Методы проведения исследований молекулярной эпидемиологии туберкулеза

Патоген Mycobacterium tuberculosis, который производит около 10,4 миллиона новых инфекций и 1,4 миллиона смертей в год и является одним из 10 ведущих причин смертности во всем мире1, остается одним из самых успешных патогенов человека сегодня с огромными проблемами здоровья и экономики как в развивающихся, так и в развивающихся странах стран с высокими доходами. Успех распространения туберкулеза (ТБ) напрямую связан с социальными и гигиеническими условиями населения. M. tuberculosis complex (MTBC) появился около 70 000 лет назад как генетическое узкое место и распространился по всему миру путем клонального расширения. Полагают, что увеличение численности населения в неолитический период и сопровождающая миграция людей являются некоторыми факторами, которые привели к распространению этого патогена2. На протяжении веков организм претерпел несколько изменений; таким образом, хотя генетически однородная группа, генетическое разнообразие MTBC может быть больше, чем предполагалось ранее3. Это разнообразие, в свою очередь, может влиять на биологические свойства организма4, что может в дальнейшем влиять на программы борьбы с туберкулезом. Возникновение туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью (MDR) и туберкулезом с широкой лекарственной устойчивостью (XDR) значительно расширило проблемы, с которыми сталкиваются программы борьбы с туберкулезом. Более того, в нескольких исследованиях показано, что различные молекулярные типы организма могут иметь разные способности приобретать лекарственную устойчивость. Следовательно, увеличение резистентности к лекарственным средствам добавило нашей потребности понять новые клоны, которые развиваются, и о клонах, которые вымерли.

Таким образом, глобальное воздействие туберкулеза может быть уменьшено только с помощью согласованных усилий не только врачей и лабораторных специалистов, но также эпидемиологов и должностных лиц общественного здравоохранения. Это означает, что нам нужны скоординированные усилия для оперативной диагностики туберкулеза, адекватного лечения болезни и выявления вспышек точно. Последнее требует использования комбинации обычных и молекулярно-эпидемиологических инструментов.

Молекулярная эпидемиология приобрела значение в последнее время как ресурс для понимания важнейших вопросов распространения туберкулеза, в частности МЛУ и ШЛУ-ТБ, и появилась как комбинация методов молекулярной типизации и классических эпидемиологических подходов. Надлежащий контроль над туберкулезом требует знания циркулирующих в регионе штаммов, способных дифференцироваться между рецидивом и реинфекцией, выявлением случаев недавней передачи, факторами риска, способностью отслеживать географическое распределение и клональное расширение определенных штаммов. Все больше доказательств того, что генетические различия в штаммах MTBC связаны с исходом заболевания и, следовательно, с управлением пациентами5. Следовательно, информация о штамме может помочь в борьбе с болезнями, особенно во время вспышек.

Хотя изначально идентификация и дискриминация микобактерий зависела от фенотипа индивидуального штамма, восприимчивости к антимикробным агентам, биохимических различий и серологической реактивности, внедрение молекулярных методов в области туберкулеза улучшило наше понимание динамики распространения и эволюционной генетики патоген. Первые методы молекулярной типизации, используемые для M. tuberculosis, были основаны на анализе ДНК полиморфизма длины рестрикционного фрагмента (RFLP) бактериальной ДНК. Позднее использовались последовательности вставки, такие как IS6110. IS6110 на основе RFLP-фингерпринтов широко используется для изучения структуры популяции микобактерий в нескольких частях мира, включая India7891011. Тем не менее, отпечаток IS6110 ограничен, поскольку значительная доля (40-44%) изолятов M. tuberculosis в некоторых регионах мира, включая несколько частей Индии, была отмечена с небольшими номерами копий или отсутствием IS6110781213. Кроме того, типизация IS6110 является трудоемкой и требует нескольких недель для культивирования изолятов M. tuberculosis. Также использовались методы молекулярной типизации, нацеленные на спейсерные последовательности в области прямого повтора, включая спориготипирование. Однако эти методы, если они используются сами по себе, могут недооценивать клональное разнообразие M. tuberculosis14, хотя было установлено, что сполиготипирование полезно для выявления штаммов, относящихся к разным кладам или линиям2. Методы, основанные на тандемных повторах с переменным числом (VNTR) генетических элементов, таких как типизация чередующихся повторяющихся единиц микобактерий (MIRU), также могут использоваться для дифференциации изолятов M. tuberculosis с элементами IS6110 с низким количеством копий15. MIRU-VNTR имеет различающую силу, большую, чем функция spoligotyping. Фактически, при совместном использовании MIRU-VNTR и spoligotyping предлагают мощный молекулярно-эпидемиологический инструмент. Кроме того, эти методы менее громоздки, чем IS6110, и результаты доступны быстрее. Хотя эти методы нацелены на последовательности, генетически изменчивые, они опросили менее одного процента генома M. tuberculosis.

