Исследование на коклюш методом кашлевых пластинок алгоритм

Приложение 1
к приказу министерства здравоохранения
Нижегородской области и
Управления Нижегородской области
от 19 декабря 2012 г. N 3012/58-о

Порядок
взятия и транспортировки материала для бактериологической диагностики коклюша

1. Бактериологическое обследование с диагностической целью проводят в ранние сроки заболевания (но не позднее 3 недели) двукратно ежедневно или через день. Обследование при первичном обращении проводится до назначения лечения.

2. При госпитализации с подозрением на коклюш 2-кратное бактериологическое обследование на наличие возбудителя коклюша проводят в первые 3 дня поступления в стационар независимо от назначения антибиотиков.

3. Взятие материала может проводиться двумя способами: "кашлевыми пластинками" и заднеглоточными тампонами.

4. Забор материала заднеглоточными тампонами:

4.1. Взятие материала для исследования (носоглоточная слизь) осуществляется натощак или не ранее, чем через 2 часа после еды, а также до применения полоскания или других видов лечения.

4.2. Используются 2 заднеглоточных тампона одновременно - сухой, который сразу засевается на питательную среду, и увлажненный фосфатным буфером с углем (согласно инструкции по бактериологическому и серологическому исследованиям при коклюше и паракоклюше (1984)), который доставляется в бактериологическую лабораторию в течение 3 часов, где засевается на питательные среды.

4.3. Техника забора материала: шпателем, находящимся в левой руке, фиксируют корень языка, правой рукой вводят тампон в полость рта за корень языка, не касаясь слизистой языка, щек, миндалин. Кончиком тампона и его выпуклой частью касаются задней стенки глотки, делая два штриха справа - налево. Тампон извлекают из полости рта, также не касаясь слизистой языка, щек, миндалин.

4.4. Коммерческие транспортные среды для взятия материала на коклюш не применяются.

4.5. При заборе материала на коклюш можно использовать стерильные сухие ватные тампоны коммерческие (на деревянных палочках, не использовать дакроновые тампоны) или приготовленных # в лабораторных условиях с учетом требований инструкции по бактериологическому и серологическому исследованиям при коклюше и паракоклюше (1984). Тампоны должны иметь форму "капли", а не "веретена".

4.6. При невозможности доставки исследуемого материала в баклабораторию в установленные сроки, т.е. не позднее 3-х часов (удаленные территории, проведение обследования во второй половине дня, праздники), материал засевается на питательные среды и термостатируется при температуре 37°C до утра следующего дня, но не более 1 суток.

5. Метод "кашлевых пластинок":

5.1. Используют только с диагностической целью при наличии кашля. У детей грудного возраста взятие материала рекомендуется брать заднеглоточным тампоном.

5.2. Взятие материала "кашлевыми пластинками" производят на 2 чашки с питательной средой КУА. Во время приступа кашля левой рукой снимают крышку чашки, а правой подносят ее ко рту на расстоянии 10 - 12 см так, чтобы капельки слизи из дыхательных путей попали на поверхность среды. Чашку в таком положении держат некоторое время (в течение 6 - 8 кашлевых толчков). При непродолжительном покашливании можно эту чашку поднести повторно. На питательную среду не должны попадать слюна, рвотные массы, мокрота. Затем чашку с питательной средой закрывают крышкой и доставляют в лабораторию.

5.3. При невозможности доставки исследуемого материала в баклабораторию, материал помещается в термостат при температуре 37°C до утра следующего дня, но не более 1 суток.

6. Для обеспечения биологической безопасности и поддержания оптимальной температуры (+4°C - +37°C) в условиях термоконтейнеров осуществляется транспортировка:

- чашек с питательными средами и пробирок с увлажненными тампонами как из лаборатории к месту хранения, так и врачом к пациенту

- материал для исследования как на чашках, так и на тампонах в пробирках к месту посева.

7. В холодное время необходимо принимать меры по предотвращению замораживания материала (использование грелок).

8. В направлении материала на исследование указывается: наименование учреждения, направившего материал на исследование, фамилия, имя, отчество, возраст и домашний адрес обследуемого, причина обследования, дата заболевания, дата и время взятия материала, число обследований, наименование материала и метод его забора, подпись лица, взявшего материал.

