными патологоанатомическими изменениями. Если подозрение на сибирскую язву возникло при вскрытии трупа животного (кроме трупов свиней), вскрытие прекращают и на исследование направляют часть селезенки.

Мазки микроскопируют немедленно, результаты срочно сообщают в хозяйство, направившее материал. Мазки фиксируют этиловым спиртом с добавлением 3 % пероксида водорода, окрашивают по Граму, на капсулы — по методу Ребигера, Михина, Ольта или Романовского— Гимзы и на споры — по методу Пешкова, Ауески, Трихинелье и Златогорова. Если в лаборатории есть люминесцирующие сыворотки, используют метод флюоресцирующих антител.

Посевы из исходного материала делают в МПБ и на МПА или в бульон и на агар Хоттингера. Посевы инкубируют 18…24 ч при температуре 37 °С, при отсутствии роста выдерживают при той же температуре еще 48 ч.

После суточного роста сибиреязвенных бактерий МПБ остается прозрачным, на дне образуется рыхлый осадок, напоминающий комок ваты. При встряхивании пробирки бульон не мутнеет, осадок разбивается на мелкие хлопья. Мазки из бульонной культуры окрашивают по Граму и исследуют под микроскопом. В мазках обнаруживают цепочки, состоящие из сибиреязвенных палочек.

На плотных питательных средах возбудитель сибирской язвы образует плоские матово-серые шероховатые колонии. Центр колоний затемнен, периферия бахромчатая, с локонообразными отростками.

Для биопробы используют лабораторных животных, восприимчивых к сибирской язве: белых мышей, кроликов, морских свинок. Исследуемый материал суспендируют в небольшом объеме 0,9%-го раствора хлорида натрия, вводят двум белым мышам в дозе 0,2…0,5 мл под кожу спины ближе к корню хвоста или 0,5…1,0 мл двум морским свинкам подкожно в область живота. За животными, зараженными суспензией из исходного материала или культурой возбудителя, наблюдают в течение 10 сут. Зараженные животные гибнут через 1…3 сут, иногда позже. Трупы вскрывают, делают мазки и посевы на питательные среды из крови сердца, селезенки, печени, а также инфильтрата, образовавшегося на месте инъекции исследуемого материала.

Сроки исследований: микроскопического — в день поступления материала, бактериологического—до 3 сут, биологического (биопроба) — 10 сут.

Кожевенное сырье на сибирскую язву исследуют в реакции преципитации (РП). Перед ее постановкой свежий патологический материал предварительно выдерживают в термостате в течение 18…20 ч, несвежий сразу экстрагируют горячим или холодным способом. При этом следует учитывать, что в экстрактах, полученных горячим способом, меньше преципитиногенов.

При горячем способе экстрагирования кусочки исследуемого материала (1…2г) помещают в пробирку или колбу, заливают 0,9%-м раствором хлорида натрия в соотношении 1 : 10 и кипятят 30…40 мин на водяной бане. При холодном кусочки материала (1…2г) растирают в ступке с песком, переносят в колбу или баночку, заливают 0,9%-м фенолизированным раствором хлорида натрия в соотношении 1 : 10 и оставляют на 16…18 ч при температуре 20 ± 2 °С.

Полученные экстракты фильтруют через асбестовую вату до ‘ прозрачности, при этом первые капли фильтрата удаляют.

РП ставят методом наслаивания или подслаивания.

При наслаивании в уленгутовскую пробирку наливают 0,2…0,3 мл прозрачной преципитирующей сибиреязвенной сыворотки, затем осторожно наслаивают равное количество экстракта так, чтобы между. Компонентами образовалась ясно выраженная граница (тонкая прямая линия). При подслаивании в уленгутовскую пробирку сначала вносят 0,2…0,3 мл экстракта, затем под него осторожно пастеровской пипеткой подслаивают равное количество преципитирующей сыворотки.

Если при соединении компонентов резко выраженная граница между ними отсутствует, опыт повторяют. Одновременно ставят контроль преципитируюшей сибиреязвенной сыворотки со стандартным сибиреязвенным антигеном: при положительной реакции в течение 1…2 мин после соединения компонентов появляется характерное кольцо.

РП считают положительной, если через 1…2 мин и не позже чем через 15 мин на границе между компонентами появилось тонкое беловатое кольцо.

При отрицательном результате РП с экстрактом, полученным горячим способом, опыт повторяют с экстрактом, полученным холодным способом.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

1. Приготовить мазки из вакцинного штамма и промикроскопировать их.

2. Разработать схему дифференциальной диагностики сибирской язвы от коликов, тимпании, отравления.