Наличие геномных последовательностей M. tuberculosis привело к новому этапу в молекулярно-эпидемиологических исследованиях туберкулеза. В более ранних исследованиях использовалось секвенирование Сэнгера16. Тем не менее, последовательные последовательности (NGS) или высокопроизводительные платформы метаморфозировали простой исследовательский инструмент в крупномасштабную диагностическую и молекулярную платформу для типизации, так как миллионы фрагментов ДНК могли быть последовательно упорядочены16.

Благодаря этим новым технологическим достижениям клинические последствия молекулярно-эпидемиологических исследований увеличились16. Молекулярная типизация MTBC может не только информировать исследователей о распространении штаммов в конкретной стране или регионе, но также может использоваться для мониторинга распространения определенных генотипов в сообществе или между пациентами. Более того, молекулярная типизация может использоваться для выявления перекрестного загрязнения в лабораториях и, таким образом, избежать ложного обнаружения псевдо-вспышек16. Что еще более важно, данные генотипирования предоставили важную информацию о факторах риска, связанных с передачей ТБ. Факторами риска, которые были выявлены при недавней передаче ТБ, являются туберкулез легких, туберкулез с мазком, ВИЧ, злоупотребление алкоголем, внутривенное употребление наркотиков и проживание в городских условиях1718. Молекулярная типизация может, таким образом, использоваться органами здравоохранения для планирования или модификации программ борьбы с ТБ.

В этом выпуске Pasechnik et al. 19 использовали spoligotyping и MIRU для идентификации штаммов M. tuberculosis, циркулирующих в Омске, Сибирь. Они сообщили, что большое количество их изолятов принадлежит семье Пекина, которая, как известно, имеет высокий уровень множественной лекарственной устойчивости. Было высказано предположение, что лекарственная устойчивость приводит к уменьшению вирулентности и трансмиссивности M. tuberculosis. Однако, как и в Омске, крупные регионы мира, как было видно, содержат лекарственно-устойчивые изоляты, наиболее заметное из которых — Индия, Китай и Россия. Считается, что эпистаз может играть роль в компенсации стоимости фитнеса, которая, как считается, связана с лекарственной устойчивостью14. Распространение штаммов МЛУ различается в разных регионах. В Европе, хотя преобладающие штаммы МЛУ варьируются между странами, семьи T, LAM и Haarlem, как было замечено, содержат максимальное количество штаммов MDR, тогда как в Восточной Азии изоляты в Пекине составляют большинство изолятов MDR16.

Индия — обширная страна с огромными генетическими и этническими различиями и вносит вклад в одну четвертую часть глобальных случаев заболевания ТБ20. Распределение родов M. tuberculosis во всем мире и в Индии подчеркивает распространение туберкулеза, связанного с путешествиями людей. Исследования из Индии показали, что среднеазиатский штамм (CAS), современный род, преобладал в западной, центральной и северной частях Индии1011212223. Линия Ману была найдена в Западной Центральной Индии, а восточноафриканская индийская линия была преимущественно обнаружена на юге Индии21. Пекин является третьей по преимуществу линией, но доминирующей линией в северо-восточной Индии21.

Было также установлено, что современные линии приобрели мутации быстрее, чем древние линии. Пекин значительно связан с МЛУ по сравнению с другими родами. Многие исследования связывают генотипы M. tuberculosis с клиническими проявлениями болезни. Например, было установлено, что штаммы CAS связаны с внелегочным заболеванием24. Евроамериканская линия ассоциировалась больше с туберкулезом легких, чем внелегочный ТБ25.