9. Ответ при бактериологическом исследовании на коклюш выдается не ранее 5 суток.

>
Порядок взятия и транспортировки материала для ПЦР-исследования на коклюш, паракоклюш и бронхосептикоз

Содержание
Приказ Министерства здравоохранения Нижегородской области и Управления Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей.

Откройте актуальную версию документа прямо сейчас или получите полный доступ к системе ГАРАНТ на 3 дня бесплатно!

Если вы являетесь пользователем интернет-версии системы ГАРАНТ, вы можете открыть этот документ прямо сейчас или запросить по Горячей линии в системе.

Для диагностики коклюша в современное время доступно большое количество тестов и анализов, но как правильно выбрать необходимый и самый точный из них?

Итак, многие специалисты по всему миру рекомендуют:

Если кашель у подростков и взрослых длится менее двух недель, а у детей менее трёх недель то, целесообразно воспользоваться микробиологическими методами (посев) или методами амплификационной диагностики (полимеразно-цепная реакция, ПЦР) [1,2].

Если кашель у детей и взрослых длится более двух недель и в течение текущего года не проводилась вакцинация против коклюша то, целесообразно воспользоваться серологическими методами диагностики (например, иммуноферментным анализом, ИФА) [1,2].

Теперь немного подробнее о важных особенностях каждого метода.

1. Полимеразно-цепная реакция (ПЦР).

Необходимый материал для анализа — назофарингеальный мазок, но предпочтительнее использовать образец слизи из носоглотки [3].

ПЦР необходимо проводить в течение первых двух-трех недель от начала кашля, так как спустя четыре недели от начала заболевания количество бактерий B.pertussis в носоглоточном секрете стремительно снижается, также количество бактерий снижается, если проводилась антибактериальная терапия (более 5 дней [4]).

У младенцев и ранее не привитых детей ПЦР допустимо выполнять в течение первых четырёх недель от начала кашля [4,5].

Для большей точности ПЦР всегда рекомендуется проводить параллельно с посевом [1], следовательно, при заборе материала следует брать два образца одномоментно — один для ПЦР, другой для посева. Зачем? ПЦР может давать ложноположительные результаты, так как определяет только наличие или отсутствие ДНК возбудителя, а не наличие живых форм [6].

При заборе ПЦР рекомендуется пользоваться палочками из нейлона, рэйона и полиэстера. При использовании хлопковой ваты возбудитель гибнет [7].

При подозреваемом коклюше важно проводить дифференциальную диагностику с аденовирусной, бокавирусной инфекциями, гриппом, парагриппом, M.pneumoniae, Chlamydia trachomatis и Chlamydia pneumoniae [8].

ПЦР не рекомендуется проводить лицам, контактировавшим с больным коклюшем при отсутствии каких-либо симптомов [7].

2. Посев.

Посев на питательную среду — золотой стандарт диагностики коклюша [1—4].

Высокая вероятность получения наиболее точного результата отмечается у лиц, страдающих кашлем менее двух недель, если для лечения ещё не применялись антибактериальные препараты и, если вакцинация против коклюша проводилась более 12 месяцев назад [4].

Необходимый материал для проведения посева — отделяемое носоглотки.

Возбудитель коклюша — B.pertussis является очень чувствительным и привередливым микроорганизмом, поэтому рекомендуется, чтобы медперсонал строго следовал инструкции и соблюдал технику забора материала для анализа.

В среднем результат посева может быть готов через 4—10—14 дней [9,10], всё зависит от возможностей лаборатории. У ранее не болевших и не привитых против коклюша предварительный результат посева может быть готов уже через 72—96 часов [9,11].

Большим преимуществом посева является то, что можно определить чувствительность микроорганизма к антибиотикам и, следовательно, правильно подобрать препараты для последующего лечения. Кроме того, по данным посева, можно определить, какой конкретно штамм бактерии циркулирует на определённой территории и оценить эффективность применяемой вакцины [12].

3. Иммуноферментный анализ (ИФА).

В случае поздней диагностики, когда кашель длится более 3—4 недель и/или уже начата или проведена антибиотикотерапия, для лабораторного подтверждения коклюша можно воспользоваться серологическими методами диагностики, например, иммуноферментным анализом (ИФА).