Общие сведения

Эта грозная инфекция, которую вызывает бактерия Bacillus anthracis, поражает животных и человека. Течение болезни может быть разным, но у человека она протекает, как правило, в карбункулезной форме. Характерными симптомами сибирской язвы является интоксикация, серозно-геморрагические воспалительные проявления на кожных покровах, во внутренних органах и лимфатических узлах. Болезнь протекает в кожной и септической формах.

О том, как передается заболевание, его характерные симптомы и лечение описаны в этой статье.

Патогенез сибирской язвы

Фото больных сибирской язвой

Впервые возбудитель сибирской язвы — бацилла Bacillus anthracis — был описан в середине девятнадцатого века. В 1876 году немецкий микробиолог Роберт Кох выделил его в чистой культуре.

Микробиология возбудителя: Bacillus anthracis – это крупная грамположительная палочка. Возбудитель хорошо развивается на мясопептонных средах, может выделять экзотоксин. Эта бактерия демонстрирует высокую устойчивость к высокой температуре и дезинфицирующим веществам. Споры бактерии могут сохраняться много лет. Вегетативные формы палочки гибнут, если их прокипятить или воздействовать на них дезинфектантами.

Ворота для инфицирования – поврежденные кожные покровы, но в редких случаях инфекция может попадать в организм через слизистые дыхательных путей и ЖКТ. Как правило, возбудитель у человека внедряется в кожу рук и головы, в более редких случаях – туловища и ног. Поражаются в основном открытые участки кожаных покровов.

В патогенезе болезни важную роль играет влияние токсинов, которые образует возбудитель. После заражения возбудитель начинает размножаться в коже уже через несколько часов. Возбудители образуют капсулы, выделяя экзотоксин, который провоцирует развитие плотного отека и некроза. На том месте, где возбудитель внедрился в кожу, развивается сибиреязвенный карбункул. Это серозно-геморрагическое воспаление с некрозом, вокруг которого отекают ткани и отмечается регионарный лимфаденит. Местные патологические изменения развиваются под влиянием экзотоксина сибиреязвенной палочки, который приводит к существенным нарушениям микроциркуляции, отеку ткани и коагуляционному некрозу.

На первой стадии инфекции происходит локализованное поражение регионарных лимфатических узлов. Возбудители достигают регионарных лимфатических узлов по лимфатическим сосудам. Далее может происходить генерализация процесса: патогены распространяются гематогенным путем по разным органам.

При кожной форме болезни генерализация инфекции, при которой происходит прорыв возбудителей сибирской язвы в кровь и развитие септической формы, развивается очень редко. Как правило, сепсис развивается, когда возбудитель внедряется через слизистые ЖКТ и оболочки дыхательных путей. В таком случае генерализация процесса происходит как следствие нарушения барьерной функции трахеобронхиальных или мезентериальных лимфатических узлов. Вследствие токсинемии и бактериемии может развиться инфекционно-токсический шок.

Если происходит аэрогенное заражение, то споры фагоцитируются альвеолярными макрофагами. После этого они попадают в медиастенальные лимфоузлы. Там, где возбудитель размножается и накапливается, лимфатические узлы средостения некротизируются. Следствием этого процесса является геморрагический медиастенит и бактериемия. В свою очередь, бактериемия приводит к вторичной геморрагической сибиреязвенной пневмонии.

Если человек потребляет зараженное мясо, споры попадают в подслизистую оболочку, а также в регионарные лимфатические узлы. В таком случае человек заболевает кишечной формой болезни. При этой форме возбудитель тоже попадает в кровь, и болезнь переходит в септическую форму. Соответственно, в септическую может перейти любая форма болезни.

Перенесенное заболевание оставляет после себя стойкий иммунитет, хотя и имеются описания повторных заболеваний через 10-20 лет после первого заболевания.

Фото сибирской язвы у животных

Болезнь передается, когда человек контактирует с кожей и шерстью больного животного, а также при употреблении зараженного мяса.

К заражению человека приводит сибирская язва у животных. Основным ее источником являются травоядные животные, в частности крупный и мелкий рогатый скот. Заражение животных происходит, когда они едят зараженный корм или пьют зараженную воду.

В свою очередь, чаще всего инфицируются те люди, которые работают с животными и продуктами животного происхождения. От человека к человеку сибирская язва не передается.

Известны следующие пути передачи сибирской язвы:

• Контактный – через поврежденные кожные покровы или слизистые, когда человек ухаживает за животными, обрабатывает туши, хоронит больных животных в скотомогильники и т. п. Также заражение может произойти при земляных работах в местах, зараженных спорами.
• Алиментарный – при приготовлении и потреблении пищи из мяса больных животных.
• Воздушно-пылевой – при вдыхании спор.
• Трансмиссивный – через укусы насекомых.

Инкубационный период может длиться от пары часов до восьми дней. Но в большинстве случаев его продолжительность — 2-3 дня.