Несмотря на то, что Индия является многообразной землей, число доступных эпидемиологических исследований не оправдывает репертуар штаммов, циркулирующих в стране. Кроме того, количество изолятов, включенных в большинство исследований, составляет лишь несколько. Более того, хотя частота рецидивов туберкулеза в Индии составляет 10 процентов, нет данных о том, вызван ли рецидив ожирением предыдущей инфекции или из-за реинфекции26. Потребность в этом часе — это большие многоуровневые исследования, которые включают штаммы из больших частей Индии. Учитывая недавнее увеличение числа поездок, связанных с работой и досугом, требуется непрерывное бдение, чтобы остановить распространение туберкулеза и появление новых клонов. Кроме того, теперь стало ясно, что пропущенные диагностические возможности, особенно лекарственно-устойчивые M. tuberculosis, могут привести к эволюции более трансмиссивных организмов, которые могут стать все более устойчивыми к лекарственным средствам. Инструменты молекулярной печати могут помочь чиновникам здравоохранения уверенно идентифицировать каналы передачи. В будущем мы можем увидеть мощные высокопроизводительные технологии, такие как NGS, которые используются для полной характеристики деформации, выявления резистентности к лекарственным средствам, мониторинга появления новых мутаций и механизмов резистентности к лекарственным средствам и исследования вспышек путем идентификации кладов и линий, которые будут трансформировать управление болезнями и целевые вмешательства и ресурсы для борьбы с туберкулезом более адекватно.

*Импакт фактор за 2018 г. по данным РИНЦ

Журнал входит в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК.

Читайте в новом номере

ЦНИИ туберкулеза РАМН, Москва

В настоящее время лабораторная диагностика занимает ведущее место в выявлении многих инфекционных заболеваний. Подтверждение диагноза туберкулеза основывается на результатах микробиологических анализов при выделении из биологического материала возбудителя – микобактерий туберкулеза. Современная микробиологическая диагностика туберкулеза состоит из нескольких основных групп анализов, направленных на выявление возбудителя, определение лекарственной чувствительности и типирование микобактерий.

Обнаружение возбудителя начинается с наиболее простых и быстрых бактериоскопических методов с использованием светового микроскопа с окраской по Циль–Нильсену и люминесцентного с окраской флюорохромами. Преимущество бактериоскопии – в быстроте получения результата. Однако возможности ее ограничены из–за низкой чувствительности. Этот метод является наиболее экономичным и рекомендован ВОЗ в качестве основного для выявления заразных больных (табл. 1).

При антибактериальной терапии обнаружение микобактерий туберкулеза имеет прогностическое значение. Поэтому бактериовыделение оценивается количественно. Золотым стандартом выявления микобактерий признаны культуральные исследования. Для посева патологического материала используют яичные среды: Левенштейна–Йенсена, среду Финна II, Мордовского и др. Количество микобактерий (или колоний в пробирке при культуральном методе исследования) в процессе химиотерапии является ориентировочным показателем ее эффективности или косвенным свидетельством развития устойчивости микобактерий к противотуберкулезным препаратам.

Для повышения процента выделения микобактерий посевы патологического материала проводят на несколько сред, в том числе и на жидкие в автоматизированных системах учета роста типа BACTEC, что позволяет удовлетворить все культуральные потребности возбудителя. Посевы инкубируют до двух с половиной месяцев. При отсутствии роста к этому времени посев считается отрицательным. Наиболее чувствительным способом обнаружения микобактерий туберкулеза считается метод биологической пробы – заражение диагностическим материалом высокочувствительных к туберкулезу морских свинок.

Развитие молекулярной биологии позволило значительно повысить эффективность обнаружения микобактерий. Базовым методом молекулярно–генетических исследований является полимеразная цепная реакция (ПЦР), направленная на выявление ДНК микобактерий в диагностическом материале. ПЦР дает экспоненциальное увеличение специфического участка ДНК возбудителя: 20 циклов ПЦР приводят к увеличению исходной ДНК в 1 миллион раз, что позволяет визуализировать результаты методом электрофореза в агарозном геле.

Роль молекулярной диагностики в клинической практике повышается, поскольку увеличивается число больных со скудным бактериовыделением. Однако при постановке диагноза результаты ПЦР являются дополнительными и должны сопоставляться с данными клинического обследования, рентгенографии, микроскопии мазка, посева и даже ответа на специфическое лечение.

Интереснейшая область исследования, которая открывается благодаря ПЦР–диагностике, – изучение латентной инфекции M. tuberculosis. По современной концепции туберкулезной инфекции, из 100 человек, контактирующих с M. tuberculosis, 90 могут быть инфицированы, но только у 10 развивается активная болезнь. У остальных 90% инфекция будет оставаться латентной из–за противотуберкулезного иммунитета. Положительные ответы ПЦР при отрицательных результатах посевов патологического материала отмечаются у 55% лиц, подвергавшихся бытовым контактам с M. tuberculosis, и у 80% лиц, у которых туберкулез протекал без рентгенографических проявлений. Проведение ПЦР–исследований у пациентов из групп риска выявляло больных с отрицательными результатами микроскопии и посевов, но с субклинической инфекцией M. tuberculosis [11]. Подобные результаты были получены и в наших исследованиях [6].