При помощи ИФА можно определять антитела классов IgM, IgA и IgG к различным антигенам возбудителя: коклюшному токсину (PT), филаментозному гемагглютинину (FHA), пертактину (PRN). Наиболее специфичным антигеном является коклюшный токсин, так как это единственный антиген, который характерен только для B.рertussis [12]. Остальные антигены могут присутствовать и у других представителей Bordetella.

У 25% младенцев и 10% подростков антитела к коклюшному токсину могут отсутствовать [2,3].

Серологическое исследование для диагностики коклюша можно использовать с 3 до 12 недель с момента начала кашля [13,14]. Материалом для исследования является кровь.

Какой класс антител лучше определять?

1. Антитела класса IgM.

Свидетельствуют об остром инфекционном процессе.
Образуются не раньше второй недели от начала заболевания, следовательно, их определение раньше этого срока нецелесообразно [9,14].
У некоторых детей и взрослых независимо от наличия вакцинации или перенесённого ранее заболевания антитела класса IgM могут вырабатываться в малом количестве и не определяться по данным анализа [9].
Если определение IgM проводилось в первые две недели от начала заболевания и результат был отрицательным, то рекомендуется повторить анализ спустя 10—14 дней. Если отрицательный результат получен спустя 14 дней от начала заболевания, то смысла переделывать анализ нет, так как с течением времени количество IgM только уменьшается.

2. Антитела класса IgG.

Обнаруживаются на третьей неделе от начала заболевания, достигают своего наибольшего значения на 6—8 неделе болезни, после чего их уровень постепенно снижается [9].

Определение специфических IgG является наиболее распространённым и стандартизированным методом при серологической диагностике коклюша [2,3]

Для более точной диагностики при определении IgG рекомендуется использовать парные сыворотки, так как по данным одного анализа сложно сделать достоверный вывод, ведь неизвестно с чем связано присутствие IgG — с заболеванием или проведенной ранее вакцинацией.
Рекомендуемый интервал между исследованиями составляет 10—14 дней. Результат считается положительным при нарастании титра в 2—4 и более раз [3,9,15].

Определение титра антител — оптимальный метод диагностики коклюша у ранее иммунизированных подростков и взрослых [1,9].

Определение IgG рекомендуется, если в течение текущего года (12 месяцев) не проводилась вакцинация против коклюша [1,9].

При исследовании однократно взятой сыворотки (даже у ранее привитого более 12 месяцев назад взрослого или ребенка) результат по обнаружению антител класса IgG может быть расценен как положительный только в случае высокого титра (точное значение необходимо уточнять в лаборатории, так как данные разнятся в зависимости от техники анализа и используемых реагентов) [14].

4. Клинический анализ крови.

В общем анализе крови при коклюше характерно увеличение количества лейкоцитов и лимфоцитов [1—4]. Количество лимфоцитов увеличивается под действием токсина коклюшной палочки. [2], однако отсутствие повышения лейкоцитов не исключает коклюш. Клинический анализ крови является только дополнительным методом диагностики [5].

Имеются данные, что если по результатам клинического анализа крови у ребёнка определяется более 10 000 лейкоцитов в 1 мкл и более чем 50% из них составляют лимфоциты, то диагноз коклюша можно рассматривать как вероятный (конечно, при наличии характерной клинической картины) [16]. Если в повторном анализе — через 24 часа — отмечается повышение лейкоцитов более 20 000 в 1 мкл и из них более чем 50% лимфоцитов, то это свидетельствует о том, что вероятность коклюша крайне высока [16].

При оценке клинического (общего) анализа крови у маленьких детей также следует помнить, что если в течение беременности мама младенца прививалась от коклюша, то повышения лейкоцитов может и не быть [16].

5. Дополнительные обследования.

В связи с большим риском развития осложнений у детей первого года жизни в случае госпитализации рекомендуется выполнять рентгенографию органов грудной клетки (из-за риска пневмонии) и эхокардиограмму (из-за риска легочной гипертензии). Остальные исследования — по показаниям.

Подробнее о симптомах коклюша и его лечении можно прочитать в наших статьях по тегу #коклюш.