Вспышки заболевания фиксируются и в настоящее время. Так, несколько лет назад произошла вспышка сибирской язвы в Казахстане — болезнь подтвердилась у жителей поселка Актогай. Позже в Казахстане также фиксировались вспышки болезни. В 2016 году произошла вспышка сибирской язвы на Ямале (Ямало-Ненецкий автономный округ), где погибло более двух тысяч животных. Более подробно о вспышках можно прочитать в тематических статьях и рефератах.

Классификация

Сибирскую язву подразделяют на две разновидности – кожную и общую (генерализованную). В свою очередь, каждая их этих разновидностей имеет еще несколько форм.

Выделяют три вида кожной формы болезни:

• Карбункулезная – проявления на коже меняются от красных пятен до узелков, а дальше – до темных язв. Больного беспокоит слабость, озноб, лихорадка.
• Эдематозная – в первые дни болезни на коже появляется большой отек. Позже наблюдается струп, вокруг которого краснеет кожа.
• Буллезная – болезнь начинается с появления пузырей на коже. Позже они лопаются, вследствие чего развиваются обширные язвы. Позже на их дне появляется характерная черная корка.

Общая (генерализованная) форма подразделяется на три вида:

• Легочная – поражаются органы дыхания. При такой форме болезни прогноз чаще всего неблагоприятный.
• Кишечная – протекает очень тяжело, отмечаются признаки поражения ЖКТ и общая интоксикация. Высокий риск летального исхода, даже если больному обеспечено адекватное лечение.
• Септическая – иногда развивается сразу, иногда – в качестве осложнений других форм. Отмечается общая интоксикация, кровотечения во внутренних органах. Часто происходит воспаление оболочек мозга и отказ внутренних органов.

Причины

Заражение происходит от сельскохозяйственных животных. Чаще всего человек заболевает, заразившись при уходе за животными, во время забоя, обработки зараженных туш и при других действиях.

Реже заражение происходит при потреблении мяса больных животных.

Также возможно заражение во время вдыхания зараженного воздуха – в лабораториях и в других условиях. Раньше люди заражались сибирской язвой на предприятиях, где обрабатывали шерсть.

Симптомы сибирской язвы у человека

Фото симптомов сибирской язвы у человека

Инкубационный период, как правило, составляет 2-3 дня. Признаки болезни зависят от ее формы.

При кожной форме болезни, которая развивается в 98% случаев, поражаются открытые части тела. Чаще всего встречается карбункулезная разновидность. Тяжелее всего болезнь протекает, если карбункулы локализуются на голове, слизистых рта и носа, на шее.

Как правило, появляется один карбункул, но в некоторых случаях развивается больше таких поражений – в сложных случаях до 20. На том месте, где инфекция попала в организм, сначала появляется красное пятно диаметром 1-3 мм, красно-синего оттенка. Оно похоже на укус насекомого. Через несколько часов на месте пятна развивается папула медно-красного оттенка. В это время беспокоит ощущение зуда и жжения. Примерно через день или немного раньше на месте папулы появляется пузырек с жидкостью. Она становится кровянистой. Когда больной чешется, пузырек лопается, иногда это происходит и самопроизвольно. На этом месте образуется язва, с приподнятыми краями, темным дном. Из нее отделяется серозно-геморрагическая жидкость. Язва постепенно увеличивается, и через сутки ее диаметр уже может достигать 15 мм. Вследствие некроза через 1-2 недели в центре язвы появляется черный плотный струп, похожий на уголь. Через 2-3 недели струп отделяется и на месте поражения появляется рубец.

Кроме кожных проявлений после заражения у больного отмечаются также общие симптомы:

• Повышение температуры – беспокоит озноб, температура держится 5-6 дней.
• Слабость.
• Головные боли.
• Боли в пояснице ломящего характера.

При генерализированной форме болезни симптомы зависят от ее разновидности. Но встречается эта форма сибирской язвы очень редко.

При легочной форме поражаются органы дыхания. Вследствие воспалительного процесса в легких развиваются нарушения в функции сердечно-сосудистой системы. Развивается сердечно-сосудистая недостаточность. У больного наблюдаются симптомы тяжелого воспаления легких. Это состояние опасно для жизни.

При кишечной форме отмечается тяжелое течение процесса. Отмечается лихорадка и озноб, головные боли, головокружение. Также развиваются признаки поражения ЖКТ – тошнота, рвота с кровью, сильные боли в животе, понос с кровью. Риск летального исхода при таком состоянии очень высок.

При септической форме вследствие интоксикации организма повышается температура тела, беспокоит боль в разных органах тела. На коже появляются кровоподтеки, во внутренних органах — множественные кровотечения. Развивается воспаление мозговых оболочек, отказывают внутренние органы. Падает давление, нарушается деятельность сердца. В мокроте и крови обнаруживается много сибиреязвенных бактерий. Вследствие кровотечений, перитонита и отека головного мозга летальный исход возможен уже в первые дни болезни.