Определение лекарственной устойчивости микобактерий

Для определения лекарственной устойчивости микобактерий используется несколько групп методов (табл. 2). По приказу № 558 МЗ РФ от 1978 г. в бактериологических лабораториях России используется метод абсолютных концентраций. В лаборатории ЦНИИТ РАМН внедрен ускоренный метод по тестированию нитратредуктазной активности микобактерий с помощью реактива Грисса.

В крупных противотуберкулезных центрах используются методы определения лекарственной устойчивости в жидких средах с автоматизированной радиометрической и флюоресцентной системой учета роста микобактерий типа ВАСТЕК, позволяющие сокращать срок анализа до 14 дней.

В последнее время разрабатываются новые методы оценки лекарственной устойчивости на уровне генотипа [10]. Работа по изучению молекулярных механизмов резистентности показала наличие у микобактерий генов, связанных с устойчивостью к различным препаратам: к изониазиду – гены katG, inhA, kasA, к рифампицину – rpoB, к стрептомицину – rpsL и 16SрРНК, к этамбутолу – emb1, к фторхинолонам – gyrA и т.д. [7].

Широкомасштабные исследования по изучению спектра мутаций в геноме устойчивых микобактерий показали, что наиболее распространенными были мутации в 531, 526 и 516 кодонах rpoB гена, устойчивость к изониазиду характеризовалась мутациями в 315 кодоне katG гена. В целом спектр мутаций не отличался от выявленных исследователями в разных регионах мира [2].

Доступность данных по молекулярной основе лекарственной устойчивости к противотуберкулезным препаратам дала возможность разработки новых, основанных на ПЦР, методов, представленных в табл. 2. Наши работы, проведенные совместно с Институтом физико–химической медицины МЗ РФ и Институтом молекулярной биологии РАН, продемонстрировали перспективность использования молекулярно–генетических методов для быстрого определения лекарственной устойчивости [1, 3, 4].

Наибольшие надежды по совершенствованию методов для определения лекарственной устойчивости микобактерий связаны с развитием микрочиповой технологии, позволяющей определять устойчивость одновременно к нескольким противотуберкулезным препаратам микобактерий непосредственно из диагностического материала в течение 2 дней [9].

Комплекс методов имеется и для типирования микобактерий, когда используются традиционные культуральные и биохимические методы, биологические, а также молекулярно–генетические (табл. 3). На основе молекулярно–генетического типирования микобактерий интенсивно развивается область молекулярно–эпидемиологических исследований, в которой по генотипу микобактерии выявляются очаги и прослеживаются пути распространения туберкулезной инфекции [5, 8].

#Pt6982.gif В заключение необходимо подчеркнуть, что в настоящее время имеется научный потенциал для совершенствования бактериологических исследований, а благодаря успехам молекулярной биологии существует возможность значительного сокращения сроков выявления микобактерий, определения лекарственной устойчивости и контроля за эффективностью химиотерапии.

1. Альтшуллер М.Л. и др. Применение аллель–специфической амплификации и SSCP для выявления устойчивости к рифампицину клинических изолятов Mycobacterium tuberculosis. // БЭБиМ, 1999; 128(11): 555–8.

2. Генерозов Э.В. и др. Молекулярная характеристика полирезистентных клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis из России. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 2000; 1: 11–7.

3. Генерозов Э.В.и др. Детекция и характеристика мутаций в rроВ гене резистентных к рифампицину клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis. // Проблемы туберкулеза, 1999; 2: 39–42.

4. В.М. Михайлович и др. Использование методов гибридизации и ПЦР на специализированном ТБ–микрочипе для обнаружения рифампицин–резистентных штаммов Mycobacterium tuberculosis // БЭБ и М, 2001, 1: 112–7.

5. Черноусова Л.Н.и др. Молекулярная эпидемиология туберкулеза в тюрьмах. // Актуальные проблемы пенитенциарной медицины. Мат–лы международной научно–практич. конференции, Минск, 2001: 48–50.

6. Черноусова Л.Н., Ларионова Е.Е., Севастьянова Э.В., Голышевская В.И. Роль ПЦР–анализа в комплексных бактериологических анализах во фтизиатрии. // Проблемы туберкулеза, 2001; 3: 58–60.

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Баранов Антон Алексеевич, Марьяндышев А. О., Маркелов Ю. М., Бьюне Г., Дале У.