3.1.2. ИНФЕКЦИИ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ

Диагностика коклюша и паракоклюша

Дата введения: с момента утверждения

1. Разработаны: Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Е.Б.Ежлова, А.А.Мельникова, Н.А.Кошкина); Федеральным бюджетным учреждением науки "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.Пастера" (Г.Я.Ценева, Н.Н.Курова); Федеральным бюджетным учреждением науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (С.Б.Яцышина, Т.С.Селезнева, М.Н.Прадед); Федеральным государственным бюджетным учреждением "Научно-исследовательский институт детских инфекций Федерального медико-биологического агентства" (Ю.В.Лобзин, И.В.Бабаченко).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 24 мая 2013 г.

3. Введены в действие с момента утверждения.

Термины и сокращения

АКДС - адсорбированная коклюшно-дифтерийно-столбнячная вакцина

ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения

ГОСТ - Государственный стандарт

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИФА - иммуноферментный анализ

КУА - казеиново-угольный агар

ME - международные единицы

МУ - методические указания

ОРВИ - острая респираторная вирусная инфекция

ПСК - период судорожного кашля

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РА - реакция агглютинации

РИФ - реакция иммунофлуоресценции

РНК - рибонуклеиновая кислота

СанПиН - санитарно-эпидемиологические правила и нормы

СОЭ - скорость оседания эритроцитов

СП - санитарно-эпидемиологические правила

ТЕ - буфер Трис-ЭДТА

ТУ - технические условия

ФС - фармакопейная статья

цАМФ - циклический аденозинмонофосфат

ELISA - enzyme-linked immunosorbent assay (разновидность ИФА)

Ig - иммуноглобулин

IL - интерлейкин

FHA - filamentous haemagglutinin (филаментозный гемагглютинин)

NASBA - nucleic acid sequence-based amplification (метод амплификации РНК)

PT - pertussis toxin (коклюшный токсин)

RS-инфекция - инфекция, вызванная респираторно-синцитиальным вирусом

1. Область применения

В методических рекомендациях представлена современная микробиологическая характеристика коклюша в условиях массовой вакцинопрофилактики. В них содержится краткое описание рода Bordetella, включая новые виды, открытые в последнее десятилетие, более детальная характеристика биологических свойств В. pertussis, В. parapertussis и В. bronchiseptica, описание бактериологического метода исследования с использованием приемов, повышающих его информативность, современных методов лабораторной диагностики ПЦР и ИФА. Представлены алгоритмы диагностики коклюша в зависимости от вакцинального статуса, возраста и сроков заболевания пациентов. Цель настоящих методических рекомендаций - унифицировать подходы к лабораторной диагностике коклюшной инфекции.

Методические рекомендации предназначены для специалистов органов и организаций Роспотребнадзора (микробиологов, эпидемиологов), специалистов по клинической лабораторной диагностике, инфекционистов, педиатров, семейных врачей и врачей общей практики.

2. Введение

В довакцинальную эру коклюш занимал второе место среди детских капельных инфекций по уровню заболеваемости и первое по уровню смертности. В настоящее время в мире ежегодно заболевает несколько миллионов человек, умирает около 200 тыс. (в 2008 г. - 16 млн заболевших, 195 тыс. смертей).

Специфическая профилактика коклюша, проводимая в нашей стране с 1959 года, отчетливо повлияла на эпидемический процесс, биологические свойства возбудителя и клинику. Этапы массовой иммунизации характеризовались различным уровнем охвата детей прививками против коклюша и, в соответствии с этим, менялась эпидемиологическая обстановка. Низкий уровень иммунизации в 90-е годы привел к росту заболеваемости коклюшем. Достижение охвата прививками детей первого года жизни (более 95%) в последующие годы и поддержание его на этом уровне обеспечило не только снижение заболеваемости коклюшем, но и с 2001 г. стабилизацию показателей на минимальном уровне (3,2-5,7 на 100 тыс. населения). Особенностью эпидемического процесса коклюша на фоне высокого охвата прививками детей раннего возраста является возникновение периодических подъемов. Это объясняется недостаточной напряженностью и длительностью поствакцинального иммунитета, создаваемого в условиях нередкого нарушения календаря прививок, в частности, несоблюдения сроков вакцинации и интервалов между введениями доз вакцины и проведением ревакцинации, что способствует накоплению значительного числа неиммунных лиц. Увеличение охвата прививками привело в настоящее время к изменению возрастной структуры лиц, заболевших коклюшем. Большинство заболевших составляют школьники 7-14 лет - до 50,0%, дети 3-6 лет - до 25,0%, наименьшую долю - дети в возрасте 1-2 лет - 11,0% и дети до 1 года - 14,0%. В периоды подъема заболеваемости коклюшем интенсивность эпидемического процесса определяется заболеваемостью детей школьного возраста. Темпы роста в этой группе увеличиваются в 2-3 раза. Из числа лиц, заболевших коклюшем, 65% составляют привитые.