Анализы и диагностика

При подозрении на сибирскую язву врачи применяют определенный алгоритм диагностики, основываясь на лабораторных и клинико-эпидемиологических данных. Изначально врач анализирует жалобы, оценивая порядок их появления. Также в процессе диагностики важен эпидемиологический анамнез – оценка контакта с зараженными животными, а также контактов с другими людьми после заражения.

Проводится общий внешний осмотр, в процессе которого врач определяет наличие внешних признаков болезни, проводит пальпацию и перкуссию для выявления нарушений внутренних органов.

В процессе исследования используют следующие лабораторные методы:

• бактериоскопический;
• бактериологический;
• иммунофлюоресцентный (для ранней диагностики).

Также может использоваться аллергологическая диагностика, которая дает возможность получить положительный результат после пятого дня болезни.

Для лабораторных исследований материал берут из карбункулов, а при общей форме исследуют кровь, мокроту, рвотные массы, кал.

При комплексной диагностике применяют сибиреязвенный аллерген — антраксин.

Лечение сибирской язвы

Очень важно начать лечение сибирской язвы как можно раньше, так как при задержке с адекватной терапией при генерализированной форме болезни увеличивается риск летального исхода.

Исследование на сибирскую язву включает микроскопию мазков из исходного материала, высевы на питательные среды, постановку тестов идентификации, метод флюоресцирующих антител, ПЦР (полимеразно-цепную реакцию), постановку биопробы и, при необходимости, реакции преципитации. У человека, кроме того, необходима постановка клинической кожно-аллергической пробы с сибиреязвенным аллергеном антраксином.

а) Взятие материала от животных. Для бактериологического исследования в лабораторию направляют ухо или мазок крови, полученный из надреза уха. Ухо отрезают с той стороны, на которой лежит труп. Предварительно его туго перевязывают шпагатом у основания в двух местах и отрезают между лигатурами. Место отреза уха на трупе прижигают. Отрезанное ухо заворачивают в пергаментную бумагу, смоченную в дезинфицирующем растворе. Если подозрение на сибирскую язву возникло при вскрытии трупа животного, вскрытие прекращают и на исследование направляют часть селезенки, от трупов свиней — участки отечной соединительной ткани, заглоточные, подчелюстные, а также другие лимфатические узлы.

б) Взятие материала от человека. Для бактериологического исследования забор материала у больных должен производиться по возможности до начала лечения. При кожной форме заболевания необходимо осторожно обработать спиртом кожу вокруг пораженного места и поверхность карбункула. Затем содержимое везикулы отсасывают стерильным шприцем, отделяемое язвы снимают с поверхности стерильным тампоном, смоченным физиологическим раствором, фрагменты отторгнутого струпа снимают влажным тампоном или пинцетом. При всех формах заболевания берут кровь в объеме 1-2 мл из вены. 1-2 капли крови непосредственно у постели больного засевают на питательные среды (агар и бульон Хоттингера, pH 7,2-7,5). При висцеральных формах сибирской язвы и менингите отбирают спинномозговую жидкость в количестве 0,5 мл в стерильную пробирку.

При подозрении на ингаляционное заражение исследуют также мазки из полости носа. Их берут сухими стерильными ватными тампонами на зондах. Тампон вводят легким движением по наружной стенке полости носа на глубину 2-3 см до нижней раковины. Затем его слегка опускают книзу, вводят в нижний носовой ход под нижнюю раковину, делают вращательное движение и удаляют вдоль наружной стенки носа. После забора материала тампон (рабочую часть зонда с ватным тампоном) помещают в стерильную одноразовую пробирку с физиологическим раствором. Погрузив рабочую часть зонда в физраствор, вращают зонд в течение 10-15 с, избегая разбрызгивания раствора. Вынимают зонд из раствора, прижимая его к стенке пробирки, и, отжав избыток жидкости, удаляют зонд и закрывают пробирку.

Для исследования методом ПЦР забор крови проводят натощак из локтевой вены одноразовой иглой (диаметр 0,8-1,1 мм) в одноразовый шприц объемом 5 мл или в стеклянную пробирку без антикоагулянта. При заборе в шприц кровь из него аккуратно (без образования пены) переносят в одноразовую стеклянную пробирку. Содержимое везикул, карбункулов в объеме 0,1-0,3 мл и фрагменты струпов массой 10,0-100,0 мг помещают в микропробирки с закручивающимися крышками или пробирки объемом 1,5 мл с защелкой, содержащие 0,1-0,2 мл транспортной среды. Спинномозговую жидкость после пункции одноразовой пункционной иглой отбирают в количестве 0,5 мл в стерильную пробирку типа Эппендорф с завинчивающейся крышкой или пробирку объемом 1,5 мл с защелкой.