В статье описывается молекулярная эпидемиология микобакте-рий туберкулеза (М. туберкулеза ) среди впервые выявленных случаев заболевания туберкулезом в четырех административных территориях Баренц-региона Российской Федерации. С помощью двух методов молекулярной биологии сполиготипирования и RFLP установлено, что превалирующим генотипом М. туберкулеза является генотип Beijing (47,1 %). Данный генотип обладает самым высоким уровнем кластерности среди всех генотипов, что свидетельствует о его активной передаче.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Баранов Антон Алексеевич, Марьяндышев А. О., Маркелов Ю. М., Бьюне Г., Дале У.

MOLECULAR EPIDEMIOLOGY OF TUBERCULOSIS IN FOUR ADMINISTRATIVE TERRITORIES OF BARENTS REGION IN RUSSIAN FEDERATION

In the article, molecular epidemiology of Mycobacterium tuberculosis among new cases of tuberculosis morbidity rate in four administrative territories of the Barents region in the Russian Federation has been described. With the help of two methods of molecular biology spoligo-identification and RFLP it has been established that a prevailing genotype was the genotype Beijing (47,1%). This genotype has the highest level of clusters' number among all genotypes, what is evidence of its active communication.

МОЛЕКУЛЯРНАЯ .. ТУБЕРКУЛЕЗА В ЧЕТЫРЕХ АДМИНИСТРАТИВНЫХ ТЕРРИТОРИЯХ БАРЕНЦ-РЕГИОНА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

*Ю. М. Маркелов, **Г. Бьюне, ***У. Дале

Северный государственный медицинский университет, г. Архангельск Петрозаводский государственный университет, г. Петрозаводск **Университет г. Осло,

***Национальный институт общественного здоровья, г. Осло, Норвегия

В статье описывается молекулярная эпидемиология микобактерий туберкулеза (М. туберкулеза) среди впервые выявленных случаев заболевания туберкулезом в четырех административных территориях Баренц-региона Российской Федерации. С помощью двух методов молекулярной биологии - сполиго-типирования и RFLP установлено, что превалирующим генотипом М. туберкулеза является генотип Beijing (47,1 %). Данный генотип обладает самым высоким уровнем кластерности среди всех генотипов, что свидетельствует о его активной передаче.

Ключевые слова: туберкулез, микобактерии туберкулеза, сполиготипи-рование, RFLP, генотип Beijing.

Впервые молекулярно-генетические методы для описательной эпидемиологии микобактерий туберкулеза (М. туберкулеза) были применены в начале 1990-х годов. Нью-Йорк (США) считается одним из первых мест, где эти методы помогли расследованию вспышки туберкулезной инфекции [10]. С тех пор появилось множество других молекулярногенетических методов анализа М. туберкулеза, которые постоянно совершенствуются [11, 17]. Это стало возможным благодаря как лучшему пониманию генетики М. туберкулеза, так и развитию молекулярной биологии в целом. Геном М. туберкулеза был полностью расшифрован в 1998 году группой авторов под руководством S. T Cole [8], и в настоящее время молекулярная генетика М. туберкулеза считается одной из наиболее изученных среди других микроорганизмов.

Однако, несмотря на успехи лабораторной медицины и пристальное внимание мировой медицинской общественности к проблемам туберкулеза, во многих частях мира пока не удается остановить распространение эпидемии туберкулеза. Согласно определению Всемирной организации здравоохранения туберкулез остается ведущей причиной смерти среди излечимых инфекционных заболеваний [19]. Каждый год в мире туберкулезом заболевают 8,9 миллиона и умирают от него 1,7 миллиона человек [20].

Россия входит в число 22 стран с наиболее высокими показателями по распространенности туберкулеза [18].

Для того чтобы предпринимать эффективные меры по контролю туберкулеза, необходимо охарактеризовать настоящую эпидемию заболевания и выявить ее особенности.

Целью настоящего исследования стало проведение анализа молекулярной эпидемиологии штаммов М. туберкулеза, циркулирующих в четырех административных территориях Баренц-региона Российской Федерации.

Всего было проанализировано 176 штаммов М. туберкулеза, выделенных от больных с впервые выявленными случаями заболевания легочным туберкулезом из гражданского сектора четырех административных территорий Северо-Западного федерального округа Российской Федерации (Архангельская, Мурманская области, Республики Карелия и Коми) за период 2004 — 2006 годов. Молекулярно-генетический анализ был проведен в Национальной референс-лаборатории для микобактерий в Национальном институте общественного здоровья (Норвегия, Осло).

Для молекулярно-генетического анализа штаммов М. туберкулеза были применены два метода молекулярной биологии — сполиготи-

пирование (англ. spoligotyping) и генотипирование по полиморфизму длин рестрикционных фрагментов (Restriction Fragment Length Polymorphism typing

— RFLP) с использованием вставочной последовательности IS6110.