Поствакцинальный иммунитет не предохраняет от заболевания. Коклюш в этих случаях протекает в виде легких и стертых форм инфекции, которые диагностируются, в основном, ретроспективно (серологически). После перенесенного заболевания остается более длительный иммунитет.

Истинная заболеваемость коклюшем значительно выше за счет недиагностированной коклюшной инфекции (легких и стертых клинических форм). Трудности клинической диагностики коклюша на ранних стадиях заболевания, отсутствие обследования всех длительно (свыше 7 дней) кашляющих или его проведение на поздних сроках заболевания, а также после продолжительного лечения антибактериальными препаратами приводит к низкому проценту выявляемости возбудителя инфекции. Уровень бактериологического подтверждения диагноза составляет 10-20%. Современные методы исследования позволяют проводить раннюю диагностику заболевания (ПЦР) и существенно облегчают постановку диагноза (ПЦР, ИФА).

Таким образом, коклюш в нашей стране требует пристального внимания со стороны врачей различных специальностей. Своевременная и качественная лабораторная диагностика коклюшной инфекции позволит избежать ошибок в постановке диагноза и будет способствовать эффективной терапии.

3. Характеристика рода Bordetella, биологические свойства возбудителей коклюша и паракоклюша

________________
* Слово "Bordetella" в наименовании раздела 3 в бумажном оригинале выделено курсивом. - Примечание изготовителя базы данных.

Род Bordetella относится к семейству Alcaligenaceae и включает 9 видов: В. ansorpii, В. avium, В. bronchiseptica, В. hinzii, В. holmesii, В. parapertussis, В. pertussis, В. petrii, В. trematum. Первой (в 1908 г.) была описана В. pertussis, бактерия патогенна для человека и является возбудителем коклюша. В. parapertussis была описана в 1938 г., вызывает у людей паракоклюш (коклюшеподобное заболевание), она также была выделена от овец. В. bronchiseptica была описана в 1911 г., является возбудителем заболеваний дыхательных путей у многих млекопитающих (кашля у собак, атрофического ринита у свиней и др.), но встречается также бессимптомное носительство. У человека редко вызывает заболевание, однако описаны случаи, когда у пожилых людей, заразившихся от домашних животных (кроликов), В. bronchiseptica вызывала длительный кашель. В. avium описана в 1984 г., является возбудителем ринотрахеита у птиц. Описано несколько случаев выделения B. avium от пожилых пациентов с отягощенным анамнезом, с клинической картиной пневмонии. В 1995 г. были описаны сразу два новых вида: В. hinzii и В. holmesii. В. hinzii колонизирует дыхательные пути домашней птицы, была выделена от иммуноскомпрометированных пациентов, описан случай летальной септицемии. В. holmesii выделялась только от людей, обнаруживалась в мокроте, несколько раз в крови, этиологическая роль в развитии инфекций не доказана. В 1996 г. выделена В. trematum, возбудитель вызывает раневые и ушные инфекции. В 2001 г. была описана В. petrii, единственный представитель рода, выделенный из окружающей среды и способный жить в анаэробных условиях. В 2005 г. была выделена В. ansorpii, описано несколько случаев выделения от пациентов с онкологическими заболеваниями (из гнойного содержимого эпидермальной кисты, из крови).