Транспортирование материала для исследования методом ПЦР осуществляют в специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом при температуре 2-8°С в течение 6 ч (кровь — в течение 1 сут., плазму и сыворотку — в течение 3 сут.), в замороженном виде — в течение 1 сут. Недопустимо замораживание образцов цельной крови.

в) Взятие материала из сырья животного происхождения и из объектов внешней среды проводится в тех случаях, когда необходимо установить источник инфекции или фактор передачи для выявления обсемененности спорами возбудителя сибирской язвы отдельных объектов, а также в целях обнаружения микроба в местах старых скотомогильников при проведении строительных, мелиоративных, гидротехнических и других работ, связанных с выемкой и перемещением грунта.

г) Отбор проб шерсти. Для исследования шерсть отбирают из разных мест не менее 5 образцов массой около 2 г каждый (лучше брать пучки загрязненной шерсти). Если шерсть упакована в кипы, берут не менее 10 образцов из разных мест каждой кипы, а также скопившуюся внутри обшивки пыль. Образцы от одной кипы объединяют и упаковывают вместе.

д) Отбор проб кожи. Берут кусочки кожи размером 3x3 см с периферических участков шкурок. При наличии на внутренней стороне шкурки кровоподтеков или инфильтратов пробы берут и в этих местах.

е) Отбор проб почвы. Пробы почвы с мест вероятного обсеменения спорами возбудителя (мест вынужденного убоя скота, стоянок и водопоя животных) берут на глубине до 15 см, на территории скотомогильников — на глубине до 2 м при помощи почвенных буров.

ж) Смывы с объектов внешней среды. Смывы делают с мест наиболее вероятного обсеменения спорами возбудителя при помощи стерильного тампона, смоченного стерильной водой. Площадь смыва одним тампоном — около 100 см 2 . Тампоны затем помещают в пробирки, заливают стерильной водой (5 мл) и закрывают пробкой.

Отбор проб для исследования методом ПЦР осуществляется аналогично.

В сопроводительном документе к пробам указывают причину проведения исследования, какой материал и в каком количестве направляют, место и дату отбора материала; для проб шерсти и кормов дополнительно указывают происхождение, объем партии, вид упаковки и количество упаковочных единиц. К сопроводительному документу прилагают опись проб и место каждой пробы.

и) Подготовка проб к бактериологическому исследованию. Кусочки органов и тканей от трупов помещают в ступку, измельчают ножницами или пестиком, затем заливают 1-5 мл физиологического раствора, суспензию через марлевый тампон набирают в шприц или пастеровскую пипетку и переносят в пробирку или колбочку.

Воду с илистыми частицами фильтруют через 2 слоя марли, чистую воду исследуют без предварительной подготовки. С целью концентрирования микробов пробы воды можно профильтровать через мембранные фильтры (№3). Осадок с каждого фильтра соскабливают скальпелем, затем смывают 1-2 мл физиологического раствора и эту взвесь используют для исследования.

Тампоны, которыми делают смывы с объектов внешней среды, отжимают о стенки пробирки и удаляют, а оставшуюся жидкость подвергают исследованию.

Пробы почвы освобождают от корней, камешков и тщательно перемешивают. От каждой пробы берут 90-100 г почвы, помещают в колбу, заливают физиологическим раствором или дистиллированной водой из расчета получения 15-20 мл суспензии. Колбу закрывают, тщательно встряхивают в течение 25 мин, дают отстояться 1-2 мин и надосадочную жидкость переносят в пробирку для дальнейшего исследования. Пробы пищевых продуктов или кормов готовят аналогично.

Для проб из шкур кусочки массой 1 г помещают в фарфоровую ступку и заливают 1-2 мл физиологического раствора. Кусочки измельчают ножницами и оставляют при 20°С на 2-3 ч для размягчения материала. После этого пробы хорошо растирают пестиком в той же жидкости до получения волокнистой мезги, затем мезгу удаляют, предварительно отжав ее пестиком на внутренней боковой поверхности ступки.

От каждой пробы шерсти отбирают наиболее загрязненные части, измельчают ножницами, вместе с пылью помещают в колбу и заливают физиологическим раствором. Колбу закрывают, тщательно встряхивают в течение 10 мин, от грубых частиц можно освободиться путем фильтрации через 2-3 слоя марли.

Для избавления от посторонней микрофлоры пробы из объектов внешней среды, шерсти и кожи, пищевых продуктов подвергаются термической обработке на водяной бане при 80°С в течение 20 мин. Пробы от больного человека и животного из патологического материала, мяса животных и пр., где возбудитель сибирской язвы находится в вегетативной форме, не прогревают.