Сполиготипирование представляет собой быстрый метод идентификации микобактерий и классификации их по известным генотипам. Он основывается на полиморфизме одного хромосомного локуса, который называется областью прямых повторов (direct repeat region).

Сполиготипирование осуществлялось по следующей методике [13]: ДНК микобактерий выделялась из клеток и очищалась от других органических соединений. Проводилась полимеразная цепная реакция с использованием одной пары праймеров против нуклеотидных последовательностей в области прямых повторов, причем один из праймеров был биотинилорованным — для последующей регистрации результатов. Затем выполнялась гибридизация с набором из 43 олигонуклеотидов, иммобилизированных на мембране. Вслед за этим мембрану инкубировали в streptavidin peroxidase и результат был визуализирован на рентгеновских пленках с помощью хеми-люминесценции.

Полученные при сполиготипировании паттерны сравнивали с паттернами, опубликованными в глобальной базе данных SpolDB4 [7] для определения генотипов циркулирующих штаммов М. туберкулеза.

RFLP с использованием вставочной последовательности IS6110 в настоящее время считается лучшим методом выявления генетического сходства между сравниваемыми штаммами М. туберкулеза, он позволяет оценить уровень трансмиссии заболевания среди популяций. Это возможно благодаря высокой стабильности вставочных элементов IS6110 в геноме микобактерий — период их полужизни составляет 3—4 года [9].

Вкратце процедура RFLP заключалась в следующем [17]: ДНК микобактерий, выделенная из клеток и очищенная от других органических соединений, расщеплялась на части рестрикционным ферментом Pvull. Вслед за этим фрагменты рестрикции распределялись согласно их молекулярному весу в агарозном геле при проведении электрофореза. С помощью южного блоттинга (Southern blotting) рестрикционные фрагменты ДНК переносились на ДНК-связывающую мембрану. Далее проводилась гибридизация ДНК к внутреннему элементу вставочной последовательности IS6110 и результаты визуализировались с помощью коммерческого лабораторного набора (digoxigenin-dUTP labeling and detection kit; Boehringer, Germany).

Для анализа полученных методом RFLP паттернов ДНК была применена специальная компьютерная программа Bionumerics (AppliedMaths, Kortrijk, Belgium), версия 1.5. Перед проведением анализа ДНК паттерны были нормализованы с помощью генетических маркеров с известным молекулярным

весом. Для выявления сходства между полученными паттернами ДНК был произведен кластерный анализ с использованием невзвешенного пара-группа усредненного метода (unweighted pair-group average method) с расчетом коэффициента сходства Диса (Dice similarity coefficient).

Данные сполиготипирования представлены в таблице. На основании анализа полученных при споли-готипировании паттернов можно прийти к выводу о наличии трех превалирующих генотипов в исследуемой популяции. Наиболее распространенным является генотип Beijing, который встретился в 83 (47,1 %) случаях. Далее следуют генотип T — 43 (24,4 %) и генотип Haarlem — 21 (11,9 %) случай. Остальные 26 (14,8 %) штаммов принадлежат к генотипам LAM, MANU, U, CAS и S. Паттерны сполиготипирования трех штаммов (1,8 %) на настоящий момент не описаны в глобальной базе данных SpolDB4, поэтому эти штаммы не были классифицированы.

Анализ RFLP-паттернов и кластерный анализ выявили 10 кластеров в исследуемой выборке. Размеры кластеров составили от 2 до 10 штаммов М. туберкулеза. Кластер — это два и более штамма М. туберкулеза, RFLP-паттерны которых обладают полным сходством между собой. Считается, что штаммы, входящие в один кластер, являются идентичными.

Девять из десяти обнаруженных кластеров включают штаммы, принадлежащие к генотипу Beijing, таким образом, штаммы данного генотипа обладают самым высоким уровнем кластерности в исследуемой выборке. Кроме того, при визуальном анализе паттернов RFLP можно заключить, что в целом штаммы М. туберкулеза генотипа Beijing обладают наибольшим генетическим сходством между собой при сравнении со штаммами других генотипов. Оба этих факта свидетельствуют об активной передаче штаммов генотипа Beijing.

Генотип Beijing был выявлен во многих частях мира. В разных странах характер распространения М. туберкулеза данного генотипа варьирует — от почти полного отсутствия и эндемических случаев до эпидемий [6]. Наибольшее распространение генотип Beijing получил в странах Азии и бывшего Советского Союза. Более того, в некоторых странах была установлена взаимосвязь между туберкулезом, вызванным микобактериями данного генотипа, и лекарственной устойчивостью к противотуберкулезным препаратам [6].