Морфологические и культуральные свойства

Бактерии рода Bordetellae - мелкие (0,2-0,5 мкм 0,5-2,0 мкм) грамотрицательные коккобациллы. В мазках - часто биполярно окрашенные, одиночные или в парах, реже в цепочках, имеют нежную капсулу. Все, за исключением В. petrii, - строгие аэробы. Температура выращивания бордетелл +35-37 °С (оптимально +35 °С). Бордетеллы требовательны к условиям роста: 130-150 мг %аминного азота, кровь, дрожжевой экстракт, никотиновая кислота, аминокислоты (цистин, пролин, метионин, серин, глютамин и др.); наиболее требователен возбудитель коклюша, он растет только на специальных средах, в то время как остальные представители рода растут на кровяном агаре. Классической средой для первичного выделения В. pertussis является среда Борде-Жангу (картофельно-глицериновый агар), позднее были предложены синтетические и полусинтетические среды, в частности, казеиново-угольный агар (КУА). На указанных средах бордетеллы вырастают в виде характерных колоний: на среде Борде-Жангу - выпуклые, гладкие, блестящие, серебряного цвета, напоминающие капли ртути, окруженные зоной гемолиза; на КУА - выпуклые, гладкие, серого цвета с жемчужным, желтоватым или беловатым оттенком. Колонии маслянистые, легко снимаются петлей. В. parapertussis и В. holmesii за счет образования пигмента вызывают потемнение сред с кровью, образуют бурую подложку.

Ростовые характеристики основных видов бордетелл

Коклюш, паракоклюш, бронхисептикоз.

Коклюш - заболевание, продолжающееся минимум две недели, без явлений интоксикации и повышения температуры тела, протекающее с приступообразным кашлем, усиливающимся ночью и по утрам, сопровождающимся покраснением лица, шумными вдохами (репризами), заканчивающимся отхождением вязкой слизи или рвотой в конце приступа кашля.

Осложнения коклюша:

Специфические: эмфизема легких, эмфизема средостения и подкожной клетчатки, ателектазы, коклюшная пневмония, нарушения ритма дыхания (задержки дыхания - до 30 с; остановки - апноэ - более 30 с), нарушение мозгового кровообращения, кровотечения (из носа, заднеглоточного пространства, бронхов, наружного слухового прохода), кровоизлияния (в кожу и слизистые оболочки, склеру и сетчатку глаз, головной и спинной мозг), грыжи (пупочная, паховая), выпадение слизистой оболочки прямой кишки, разрывы барабанной перепонки и диафрагмы.

Неспецифические осложнения обусловлены наслоением вторичной бактериальной флоры (пневмония, бронхит, ангина, лимфаденит, отит и др.). Резидуальные явления: хронические бронхолегочные заболевания (хронический бронхит, бронхоэктатическая болезнь); задержка психомоторного развития, неврозы, судорожный синдром, различные речевые расстройства; энурез; редко - слепота, глухота, парезы, параличи.

Лабораторная диагностика

Лабораторные исследования проводят с диагностической целью и по эпидемическим показаниям:

1) с диагностической целью:

- детям, кашляющим в течение 7 дней и более, независимо от указаний на контакт с больным коклюшем;

- детям с подозрением на коклюш и коклюшеподобные заболевания по клиническим данным; - взрослым с подозрением на коклюш и коклюшеподобные заболевания, работающим в родильных домах, детских больницах, санаториях, детских образовательных учреждениях и школах, в т.ч. закрытого типа;

2) по эпидемическим показаниям (лицам, бывшим в контакте с больным):

- детям, посещающим детские образовательные учреждения, находящимся в детских больницах, санаториях, в которых были выявлены больные коклюшем/паракоклюшем, а также всем детям до 14 лет, общавшимся с больным коклюшем/паракоклюшем в домашних условиях;

- взрослым, работающим в указанных выше детских учреждениях, при выявлении в них больных коклюшем/паракоклюшем, а также при общении с больным коклюшем/паракоклюшем в домашних условиях.

Диагноз "коклюш, вызванный B. pertussis" ставится при подтверждении клинического диагноза "коклюш" хотя бы одним из указанных методов:

- выделение культуры B. pertussis; - обнаружение специфического фрагмента генома B. pertussis методом ПЦР; - у привитых детей и взрослых: выраженная сероконверсия, т.е. увеличение или уменьшение в 4 и более раз уровня специфических IgG и/или IgA (ИФА) или уровня агглютинирующих антител (РА) при исследовании парных сывороток, взятых с интервалом не менее 2 недель;

- у взрослых: допустимо однократное обнаружение специфических IgM (ИФА); - у непривитых детей: однократное обнаружение специфических IgM, и/или IgA, и/или IgG (ИФА) или антител в титре 1/80 и более (РА).