к) Предварительная обработка проб для исследования при помощи ПЦР. Для получения сыворотки пробирки с кровью отстаивают при комнатной температуре в течение 30 мин до полного образования сгустка. После этого сгусток обводят пастеровской пипеткой и оставляют при комнатной температуре до образования сыворотки. Затем сыворотку в объеме 1 мл переносят отдельными наконечниками с аэрозольным барьером или пастеровскими пипетками в стерильные пробирки объемом 1,5 мл. Сыворотка, содержимое везикул, отделяемое язв, фрагменты отторгнутого струпа, мазки из полости носа и спинномозговая жидкость не требуют предварительной обработки. Воду, смывы с объектов внешней среды, пробы почвы, пищевых продуктов или кормов, шкур, шерсти предварительно обрабатывают так же, как для бактериологического исследования, отбирая для исследования методом ПЦР 0,1-0,2 мл водной фазы образцов.

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 20.12.2019

Глава 30. Возбудитель сибирской язвы

Возбудитель сибирской язвы Bacillus anthracis включен в семейство Bacillaceae, род Bacillus. Название болезни - "углевик" дано русским врачом Андриевским, который в конце XVIII века изучал это заболевание в Сибири во время большой эпизоотии среди коров.

Возбудитель сибирской язвы был открыт Паллендером в 1849 г. Большой вклад в изучение этого заболевания внесли Р. Кох, Л. Пастер и Л. С. Ценковский.

Морфология. Возбудители сибирской язвы - крупные палочки 6-8 × 1-1,5 мкм с обрубленными или несколько вогнутыми концами. Грамположительны. В организме они располагаются попарно или в виде коротких цепочек. На питательных средах встречаются длинные цепочки. Бациллы сибирской язвы неподвижны. В организме образуют капсулу, окружающую одну, две особи или всю цепочку. Бациллы сибирской язвы образуют споры овальной формы, расположенные в центре и не превышающие поперечника микробной клетки. Спорообразование лучше всего происходит при доступе кислорода и температуре 30-40° С. При температуре выше 43° С и ниже 15° С спорообразование прекращается. В период образования спор цитоплазма клетки почти полностью лизируется, клеточная стенка разрывается и спора выходит наружу (рис. 47).

Рис. 47. Морфологические и культуральные свойства возбудителя сибирской язвы (Bacillus anthracis). а - В. anthracis (в крови мыши); б - образование капсул; в - споры; г - рост колонии; д - рост культуры на МПБ; е - рост культуры на желатине

Культивирование. Возбудители сибирской язвы - факультативные анаэробы. Неприхотливы. Растут при температуре 35-38° С и рН среды 7,2-7,6. На МПА образуют крупные колонии с неровными бахромчатыми краями (R-форма). От края колонии отходят пучки нитей. Вид колоний напоминает голову медузы или львиную гриву. R-форма является характерной для вирулентных штаммов сибиреязвенных бацилл. В старых культурах появляются гладкие S-формы колоний - не вирулентные.

В бульоне рост сибиреязвенных бацилл характеризуется придонным ростом. На дне пробирки образуется осадок в виде комка ваты, при этом среда остается прозрачной.

При посеве на 10-12% желатин после 2-3-дневной инкубации появляется рост по ходу укола в виде белых тяжей, уменьшающихся книзу (вид опрокинутой елочки).

При посеве возбудителей на МПА с пенициллином (на пластинчатом агаре) наблюдается распад бацилл на шары, цепь из которых напоминает жемчужное ожерелье. Характер роста на средах имеет диагностическое значение (см. рис. 47).

Ферментативные свойства. Сибиреязвенные бациллы обладают выраженной ферментативной активностью. Сахаролитические свойства: расщепляют глюкозу, лактозу, мальтозу, левулезу и другие сахара до образования кислоты.

Протеолитические свойства выражаются в пептонизации молока, разжижении желатина, свертывании молока (медленно). Они образуют сероводород и аммиак, переводят нитраты в нитриты, гидролизируют крахмал и т. д. Не гемолизируют эритроциты, чем отличаются от Вантракоида. Лизируются противосибиреязвенным фагом. Сибиреязвенные бациллы образуют ферменты: диастазу, пероксидазу, липазу.

Токсинообразование. В. anthracis образует токсин - протеиновый комплекс, содержащий отечный и летальные факторы. Этот токсин называют "мышиный токсин" (ввиду высокой чувствительности мышей). Большая роль в вирулентности сибиреязвенных бацилл принадлежит капсуле, которая связана с токсическим веществом.

Антигенная структура. Бациллы сибирской язвы содержат два антигена: 1) соматический (полисахаридный), который находится в клеточной стенке микроба. Термоустойчив. Против этого антигена антитела не продуцируются. Этот антиген длительно сохраняется в культурах и трупном материале. На его обнаружении основана реакция преципитации Асколи; 2) капсульный (протеиновый) антиген, обусловливающий антифагоцитарное действие.