Некоторые исследователи предполагают наличие у штаммов М. туберкулеза генотипа Beijing повышенной вирулентности [12] или наличие возможности обойти иммунную защиту организма, сформированную вакциной БЦЖ [5]. Однако на настоящий момент реальные механизмы, способствующие распространению генотипа Beijing, остаются неясными.

Паттерны сполиготипирования штаммов микобактерий туберкулеза, выделенных от больных с впервые выявленными случаями легочного туберкулеза, в четырех административных территория Баренц-региона Российской Федерации (n = 176)

В Российской Федерации генотип Beijing является превалирующим почти повсеместно — это было выявлено исследованиями, проведенными в московском регионе [1], Самарской области (в том числе в системе исполнения наказаний) [2], Кавказском регионе [1], Республике Тыва [3], Архангельской области (как в гражданском секторе, так и в системе исполнения наказаний) [15, 16], Восточной Сибири [4].

Нашим исследованием было выявлено, что в Баренц-регионе Российской Федерации генотип Beijing встречается почти в половине (47,1 %) всех впервые выявленных случаев заболевания легочным туберкулезом. Это подтверждает эпидемический характер распространения данного генотипа.

С помощью RFLP мы установили, что почти все Beijing-штаммы М. туберкулеза обладают высокой степенью схожести между собой и среди них имеется большое количество кластеров. Это свидетельствует об активной передаче штаммов туберкулеза данного генотипа. Более того, в состав многих кластеров входят штаммы, выделенные от больных туберкулезом в различных регионах Северо-Западного федерального округа России. По всей видимости, это связано с активными миграционными процессами.

Можно предположить, что генотип Beijing обладает каким-то преимуществом по сравнению с другими генотипами, которое способствует его обширному распространению. В Архангельской области ранее проведенным исследованием была выявлена взаимосвязь между данным генотипом и наличием лекарственной устойчивости к противотуберкулезным препаратам [16]. Кроме того, было продемонстрировано, что принадлежащие к генотипу Beijing М. туберкулеза не теряют фитнес (выраженный как скорость роста), приобретая лекарственную устойчивость, — в отличие от других генетических групп М. туберкулеза [14]. Таким образом, пациенты, зараженные М. туберкулеза генотипа Beijing, возможно, дольше остаются эпидемически опасными для окружающих людей. Это может быть одним из объяснений столь широкого распространения данного генотипа.

1. Наиболее часто встречающимся генотипом М. туберкулеза в Баренц-регионе Российской Федерации является генотип Beijing, который обнаруживается почти в половине (47,1 %) новых случаев заболевания легочным туберкулезом. Тем не менее в исследуемых территориях также обнаружено довольно высокое распространение генотипов T и Haarlem.

2. Генотип Beijing обладает самым высоким уровнем кластерное™ среди всех превалирующих генотипов, что свидетельствует об активной передаче М. туберкулеза этого генотипа.

3. Многие RFLP-кластеры включают штаммы, выделенные от больных в различных административных территориях Северо-Западного федерального округа. Это отражает миграционные процессы и вызывает необходимость усиления и координирования противотуберкулезных программ во всех регионах.

1. Андреевская С. Н. Трансмиссия штаммов микобактерий туберкулеза, обусловленная миграционными процессами в Российской Федерации (на примере миграции населения из Кавказского региона в Москву и Московскую область) / С. Н. Андреевская, Л. Н. Чер-ноусова, Т. Г. Смирнова и др. // Проблемы туберкулеза и болезней легких. — 2006. — № 1. — С. 29—35.

2. Балабанова Я. М. Преобладание штаммов Mycobacterium tuberculosis семейства Beijing и факторы риска их трансмиссии в Самарской области / Я. М. Балабанова, В. В. Николаевский, М. Радди и др. // Там же.

3. Матракшин А. Г. Генотипическая характеристика штаммов Mycobacterium tuberculosis из Республики Тыва / А. Г. Матракшин, Е. М. Месько, Н. К. Белякова и др. // Там же. — 2004. — № 3. — С. 37-40.

4. Медведева Т. В. MIRU-VNTR-генотипирование штаммов Mycobacterium tuberculosis в Восточной Сибири: семейство Beijing против Kilimanjaro / Т. В. Медведева, О. Б. Огарков, О. М. Некипелов и др. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2004. - № 4.

5. Abebe F. The emergence of Beijing family genotypes of Mycobacterium tuberculosis and low-level protection by bacille Calmette-Guerin (BCG) vaccines: is there a link? / F. Abebe, G. Bjune // Clin. Exp. Immunol. - 2006. -Vol. 145, N 3. - P 389-397.