Диагноз "коклюш, вызванный B. parapertussis" ставится в случае: - выделения культуры B. parapertussis; - или при обнаружении фрагмента генома B. parapertussis методом ПЦР;

- или при обнаружении антител к B. parapertussis методом РА в титре не менее 1/80.

Диагноз "бронхисептикоз" ставится при выделении культуры B. bronchiseptica или при обнаружении специфического фрагмента генома B. bronchiseptica методом ПЦР.

Обследование методом ПЦР нередко оказывается эффективнее бактериологического метода в более поздние сроки заболевания и на фоне лечения антибиотиками.

Материал для исследования:

1.мазки со слизистой нижнего носового хода и задней стенки ротоглотки

2. культуры микроорганизмов.

Взятие мазков со слизистой нижнего носового хода

Мазки берут сухим стерильным назофарингеальным велюр-тампоном на пластиковом аппликаторе. Если полость носа заполнена слизью, перед процедурой рекомендуется провести высмаркивание. Зонд вводят легким движением по наружной стенке носа на глубину 2-3 см до нижней раковины. Затем зонд слегка опускают книзу, вводят в нижний носовой ход под нижнюю носовую раковину до носоглотки, делают вращательное движение и удаляют вдоль наружной стенки носа.После взятия материала тампон (рабочую часть зонда с тампоном) помещают до места слома в стерильную одноразовую пробирку с 500 мкл транспортной среды для хранения и транспортировки респираторных мазков. Конец зонда отламывают с расчетом, чтобы он позволил плотно закрыть крышку пробирки. Пробирку с раствором и рабочей частью зонда закрывают и маркируют.

Взятие мазков из ротоглотки

Мазки из ротоглотки берут сухими стерильными зондами с вискозными тампонами вращательными движениями с поверхности миндалин, небных дужек и задней стенки ротоглотки.

После взятия материала тампон (рабочую часть зонда с вискозным тампоном) помещают в стерильную одноразовую пробирку с 500 мкл транспортной среды для хранения и транспортировки респираторных мазков. Конец зонда отламывают, придерживая крышкой пробирки с расчетом, чтобы он позволил плотно закрыть пробирку. Пробирку с раствором и рабочей частью зонда закрывают, маркируют.

Хранение

Допускается хранение клинического материала до проведения исследования в течение 3 суток при температуре от 2 до 8 °С или 1 неделю – при температуре не выше минус 16 °С.

Техника взятия материала на коклюш и первичный посев на среду. Техника взятия. Название среды.

Цель исследования: выявление возбудителя и дифференциация возбудителей коклюша и паракоклюша.

1. Метод кашлевых пластинок (Борде)

Оборудование: чашка Петри с питательной средой (КУА)

· Усаживаем пациента на стул

· В момент появления кашля подносим открытую чашку Петри с питательно средой ко рту пациента на расстоянии 8-10см, удерживаем несколько секунд.

· Закрываем чашку и ставим в термостат.

2. Заднеглоточный способ взятия материала и первичный посев на чашку с питательной средой (КУА)

Оборудование: 2 стерильных тампона, растопленная на водяной бане среда КУА, стерильный шпатель.

1. Усаживаем пациента

2. Вынимаем первый тампон из пробирки и сгибаем под углом 120*.

3. Просим обследуемого открыть рот.

4. Вводим в рот шпатель и прижимаем им корень языка.

5. Вводим в рот первый (сухой) тампон до тех пор, пока конец его не прикоснется к задней стенке глотки.

6. После появления у обследуемого кашлевого рефлекса и выделения слизи вынимаем тампон из полости рта.

7. Делаем первичный посев на среду КУА в чашку Петри.

8. Сначала делаем несколько штрихов в одном месте, затем растираем материал по всей поверхности среды, со всех сторон тампона.

9. Засеянные чашки ставим в термостат.