Находясь в организме или на средах, содержащих экстракты тканей, бациллы сибирской язвы вырабатывают протективный термолабильный антиген, который является атоксичным, но обладает иммунизирующей способностью.

У сибиреязвенных бацилл имеется общий антиген с антракоидом и другими спорообразующими сапрофитами (В subtilis, B. cereus и др.).

Устойчивость к факторам окружающей среды. Вегетативные формы возбудителей сибирской язвы малоустойчивы. При 100° С они погибают мгновенно, температура 55-60° С губит их через 30-40 мин. Обычные концентрации дезинфицирующих растворов убивают их через несколько минут. Капсулы сибиреязвенных бацилл обладают большой устойчивостью. При исследовании трупов животных, подвергнутых действию гнилостной микрофлоры, можно обнаружить пустые капсулы (тени). Споры устойчивы: они выдерживают кипячение на протяжении 15-20 мин. Автоклавирование (120° С) убивает их через 20 мин. К низким температурам не чувствительны. В сухом состоянии сохраняются до 30 лет, в почве - десятилетия.

Обычные растворы дезинфицирующих веществ губят их через 2-3 сут (табл. 46).

Таблица 46. Свойства возбудителей сибирской язвы

Примечание. B. anthracoides обладают слабой подвижностью, вызывают гемолиз эритроцитов, непатогенны для морских свинок.

Восприимчивость животных. К сибиреязвенным бациллам чувствительны коровы, овцы, лошади, олени, свиньи. Заражаются они друг от друга пищевым путем, поглощая с кормом споры возбудителя.

Из лабораторных животных наиболее восприимчивы белые мыши, морские свинки, кролики. Эти животные после заражения погибают через 2-4 сут от септицемии. На месте введения наблюдаются отек и гиперемия. Кровь у погибших животных густая и темно-красного цвета, так как сибиреязвенные бациллы обладают антикоагулирующим действием.

Источники заболевания. Больные животные.

Пути передачи. Контактно-бытовой, воздушно-пыльевой, пищевой (при использовании продуктов, зараженных бациллами сибирской язвы).

Человек от человека обычно не заражается, тем не менее при заболевании человека сибирской язвой принимаются все необходимые меры предосторожности.

Патогенез. Входными воротами являются кожа и слизистые оболочки дыхательных путей и пищеварительного тракта. В зависимости от локализации различают кожную, легочную и кишечную формы. Каждая форма может генерализоваться.

Кожная форма - в месте проникновения появляется покраснение, переходящее в папулу (зудящую). Папула медно-красного цвета переходит в везикулу с серозно-геморрагическим содержимым, после подсыхания образуется черный струп (углевик).

Легочная форма - развивается специфическая пневмония, протекающая по типу отека легких. Обычно заканчивается летально.

Кишечная форма - все вышеописанные явления развиваются в слизистой кишечника. Обычно заканчивается летально.

Иммунитет. Довольно стойкий, антимикробный и антитоксический. Зависит от образования протективных антител. Большая роль принадлежит фагоцитарной реакции. В сыворотке переболевших сибирской язвой обнаруживаются антитела, разрушающие капсульную субстанцию бацилл.

При сибирской язве развивается гиперчувствительность, регистрируемая в аллергической пробе с антраксином.

Профилактика. Все мероприятия по предупреждению сибирской язвы проводят совместно с ветеринарной службой Они предусматривают своевременное выявление, изоляцию больных животных, тщательную дезинфекцию территории.

Специфическая профилактика. В настоящее время используют вакцину СТИ, которая была изготовлена в 1942 г. Н. Н. Гинсбургом из бескапсульной культуры. Вакцинируют обычно людей, которые по характеру своей работы связаны с сельскохозяйственными животными. Для экстренной профилактики (людям, контактировавшим с больными) вводят противосибиреязвенный иммуноглобулин и антибиотики.

Лечение. Противосибиреязвенный иммуноглобулин, антибиотики: пенициллин, стрептомицин, тетрациклин.

1. Опишите морфологию возбудителя сибирской язвы.

2. Опишите культуральные свойства и какая форма: S или R является вирулентной?

3. Какими свойствами обладает сибиреязвенный токсин?

4. Пути передачи и формы заболевания сибирской язвой.

5. Какие факторы обусловливают иммунитет при сибирской язве.

Цель исследования: выявление возбудителей сибирской язвы и дифференциация его от антракоида, выявление антигенов возбудителя.

Работа с возбудителем сибирской язвы проводится в строго режимных условиях!

1. Содержимое везикул, карбункула, отторгнутый струп (кожная форма).

2. Мокрота (легочная форма).

3. Испражнения (кишечная форма).

4. Кровь (септическая форма).

5. Почва, шерсть животных (для постановки реакции Асколи).

Способы сбора материала

5. Реакция преципитации Асколи.

Первый день исследования

1. Посевы вынимают из термостата. Изучают рост на плотной и жидкой питательной среде. Колонии на плотной питательной среде изучают под микроскопом при малом увеличении. При наличии подозрительных колоний выделяют чистую культуру на скошенный МПА. Посевы инкубируют в термостате.

2. Из бульонной культуры (рост в виде комка ваты на дне, бульон прозрачный) делают висячую каплю (для установления неподвижности - дифференциации от антракойда).

3. Ставят тест "жемчужного ожерелья" (ускоренный метод исследования). С этой целью к бульону Хоттингера добавляют 30% инактивированной лошадиной сыворотки и пенициллин из расчета 0,5 ЕД на 1 мл бульона. Приготовленную среду разливают в пробирки по 2-3 мл и в каждую вносят 2 капли исследуемой бульонной культуры. Посевы инкубируют в термостате 3 ч при температуре 37° С. Затем вынимают их из термостата. Из каждой пробирки делают 2-3 мазка, высушивают на воздухе и фиксируют в жидкости Карнуа (6 частей этилового спирта + 3 части хлороформа + 1 часть ледяной уксусной кислоты). Фиксацию проводят до полного испарения жидкости. Полученные мазки окрашивают метиленовым синим и микроскопируют.

В мазках сибиоеязвенные бациллы обнаруживаются в виде цепи шаров, напоминающих жемчужное ожерелье - результат действия пенициллина.

4. Осматривают зараженных животных. Павших животных вскрывают, делают мазки и мазки-отпечатки, которые фиксируют, окрашивают и изучают под микроскопом. При наличии подозрительных палочек производят посевы на МПА и МПБ.

Вынимают посевы из термостата, делают мазки, микроскопируют. На МПА и МПБ бациллы сибирской язвы растут в виде бескапсульных особей. Производят посев на сахара, лакмусовое молоко, желатин, на чашки с 2% кровью и ставят пробу с сибиреязвенным бактериофагом. Посевы инкубируют в термостате.

Вынимают посевы из термостата и учитывают полученные результаты (см. табл. 46).

Исследование мокроты, испражнений и крови после специальной обработки ведут так же.

Для диагностики сибирской язвы используют аллергическую пробу с сибиреязвенным антигеном (антраксин). Для этого внутрикожно на внутренней поверхности предплечья вводят антраксин. Реакцию учитывают через 24-48 ч. Положительная реакция проявляется с первых дней заболевания.

Реакцию ставят для обнаружения специфического антигена бацилл сибирской язвы в шерсти животных, коже, трупах, почве и т. д.

Приготовление антигена: исследуемый материал измельчают в ступке, заливают 25-50-кратным объемом изотонического раствора натрия хлорида и кипятят (антиген термоустойчив). Полученный экстракт фильтруют через смоченную тем же раствором фильтровальную бумагу. Фильтрат-термоэкстракт - прозрачная жидкость. Для реакции используют преципитирующую сибиреязвенную сыворотку и для контроля сибиреязвенный антиген (рис. 48).

Рис. 48. Реакция Асколи. 1 - преципитирующая сыворотка + исследуемый термоэкстракт; 2 - преципитирующая сыворотка + стандартный сибиреязвенный антиген (контроль); 3 - преципитирующая сыворотка + антиген из шерсти здорового животного (чужеродный антиген); 4 - преципитирующая сыворотка + изотонический раствор хлорида натрия; 5 - нормальная сыворотка + испытуемый антиген

Постановка реакции: 1-я пробирка - преципитирующая сыворотка + исследуемый термоэкстракт;

2-я пробирка - преципитирующая сыворотка + стандартный сибиреязвенный антиген (контроль).

3-я пробирка - преципитирующая сыворотка + термоэкстракт из шерсти здорового животного (контроль).

При положительной реакции в первых двух пробирках образуется преципитационное кольцо, в третьей - кольцо отсутствует.

Реакция эта очень чувствительна (см. рис. 48).

МПА, МПБ, желатиновая среда (см. главу 7).

1. Какой материал используют для бактериологического исследования?

2. Основные методы микробиологического исследования.

3. Какие имеются ускоренные методы исследования? Как получить тест "жемчужного ожерелья?"

4. Каким методом можно выявить сибиреязвенные бациллы во внешней среде?

Нарисуйте схему лабораторного исследования сибирской язвы но дням.

Престижные индивидуалки согласны оттянуться в полный рост с вами предельно пышным отдыхом сексуального характера. Они изящные проститутки будут рады, если вы насвистите им в пустое время и посоветуйте увидеть друг друга.