6. Beijing/W genotype Mycobacterium tuberculosis and drug resistance // Emerg. Infect. Dis. - 2006. - Vol. 12, N 5. - P. 736-743.

7. Brudey K. Mycobacterium tuberculosis complex genetic diversity: mining the fourth international spoligo-typing database (SpolDB4) for classification, population genetics and epidemiology / K. Brudey, J. R. Driscoll, L. Rigouts et al. // BMC Microbiol. - 2006. - Vol. 6.

8. Cole S. T. Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence / S. T. Cole, R. Brosch, J. Parkhill et al. // Nature. - 1998. - Vol. 393, N 6685. - P. 537-544.

9. de Boer A. S. Analysis of rate of change of IS6110 RFLP patterns of Mycobacterium tuberculosis based on serial patient isolates / A. S. de Boer, M. W. Borgdorff, P. E. de Haas et al. // J. Infect. Dis. - 1999. - Vol. 180, N 4. - P. 1238-1244.

10. Edlin B. R.. An outbreak of multidrug-resistant tuberculosis among hospitalized patients with the acquired immunodeficiency syndrome / B. R. Edlin, J. I. Tokars, M. H. Grieco et al. // N. Engl. J. Med. - 1992. - Vol. 326, N 23. - P. 1514-1521.

11. Kremer K. Discriminatory power and reproducibility of novel DNA typing methods for Mycobacterium tuberculosis complex strains / K. Kremer, C. Arnold, A. Cataldi et al. // J. Clin. Microbiol. - 2005. - Vol. 43, N 11. -P. 5628-5638.

12. Lopez B. A marked difference in pathogenesis and immune response induced by different Mycobacterium tuberculosis genotypes / B. Lopez, D. Aguilar, H. Orozco et al. // Clin. Exp. Immunol. — 2003. — Vol. 133, N 1.

13. Spoligotyping kit manual. — Isogen Life Science, 2005.

14. Toungoussova O. S. Impact of drug resistance on fitness of Mycobacterium tuberculosis strains of the W-Beijing genotype / O. S. Toungoussova, D. A. Caugant, P. Sandven et al. // FEMS Immunol. Med. Microbiol. — 2004. — Vol. 42, N 3. — P. 281—290.

15. Toungoussova O. S. Molecular epidemiology and drug resistance of Mycobacterium tuberculosis isolates in the Archangel prison in Russia: predominance of the W-Beijing clone family / O. S. Toungoussova, A. Mariandyshev, G. Bjune et al. // Clin. Infect. Dis. — 2003. — Vol. 37, N 5. — P. 665—672.

16. Toungoussova O. S. Spread of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis strains of the Beijing genotype in the Archangel Oblast, Russia / O. S. Toungoussova, P. Sandven, A. O. Mariandyshev et al. // J. Clin. Microbiol. — 2002. — Vol. 40, N 6. — P. 1930—1937.

17. Van S. D. Molecular epidemiology of tuberculosis and other mycobacterial infections: main methodologies and achievements / S. D. Van // J. Intern. Med. — 2001. — Vol. 249, N 1. — P. 1—26.

18. WHO. The world health report 2004: changing history. — Geneva : World Health Organization, 2004.

19. WHO. The world health report 2004: changing history. — Geneva : World Health Organization, 2004.

20. WHO. Tuberculosis fact sheet. — 2006. — N 104.

MOLECULAR EPIDEMIOLOGY OF TUBERCULOSIS IN FOUR ADMINISTRATIVE TERRITORIES OF BARENTS REGION IN RUSSIAN FEDERATION

А. А. Baranov, А. О. Maryandyshev, *Yu. М. Мarkelov, **G. Bjune, ***U. Dale

Northern State Medical University, Arkhangelsk *Petrozavodsk State University, Petrozavodsk **Oslo University,

***National Institute of Public Health, Oslo, Norway

In the article, molecular epidemiology of Mycobacterium tuberculosis among new cases of tuberculosis morbidity rate in four administrative territories of the Barents region in the Russian Federation has been described. With the help of two methods of molecular biology - spoligo-identification and RFLP - it has been established that a prevailing genotype was the genotype Beijing (47,1%). This genotype has the highest level of clusters’ number among all genotypes, what is evidence of its active communication.

Key words: tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis, spoligo-identification, RFLP, the genotype Beijing.

Баранов Антон Алексеевич - аспирант кафедры фтизиопульмонологии Северного государственного медицинского университета

Адрес: 163000, г. Архангельск, пр. Троицкий, д. 51, СГМУ