10. Берем второй тампон и смачиваем его в расплавленной на водяной бане среде КУА.

11. Вводим в рот шпатель и прижимаем им корень языка.

12. Вводим тампон до тех пор, пока конец его не прикоснется к задней стенке глотки.

13. После появления у обследуемого кашлевого рефлекса и выделения слизи вынимаем тампон из полости рта.

14. Вынимаем тампон и производим посев материала.

3. Носоглоточный способ взятия материала и первичный посев на чашку с питательной средой (КУА)

Оборудование: 2 стерильных тампона, растопленная на водяной бане среда КУА.

1. Усаживаем пациента

2. Вынимаем первый тампон из пробирки и сгибаем под углом 120*.

3. Вводим в нос первый (сухой) тампон до тех пор, пока конец его не прикоснется к задней стенке глотки.

4. После появления у обследуемого кашлевого рефлекса и выделения слизи вынимаем тампон из полости рта.

5. Делаем первичный посев на среду КУА в чашку Петри.

6. Сначала делаем несколько штрихов в одном месте, затем растираем материал по всей поверхности среды, со всех сторон тампона.

7. Засеянные чашки ставим в термостат.

8. Берем второй тампон и смачиваем его в расплавленной на водяной бане среде КУА.

9. Вводим в рот шпатель и прижимаем им корень языка.

10. Вводим тампон до тех пор, пока конец его не прикоснется к задней стенке глотки.

11. После появления у обследуемого кашлевого рефлекса и выделения слизи вынимаем тампон из полости рта.

12. Вынимаем тампон и производим посев материала.

Микробиологическое исследование на менингит

на расстоянии 3-4 см от конца.
Предложить пациенту широко открыть рот.
Надавить шпателем, который находится в левой руке, на корень языка.
Ввести тампон концом вверх под мягкое небо в носоглотку и осторожным движением собрать слизь.
Извлечь тампон, не касаясь слизистой оболочки рта и зубов.
Провести первичный посев в пробирке на сывороточный агар штрихообразными движениями сверху вниз.
Поместить пробирку с посевом в термостат.

Цифровой отчет:

Микробиологическое исследование стафилококко-6

Микробиологическое исследование на дифтерию-8

Микробиологическое исследование на коклюш-3

Микробиологическое исследование на менингит-4

Выписка направлений – 21

Заполнение журналов – 4

Выдача результатов - 21

Десятый день практики.

Методы культивирования
и выделения чистой культуры бактерий.

Этапы выделения чистой культуры бактерий
I этап (нативный материал)
Микроскопия (ориентировочное представление о микрофлоре).
Посев на плотные питательные среды (получение колоний).
II этап (изолированные колонии)
Изучение колоний (культуральные свойства бактерий).
Микроскопическое изучение микробов в окрашенном мазке
(морфологические свойства бактерий).
Посев на скошенный питательный агар для выделения чистой культуры.
III этап (чистая культура)
Определение культуральных, морфологических, биохимических
и других свойств для идентификации культуры бактерий

Особенность микроскопирования микробов — применение исключительно иммерсионной системы, состоящей из исследуемого объекта, иммерсионных масла и объектива. Преимущество этой системы заключается в том, что между объектом на предметном стекле и фронтальной линзой объектива находится среда с одинаковым показателем преломления (кедровое, вазелиновое масло и др.). Благодаря этому достигается наилучшее освещение объекта, так как лучи не преломляются и попадают в объектив. При обычной световой микроскопии наблюдаемый объект (в том числе и микробы) рассматриваются в проходящем свете. Поскольку микробы, как и другие биологические объекты, малоконтрастны, то для лучшей видимости их окрашивают. С целью расширения границы видимости применяют другие виды световой микроскопии.

Цифровой отчет:

Выделения чистой культуры бактерий-5

Одиннадцатый день практики. Подготовка сыворотки крови для серогического исследования.(инактивирование, осаждение эритроцитами барана, разведение сыворотки 1:5, 1:10)Постановка иммунологических реакций: агглютинации на стекле и объемным методом, РПГА, реакций Хедельсона и Райта. Учет иммунологических реакций. Выдача результатов. Выписка протоколов. Ведение дневников

Читайте также: